JP5848243B2 - デングウイルスに対する免疫原性組成物 - Google Patents

Description

（優先権）
本出願は、２００９年６月１日に出願された米国仮特許出願第６１／１８３，０２０号の米国特許法§１１９（ｅ）の下での利益を主張する。この仮特許出願は、本明細書においてその全体が参照として援用される。

（分野）
本発明の実施形態は、デングウイルスに対して、ワクチンを被験体に投与するための組成物および方法を報告する。いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、皮内注射によって投与され得る。特定の実施形態において、デングウイルスに対するワクチンの被験体における皮内注射は、最初のワクチン接種後の１回以上の皮内ブーストを含み得る。他の実施形態は、デングウイルスに対するワクチン組成物の皮内注射を含み、ここで上記組成物は、デングウイルスの１より多くの血清型（例えば、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４）に対する防御を提供する。

（背景）
ウイルス感染に対する防御のためのワクチンは、ヒト疾患の発生率を低下させるために効果的に使用されてきた。ウイルスワクチンで最も成功している技術のうちの１つは、動物もしくはヒトを、上記ウイルスの弱毒化株（ｗｅａｋｅｎｅｄ ｏｒ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ）（「生の弱毒化ウイルス」）で免疫することである。免疫後の制限された複製に起因して、上記弱毒化株は、疾患を引き起こさない。しかし、上記制限されたウイルス複製は、ウイルス抗原の完全なレパートリーを発現するには十分であり、上記ウイルスに対する強力かつ長期間持続する免疫応答を発生させ得る。従って、上記ウイルスの病原性株にその後に曝露されると、上記免疫された固体は、疾患から防御される。これら生の弱毒化ウイルスワクチンは、公衆衛生において最も成功裏に使用されているワクチンの中のものである。

（要旨）
本発明の実施形態は、一般に、例えば、デングウイルスに対してワクチンをヒトに投与することによって、デングウイルスに対する被験体の防御を誘導するための方法および組成物に関する。いくつかの実施形態は、皮内（ＩＤ）注射を介して、被験体にワクチン組成物を導入する工程を包含し得る。これら実施形態によれば、上記ワクチン組成物は、例えば、１種以上のデング血清型に対して防御する（例えば、交差防御）ために、被験体の皮内に導入され得る。特定の実施形態において、ワクチン組成物は、被験体に投与される、デングウイルスのうちの１種の血清型（例えば、ＤＥＮＶａｘ ４）の単一用量が挙げられ得るが、これらに限定されない。他の実施形態において、ワクチン組成物は、デングウイルスのうちの１種の血清型（例えば、ＤＥＮＶａｘ ４もしくは他の血清型）の初期用量を含み得るが、これらに限定されず、次いで、同じものの１回以上のブースト、組み合わせもしくは異なる血清型が、被験体に投与され得る。

本明細書における他の局面は、例えば、ワクチン組成物を、皮内導入を介して被験体に導入することによって、被験体における細胞性免疫応答を誘導することに関し得る。ここで上記ワクチン組成物は、デングウイルスワクチンを含むが、これに限定されない。これら実施形態によれば、開示される組成物は、デングウイルス血清型に対する被験体における中和抗体生成を調節するために、上記被験体に皮内投与され得る。いくつかの局面は、所定の組成比（例えば、１：１、１：２、１：４）に関し、２種以上の血清型の任意の比は、上記被験体が単一のワクチン組成物を皮内に投与される場合に、いくつかのもしくは全てのデングウイルス血清型に対する被験体の交差防御を増大させるために、単一のワクチン組成物における、デングウイルスの種々の血清型もしくはそれらのフラグメントまたはこれらの弱毒化組成物を企図する。

