CN111443206B - 一种与儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗相关的生物标志物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗相关的生物标志物及应用，所述生物标志物为角蛋白1，还公开了所述生物标志物在制备辅助筛选儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗患者的试剂、试剂盒、试纸或芯片中的应用；本发明填补了目前仍缺乏可常规用于免疫治疗患者筛选及疗效预判的生物标志物的空白，所述生物标志物与儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗密切相关，有利于精准选择适合于特异性免疫治疗的患儿，避免疗效欠佳患儿进行免疫治疗造成经济损失及身体的伤害，具有极大的应用意义和经济价值。

Description

一种与儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗相关的生物标志 物及应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种与儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗相关的生物标志物及应用。

背景技术

支气管哮喘是儿童期最常见的慢性疾病，其病程长易反复，严重影响儿童的身心健康，给患儿家庭以及社会造成巨大的精神和经济负担。支气管哮喘是一种复杂的气道疾病，是由环境因素、免疫因素、遗传因素多种因素共同作用导致的慢性气道炎症及气道重构。其中过敏原是哮喘发生相关的独立危险因素，而尘螨相关性的支气管哮喘为最常见的哮喘类型。变应原特异性免疫治疗是唯一可改变过敏性疾病自然进程的对因疗法，变应原特异性免疫治疗主要包括SCIT(皮下免疫治疗)和舌下免疫治疗。SCIT包括逐渐增加对过敏受试者的过敏原疫苗数量，诱导免疫耐受，以降低症状严重程度，减少药物治疗干预的需要，从而达到根本治愈，最终提高生活质量；但该治疗花费高、疗程长，给儿童及家庭带来身体和经济负担。但在临床应用中发现并非所有患儿均可取得满意疗效。因而，临床上寻找与尘螨相关性哮喘皮下特异性免疫治疗效果相关的生物分子标志物为一个迫切的需求。

近年来，生物医学界一直在寻找免疫治疗生物分子标志物，因为支气管哮喘的发病机制及特异性免疫治疗的作用机制没有研究清楚，大多学者集中在通过特异性IgE、tIgE、特异性IgG抗体、嗜碱性粒细胞、血清抑制性IgE、细胞因子及趋化因子等来筛选支气管哮喘患儿免疫治疗疗效的特异性生物分子标志物。然而，到目前为止，尚缺乏可常规用于免疫治疗患者筛选及疗效预判的生物标志物以及检测方法，因此为了精准选择特异性免疫治疗的患儿，避免疗效欠佳患儿进行免疫治疗造成经济损失及身体的伤害，我们需要继续努力寻找免疫治疗患者筛选及疗效预判的生物标志物，这将具有极大的临床意义和经济效益。

可见，现有技术还有待改进和提高。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供与儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗相关的生物标志物及应用，旨在解决目前仍缺乏可常规用于特异性免疫治疗患者筛选的生物标志物以及应用。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种与儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗相关的生物标志物，所述生物标志物为角蛋白1。

一种与儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗相关的的生物标志物，在制备辅助筛选儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗患者的试剂、试剂盒、试纸或芯片中的应用；所述试剂、试剂盒、试纸或芯片能对所述的生物标志物进行特异性识别和/或定量。

有益效果：

本发明提供了一种与儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗相关的生物标志物，还提供了所述生物标志物在制备辅助筛选儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗患者的试剂、试剂盒、试纸或芯片中的应用；填补了目前仍缺乏可常规用于免疫治疗患者筛选及疗效预判的生物标志物的空白，所述生物标志物与儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗密切相关，有利于精准选择适合于特异性免疫治疗的患儿，避免疗效欠佳患儿进行免疫治疗造成经济损失及身体的伤害，具有极大的应用意义和经济价值。

