ES2826385T3 - IL-10 como biomarcador pronóstico de la sensibilidad a la inmunoterapia con alérgenos de ácaros del polvo doméstico - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para predecir la sensibilidad de un paciente alérgico a los ácaros del polvo doméstico a la inmunoterapia, cuyo procedimiento comprende a) medir la abundancia de ARNm de IL-10 en una muestra de células de sangre completa de dicho paciente, b) comparar dicha abundancia de ARNm de IL-10 con un control, c) identificar a dicho paciente como susceptible de responder o no responder a la inmunoterapia en base a la comparación con el control, en el que dicha muestra de sangre completa se toma antes del comienzo de la inmunoterapia y en el que dicha inmunoterapia comprende la administración de un alérgeno de ácaros de polvo doméstico a dicho paciente con el fin de tratar la alergia a los ácaros del polvo doméstico, en el que la etapa c) se realiza: (i) determinando que el paciente es susceptible de responder a la inmunoterapia si el control se obtiene de un sujeto que responde al tratamiento, o de un grupo de sujetos que responden al tratamiento, que se sabe que responden a dicha inmunoterapia, y si la abundancia de ARNm de IL-10 en la muestra del paciente es igual o superior al nivel de expresión en el control; o (ii) determinando 20 que el paciente es susceptible de responder a la inmunoterapia si el control se obtiene de un sujeto que no responde al tratamiento, o de un grupo de sujetos que no responden al tratamiento, y si la abundancia de ARNm de IL-10 en la muestra del paciente es superior al nivel de expresión en el control; o (iii) determinando que el paciente es susceptible de responder a la inmunoterapia si el control se obtiene de un grupo de sujetos seleccionados aleatoriamente, y si la abundancia de ARNm de IL-10 en la muestra del paciente es superior al nivel de expresión en el control.

Description

DESCRIPCIÓN

IL-10 como biomarcador pronóstico de la sensibilidad a la inmunoterapia con alérgenos de ácaros del polvo doméstico [0001] La presente invención se refiere al uso de interleucina 10 (en lo sucesivo “IL-10”) como marcador biológico para predecir la sensibilidad de un paciente alérgico a los ácaros del polvo doméstico a la inmunoterapia con alérgenos de ácaros del polvo doméstico.

[0002] La alergia es un problema de salud importante y creciente en todo el mundo. A medida que las sociedades prosperan y reducen la incidencia de enfermedades contagiosas, aumenta la prevalencia de enfermedades alérgicas. Encontrar tratamientos eficaces para la alergia, tanto preventivos como terapéuticos, es un reto creciente para la industria sanitaria actual. Tradicionalmente, el tratamiento de la alergia se ha centrado en el alivio de los síntomas, usando antihistamínicos y medicamentos que alivian los síntomas alérgicos, que incluyen congestión nasal, dermatitis y asma, tales como descongestivos, cremas, antinflamatorios y broncodilatadores. La elusión de los alérgenos es otra estrategia para el tratamiento de la alergia, pero esto a menudo es difícil o imposible, particularmente en el caso de alérgenos abundantes tales como el polen. Una tercera alternativa es la vacunación específica contra la alergia, o inmunoterapia con alérgenos (ITA), en la que se inocula a los pacientes el alérgeno que causa la alergia con el fin de obtener una mejora en el estado inmunitario del paciente. Esta clase de tratamiento tiene la ventaja de alterar el curso de la enfermedad para evitar la manifestación de síntomas, en lugar de simplemente aliviar los síntomas.

[0003] La inmunoterapia con inyecciones (inmunoterapia subcutánea o ITSC) se describió por primera vez en 1911 y se ha usado en la práctica clínica desde los años 70. Sin embargo, la naturaleza invasiva de la terapia, que requiere consultas regulares con el médico, y los problemas con los efectos secundarios, que incluyen en raras ocasiones anafilaxia y muerte, han afectado a su aceptación como un tratamiento de la alergia. También se ha estudiado la inmunoterapia mediante la administración de alérgenos a la mucosa, tal como la mucosa oral de la boca y el intestino. La inmunoterapia sublingual (ITSL), en la que la vacuna se administra debajo de la lengua y se absorbe a través de la mucosa sublingual, es una alternativa consolidada a la inmunoterapia con inyecciones. La ITSL ha demostrado ser comparable a la ITSC en términos de eficacia y tiene un perfil de seguridad superior. Actualmente, se prefiere generalmente a la ITSC debido a la naturaleza menos invasiva de la técnica y al riesgo inferior de efectos secundarios, ya que la aparición de efectos secundarios nocivos de la ITSL es relativamente baja. Sin embargo, el gasto del tratamiento sigue siendo un factor importante en la ralentización de la aceptación de la ITSL.

[0004] La idoneidad de los pacientes para ITA se basa actualmente en la anamnesis y la determinación de la reactividad de IgE a un alérgeno específico mediante punción cutánea o pruebas in vitro. Por ejemplo, Ciprandi y col. (EXPERT REVIEW OF CLINICAL IMMUNOLOGY, 2014, vol. 10, n.° 3, páginas 321-324) describieron el uso de IgE específica de alérgenos como biomarcador para predecir la respuesta a la inmunoterapia con alérgenos. Sin embargo, la selección de pacientes se beneficiaría enormemente de la identificación de biomarcadores que predigan la probabilidad de mejora clínica después de la ITA (Senna y col. Curr Opin Allergy Clin Immunol 11, 375-380 (2011) ; Shamji, y col. Immunotherapy 5, 203-206 (2013)).

[0005] La solicitud de patente internacional WO 2012/137180 ha descrito que la fetuína-A, beta-2-glucoproteína 1, antitrombina-III, MCP-1 y eotaxina son biomarcadores pronósticos de la sensibilidad de un paciente a la inmunoterapia.

[0006] Baron-Bodo y col. (Scientific matters, 2010-01-01, páginas 9-11) evaluaron biomarcadores para inmunoterapia, tales como biomarcadores para predecir la sensibilidad al tratamiento, y llegaron a la conclusión de que todavía no había ningún biomarcador conocido para predecir la sensibilidad.

[0007] Sin embargo, hay una necesidad de parámetros biológicos adicionales medidos antes de la ITA que permitan distinguir a los pacientes que posteriormente se beneficiarán de la ITA de aquellos que no responden al tratamiento.

[0008] La expresión de IL-10 se ha asociado tradicionalmente a la inducción de la tolerancia tras la inmunoterapia. Por consiguiente, se ha propuesto la IL-10 como un posible biomarcador de seguimiento de la eficacia de la ITA en base a varios estudios exploratorios (véase, por ejemplo, Akdis y col. J Clin Invest 102, 98-106 (1998), Barberi y col., Journal of Biological Regulators and Homeostasis, 2011, 25(4), 627-634). Sin embargo, aunque algunos estudios describieron que los linfocitos B y T reguladores productores de IL-10 específicos de los alérgenos están elevados durante el ciclo de la ITA o por exposición natural a alérgenos (Jutel y col. J Immunol 154, 4187-4194 (1995); Jutel y col. Eur J Immunol 33, 1205-1214 (2003); Francis y col. J Allergy Clin Immunol 111, 1255-1261 (2003); Akdis y col. J Exp Med 199, 1567-1575 (2004); Bohle y col. J Allergy Clin Immunol 120, 707-713 (2007); van de Veen y col. J Allergy Clin Immunol 131, 1204-1212 (2013), Wang y col. Chinese Medical Journal, 2010, 123(15), 2099-2104), otros, incluyendo nuestro grupo, no observaron tal alteración de la IL-10 en la sangre de los pacientes durante la ITA (Dehlink y col. Clin Exp Allergy 36, 32-39 (2006); Bonvalet y col. Clin Exp Allergy 42, 1745-1755 (2012)).