特定の実施形態において、デングウイルスに対するワクチンの皮内導入を使用するいくつかの利点としては、被験体におけるいくつかのもしくは全てのデングウイルス血清型に対する複数の防御、皮下注射と比較して低用量を使用することによるコストの低下、被験体におけるいくつかのもしくは全てのデングウイルス血清型に対して生成される抗体の調節、およびデングウイルスに対するワクチンの組成物を投与した被験体における投与部位での疼痛の低下が挙げられ得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、デングウイルスに対する単回用量ワクチンは、１種以上のデングウイルス血清型を含み得る。これら実施形態によれば、被験体は、最初の注射とは別個の部位において（例えば、その近くもしくは上記被験体の別個の解剖学的部位において）投与される少なくとも１回のさらなる皮内注射で処置され得る。さらに、少なくとも１回のさらなる皮内注射は、上記被験体への最初の投与後３０日未満で行われ得る。本明細書で開示されるこれらおよび他の実施形態のワクチン組成物は、所定の比において２種以上のデングウイルス血清型を含み得る。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、特定の実施形態をさらに示すために含められる。いくつかの実施形態は、これら図面のうちの１つ以上への言及によって、単独で、もしくは示される具体的実施形態の詳細な説明と組み合わせて、よりよく理解され得る。
図１は、現在利用可能な皮内注射デバイスの例を示す。 図２は、デングウイルスに対するワクチンを皮内導入した被験体における注射部位の例を示す。 図３は、デングウイルスに対するワクチンの皮下注射 対 皮内注射の棒グラフ比較および最初の投与後の異なるデングウイルス血清型に対して生成される中和抗体力価を示す。 図４は、デングウイルスに対するワクチンの皮下注射 対 皮内注射の棒グラフ比較、および２回目のブースト投与後の異なるデングウイルス血清型に対して生成された中和抗体力価を示す。 図５は、デングウイルス血清型に対するワクチンでのマウスにおける皮下免疫および皮内免疫のヒストグラムプロットを示す。 図６Ａおよび図６Ｂは、デング血清型に対して２種の異なるデングウイルス血清型を使用するチャレンジ実験（別のデングウイルス血清型での上記マウスのワクチン接種後の免疫マウス集団）のグラフ描写を示す。

（定義）
本明細書で使用される場合、「１つの、ある（ａ）」もしくは「１つの、ある（ａｎ）」とは、１つもしくは１つより多くの事項を意味し得る。

本明細書で使用される場合、容器は、試験管、ミニ遠心分離チューブもしくはマイクロ遠心分離チューブ、チャネル、バイアル、マイクロタイタープレートもしくは容器を含み得るが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「被験体（単数）（ｓｕｂｊｅｃｔ））」もしくは「被験体（複数）（ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」は、哺乳動物（ヒトもしくは家畜化されたもしくは野生の哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、他の家庭のペット（例えば、ハムスター、モルモット、マウス、ラット）、フェレット、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、プレーリードッグ、もしくは動物園の動物）を含み得るが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「約」とは、±１０％を意味し得る。

本明細書で使用される場合、「弱毒化ウイルス」とは、被験体（例えば、哺乳動物（例えば、ヒトもしくは動物）に投与された場合に、疾患の臨床的徴候が低下しているかもしくはないことを示すウイルスを意味し得る。

（説明）
以下の節において、種々の例示的組成物および方法は、種々の実施形態を詳述するために記載される。上記種々の実施形態の実施が、本明細書で概説される具体的詳細のうちの全てもしくはさらにいくつかの使用を必要とするのではなく、むしろ濃度、時間および他の具体的詳細が、慣用的な実験を介して改変され得ることは、当業者に明らかである。いくつかの場合には、周知の方法もしくは成分は、説明に含めなかった。

本発明の特定の局面は、デングウイルスに対するワクチン組成物の投与を含むが、これらに限定されない。

本発明の実施形態は、一般に、デングウイルス血清型に対する被験体における防御を誘導するための方法および組成物に関する。他の実施形態は、皮内（ＩＤ）注射を介して被験体にワクチン組成物を導入することを包含し得る。ここで皮内に導入される上記ワクチン組成物は、いくつかもしくは全てのデング血清型に対する交差防御を誘導する。特定の実施形態において、上記ワクチン組成物は、被験体に投与されたデングウイルス血清型４（ＤＥＮＶａｘ ４）に対するワクチンの単一用量を含む。他の実施形態において、上記ワクチン組成物は、ＤＥＮＶａｘ ４の最初の用量を含み、次いで、上記ワクチンの１回以上のブーストが、被験体に投与される。