附图说明

图1为本发明提供的各组间血清蛋白同位素标记相对和绝对定量法测序结果及差异表达分析图。

图2为本发明提供的实验设计和工作流程示意图。

图3为本发明提供的PPI(蛋白质-蛋白质相互作用)网络和MCODE(分子复合物检测)组分与-治疗组与对照组和+治疗组与对照组的差异表达蛋白图。

图4为本发明提供的-治疗组与对照组差异表达蛋白的PPI网络STING(检索相互作用基因/蛋白质的搜索工具)分析。

图5为本发明提供的+治疗组与对照组差异表达蛋白的PPI网络STING分析。

图6为本发明提供的用Western blot(免疫印迹法)的方法验证蛋白组学的结果图。

图7为本发明提供的ELISA(酶联免疫吸附测定技术)再次验证蛋白组学结果图。

具体实施方式

本发明提供与儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗相关的生物标志物及应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下列实施例中未注明的具体实验方法，通常按照常规的方法，实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

一种筛查儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗生物标志物的方法，所述方法包括如下步骤：

S1.采集受试者样本；

S2.通过同位素标记相对和绝对定量法对受试者样本中的角蛋白1进行确定和/或定量；

S3.将步骤S2中定量得到的角蛋白1的蛋白浓度与对照组进行比较；

S4.通过免疫印迹法、酶联免疫吸附测定技术对角蛋白1进行验证。

所述方法通过采集所有受试者的样本，对离体样本中角蛋白1进行确定和定量，比较分析得出角蛋白1在儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗前后的表达显著差异，所述角蛋白1可作为与儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗患者筛选的生物标志物，填补了目前仍缺乏可常规用于免疫治疗患者筛选及疗效预判的生物标志物的空白。

一种与儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗相关的的生物标志物在制备辅助筛选儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗患者的试剂、试剂盒、试纸或芯片中的应用；所述试剂、试剂盒、试纸或芯片能对所述生物标志物进行特异性识别和/或定量。可将其用来辅助尘螨相关支气管哮喘性特异性免疫治疗的早期筛查，以弥补目前尘螨特异性免疫治疗生物标志物检测技术的空白。

研究人群：本实施例共选取尘螨相关过敏性哮喘特异性免疫治疗前、治疗后患儿各30名、对照组为30名年龄性别相匹配的正常儿童。患者来自佛山市妇幼保健院，本实验经佛山市妇幼保健院伦理委员会批准，从每位受试者的监护人处获得书面知情同意。这些患者中，关键入选标准如下：根据全球哮喘倡议(GINA)指南，患者被诊断为轻度或中度过敏性哮喘；年龄在4-14岁之间。所有患者均对HDM过敏原敏感；通过阳性皮肤点刺试验(SPT)和/或血清特异性IgE水平＞2级来测量，以及接触高密度脂蛋白引起的过敏性哮喘症状。当过敏原引起的风团大小大于或等于组胺引起的风团大小时，测定SPT对过敏原的阳性率。特异性IgE的临界值为0.35KU/l被视为阳性结果(1级，0.35-0.7KU/l；2级，0.7-3.5IU/l；3级，3.5-17.5IU/l；4级，17.5-50IU/l；5级，50-100IU/l；6级，＞100IU/l)。如果患者患有以下情况将被排除：i)严重或不受控制的哮喘的；ii)由于任何其他过敏原因(包括猫/狗皮屑、青蒿花粉和真菌)使特异性IgE水平<0.7IU/l的；Ⅲ)有先天性心肺疾病、恶性肿瘤、支气管扩张病史，慢性鼻窦炎或可能影响预后评估的心理或神经疾病的；iv)同时接受β-阻滞剂或血管紧张素转换酶抑制剂治疗的。

在这些患者中，30名儿童在未经免疫治疗的情况下首次诊断为HDM相关过敏性哮喘，标记为“-治疗组”，30名儿童在接收SCIT治疗3年后表现出良好的HDM相关过敏性哮喘控制，并标记为“+治疗组”。接受SCIT治疗的患者在整个SCIT过程中也接受了对照治疗，如吸入性皮质类固醇、吸入性长效β2激动剂，或抗白三烯(根据GINA指南)。分别测定并记录每个个体样本的哮喘综合征评分(ASS)、药物总评分(TMS)、血清总(t)IgE、HDM特异性(s)IgE、嗜酸性粒细胞计数、SPT和肺功能，具体测定数据请参阅表1。