[0009] Asimismo, el hecho de que un biomarcador tenga relevancia como biomarcador de seguimiento para la eficacia de la inmunoterapia no implica ninguna conclusión sobre su función como biomarcador pronóstico, y viceversa.

[0010] La presente solicitud proporciona pruebas de concentraciones altas de IL-10 en las muestras, recogidas antes de la ITA específica, de pacientes alérgicos a los ácaros del polvo doméstico que presentan respuestas clínicas, en comparación con los que no responden al tratamiento. Por consiguiente, la medición de la expresión de IL-10 se puede usar como un procedimiento para predecir la sensibilidad de los pacientes alérgicos a los ácaros del polvo doméstico a la ITA.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0011] La descripción se refiere a un procedimiento para predecir la sensibilidad a la inmunoterapia de un paciente alérgico a los ácaros del polvo doméstico, procedimiento que comprende medir el nivel de expresión de IL-10 en una muestra biológica de dicho paciente, donde dicha muestra biológica se toma antes del comienzo de la inmunoterapia y donde dicha inmunoterapia comprende la administración de un alérgeno de ácaros del polvo doméstico a dicho paciente con el fin de tratar la alergia a los ácaros del polvo doméstico.

[0012] La descripción también se refiere a un procedimiento para seleccionar un paciente alérgico a los ácaros del polvo doméstico para inmunoterapia, procedimiento que comprende las etapas de:

a) detectar el nivel de expresión de IL-10 en una muestra biológica de dicho paciente;

b) comparar dicho nivel de expresión con un control;

c) seleccionar o rechazar a dicho paciente para inmunoterapia en base a la comparación con el control; donde dicha muestra biológica se toma antes del comienzo de la inmunoterapia y donde dicha inmunoterapia comprende la administración de un alérgeno de ácaros del polvo doméstico a dicho paciente con el fin de tratar la alergia a los ácaros del polvo doméstico.

[0013] En otro aspecto, la invención se refiere a un alérgeno de ácaros del polvo doméstico para uso en inmunoterapia de la alergia a los ácaros del polvo doméstico en un paciente seleccionado para inmunoterapia, que comprende seleccionar el paciente para inmunoterapia aplicando el procedimiento para seleccionar al paciente de la invención.

[0014] La descripción proporciona además un procedimiento para tratar a un paciente alérgico a los ácaros del polvo doméstico mediante inmunoterapia, que comprende:

a) detectar el nivel de expresión de IL-10 en una muestra biológica de dicho paciente tomada antes del comienzo de la inmunoterapia;

b) comparar dicho nivel de expresión con un control;

c) seleccionar o rechazar a dicho paciente para inmunoterapia en base a la comparación con el control; donde dicha muestra biológica se toma antes del comienzo de la inmunoterapia; y

d) administrar un alérgeno de ácaros del polvo doméstico a dicho paciente seleccionado para inmunoterapia con el fin de tratar la alergia a dicho alérgeno.

[0015] La invención es como se define en las reivindicaciones.

[0016] Según la invención, la medición del nivel de expresión de IL-10 se realiza midiendo la abundancia de ARNm de IL-10.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0017] La invención proporciona un procedimiento para seleccionar pacientes alérgicos a los ácaros del polvo doméstico idóneos para ITA en base a los niveles de IL-10. Usando este procedimiento, las puntuaciones promedio ajustadas de síntomas (AASS) medidas después de recibir el tratamiento activo fueron muy inferiores en los pacientes que presentaban un nivel inicial alto de expresión de IL-10 en comparación con las AASS de toda la cohorte de pacientes no seleccionados.

Inmunoterapia

[0018] El término “inmunoterapia” está destinado a significar un tratamiento de la enfermedad induciendo, mejorando o inhibiendo una respuesta inmunitaria mediante la administración de sustancias (p. ej., alérgenos).

[0019] Los términos “terapia”, “terapéutico”, “tratamiento” o “tratar” incluyen reducir, aliviar, inhibir o eliminar las causas de una enfermedad o de procesos patológicos (p. ej., alergia), así como el tratamiento destinado a reducir, aliviar, inhibir o eliminar los síntomas de dicha enfermedad o proceso patológico. Estos términos pueden incluir el tratamiento preventivo que está destinado a, o tiene el efecto de, prevenir la aparición de la enfermedad o el proceso patológico, o reducir, aliviar, inhibir o eliminar síntomas futuros. También pueden incluir el tratamiento de síntomas en curso.

[0020] La “alergia” o “hipersensibilidad de tipo 1” es una afección caracterizada por la producción de IgE específica del alérgeno en respuesta a un alérgeno específico, normalmente una proteína. Las manifestaciones y síntomas clínicos de la alergia pueden incluir congestión nasal, prurito nasal, prurito ocular, lagrimeo, rinorrea, sinusitis, rinitis, estornudos, sibilancias, conjuntivitis, prurito cutáneo, dermatitis, irritación cutánea, urticaria, disnea, tos repetitiva y asma.

[0021] En lo que respecta a la alergia, la inmunoterapia comprende administrar un alérgeno de ácaros del polvo doméstico al paciente con el fin de tratar la alergia a ácaros del polvo doméstico del paciente, es decir, reducir la respuesta inmunitaria actual o futura, tal como una respuesta de IgE específica del alérgeno y/o la liberación de histamina por los mastocitos y/o granulocitos inducida por el alérgeno y/o la manifestación de síntomas clínicos de la alergia. La inmunoterapia se lleva a cabo convencionalmente administrando repetidamente una monodosis o dosis crecientes de un alérgeno a un paciente con necesidad de las mismas, dando como resultado de ese modo una respuesta inmunitaria adaptativa del paciente que se desensibiliza al alérgeno.

[0022] En algunas realizaciones, la inmunoterapia comprende la administración de alérgeno a una superficie mucosa, tal como una superficie sublingual, oral, nasal, bucal, ocular, rectal, vaginal, pulmonar o auditiva. En particular, la inmunoterapia es preferentemente inmunoterapia sublingual. Alternativamente, en otras realizaciones, la inmunoterapia comprende la administración por vía parenteral, tal como por vía intralinfática, subcutánea o intravenosa, por ejemplo, por inyección, o por vías alternativas tales como inmunización cutánea, p. ej., administración transdérmica o epicutánea.

[0023] Un alérgeno es una sustancia, normalmente una proteína, que provoca la producción de anticuerpos de IgE en individuos predispuestos. Los alérgenos incluyen alérgenos de ácaros del polvo doméstico.

[0024] Por ejemplo, un alérgeno se puede seleccionar del grupo que consiste en un alérgeno proteico del género Dermatophagoides.

[0025] Los ejemplos de diversos alérgenos proteicos conocidos obtenidos de los géneros antes identificados incluyen: Dermatophagoides (pteronyssinus o farinae) Der p 1; Der p 2; Der p 23, Der f 1; Der f 2.

[0026] El “alérgeno” usado para inmunoterapia puede ser una única sustancia alergénica o una mezcla de tales sustancias, por ejemplo, una mezcla de alérgenos. En tal caso, la mezcla puede comprender alérgenos que tienen cantidades equimolares o cantidades diferentes en una relación de preferentemente hasta 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20. Puede ser un extracto de alérgeno. El extracto de alérgeno puede ser un extracto de alérgeno parcial o totalmente purificado. El extracto de alérgeno puede ser un extracto de alérgeno modificado (p. ej., alergoides) o no modificado. El alérgeno también puede ser una proteína recombinante, una proteína de fusión, un mutante o péptido obtenido de la misma. El alérgeno puede ser además un hipoalérgeno, tal como un alergoide (forma químicamente modificada de un alérgeno presente en la naturaleza que se ha modificado químicamente, por ejemplo, mediante aldehidación) o un mutante con alergenicidad reducida, o un péptido obtenido del mismo. Por ejemplo, el alérgeno administrado para inmunoterapia puede ser un extracto de ácaros del polvo doméstico de uno o varios géneros de ácaros del polvo doméstico, tales como ácaros del género Dermatophagoides. El alérgeno se puede administrar junto con un aditivo y/o un sistema de vector.