本発明の他の局面は、被験体へ皮下に投与されるのと比較して、皮内に投与されたデングウイルスに対するワクチンに対する免疫応答を調節することを包含する。デングウイルスに対するワクチンは、デングウイルスの血清型の比、生の弱毒化デングウイルス、もしくはこれらのフラグメント（例えば、デングウイルス血清型に由来するかもしくはこれらから得られたタンパク質もしくは核酸）を含む組成物を含み得る。種々の血清型の比は等しくてもよいし、特定の血清型が、必要性もしくは上記ウイルスへの曝露もしくは潜在的曝露に依存して、他のものより多く提示され得る。これら実施形態によれば、比は、例えば、上記処方物において提示される血清型の数、所定の応答および所望される効果に依存して、１：２、１：３、１：４、１：１０、１：２０；１：１：１、１：２：２、１：２：１、１：１：１：１、１：２：１：２；１：３：１：３、２：３：３：３、５：４：５：５、１：２：２、または血清型１、２、３および／もしくは４のうちのいずれかの任意の比であり得る。任意のデングウイルス血清型処方物は、必要な被験体への皮内投与において有用なワクチン（例えば、弱毒化ウイルスなど）を生成するために使用され得ることが企図される。いくつかの処方物は、他の処方物以外に皮内に導入された場合に他のものより有効であり得ることが企図される。

他の実施形態において、デングウイルスワクチン処方物の組成物は、上記被験体によるデングウイルスへの曝露の前に、その間に、もしくはその後に、被験体へ皮内に導入され得る。これら実施形態によれば、被験体は、デングウイルス処方物を含む単一の皮内注射もしくは１回より多い注射、必要に応じて、続いて、１回以上のさらなる注射を受容し得る。本明細書に記載される処方物の皮内適用は、被験体への任意の他の抗ウイルス処置もしくはワクチンの投与様式（例えば、皮下注射）と組み合わされ得る。いくつかの実施形態において、本明細書で企図された処方物の皮内導入は、被験体の身体（例えば、腕、臀部など）の任意の適切な領域に投与され得ることが企図される。さらに、初回投与もしくはブースト投与としての本明細書中のワクチン処方物の皮内投与は、同日に起こってもよいし、連続した日に起こってもよいし、１週間に１回、１ヶ月に１回、１ヶ月に２回、もしくは他の適切な処置レジメンで起こってもよい。

（方法）
（核酸増幅）
核酸は、任意の処方物において使用され得るか、または本明細書で企図される任意の処方物を生成するために使用され得る。増幅用テンプレートとして使用される核酸配列は、標準的な方法論によれば、単離されたウイルス（例えば、デングウイルス）であり得る。核酸配列は、ゲノムＤＮＡであってもよいし、フラグメント化されたＲＮＡであっても、全細胞ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡが使用される場合、上記ＲＮＡを相補的ｃＤＮＡへ変換することが望ましいことであり得る。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、全細胞ＲＮＡであり、増幅用テンプレートとして直接使用される。核酸分子を増幅するための当該分野で公知の任意の方法が企図される（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、Ｑｂｅｔａレプリカーゼなど）。

（発現されるタンパク質もしくはペプチド）
遺伝子は、任意の数の異なる組換えＤＮＡ発現系において発現されて、その大量のポリペプチド生成物を生成し得、上記ポリペプチド生成物は、次いで、精製され得、本明細書で報告される方法および組成物において使用され得る。構築物を生成および使用するための当該分野で公知の任意の方法が、企図される。特定の実施形態において、１種以上のポリペプチドをコードする遺伝子もしくは遺伝子フラグメントが、当該分野で公知の標準的なクローニング技術もしくはサブクローニング技術によって発現ベクターへと挿入され得る。

タンパク質、ペプチドおよび／もしくは抗体、またはこれらのフラグメントは、当該分野で公知の任意の手段によって検出もしくは分析され得る。特定の実施形態において、分子を分離および分析するための方法が使用され得る（ゲル電気泳動もしくはカラムクロマトグラフィー法）。

（電気泳動）
電気泳動は、分子（例えば、高分子（例えば、タンパク質もしくは核酸））をそれらのサイズおよび電荷に基づいて分離するために使用され得る。当該分野で公知の電気泳動には、多くのバリエーションがある。上記分子が移動する溶液は、遊離していてもよい（通常は、キャピラリーチューブ中にある）し、当該分野で公知のマトリクスもしくは他の材料中に埋め込まれていてもよい。一般的なマトリクスとしては、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、質量分析、ブロッティングおよび濾紙が挙げられ得るが、これらに限定されない。