方法：

血清样本制备：所有受试者的血液样品采集后，经1000×g离心10min分离血清，血清放置在-80℃冰箱保存待后续处理。使用血清高丰度蛋白去除试剂盒(Sigma-Aldrich；Merck KGaA)处理血清样品以去除白蛋白和免疫球蛋白G(IgG)。使用Bradfor蛋白浓度测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Inc.)确定每个样品中蛋白质的浓度。然后将血清样本随机分为两组，每组包括三组(对照组、-治疗组和+治疗组)。一组随后使用iTRAQ(同位素标记相对和绝对定量法)进行筛查，寻找尘螨过敏的哮喘患者SCIT治疗前、治疗后及正常对照组血清差异表达蛋白，另一组则通过Western blot(免疫印迹法)及Elisa(酶联免疫吸附测定)进行验证分析。

蛋白质鉴定及分析：用100微克的三(2-羧乙基)膦盐酸盐还原剂(SCIEX)在60℃下1h还原每个蛋白质样本，并在室温下与甲基硫磺酸甲酯半胱氨酸阻滞剂(SCIEX)烷基化30分钟。然后，蛋白质由2％胰蛋白酶(Promega公司)在37℃下以1:50(酶：底物)的比例消化过夜。每个样品都贴上标签，然后在真空离心机中以6000x g的速度在25℃下离心4小时。

在上高效液相色谱之前(泵型号：LC-20AD，岛津公司，色谱柱：

μm NX-C18 110A、150x 2.00mm Phenomenex柱)，首先用H₂O缓冲液(NH3+H2O，pH 10.0)将标记的样品稀释至100微升。采用H₂O(流动相A)和80％乙腈(流动相B)进行反相柱分离，流速为0.2ml/min，梯度系统参数为：5-10％B，时间为0-10min；10-40％B，时间为10-60min；40-95％B，时间为60-65min；95％B，时间为65-75min。然后在214/280nm处通过吸光度监测洗脱，每50秒收集一次，收集每个样品的组分，并在真空离心条件下，通过6000x g离心在25℃下脱水4h。用流动相A(0.1％甲酸)和5-40％流动相B(0.1％甲酸和80％乙腈)分离肽99min(流速为0.3ml/min)。在质谱仪上进行，利用版本4.5ProteinPilot^TM软件(SCIEX)对人类蛋白质数据库进行原始质谱数据搜索。搜索参数设置为“cys烷基化”和“甲硫磺酸甲酯”，另外允许“消化”和“胰蛋白酶”，错误发现率设置为<0.01。

Western blot分析：第二组患者的蛋白质用4体积丙酮储存过夜以获得沉淀蛋白。沉淀蛋白随后在裂解缓冲液(Beyotime Institute of Biotechnology)中裂解，并使用Bradford蛋白检测试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Inc.)测量蛋白质浓度。用25微克蛋白质经10-15％SDS-PAGE电泳后，将分离的蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜(PVDF)(Sigma-Aldrich；Merck-KGaA)上，并在室温下用5％脱脂乳封闭2小时。然后用抗角蛋白(KRT)1，载脂蛋白(APO)B，纤维连接蛋白1(FN1)，抗凝血酶Ⅲ(SERPINC1)，a-1-抗胰蛋白酶(SERPINA1)和β-肌动蛋白的原代抗体(1:1000；均购自Abcam)在4℃下过夜孵育。随后，在室温下将辣根过氧化物酶结合山羊抗兔IgG(1:2000；Abcam)涂在经抗体处理的PVDF膜上2小时。用SuperSignal观察这些膜上的特异性条带化学发光HRP底物(Promega公司)。使用ImageJ软件(2.0版)对能带强度进行量化。

ELISA：根据制造商的方案，用相应的ELISA试剂盒测定血清角蛋白1(KRT1)、载脂蛋白B(APOB)、纤维粘连蛋白1(FN1)、抗凝血酶Ⅲ(SERPINC1)和α-1-抗胰蛋白酶(SERPINA1)蛋白的浓度。用酶联免疫吸附测定仪在450nm处测定吸光度。所有样本分析一式三份，计算每个病人的蛋白平均浓度。