[0027] La composición usada para inmunoterapia puede estar en fase líquida, fase sólida o una combinación de ambas, tal como una vacuna adsorbida.

[0028] Puede comprender, por ejemplo, una cantidad total de 0,01-10000 mg, preferentemente 0,01-1000 mg, preferentemente 0,1-500 mg de alérgenos, más particularmente de alérgenos mayoritarios, más particularmente de alérgenos de ácaros del polvo doméstico del grupo I y/o grupo II.

[0029] El contenido de alérgenos de la composición se puede expresar en términos de biopotencia (actividad alergénica como se mide “in vivo” y/o “in vitro”) para la cual actualmente no hay un procedimiento estandarizado aceptado internacionalmente. La biopotencia de un extracto determinado depende principalmente del contenido de alérgenos relevantes en el extracto, cuyo contenido varía con el material biológico original. Se han desarrollado diferentes unidades, tales como IR (índice de reactividad), BAU (unidades alergénicas bioequivalentes), AU (unidades de alergia), unidades SQ (unidades de calidad estandarizada). El índice de reactividad o IR se establece en base al procedimiento estandarizado de IR de la biopotencia de Stallergenes. El IR se puede determinar por medio de un inmunoanálisis, tal como un ELISA de inhibición. Los extractos de polen de hierba que contienen 100 IR equivalen a alrededor de 3000 BAU. Las BAU o unidades alergénicas bioequivalentes son las unidades de biopotencia establecidas en base a los requisitos de la FDA descritos en “Methods of the Allergenics Products Testing Laboratory”, octubre de 1993, n.° de registro 94N-0012, en la página 15. En cuanto a su potencia, la composición usada para inmunoterapia puede comprender, por ejemplo, un valor total de 0,01-10000 IR, preferentemente 0,1-1,000 IR, preferentemente 1-500 IR, preferentemente 100-300 IR. En una realización, la inmunoterapia comprende la administración de un extracto de alérgeno de al menos una especie Dermatophagoides, preferentemente una mezcla de extractos de alérgeno de D. pteronyssinus y D. farinae, más preferentemente una mezcla de extractos de alérgeno de D. pteronyssinus y D. farinae que tiene una cantidad similar de cada extracto o cantidades diferentes en una relación de hasta preferentemente 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20. En otra realización, la mezcla de extractos de D. pteronyssinus y D. farinae tiene cantidades equimolares de alérgenos mayoritarios o cantidades diferentes en una relación de hasta preferentemente 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20. En una realización adicional, la mezcla de extractos de D. pteronyssinus y D. farinae tiene una alergenicidad similar de cada extracto, teniendo preferentemente cada uno una potencia de 0,01-10000 IR, preferentemente 0,1-1000 IR, preferentemente 1-500 IR, preferentemente IR de 100-300, o una relación diferente de hasta preferentemente 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20. Como una realización más preferida, tales composiciones se formulan en un comprimido, tal como un comprimido de liberación rápida.

[0030] La “respuesta” de un paciente al tratamiento indica que el paciente manifiesta una reducción en los síntomas clínicos. Los síntomas clínicos se pueden evaluar a lo largo del ciclo de tratamiento, es decir, los síntomas antes del tratamiento se pueden comparar con los síntomas durante y después del tratamiento. Alternativamente, se puede determinar una reducción de los síntomas por comparación con un nivel inicial determinado antes del tratamiento. En lo que respecta a la alergia, esta estrategia es particularmente útil cuando, por ejemplo, la inmunoterapia se lleva a cabo en pacientes que actualmente no presentan síntomas, como puede ser el caso de las personas que padecen estacional al polen de gramíneas, que pueden recibir tratamiento antes de la temporada de polen. Los síntomas se pueden evaluar mediante procedimientos estándar, tales como la autoevaluación del paciente o el registro de la cantidad de medicación requerida. El grado de respuesta de un paciente al tratamiento se puede evaluar midiendo el grado de reducción de la intensidad de los síntomas.

[0031] Un sujeto “que responde al tratamiento”, como se define en esta memoria, es un sujeto que responde a la inmunoterapia o la administración de vacunas con una mejora de los síntomas clínicos, preferentemente una mejora estadísticamente significativa en comparación con los pacientes que reciben placebo o no reciben ningún tratamiento. Preferentemente, un sujeto que responde al tratamiento presentará al menos 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 % o 50 % de mejora de los síntomas clínicos. Como otra realización preferida, un sujeto que responde al tratamiento presentará una mejora de los síntomas clínicos que es superior a la mejora promedio o media observada en una muestra aleatoria de sujetos.

[0032] Un sujeto “que no responde al tratamiento” es un sujeto que no manifiesta ninguna mejora de los síntomas clínicos después de la inmunoterapia o la administración de vacunas, o que presenta una mejora no estadísticamente significativa de los síntomas, o que presenta una mejora inferior a 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 % o 50 % de los síntomas clínicos, o que presenta una mejora de los síntomas clínicos inferior a la mejora promedio o media observada en una muestra aleatoria de sujetos.

[0033] Por ejemplo, la mejora de los síntomas clínicos para la hipersensibilidad de tipo 1 o alergia se puede detectar mediante:

- una reducción de la frecuencia o la intensidad de la congestión nasal, el prurito nasal, el prurito ocular, el lagrimeo, la rinorrea, la sinusitis, la rinitis, los estornudos, las sibilancias, la conjuntivitis, el prurito cutáneo, la dermatitis, la irritación cutánea, la urticaria, la disnea, la tos repetitiva y el asma, y/o

- reducción en el consumo de medicación de alivio conocida, tal como antihistamínicos, corticosteroides, agentes broncodilatadores o agentes antileucotrienos,

- Una mejora de una prueba de la función pulmonar, tal como una prueba de caudal de aire, volumen de flujo, FEV1 (volumen espiratorio forzado en 1 segundo),

- Una reducción en parámetros inflamatorios tales como NO,

- Una reducción de la reactividad a un problema alergénico, tal como, una prueba intranasal, intraconjuntival, intrabronquial, de punción cutánea.

[0034] Asimismo, la mejora de los síntomas clínicos también se puede demostrar en base a una combinación de las mismas, tal como una puntuación de síntomas (p. ej., puntuación total de síntomas de rinoconjuntivitis (RTSS) o puntuación total promedio de síntomas de rinoconjuntivitis (ARTSS)), una puntuación de medicación (p. ej., puntuación de medicación de rescate (RMS) o puntuación promedio de medicación de rescate (ARMS)), puntuaciones combinadas (p. ej., puntuación combinada de síntomas (CS), puntuación promedio combinada de síntomas (ACS), puntuación promedio ajustada de síntomas (AASS o AdSS)) (véase Clark J. y col., Allergy 2007: 62: 1023-1028; Pfaar y col., Allergy 2014: 69: 854-867), ACT (Puntuación de síntomas de asma), ACQ (cuestionario de control del asma), guía de tratamiento del asma de la GINA (Iniciativa Global para el Asma).