ポリペプチドをコードする遺伝子もしくは遺伝子フラグメントを使用するいくつかの実施形態は、標準的なサブクローニング技術によって、発現ベクターへと挿入され得る。融合タンパク質として組換えポリペプチドを生成する発現ベクターが使用され得、このことは、ペプチドもしくはタンパク質の迅速なアフィニティー精製を可能にする。このような融合タンパク質発現系の例は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、マルトース結合タンパク質系（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）、ＦＬＡＧ系（ＩＢＩ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）、および６ｘＨｉｓ系（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）である。

（薬学的処方物）
ワクチンに関する当該分野で公知の任意の薬学的処方物は、本明細書で企図される。特定の実施形態において、処方物は、デングウイルスサブタイプもしくはその存在への所定の曝露に依存して、種々の比において１種以上のＤＥＮ血清型を含み得る。処方物が、被験体のワクチン接種において有用な他の因子（他の活性成分もしくは不活性成分または当業者に公知の組成物が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得ることが企図される。

（キット）
他の実施形態は、本明細書で記載される方法（例えば、ワクチンの適用補うもしくは投与法）および組成物で使用するためのキットに関する。いくつかの実施形態は、１種以上のデングウイルスに曝されたか、曝されたことが疑われているかもしくは曝されている被験体を予防もしくは処置するために有用なワクチン組成物を有するキットに関する。特定の実施形態において、キットは、所定の比のデングウイルス血清型の１つ以上の処方物（例えば、弱毒化ワクチン）を含み得る。キットは、携帯式であり得、例えば、輸送可能であり、軍事施設もしくは遠くの村落のような遠い地域において使用できる。他のキットは、１種以上のデングウイルスに曝されたか、もしくはデングウイルスへの曝露の危険にあると疑われた被験体を処置するために、医療施設において有用であり得る。

キットはまた、適切な容器（例えば、バイアル、チューブ、ミニ遠心分離チューブもしくはマイクロ遠心分離チューブ、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器）を含み得る。さらなる成分もしくは因子が提供される場合、上記キットは、１つ以上のさらなる容器を含み得、これら容器の中に、この因子もしくは成分が配置され得る。本明細書中のキットはまた、代表的には、商業的販売のために密に拘束した状態で上記因子、組成物および任意の他の試薬容器を含むための手段を含む。このような容器は、射出成形プラスチック容器もしくは吹き込み成形プラスチック容器を含み得る。その中に、所望のバイアルが保持される。必要に応じて、１種以上のさらなる因子（例えば、免疫原性因子もしくは他の抗ウイルス剤、抗真菌剤もしくは抗菌剤）は、記載される組成物のために、例えば、１種以上のさらなる微生物に対するワクチンとして有用な組成物のために、必要とされ得る。

以下の実施例は、本明細書で示される特定の実施形態を実証するために含められる。以下の実施例において発見された技術が、本明細書で開示される実施において十分に機能することは発見された技術を示すことは、当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示に鑑みれば、多くの変化が、開示される特定の実施形態において行われ得、本明細書中の趣旨および範囲から逸脱することなく、同様もしくは類似の結果をなお得ることを認識するはずである。

（実施例１）
以前の研究から、各ＤＥＮ（デングウイルス）血清型による天然の感染が、同一源の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）血清型によって引き起こされるデング熱に対する長時間持続する防御をもたらすことが明らかになった。特定の実施形態において、有効なデングワクチンの投与は、天然の感染に非常に近く模倣し、デングウイルスに対するワクチンを投与するための様式として働き得る。本明細書で報告される実施形態は、輸送宿主（蚊の咬傷）による皮内送達に類似する、デングウイルス（ＤＥＮ）感染の天然の感染経路に関し得る。特定の実施形態において、上記ワクチンウイルスを同じ組織に沈着させるための皮内注射が使用され得る。皮膚は、非常に接近しやすい器官であり、表皮に存在するランゲルハンス細胞（ＬＣ）の存在に主に帰する効率的な免疫バリアを示す。皮膚免疫は、広い範囲の免疫応答（液性免疫、細胞性免疫、および粘膜免疫を含む）を誘発し、投与されたワクチンの免疫原性に対する既存の免疫の効果を出し抜く（ｂｙｐａｓｓ）可能性を有する。