差异表达蛋白的功能分布分析

通过进化关系(PANTHER)数据库进行蛋白质分析，对差异表达的蛋白质家族和亚家族进行聚类，并使用在线工具Metascape(http://Metascape.org)对功能基因本体(GO)项进行分析。富集分析包括“生物过程”、“细胞成分”、“分子功能”和京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径。以基因组中的所有基因为富集背景。蛋白质之间的关联也可以通过使用由Metascape数据库生成的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络来确定，并在Cytoscape(3.7.1版)中可视化。Metascape工具使用分子复合物检测(MCODE)算法来识别蛋白质-蛋白质相互作用的紧密连接网络。

基因/蛋白质相互作用数据库(STRING)PPI分析

使用版本11的数据库(https://STRING-db.org)建立了所识别蛋白质的关联网络，其置信度最高(0.9)。此外，根据候选蛋白的PPI连接度来选择候选蛋白，这是网络重要性的粗略表示。这些蛋白可能是具有重要生理调节功能的核心蛋白或关键候选基因。

统计分析：数据用SPSS统计软件(19.0版；IBM公司)进行分析，实验至少采用3次重复实验，实验数据以平均值±标准差的方式表示。描述性参数在表一中以中位数和四分位间距表示。t检验用于比较实验值与正态分布和齐次方差。当实验室值不是正态分布或非均匀分布时，使用Mann-Whitney U检验。采用Shapiro-Wilk正态性检验和Levene均一性检验对Western blotting和ELISA验证数据的正态分布和方差均一性进行评价。根据Levene试验结果，采用方差分析或Welch检验分析多组(对照组、-治疗组和+治疗组)蛋白质表达水平的差异。Dunnett's试验或Dunnett's T3试验用于特殊配对比较(对照组和-治疗组或对照组和+治疗组)。P＜0.05表示有统计学意义的差异。

结果：

HDM哮喘患者和正常儿童的临床特征、人口情况特征见表一。每组受试者均为性别和年龄匹配。SCIT治疗后，根据ASS评分，过敏患者的症状明显减轻，从治疗前的10.00分下降到治疗后的1.00分。同样地，药物的使用显著降低了症状，由治疗前的3.00分下降到SCIT治疗后的0.00分。SCIT治疗后嗜酸性粒细胞计数也明显下降。从治疗开始到SCIT后3年，tIgE和sIgE水平略有下降，但不明显。肺功能参数(一秒用力呼气量(FEV1％)和最大肺活量)显示SCIT治疗后有显著改善，有助于特异性免疫治疗患者疗效判断。

差异表达蛋白的鉴定：通过iTRAQ技术，在健康儿童和-治疗组或健康儿童和+治疗组之间共鉴定出72个差异表达蛋白(定义：在-治疗组或+治疗组中至少有一个组与对照组的倍数变化率大于1.5)，这些蛋白质的标准倍数变化如图1所示。与对照组相比，-治疗组和+治疗组分别鉴定出33种(上调19种，下调14种)和57种(上调12种，下调44种)表达差异显著的蛋白质(表二和表三)。

差异表达蛋白的功能分析：

根据MCODE方法，识别出四个蛋白质亚簇，如图3B所示(MCODE1、MCODE2、MCODE3和MCODE4)；每个簇中的蛋白质共享相同的GO项和KEGG路径。簇MCODE1包括APOC2、APOE、APOB、APOA4、APOC3和APOA1。簇MCODE2包括补体成分5、维生素E、补体8γ、补体成分9和补体成分7。簇MCODE3包括KRT10、KRT2、KRT1和血管细胞粘附分子1。最后，MCODE4簇包括纤维蛋白原b链(FGB)、脂蛋白A和FN1。这些蛋白质需要进一步的筛选和分析。

STRING PPI网络分析：

接下来，利用-治疗组(图4)和+治疗组(图5)中差异表达蛋白质的STRING数据构建PPI网络，这些数据使主要蛋白质在PPI网络中得以测定。在-治疗与对照分析中，30/33差异表达蛋白被过滤以形成PPI网络复合物(图4A)。网络包含30个节点和34个边。在30个节点中，前10个连接最紧密的PPI节点被选为中枢蛋白。这些中枢蛋白是APOB、FN1、APOA1、APOE、SERPIND1、a-胰蛋白酶抑制剂重链2(ITIH2)、APOA4、FGB、APOC3和纤溶酶原(图4B)。APOB显示了这个PPI网络中最高的网络连接性。在+治疗与对照的比较中，54/57差异表达的蛋白质被过滤以形成PPI网络复合物(图5A)。PPI网络包含54个节点和117个边。在这些节点中，主要的枢纽蛋白是APOA1、APOB、补体C4A(C4A)、FGA、FN1、激肽原1(KNG1)、SERPINA1、SERPINC1、铜蓝蛋白和ITIH2(图5B)。因此，APOB在这个PPI网络中具有第二高的连接度。