Paciente

[0035] El paciente es preferentemente un mamífero, tal como un roedor, un felino, un equino, un bovino, un ovino, un canino o un primate, y es preferentemente un ser humano, en particular un niño, una mujer, un hombre.

[0036] En función del origen de la muestra que se va a analizar (p. ej., un roedor, un felino, un equino, un bovino, un ovino, un canino o un primate...), el experto en la materia determinará fácilmente cuáles son las secuencias del ARNm o polipéptido de IL-10 homólogos que se van a detectar consultando las bases de datos de secuencias habitualmente conocidas y, por lo tanto, elegirá los medios adecuados para detectar estos marcadores.

[0037] Por ejemplo, cuando el paciente es un ser humano, ARNm o el polipéptido de IL-10 está destinado a significar cualquier isoforma del ARNm o proteína de IL-10 presente en la naturaleza codificado de forma natural por el genoma humano, lo que incluye el ARNm que comprende, o consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 1, o que comprende, o consiste en, una secuencia complementaria a la SEQ ID NO: 2, o la proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

[0038] El término “paciente” incluye cualquier individuo alérgico a los ácaros del polvo doméstico que es candidato para la inmunoterapia con alérgenos.

[0039] Para la inmunoterapia con alérgenos, en la mayoría de los casos, el paciente es un individuo que tiene, o ha tenido en cualquier momento en el pasado, síntomas clínicos de alergia a los ácaros del polvo y/o sensibilización a un alérgeno y/o una respuesta de IgE específica del alérgeno, o un individuo en riesgo de desarrollar tales síntomas. La sensibilización a un alérgeno se puede evaluar detectando la IgE dirigida contra uno o más alérgenos de esta fuente en el suero del paciente o realizando pruebas cutáneas con una preparación que contiene el uno o más alérgenos correspondientes. El alérgeno incluye un alérgeno de ácaros del polvo doméstico.

[0040] Según la presente invención, el paciente tiene alergia a los ácaros del polvo doméstico, en particular alergia a un alérgeno Dermatophagoides. En esta realización, la inmunoterapia usa al menos un alérgeno de ácaros del polvo doméstico, en particular un extracto de alérgeno de ácaros del polvo doméstico. En particular, la inmunoterapia puede comprender la administración de una mezcla de extractos de alérgenos de D. pteronyssinus y D. farinae, más preferentemente una mezcla de extractos de alérgenos de D. pteronyssinus y D. farinae que tiene una cantidad similar de cada extracto o cantidades diferentes en una relación de hasta preferentemente 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20. En otra realización, la mezcla de extractos de D. pteronyssinus y D. farinae tiene cantidades equimolares de alérgenos mayoritarios o cantidades diferentes en una relación de hasta preferentemente 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20. En una realización adicional, la mezcla de extractos de D. pteronyssinus y D. farinae tiene una alergenicidad similar de cada extracto, teniendo preferentemente cada uno una potencia de 0,01-10000 IR, preferentemente 0,1-1000 IR, preferentemente 1-500 IR, preferentemente IR de 100-300, o una relación diferente de hasta preferentemente 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20. Como una realización más preferida, tales composiciones se formulan en un comprimido, tal como un comprimido de liberación rápida.

Muestra biológica

[0041] La muestra biológica puede ser, sin limitación, sangre completa, células mononucleares de sangre periférica (CMSP), subconjuntos de inmunocitos (p. ej., linfocitos B y/o T, células dendríticas, eosinófilos, células linfoides innatas, macrófagos, neutrófilos, monocitos, basófilos y linfocitos citolíticos naturales), sobrenadante de cultivos celulares, fluidos corporales (p. ej., suero sanguíneo, plasma sanguíneo, linfa, leche materna, heces, moco, saliva, esputo, orina, secreción nasal, líquido broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo), tejidos mucosos, condensado de aire exhalado o biopsia epitelial por cepillado. En particular, la muestra biológica es una muestra de sangre completa.

[0042] La muestra biológica se puede tomar en un momento en el que el paciente presenta o no síntomas o alergia al alérgeno usado para la inmunoterapia.

[0043] La muestra biológica recogida del paciente se puede someter a un procesamiento tal como separación, purificación, fraccionamiento, procesamiento enzimático, etc., antes de medir el nivel de expresión de IL-10. Por consiguiente, la medición del nivel de expresión de IL-10 se puede realizar directamente en la muestra biológica o en una fracción de la misma.

Medición del nivel de expresión de IL-10

[0044] La medición del nivel de expresión de IL-10 se puede conseguir por diferentes medios.

[0045] Según la invención, el nivel de expresión de IL-10 se determina midiendo la abundancia (o cantidad) de ARNm de IL-10.

[0046] La medición de la cantidad de ARNm de IL-10 se puede conseguir detectando el ARNm de IL-10.

[0047] Una secuencia de referencia de ARNm de IL-10 humana está disponible, por ejemplo, en la base de datos del NCBI con el número de entrada NM_000572.2 (SEQ ID NO: 1). En una realización, el “ARNm de IL-10” simboliza un ARNm que comprende, o consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 1. Una secuencia de referencia de ADNg de IL-10 humana está disponible, por ejemplo, en la base de datos del NCBI con el número de entrada NG_012088.1 (versión SEQ ID NO: 2). En otra realización, el “ARNm de IL-10” simboliza un ARNm que comprende, o consiste en, una secuencia complementaria a la SEQ ID NO: 2 o una forma sometida a corte y empalme de la misma.

[0048] El nivel de expresión de los ARNm de las proteínas de marcador se puede determinar mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real, usando cebadores específicos para las proteínas de marcador que se van a medir. Este procedimiento permite la detección de ARNm en una muestra biológica generando ADNc mediante transcripción inversa usando al menos un cebador; amplificando el ADNc así producido usando polinucleótidos específicos del gen como cebadores codificantes y no codificantes y detectando la presencia del ADNc amplificado mediante procedimientos bien conocidos por el experto en la materia.

[0049] Tales procedimientos pueden incluir el uso de sondas específicas de IL-10 compuestas por ácidos nucleicos (ADN, ARN) complementarios a la secuencia diana tales como sondas Taqman o sondas marcadas con isótopos radioactivos o sustratos quimioluminiscentes. Los estándares posibles incluyen actina-p, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), hipoxantina fosforribosiltransferasa (HPRT), microglobulina p2, ARNr 18S.

[0050] También son aplicables otros procedimientos tales como la secuenciación paralela masiva.

[0051] Como se describe adicionalmente, el nivel de expresión de IL-10 se puede determinar midiendo la abundancia (o cantidad) de polipéptido de IL-10.

[0052] Una secuencia de referencia del polipéptido de IL-10 humana está disponible, por ejemplo, en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot con el número de entrada P22301 (versión de entrada del 1 de agosto de 1991, SEQ ID NO: 1). La secuencia completa de IL-10 (preproteína) consiste en 178 aminoácidos y comprende un péptido señal que abarca los aminoácidos 1-18 y un polipéptido maduro secretado que abarca los aminoácidos 19-178. Como se emplea en esta memoria, “polipéptido de IL-10” incluye todas las isoformas de proteínas de IL-10, de las cuales, formas modificadas postraduccionalmente tales como glucoformas. Por consiguiente, en una realización, el “polipéptido de IL-10” simboliza un polipéptido que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3. Más preferentemente, “polipéptido de IL-10” simboliza un polipéptido que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 4.

[0053] La medición de la cantidad de polipéptido de IL-10 se puede conseguir midiendo el polipéptido de IL-10, o un fragmento degradado del mismo (por ejemplo, si se van a usar técnicas de espectrometría de masas para la medición). Dicho fragmento degradado puede resultar del tratamiento proteolítico del polipéptido de IL-10 con una proteasa. La secuencia de dicho fragmento degradado puede ser predecida por el experto en la materia de una manera obvia en base al conocimiento de la secuencia del polipéptido de IL-10 y empleando una proteasa con un patrón proteolítico definido tal como tripsina.