四価デングワクチンの皮内（ＩＤ）投与についての、このような処置が必要な被験体におけるいくつかの実施形態が、報告される。皮内投与の１つの例示的方法を、５：５：５：５ ＤＥＮＶａｘ（デングウイルスワクチン）を皮内投与によって投与した４匹のＣｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓに対して行った。等価なウイルス用量を達成するために、０．１５ｍｌのワクチンを、針なしのジェットインジェクターを使用して、３箇所の、接近して間隔を空けた部位においてＩＤを植え付けた（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）（以下の図１および図２を参照のこと）。図１は、皮内接種のために使用される皮内注射（例えば、ＰｈａｒｍａＪｅｔ（登録商標））デバイスを表す。

図２は、ＰｈａｒｍａＪｅｔデバイスでのワクチン接種後のＣｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓの接種部位を図示する。動物に、同じ毛色で同じ処方物を６０日後にブーストした。所定の間隔（１５日目、３０日目、５８日目、７４日目、および９１日目）で血清サンプルを回収し、上記４種のデング血清型に対して指向される中和抗体の存在について試験した。ＰＲＮＴ（プラーク減少中和試験（抗ＤＥＮ中和抗体のレベルを提供するための当該分野で公知））を、同じサンプルに対して行った。

上記中和抗体力価は、初回投与後（図３を参照のこと）もしくは２回目の投与後（図４を参照のこと）のＳＣ投与と比較して、ＩＤ投与後に顕著により高いことが実証された。上記部位は、同じ領域において接近して間隔を空け、各接種物は４種全てのウイルスからなるので、このワクチン送達様式は、ＤＥＮＶａｘの単一投与に非常に似ている。図３は、５８日目（初回投与の５８日後）の５０％ＰＲＮＴ幾何平均力価を図示する。図４は、７４日目（６０日目の２回目の投与の１４日後）の５０％ＰＲＮＴ幾何平均力価を図示する。上記図において認められ得るように、４種全てのデングウイルスに対する上記中和抗体力価は、皮下投与に対して、皮内投与後により高かった。さらに、中和抗体応答（ＰＲＮＴ＞１０として定義される「血清変換」）を示した動物の数は、ワクチンの第１の用量の後より多かった（表１を参照のこと（上記４種のデング血清型の各々に対して血清変換した動物のパーセンテージは、初回免疫および２回目の免疫後に示される））。

表１：デング免疫後の非ヒト霊長類の血清変換

上記免疫した動物を、野生型デングウイルスでのチャレンジに対する防御について試験した。ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓにおいて、野生型デングウイルス感染は、ウイルス複製およびウイルス血症をもたらすが、臨床的徴候はもたらさない。９１日目に、２匹のサルに、ＤＥＮＶ−１（デングウイルス血清型１）をチャレンジし、２匹のサルに、ＤＥＮ−２（デングウイルス血清型２）をチャレンジした。血清サンプルを、チャレンジの１１日後に、毎日回収した。デングウイルスＲＮＡのレベルを、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応技術（ｑ−ｒｔＰＣＲ）によって上記サンプル中で測定し、生きているウイルスの力価を、ウイルス単離およびＶｅｒｏ細胞上でのプラーク形成によって測定した。結果を、表２および表３に示す。９１日目（チャレンジの直前（「チャレンジ前」））および１０５日目（チャレンジの１４日後（「チャレンジ後」））のＤＥＮ−１に対する中和抗体。ウイルス血症を、生きているＤＥＮ−１ウイルスが血液サンプルから単離できた日数（「持続期間」）および各動物から単離されたピーク力価のｌｏｇ１０として示す。ウイルスＲＮＡを、ウイルスＲＮＡが上記血清サンプル中で検出できた日数（「持続期間」）および各サルにおけるピークウイルスＲＮＡレベル（検出されたウイルスＲＮＡゲノムの数のｌｏｇ１０として表される）として示す。

表２：ＤＥＮ−１でチャレンジした後の応答

表３：ＤＥＮ−２でチャレンジした後の応答

チャレンジ後、上記ＳＣ免疫した動物およびＩＤ免疫した動物は、ＤＥＮ−１もしくはＤＥＮ−２誘導性のウイルス血症から完全に防御された（長い持続期間の顕著なウイルス血症を示したコントロール動物と比較して）。上記ＩＤ免疫した動物の全てにおいて（しかし、上記ＳＣ免疫した動物の全てではない）、ウイルスＲＮＡ複製の非存在およびチャレンジ後の抗体力価の増加の欠如もまたあった（上記ＩＤ動物と、ＳＣ注射したＣＹ０１８１、ＣＹ０１７２もしくは上記コントロール動物とを比較のこと）。これらデータは、防御が「滅菌（ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ）」であり、チャレンジ後のいかなるウイルス複製をも妨げることを示唆する。