与对照组相比，-治疗组和+治疗组中所有差异表达蛋白的蛋白节点形成了更全面的PPI网络复合物(图2)。这个综合网络包含68个节点和188个边，前十位的枢纽蛋白是C4A、APOA1、FGA、FN1、KNG1、APOB、APOE、SERPINA1、SERPINC1和SERPIND1。KRT1不是一个顶级PPI网络连接蛋白，而是一个MCODE-中枢蛋白(图3B)，表达有显著差异；它在气道上皮细胞的再生、炎症和应激反应途径中起着重要作用。基于以上结果，作为候选蛋白的KRT1、APOB、FN1、SERPINC1和SERPINA1在表达上表现出明显的差异，被选为进一步验证的候选蛋白。

所述候选蛋白中角蛋白1(KRT1)是一种细胞骨架相关的II型角蛋白，在本发明中，与对照组相比，-治疗组的KRT1水平增加了3倍，而根据iTRAQ(同位素标记相对和绝对定量法)鉴定，+治疗组的KRT1水平略有下降；Western blot(免疫印迹法)分析和ELISA(酶联免疫吸附测定)检测证实了该结果。载脂蛋白B(APOB)是一种参与脂蛋白转运的载脂蛋白，与胆固醇代谢有关，本发明发现，与对照组相比，-治疗组和+治疗组的APOB表达下调。纤维结合蛋白1(FN1)是一种参与细胞粘附和迁移的纤维腺瘤蛋白，它能影响伤口愈合和宿主免疫过程，本实施例通过iTRAQ分析和ELISA检测发现，HDM(粉尘螨和屋尘螨)相关哮喘组(-治疗组和+治疗组)FN1表达较对照组升高，但Western blot分析结果显示FN1表达无显著性差异。这表明FN1在HDM相关哮喘患者中可能表现出高度异质性。抗凝血酶Ⅲ(SERPINC1)属于丝氨酸蛋白酶家族，编码一种血浆蛋白酶抑制剂，在凝血调节中起关键作用；在本发明中，通过iTRAQ分析、Western blot分析和ELISA验证，与对照组相比，+治疗组的SERPINC1水平显著降低。α-1-抗胰蛋白酶(SERPINA1)编码一种丝氨酸蛋白酶抑制剂a-1抗胰蛋白酶(ATT)，可使中性粒细胞中的弹性蛋白酶、蛋白酶3和组织蛋白酶G失活，保护下呼吸道和肺部免受这些蛋白酶的攻击；在本发明中，与对照组相比，+治疗组的SERPINA1略微下调，证实SERPINA1与HDM相关哮喘的发生有关。

用Western blot分析和ELISA验证候选蛋白。为验证基于iTRAQ的蛋白质组学分析结果，用Western blot和ELISA检测了几种候选蛋白的表达水平。(图6A)Western blot分析用于验证来自对照，-治疗组、+治疗组的5种蛋白质(KRT1，APOB，FN1，SERPINC1和SERPINA1)表达；β-actin作为内参。Western blot分析的直方图(图6B)。对照组显示为灰色，-治疗组为蓝色，+治疗组为棕色。数据表示为平均值±标准偏差。对照组与-治疗组、+治疗组的多重比较检验是使用Dunnett检验进行的方差分析进行的。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001。Western blot分析结果显示，+治疗组和-治疗组的APOB和SERPINC1表达水平明显低于对照组。与对照组相比，+治疗组中SERPINA1表达明显下调，而-治疗组则无明显下调。与对照组比较，-治疗组中KRT1表达上调，与+治疗组比较无显著性差异。-治疗组FN1的表达略高于+治疗组和对照组，但差异不显著(图6)。酶联免疫吸附试验进一步证实了KRT1、APOB、FN1、SERPINC1和SERPINA1的相同表达变化(图7)。图7中，对照组以灰色显示，-治疗组以蓝色显示，+治疗组以棕色显示。数据表示为平均值±标准偏差。根据方差同质性的结果，使用带有Dunnett的ANOVA或带有Dunnett的韦尔奇(Welch)的T3检验，进行对照组与-治疗组以及对照组与+治疗组的多重比较测试。结果显示，除KRT1(ANOVA统计数据)外，APOB，FN1，SERPINC1和SERPINA1的方差不均一。使用Welch检验分析数据。与对照相比，*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001。