[0054] El nivel de expresión de polipéptido de IL-10 se puede determinar mediante electroforesis en gel (SDS-PAGE), en particular electroforesis en gel bidimensional (2D-PAGE), llevada a cabo en la muestra biológica o en un extracto de la misma que contiene proteína. 2D-PAGE es una técnica bien consolidada en la que las proteínas se separan primero en una dimensión mediante isoelectroenfoque y después se separan mediante SDS-PAG^e a lo largo de una segunda dimensión. La expresión de proteínas se puede analizar mediante la visualización de proteínas marcadas o mediante inmunoelectrotransferencia y detección inmunitaria. La cuantificación de proteínas mediante 2D-PAGE normalmente se lleva a cabo mediante 2D-DiGE, en la que las proteínas de una muestra de control y de la muestra de prueba se marcan con colorantes diferentes. Los colorantes coinciden en cuanto a la masa y carga, por lo que las proteínas marcadas migran a la misma posición en el gel, lo que permite llevar a cabo la cuantificación en un único gel.

[0055] El nivel de expresión de polipéptido de IL-10 también se puede medir mediante análisis de masas, tal como espectrometría de masas. Las técnicas de espectrometría de masas cualitativa y cuantitativa son conocidas y se usan en la técnica. También se puede usar CL-EM/EM cuantitativa.

[0056] También se puede usar un anticuerpo, un aptámero o una DARPin que se une específicamente al polipéptido de IL-10 para medir el nivel de expresión de polipéptido de IL-10.

[0057] Según un aspecto de la descripción, el nivel de expresión de polipéptido de IL-10 se mide usando un anticuerpo que se une a la IL-10, preferentemente que es específico de la IL-10, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal, una variante o fragmentos de anticuerpo tales como un anticuerpo monocatenario, un diacuerpo, un minicuerpo, un fragmento Fv monocatenario (sc(Fv)), un anticuerpo Sc(Fv)2, un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2, un anticuerpo V^hH o un anticuerpo de dominio único. El anticuerpo puede ser mono-, bi-, tri- o multivalente. El anticuerpo se puede inmovilizar sobre un soporte sólido. Los anticuerpos se pueden usar para determinar la expresión de polipéptido de IL-10 en un abanico de inmunoanálisis que incluyen sistemas de análisis competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como inmunoelectrotransferencia, radioinmunoanálisis tal como RIA (análisis inmunorradiométrico), ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción), inmunoanálisis de tipo “sándwich”, análisis de inmunoprecipitación, análisis de inmunodifusión, análisis de aglutinación, análisis de fijación del complemento, análisis radioinmunométrico, fluoroinmunoanálisis, p. ej., FIA (inmunoanálisis de fluorescencia), inmunoanálisis de quimioluminiscencia, inmunoanálisis de electroquimioluminiscencia (ECLIA), inmunoanálisis de proteína A y análisis de luminiscencia con canalización de oxígeno.

[0058] Según otro aspecto, el nivel de expresión de polipéptido de IL-10 se mide usando un aptámero específico de la proteína. Un aptámero es una molécula de oligonucleótido o péptido que se une específicamente a una molécula diana específica. Como oligonucleótido, puede ser un ARN o ^a Dⁿ monocatenario corto (ADNmc o ARNbc). Como péptido corto consiste en un bucle peptídico variable fijado en ambos extremos a un armazón proteico. Los procedimientos para fabricar aptámeros son bien conocidos en la técnica, tales como la evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial (SELEX) para aptámeros de oligonucleótidos o el sistema de dos híbridos de levadura para aptámeros peptídicos. Tales aptámeros se pueden marcar preferentemente con el fin de permitir la detección de una interacción proteína-ligando. También se podría usar un análisis a base de nanotecnología.

[0059] Según un aspecto adicional, el nivel de expresión de IL-10 se mide usando una DARPin específica de la proteína. Una DARPin (proteína con repeticiones de anquirina diseñada) es un polipéptido modificado genéticamente que generalmente comprende cuatro a cinco motivos de repetición de anquirina y presenta una unión altamente específica y de alta afinidad a las proteínas diana.

Predicción de la sensibilidad del paciente en base al nivel de expresión de IL-10

[0060] La expresión del biomarcador del biomarcador IL-10 en una muestra biológica del paciente se compara con un control. Este control puede ser un valor estándar de control y/o puede consistir en la expresión de dicho ARNm de IL-10 en una muestra de control, por ejemplo, una muestra de control de la misma naturaleza que la muestra biológica.

[0061] El procedimiento para predecir la sensibilidad de un paciente alérgico a los ácaros del polvo doméstico a la inmunoterapia habitualmente comprende las etapas de:

a) detectar el nivel de expresión de IL-10 (ARNm de IL-10) en la muestra biológica del paciente;

b) comparar dicho nivel de expresión de IL-10 con un control;

c) identificar a dicho paciente como susceptible de responder o no responder a la inmunoterapia en base a la comparación con el control:

(i) determinar que el paciente es susceptible de responder a la inmunoterapia si el control se obtiene de un sujeto que responde al tratamiento, o un grupo de sujetos que responden al tratamiento, que se sabe que responden a dicha inmunoterapia, y si un nivel de expresión de dicha IL-10 en la muestra del paciente es superior al nivel de expresión en el control; o

(ii) determinar que el paciente es susceptible de responder a la inmunoterapia si el control se obtiene de un sujeto que no responde al tratamiento, o un grupo de sujetos que no responden al tratamiento, y si el nivel de expresión de dicha IL-10 en la muestra del paciente es superior al nivel de expresión en el control; o (iii) determinar que el paciente es susceptible de responder a la inmunoterapia si el control se obtiene de un grupo de sujetos seleccionados aleatoriamente, y si un nivel de expresión de dicha IL-10 en la muestra del paciente es superior al nivel de expresión en el control.

[0062] En realizaciones donde se mide la abundancia del ARNm de IL-10, el control consiste preferentemente en un valor de la abundancia del ARNm de IL-10, expresada en números de copias por millón de copias de ARNm de p-actina, según se determina mediante qRT-PCR, que se establece (i) definiendo un valor umbral para el porcentaje de mejoras de la AASS, (ii) definiendo un valor umbral de sensibilidad del ensayo y (iii) determinando el valor umbral correspondiente de abundancia de ARNm de IL-10. En otras realizaciones, en lugar de determinar un valor umbral de sensibilidad del ensayo en la etapa (ii), se puede seleccionar un valor umbral de especificidad. En realizaciones adicionales, se puede seleccionar un valor umbral tanto de sensibilidad como de especificidad en la etapa (ii). Como una realización más preferida, se puede seleccionar cualquiera de los números de copias de una muestra biológica definidos en las tablas 1, 2 y 3.

Procedimiento para seleccionar un paciente para inmunoterapia

[0063] En dicho procedimiento, la expresión del biomarcador IL-10 en una muestra biológica del paciente alérgico a los ácaros del polvo doméstico también se puede comparar con un valor estándar de control y/o con la expresión de dicho ARNm de IL-10 en una muestra de control, por ejemplo, una muestra de control de la misma naturaleza que la muestra biológica.