（実施例２）
別の例において、異なる位置および異なるタイミングで送達した、最適化したＤＥＮＶａｘ処方物を、非ヒト霊長類において試験する。８匹のＣｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓの群を、それぞれ、１×１０^５プラーク形成単位（ｐｆｕ）、１×１０^４ ｐｆｕ、１×１０^５ ｐｆｕおよび１×１０^５ ｐｆｕのＤＥＮＶＡｘ−１、ＤＥＮＶａｘ−２、ＤＥＮＶａｘ−３およびＤＥＮＶａｘ−４（５：４：５：５は省略）を含むＤＥＮＶａｘ処方物で免疫する。２用量を、０．１ｍｌ ＩＤにおいて投与する。群を、０日目に各腕において１用量、０日目に一方の腕において１用量および７日目に他方の腕において１用量、または０日目に一方の腕において１用量および６０日目に他方の腕において１用量のいずれかで免疫する。これら群を、同じ用量（５：４：５：５）を同日の０日目に３箇所の部位に、および他方の腕に６０日目に３箇所の部位に受けた群と、ならびに０日目に一方の腕におよび６０日目に他方の腕に単一の０．５ｍｌ ＳＣ免疫を同じ用量を受けた群と比較する。コントロール群に、ワクチン賦形剤のみ（ワクチンウイルスなし）を免疫する。免疫後、血液サンプルを０日目、７日目（ピークウイルス血症に関して）、１５日目、３０日目、６０日目、および９０日目に回収して、上記４種のデングウイルス血清型に対する中和抗体をＰＲＮＴ５０によって試験する。３０日目、６０日目、９０日目に回収したＰＢＭＣをまた、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ＩＦＮ−γ分泌に関してモニターする。９０日目に、各群から２匹の動物に、野生型ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３、もしくはＤＥＮ−４のウイルスをチャレンジする。チャレンジさせた動物を、臨床的徴候および温度（１日に２回）、飼料消費の変化（１日に１回）および体重（毎週）についてモニターする。さらに、全ての動物からチャレンジ後１１日間にわたって毎日採血して、ウイルス血症および血液学的パラメーターをモニターする。繰り返すと、４種全てのＤＥＮウイルスに対するＰＲＮＴ応答の速度および持続期間、ならびに９０日目のチャレンジ後の防御を評価する。複数部位でのおよび別個の解剖学的位置での皮内投与が、単一ボーラスとしての皮下投与より有効であり得ると考えられる。複数部位は、より多くの抗原提示細胞への上記ワクチンの曝露を提供し得る。別個の解剖学的位置は、ワクチンが複数のリンパ節へ接近することを可能にし得る。さらに、デングワクチンのブースター免疫は、マウス、霊長類およびヒト臨床試験における抗体応答の発生後に（３０日間以上）投与したに過ぎなかった。この時点で、中和抗体は、生ウイルスワクチンへの応答を阻害する。初回免疫の１ヶ月後に霊長類をブーストすると、初回免疫の４ヶ月後に投与するより有効性は低いことが以前に示された。初回免疫後に循環する高レベルの同種抗体および異種抗体が、第２の用量においてウイルス複製を阻害し得ると推測された。長期化した（２ヶ月以上の）免疫は、この阻害を出し抜き（ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ）得るが、強力な中和抗体応答の発生前のより短期間の免疫間隔での加速免疫レジメンが、有利であり得るか否かを試験しなかった。このようなより短期間のレジメンは、特定の蔓延した国（ｅｎｄｅｍｉｃ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ）におけるもしくは免疫の間のデングウイルスへの曝露が、彼らを疾患のリスクに陥らせる可能性のある旅行者にとっての利点であり得る。