表1.HDM相关性哮喘患者与正常儿童的临床特征、人口情况特征值

HMD：屋尘螨；TMS：药物总评分(从0分到6分，根据总药物摄入量按4分量化评定：0分，不服药；1分，服用抗组胺药或吸入性β2激动剂；2分，局部服用皮质类固醇；3分，口服皮质类固醇)；ASS：哮喘综合征评分(按4种哮喘症状总分计算，0～12分)；^aaP＜0.01为与对照组相比；^bP＜0.01、^bbP＜0.01为与-治疗组相比。

表2.用同位素标记相对和绝对定量技术鉴定-治疗组样品和对照组样品之间差异表达的蛋白质。

表3.用同位素标记相对和绝对定量技术鉴定+治疗组样品和对照组样品之间差异表达的蛋白质。

综上所述，本发明通过提供一种与儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗相关的生物标志物、应用及筛选方法，达到了如下优点：

1、为尘螨相关过敏性哮喘的特异性免疫治疗提供了患者筛选及疗效预判的生物标志物、检测方法，将有助于特异性免疫治疗患者筛选及疗效预判，可降低接受了免疫治疗而治疗效果欠佳患者的家庭经济负担和身体负担，具有临床指导意义。

2、本发明显示了尘螨相关的支气管哮喘在皮下特异性免疫治疗前后蛋白质谱发生明显变化，寻找到了皮下特异性免疫治疗前后变化的蛋白分子作为免疫治疗相关的生物分子标志物，将其应用于相关的试剂、试剂盒、试纸或芯片中对血清中KRT1表达量进行定量测定，可将其用来辅助尘螨相关支气管哮喘性特异性免疫治疗的早期筛查，以弥补目前尘螨特异性免疫治疗生物标志物检测技术的空白。

3、本发明使用了尘螨相关支气管哮喘患儿血清KRT1作为生物分子标志物，筛选发现KRT1在特异性免疫治疗前后有明显差异，该标志物未在现有技术中的其他涉及哮喘特异性免疫治疗相关生物分子标志物及其相关诊断试剂盒中出现。本发明检测患儿血清中的KRT1，在定量测定方面的定量精度和灵敏度非常高。

4、本发明筛选了单个蛋白质生物分子标志物，就能够有效用于皮下特异性免疫治疗患儿的筛查及疗程，是一种简单、低成本的检测方法。相比于多个指标，该标志物稳定、可靠、重复性好，从而达到更好的检测效果，实验操作性和时效性都更好。而且本发明的检验方案是使用样品中稳定内源参考基因β-actin进行标准化定量，能够完全消除了因为取样方法、操作人员操作不精准等带来的误差，因而稳健性比传统方法好很多，便于低成本大规模推广应用。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种在制备辅助筛选儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗患者的试剂、试剂盒、试纸或芯片中的应用，其特征在于，与儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗相关的生物标志物为角蛋白1；所述试剂、试剂盒、试纸或芯片能对所述生物标志物进行特异性识别和/或定量；所述儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗患者为接受SCIT治疗3年的患者；

其中，所述生物标志物的构建过程包括通过同位素标记相对和绝对定量法确定儿童尘螨相关性哮喘特异性免疫治疗患者血清样本中的候选生物标志物，通过免疫印迹法、酶联免疫吸附测定技术对候选生物标记物进行验证；

所述候选生物标志物为角蛋白1、载脂蛋白B、纤维结合蛋白1、抗凝血酶Ⅲ、α-1-抗胰蛋白酶；所述候选生物标志物的蛋白浓度与对照组候选生物标志物的蛋白浓度的倍数变化率大于1.5。

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