[0064] En el procedimiento para seleccionar un paciente alérgico a los ácaros del polvo doméstico para inmunoterapia según la invención, la selección o el rechazo de dicho paciente para inmunoterapia en base a la comparación con el control se realiza:

(i) si el control se obtiene de un sujeto que responde al tratamiento o un grupo de sujetos que responden al tratamiento, que se sabe que responden a dicha inmunoterapia, seleccionando al paciente para inmunoterapia si el nivel de expresión de dicho ARNm de IL-10 en la muestra del paciente es superior al nivel de expresión en el control;

(ii) si el control se obtiene de un sujeto que no responde al tratamiento o un grupo de sujetos que no responden al tratamiento, seleccionando al paciente para inmunoterapia si el nivel de expresión de dicho ARNm de Il-10 en la muestra del paciente es superior al nivel de expresión en el control; o

(iii) si el control se obtiene de un grupo de sujetos seleccionados aleatoriamente, seleccionando al paciente para inmunoterapia si el nivel de expresión de dicho ARNm de IL-10 en la muestra del paciente es superior al nivel de expresión en el control.

[0065] En realizaciones donde se mide la abundancia del ARNm de IL-10, el control consiste preferentemente en un valor de la abundancia del ARNm de IL-10 o fragmento del mismo de al menos cualquiera de los números de copias definidos en las tablas 1, 2 y 3 por millón de copias de ARNm de p-actina, según se determina mediante qRT-PCR.

Aplicación de inmunoterapia en pacientes seleccionados para inmunoterapia

[0066] A los pacientes alérgicos a los ácaros del polvo doméstico que son seleccionados para inmunoterapia con el alérgeno, o que se prevé que van a ser sensibles a la inmunoterapia con el alérgeno, se les administra a continuación el alérgeno para tratar la alergia al antígeno, p. ej., reduciendo la respuesta inmunitaria al alérgeno.

[0067] Preferentemente, la invención se refiere a un alérgeno para uso en un procedimiento de inmunoterapia para la alergia en un paciente alérgico o sensibilizado a los ácaros del polvo doméstico que ha sido seleccionado para inmunoterapia con alérgenos mediante un procedimiento según la invención.

[0068] Se ha descrito un procedimiento para tratar a un paciente alérgico a los ácaros del polvo doméstico mediante inmunoterapia.

[0069] A lo largo de la presente solicitud, el término “que comprende” se debe interpretar como que abarca todas las características mencionadas específicamente, así como las opcionales, adicionales y no especificadas. Como se emplea en esta memoria, el uso del término "que comprende" también abarca la realización en la que no están presentes características distintas de las características mencionadas específicamente (es decir, "que consiste en"), así como la realización en la que están presentes características distintas de la característica específicamente mencionada, siempre que las características esenciales de la composición no se vean sustancialmente afectadas por su presencia (es decir, "que consiste esencialmente en").

[0070] La invención se ilustrará adicionalmente a la vista de las figuras y los ejemplos siguientes.

FIGURAS

[0071]

Figura 1. Niveles superiores de ARNm de IL-10 en células se sangre completa de pacientes alérgicos a los APD que responden a la ITA.

La expresión del gen de IL-10 (media 6 EEM) se evaluó en el momento inicial (antes del tratamiento - V2) mediante qPCR en células de sangre completa de pacientes de los grupos de tratamiento activo y placebo (AR, n = 38; ANR, n = 37; PR, n = 18; y PNR, n = 59) (** p < 0,01, pruebas de Mann-Whitney). Se aplicó un umbral de mejora de la AASS de 51,18 % después del tratamiento (mejora de AASS entre 44-52 semanas de tratamiento y el momento inicial - V17/V2) para distinguir a los pacientes que responden al tratamiento de los que no responden al tratamiento.

Figura 2. Los niveles de ARNm de IL-10 en células de sangre completa de pacientes alérgicos a los APD están interrelacionados con la eficacia clínica de la ITA.

La expresión del gen de IL-10 (media 6 EEM) se evaluó en el momento inicial (antes del tratamiento - V2) mediante qPCR en células de sangre completa de pacientes de los grupos de tratamiento activo y placebo (Activos = 75, Placebo = 77). Correlaciones de Spearman a nivel de un paciente individual de las concentraciones de gen de IL-10 representando gráficamente los números de copias de ARNm de IL-10 por millón de copias de ARNm de pactina frente a las mejoras porcentuales en la AASS (mejora de la AASS entre 44-52 semanas de tratamiento y el momento inicial - V17/V2) en pacientes de los grupos de tratamiento activo (grupo de pruebas superior) y placebo (grupo de pruebas inferior) (** p < 0,01, ns = no significativo; prueba de Spearman).

Figura 3: la selección de pacientes con IL-10 alta mejora la diferencia en las puntuaciones clínicas entre pacientes con tratamiento activo y con placebo. Las puntuaciones promedio ajustadas de síntomas (AASS; media 6 DE) se presentan después de 12 meses (semanas 44-52) de inmunoterapia para 152 pacientes (75 que recibieron el tratamiento activo y 77 que recibieron placebo) sin usar criterios del biomarcador pronóstico (grupo de pruebas superior). Las AASS se presentan después de 12 meses (semanas 44-52) de inmunoterapia para 114 pacientes que presentan niveles altos de ARNm de IL-10 (52 que reciben el tratamiento activo y 62 que reciben placebo) ( grupo de pruebas inferior ). (**** p < 0,0001, pruebas de Mann-Whitney).

Figura 4: curvas ROC de la abundancia de ARNm de IL-10. Curvas de ROC de la abundancia de ARNm de IL-10 en el grupo de tratamiento activo con % de mejora de la AASS como corte de 16,54 % (A), 25 % (B) y 51,18 % (C) para definir los pacientes que responden al tratamiento y en las que los controles se definen como pacientes que no responden al tratamiento (es decir, pacientes con un porcentaje de mejora en la AASS inferior a un umbral) (AUC: área bajo la curva ROC).

EJEMPLOS

[0072] Con el fin de identificar parámetros biológicos que permitan distinguir a los pacientes alérgicos a los ácaros del polvo doméstico, antes de que inicien la inmunoterapia con alérgenos (ITA), que posteriormente se beneficiarán de la ITA de aquellos que no responden al tratamiento, se han realizado experimentos con muestras biológicas de pacientes sometidos a un ensayo clínico de fase 2/3 con comprimidos de iTs L con ácaros del polvo doméstico.

Ejemplo 1: diseño del estudio para la evaluación de la eficacia y seguridad de los comprimidos de ITSL con ácaros del polvo doméstico en un estudio a gran escala de un año de duración en pacientes con rinitis alérgica Diseño del ensayo clínico:

[0073] Se ha realizado un estudio aleatorizado, con doble ocultación y controlado con placebo para evaluar la eficacia y seguridad de los comprimidos de ácaros del polvo domésticos (APD) en pacientes adolescentes y adultos con rinitis alérgica por APD, con o sin asma intermitente. Los sujetos se aleatorizaron 1:1:1 a los grupos de placebo o tratamiento activo con extractos de APD a dosis (expresadas en índice de reactividad [IR], la unidad de estandarización interna) de 300 IR o 500 IR y se trataron durante 52 semanas.

Población del estudio:

[0074] El conjunto de análisis completo incluyó 927 sujetos, que abarcaron pacientes que recibieron comprimidos de 300 IR (N = 315), 500 IR (N = 296) y placebo (N = 316).

Participantes:

[0075] Los principales criterios de inclusión fueron hombres o mujeres; edades entre 12 y 64 años; antecedentes de rinitis alérgica inducida por APD al menos durante 2 años; IgE sérica específica de APD positiva y prueba de provocación nasal positiva.

Tratamiento del estudio y otros medicamentos:

[0076] Se administraron dos dosis de comprimidos de APD, 300 IR y 500 IR, en los grupos de tratamiento activo. Los comprimidos activos contienen una mezcla 1:1 de extractos estandarizados de D. pteronyssinus y D. farinae. Se administraron comprimidos de placebo al grupo placebo.