（実施例３）
別の例において、２種のＤＥＮＶａｘ処方物の安全性および免疫原性を研究するヒト臨床試験を開始し、ＩＤ注射もしくはＳＣ注射のいずれかによって、０．１ｍｌを投与した。１２個体の群に、０日目および９０日目に、例えば、低用量ＤＥＮＶａｘ処方物（それぞれ、ＤＥＮＶａｘ−１、−２、−３および−４の８×１０^３ ｐｆｕ、５×１０^３ ｐｆｕ、１×１０^４ ｐｆｕおよび２×１０^５ ｐｆｕ）もしくは高用量（それぞれ、ＤＥＮＶａｘ−１、−２、−３および−４の２×１０^４ ｐｆｕ、５×１０^４ ｐｆｕ、１×１０^５ ｐｆｕおよび３×１０^５ ｐｆｕ）のＤＥＮＶａｘ ＩＤもしくはＳＣを免疫する。２つのコントロール群に、リン酸緩衝化生理食塩水をＳＣもしくはＩＤで注射する。患者を任意の有害な事象について、および血液学的もしくは血液化学的パラメーターの任意の顕著な変化についてモニターする。血清サンプルを回収して、周期的間隔でワクチンウイルス複製および中和抗体応答を測定する。

（実施例４）
ＡＧ１２９マウスにおいて皮内投与したＤＥＮＶａｘの免疫原性および有効性。別の例において、２つの研究を行って、ＡＧ１２９マウスにおけるＤＥＮＶａｘの免疫原性および有効性に対して投与経路の効果を比較した。一例において、一価ＤＥＮＶ^ａｘ−４（例えば、１種のデングウイルス血清型に対するワクチン）の免疫原性を、背中の皮膚の下でのＳＣ注射もしくは針およびシリンジを使用する足蹠へのＩＤ注射の後の中和抗体応答を測定することによって、ＡＧ１２９マウスにおいて比較した。８匹のＡＧ１２９マウスの群に、それぞれ、５０μｌおよび１００μｌ最終容積において、１０^５ ＰＦＵ／用量のキメラＤＥＮＶａｘ−４ワクチンをＩＤ注射もしくはＳＣ注射した。初回の６週間後に、各処置群の動物に、１０^５ ＰＦＵのＤＥＮＶａｘ−４もしくはＴＦＡを、対応するＩＤ経路もしくはＳＣ経路を介してブーストした。３１日目および５８日目にマウスから採血し、回収した血清をプールして、中和抗体応答を測定した。

上記ＩＤ経路を介するＤＥＮＶａｘ−４の免疫は、上記ＳＣ経路を介して誘導した応答と比較して、上記ブースト後のＤＥＮ−４に対して５倍高い中和抗体応答を誘発した（例えば、図４を参照のこと）。いずれかの免疫経路によって誘発された上記抗ＤＥＮ−４応答は、ＤＥＮ−３に対する顕著な交差中和抗体を有したが、ＤＥＮ−１もしくはＤＥＮ−２の血清型に対しては有さなかった。図４は、キメラＤＥＮＶａｘ−４でのＡＧ１２９マウスの初回免疫および２回目の免疫後の中和抗体応答を示す。３１日目および５８日目にマウスから採血し、回収した血清をプールして、上記プラーク低下アッセイ（ＰＲＮＴ５０）を使用して中和抗体応答を測定した。

ブーストしてから２週間後に、各群の動物を２つの群に分け、１０^６ＰＦＵのＤＥＮ−１（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉウイルス株）もしくはＤＥＮ−２（Ｎｅｗ Ｇｕｉｎｅａ Ｃ株）ウイルスでチャレンジした。チャレンジした動物を、疾患の臨床的徴候についてモニターし、５週間にわたって生存率を記録した。上記ＩＤ経路を介して免疫したマウスは、ＤＥＮ−１チャレンジ後に疾患の徴候を示さなかった（図５Ａ）。上記ＳＣ免疫した群では、１匹のマウスのみが感染に負けたが、残りの動物は感染の明らかな徴候を何ら有さなかった（図５Ｂ）。対照的に、全てのコントロール動物は、ＤＥＮ−１チャレンジ後の１３日目までには感染に負けた（図５Ａ）。ＤＥＮ−２チャレンジの後、ＤＥＮＶａｘ−４のみで上記ＳＣ経路を介して免疫した全ての動物は、２５日目までに感染に負け、チャレンジ後１７日目まで（ＭＳＴ＝１２．５日）に全て負けた上記コントロール（ＴＦＡ）マウスと比較して、平均生存期間（ＭＳＴ）は、１９．５日であった（図５Ｂ）。対照的に、ＩＤ ＤＥＮＶａｘ−４免疫したマウスのうちの５０％は、５週間のモニタリング期間の最後まで感染から生き延びた（図５Ｂ）。図５Ａおよび図５Ｂは、ＤＥＮ−１（ａ）もしくはＤＥＮ−２（ｂ）ウイルスでのチャレンジ後のＤＥＮＶａｘ−４免疫ＡＧ１２９マウスの生存を示す。チャレンジした動物を、疾患の臨床的徴候についてモニターし、５週間の期間にわたって生存率を記録した。