[0077] Se indicó a los sujetos que usaran MR (medicación de rescate) si los síntomas eran intolerables o interferían con las actividades diarias y, de manera gradual, en la etapa 1: antihistamínico oral u oftálmico, etapa 2: corticosteroide nasal, etapa 3: antihistamínico oral u oftálmico con corticosteroide nasal.

Evaluaciones:

[0078] Los sujetos registraron sus síntomas nasales diarios (0-4 para estornudos, rinorrea y congestión nasal, y 0-3 para prurito nasal, escala total de 0-15 puntos), síntomas oculares (0-4 para picor de ojos y ojos llorosos), interferencia con las actividades diarias (0-4) y uso de MR, durante los períodos de evaluación intermedios de 2 semanas (semanas 8-10, 16-18, 24-26, 32-34 y 40-42) y al final del período de evaluación del tratamiento (semana 44-52, período de evaluación principal). La puntuación de medicación de rescate (RMS; intervalo, 0-2) se asignó como 1 si un sujeto tomaba antihistamínico oral y/u oftálmico (Etapa 1) y 2 si un sujeto tomaba corticosteroide nasal (Etapa 2). Si un sujeto tomaba tanto antihistamínico como corticosteroide nasal (Etapa 3), se asignó la RMS de 2.

Resultados:

[0079] La variable principal de eficacia fue la AASS en las últimas semanas del periodo de tratamiento de 52 semanas (semanas 44-52) (Grouin y col. Clin Exp Allergy. 2011;41:1282-8). La AASS es el promedio para cada paciente de la puntuación ajustada de síntomas (ASS) que se obtiene como se indica a continuación. Si un sujeto no tomó MR ese día o el día anterior, la ASS equivalía a la puntuación total de síntomas rinitis (RTSS). Si un sujeto tomó MR ese día, la ASS en ese día era igual a la RTSS de ese día o a la ASS del día anterior, la que fuera superior, y la ASS del día siguiente era la RTSS del día siguiente o la ASS del día anterior, la que fuera superior. La RTSS (intervalo, 0-15) era la suma de las 4 puntuaciones de síntomas de rinitis. La puntuación combinada (CS; intervalo, 0-2.875) se obtiene como (RTSS/4 RMS)/2.

Ejemplo 2: identificación de la IL-10 como biomarcador de la eficacia de la ITA

[0080] En el contexto del ensayo clínico descrito en el ejemplo 1, se realizaron estudios complementarios del biomarcador en pacientes

alérgicos a los APD que recibían diariamente comprimidos de APD de 300 IR (n = 75) o un placebo (n = 77). En este estudio, las respuestas clínicas se evaluaron en cada paciente individual como porcentajes de mejora en la puntuación promedio ajustada de síntomas (AASS) que ajusta las puntuaciones de los síntomas para el uso de medicación de rescate.

PROCEDIMIENTOS

Subgrupos de pacientes

[0081] Los porcentajes medios de mejora de la AASS en el grupo de tratamiento activo después del tratamiento también se usaron como umbral

para identificar a los pacientes clínicos que respondían al tratamiento, con los pacientes que presentan una mejora de la AASS >51,18% considerados como pacientes que respondían al tratamiento y aquellos con una mejora inferior como pacientes que no respondían al tratamiento. En base a este umbral, se definieron 4 subgrupos de pacientes, que incluían los pacientes que respondían al tratamiento y recibían tratamiento activo (AR, n = 38), que no respondían al tratamiento y recibían tratamiento activo (ANR, n = 37), que respondían al tratamiento y recibían placebo (PR, n = 18) y que no respondían al tratamiento y recibían placebo (PNR, n = 59).

Recogida de muestras

[0082] Se recogieron células de sangre completa en el momento inicial (Visita 2; V2) y después de 2 (V6) y 12 meses (V17) de ITA usando tubos de ARN sanguíneo PAXgene (Qiagen) y se mantuvieron congeladas a -20 °C hasta su uso. Todos los análisis biológicos se realizaron en muestras codificadas para los operadores.

Aislamiento de ARN y análisis mediante PCR cuantitativa en tiempo real

[0083] Se extrajeron los ARN totales, lo que incluye los miARN, con el kit de purificación de ácidos nucleicos (kit de miARN sanguíneo PAXgene) según las instrucciones del fabricante. Los ADNc se sintetizaron usando el kit de síntesis de ADNc SuperScript® VILO™ (Applied Biosystems, Les Ulis, Francia) según las instrucciones del fabricante. Se evaluó la expresión del gen de lL-10 (IL-10 - Hs00174066_m1) y se comparó con p-actina endógena (Hs99999903_m1) como control mediante PCR cuantitativa (qPCR) en un sistema de PCR en tiempo real 7900HT (Applied Biosystems) según las instrucciones del fabricante. Las cantidades relativas de ARNm de IL-10 correspondientes al gen diana en cada muestra se calcularon en comparación con el gen calibrador, es decir, p-actina endógena, usando la ecuación siguiente: ACt = (Ct IL-10 - Ct p-actina). Para los análisis gráficos, se usó la fórmula (2 áct) x 106 para determinar los números de copias de ARNm de IL-10 por millón de copias de ARNm de p-actina. Análisis estadísticos

[0084] Las diferencias estadísticas entre los grupos y los análisis de correlación se realizaron usando las pruebas de Mann-Whitney y Spearman, respectivamente, con los valores de p < 0,05 considerados significativos. RESULTADOS

En el momento inicial, los niveles de ARNm de IL-10 son superiores en las células de sangre completa de pacientes clínicos que respondían al tratamiento que en los pacientes que no respondían al tratamiento y están significativamente interrelacionados con el beneficio clínico de los pacientes del grupo de tratamiento activo

[0085] Para evaluar la IL-10 como marcador pronóstico de las respuestas clínicas a la ITA, se midió la expresión de IL-10 mediante qPCR en células de sangre completa recogidas antes de la ITA (V2) de 152 pacientes alérgicos a los APD que recibieron indistintamente un comprimido de APD de 300 IR (n = 75) o placebo (n = 77) por vía sublingual, una vez al día, durante 12 meses. Los pacientes se estratificaron en 4 subgrupos (véase el apartado Procedimientos), que incluían pacientes que respondían al tratamiento y recibían tratamiento activo (AR; n = 38), pacientes que no respondían al tratamiento y recibían tratamiento activo (RAN; n = 37), pacientes que respondían al tratamiento y recibían placebo (RP; n = 18) y pacientes que no respondían al tratamiento y recibían placebo (PNR; n = 59). Como se muestra en la Fig. 1, los niveles de ARNm de IL-10 fueron significativamente superiores (p < 0,01) en los AR que en los ANR. No se observaron tales diferencias en el grupo placebo entre los RP y PNR y no hubo sesgo posible, ya que no hubo diferencias entre los grupos de tratamiento activo y placebo (Fig. 1).

[0086] Cuando se representaron gráficamente frente a los porcentajes de mejora de la AASS (V17/V2) para cada paciente individual, los niveles de ARNm de IL-10 estuvieron significativamente interrelacionados (con una correlación de Spearman R = 0,3511, p = 0,002) con el beneficio clínico en los pacientes del grupo de tratamiento activo (Fig. 2, grupo de pruebas superior), mientras que no se observó tal interrelación en los pacientes tratados con placebo (Fig. 2, grupo de pruebas inferior).

La selección de pacientes con IL-10 alta mejora la diferencia en las puntuaciones clínicas entre pacientes con tratamiento activo y con placebo.

[0087] Para evaluar la ventaja de seleccionar pacientes alérgicos a los APD idóneos para la ITA en base a los niveles de ARNm de IL-10 en células de sangre completa, seleccionamos para análisis adicionales 75 % (114 de 152) de pacientes alérgicos a los APD que presentaban los niveles más altos de ARNm de IL-10, definidos como pacientes con IL-10alta, en base a números de copias de ARNm de IL-10 por millón de copias de ARNm de p-actina >94,455. Por el contrario, 25 % (38 de 152) de los pacientes que presentaban los niveles más bajos de ARNm de IL-10 (pacientes con IL-10baja) fueron retirados de los análisis. Como se muestra en la Fig. 3, después de la ITA durante 12 meses (semanas 44-52), las diferencias en la AASS de los pacientes con IL-10alta que recibieron el tratamiento activo frente a los que recibieron placebo eran muy superiores (grupo de pruebas inferior; -34,5 %) en comparación con las diferencias en la AASS de toda la cohorte de pacientes no seleccionados (grupo de pruebas superior; -26,0 %).

[0088] Por tanto, el presente estudio establece claramente que el gen de IL-10 está más expresado en las células de sangre completa de los AR que de los ANR. Estos resultados permiten el uso de los niveles de IL-10, en particular los niveles de ARNm de IL-10, antes de la ITA como un criterio para seleccionar pacientes más susceptibles de beneficiarse del tratamiento. Como tal, la IL-10 representa un biomarcador para predecir la eficacia de la ITA [0089] La idoneidad del ARNm de IL-10 se evaluó adicionalmente mediante un análisis de la curva de eficacia diagnóstica (ROC). La curva ROC de los niveles de copias de ARNm de IL-10 de 75 pacientes del grupo de tratamiento activo divididos en 2 subgrupos en base a un porcentaje umbral de mejora en la AASS de 16,54 % se presenta en la Figura 4A. El AUC fue de 0,6911 (con un valor de p de 0,03682).

[0090] La curva ROC de los niveles de copias de ARNm de IL-10 de 75 pacientes del grupo de tratamiento activo divididos en 2 subgrupos en base a un porcentaje umbral de mejora en la AASS de 25 % se presenta en la Figura 4B. El AUC fue de 0,7242 (con un valor de p de 0,004345).

[0091] La curva ROC de los niveles de copias de ARNm de IL-10 de 75 pacientes del grupo de tratamiento activo divididos en 2 subgrupos en base a un porcentaje umbral de mejora en la AASS de 51,18 % se presenta en la Figura 4C. El AUC fue de 0,7116 (con un valor de p de 0,001627).

[0092] En estas curvas ROC, los controles se definen como pacientes que no responden al tratamiento (es decir, pacientes con un porcentaje de mejora en la AASS inferior a los porcentajes umbral de mejora de la AASS definidos anteriormente).

[0093] Estas últimas curvas ROC en las que los controles se definen como pacientes que no responden al tratamiento estuvieron asociadas a los datos de sensibilidad y especificidad siguientes.

continuación

T l 2 - mrl m r 2 n l AA

continuación

T l=^ m r l= =m r= =1±1 =n ^A

continuación

[0094] Estos resultados confirman que el ARNm de IL-10 es útil para distinguir a los pacientes clínicos que responden al tratamiento de los que no responden al tratamiento antes de la ITA.

Ejemplo 3 - Expresión de IL-10 en CMSP frescas

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para predecir la sensibilidad de un paciente alérgico a los ácaros del polvo doméstico a la inmunoterapia, cuyo procedimiento comprende

a) medir la abundancia de ARNm de IL-10 en una muestra de células de sangre completa de dicho paciente, b) comparar dicha abundancia de ARNm de IL-10 con un control,

c) identificar a dicho paciente como susceptible de responder o no responder a la inmunoterapia en base a la comparación con el control,

en el que dicha muestra de sangre completa se toma antes del comienzo de la inmunoterapia y en el que dicha inmunoterapia comprende la administración de un alérgeno de ácaros de polvo doméstico a dicho paciente con el fin de tratar la alergia a los ácaros del polvo doméstico,

en el que la etapa c) se realiza:

(i) determinando que el paciente es susceptible de responder a la inmunoterapia si el control se obtiene de un sujeto que responde al tratamiento, o de un grupo de sujetos que responden al tratamiento, que se sabe que responden a dicha inmunoterapia, y si la abundancia de ARNm de IL-10 en la muestra del paciente es igual o superior al nivel de expresión en el control; o

(ii) determinando que el paciente es susceptible de responder a la inmunoterapia si el control se obtiene de un sujeto que no responde al tratamiento, o de un grupo de sujetos que no responden al tratamiento, y si la abundancia de ARNm de IL-10 en la muestra del paciente es superior al nivel de expresión en el control; o

(iii) determinando que el paciente es susceptible de responder a la inmunoterapia si el control se obtiene de un grupo de sujetos seleccionados aleatoriamente, y si la abundancia de ARNm de IL-10 en la muestra del paciente es superior al nivel de expresión en el control.

2. Un procedimiento para seleccionar un paciente alérgico a los ácaros del polvo doméstico para inmunoterapia, cuyo procedimiento comprende las etapas de:

a) medir la abundancia de ARNm de IL-10 en una muestra de células de sangre completa de dicho paciente; b) comparar dicho nivel de expresión con un control;

c) seleccionar o rechazar a dicho paciente para inmunoterapia en base a la comparación con el control;

en el que dicha muestra de células de sangre completa se toma antes del comienzo de la inmunoterapia y en el que dicha inmunoterapia comprende la administración de un alérgeno de ácaros del polvo doméstico a dicho paciente con el fin de tratar la alergia a los ácaros del polvo doméstico, en el que la selección o el rechazo de dicho paciente para inmunoterapia en base a la comparación con el control se realiza:

(i) si el control se obtiene de un sujeto que responde al tratamiento o de un grupo de sujetos que responden al tratamiento que se sabe que responden a dicha inmunoterapia, seleccionando al paciente para inmunoterapia si la abundancia de ARNm de IL-10 en la muestra del paciente es igual o superior al nivel de expresión en el control; (ii) si el control se obtiene de un sujeto que no responde al tratamiento o de un grupo de sujetos que no responden al tratamiento, seleccionando al paciente para inmunoterapia si la abundancia de ARNm de IL-10 en la muestra del paciente es superior al nivel de expresión en el control; o

(iii) si el control se obtiene de un grupo de sujetos seleccionados aleatoriamente, seleccionando al paciente para inmunoterapia si el nivel de expresión de dicha IL-10 en la muestra del paciente es superior al nivel de expresión en el control.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que un sujeto que responde al tratamiento presenta al menos 10 % de mejora en los síntomas clínicos de alergia a los ácaros del polvo doméstico y un sujeto que no responde al tratamiento presenta menos de 10 % de mejora en los síntomas clínicos de alergia a los ácaros del polvo doméstico.

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho ARNm de IL-10 consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1.

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la inmunoterapia comprende la administración de un alérgeno de ácaros del polvo doméstico a una superficie mucosa, preferentemente una superficie sublingual, oral, nasal, bucal, ocular, rectal, vaginal, pulmonar o auricular, o la administración de alérgeno por vía subcutánea, intranasal, transdérmica, intralinfática o epicutánea.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha inmunoterapia comprende la administración de un extracto de alérgeno de ácaros del polvo doméstico.

7. Un alérgeno de ácaros del polvo doméstico para uso en un procedimiento para inmunoterapia de la alergia a los ácaros del polvo doméstico en un paciente que ha sido seleccionado para inmunoterapia, en el que la selección del paciente para inmunoterapia se realiza aplicando el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

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