２つめの研究において、マウス（例えば、ＡＧ１２９）においてＳＣ投与もしくはＩＤ投与した四価ＤＥＮＶａｘワクチンの免疫原性を試験した。ＡＧ１２９マウスの群（６匹／群）に、上記ＤＥＮＶａｘを、１００μｌもしくは５０μｌ（最終容積）でそれぞれＳＣ注射もしくはＩＤ注射した。マウスを、複合キメラワクチンの５：４：５：５（１０^５ ＰＦＵのＤＥＮＶａｘ−１、−３および−４、ならびに１０^４ ＰＦＵのＤＥＮＶａｘ−２）用量レベルでＤＥＮＶａｘを免疫した。全ての免疫した動物に、初回接種の４２日後に、５：４：５：５ ＤＥＮＶａｘのブースター注射を与えた。４２日目および５６日目に血液サンプルを回収して、各ＤＥＮウイルス血清型に対する中和抗体応答を測定した。

表４に表されるように、４種全てのＤＥＮ血清型に対する初回および２回目の中和抗体応答がともに誘導された。上記ブーストの後、上記中和抗ＤＥＮ−１抗体、中和抗ＤＥＮ−３抗体中和抗ＤＥＮ−４抗体の力価は、上記ＳＣ免疫した動物と比較して、ＩＤ注射したマウスの群においてそれぞれ２倍、５倍および２倍増大した。ＤＥＮ−２ウイルスに対する中和応答は、両方の群で匹敵した。上記ＳＣ経路を介する免疫は、ＤＥＮ−１＞ＤＥＮ−２＞ＤＥＮ−３＞ＤＥＮ−４に対して優勢な中和抗体応答のプロフィールを生じ、それぞれ、中和力価５１２０、１２８０、６４０および８０を生じた。ＩＤ投与後の中和抗体応答の階層は、以下のようにシフトした；ＤＥＮ−１＞ＤＥＮ−３＞ＤＥＮ−２＞ＤＥＮ−４（中和抗体力価は、それぞれ、１０２４０、３８４０、１２８０および１６０）。

表４は、マウスのＳＣ免疫もしくはＩＤ免疫後の、比率５：４：５：５ ＰＦＵの各複合キメラウイルス（１０^５ ＰＦＵのＤＥＮＶａｘ−１、−３および−４、ならびに１０^４ ＰＦＵのＤＥＮＶａｘ−２）を有する四価ＤＥＮＶａｘの免疫原性の比較である。４２日目および５６日目に血液サンプルを回収して、各ＤＥＮウイルス血清型に対する中和抗体応答を測定した。
表４

（材料および方法）
マウス：ＡＧ１２９マウスは、「完全な（ｉｎｔａｃｔ）」免疫系を有する；インターフェロン（ＩＦＮ）-α／βおよび-αレセプターを欠損している。デング感染が記載されてきた。他の研究：病原論、細胞親和性、およびＡＤＥが試験されてきた。このモデルは、ＤＥＮ−１およびＤＥＮ−２でのチャレンジを可能にする。

非ヒト霊長類：Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ、ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓはウイルスを有する（ウイルス血症）が、疾患発現はない。

本明細書で開示されかつ特許請求される組成物および方法の全ては、本開示に鑑みて、過度の実験なくして作製され得、実施され得る。上記組成物および方法は、好ましい実施形態に関連して記載されてきたが、上記組成物および方法に、ならびに本明細書に記載される方法の工程もしくは工程の順序において、本明細書の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、バリエーションが適用され得ることは、当業者に明らかである。より具体的には、化学的にかつ生理学的に関連する特定の因子が、本明細書で記載される上記因子の代わりに使用される一方で、同じもしくは類似の結果が達成される。当業者に明らかな全てのこのような類似の置換物および改変は、添付の特許請求の範囲によって規定されるような、上記趣旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
以下、上記の実施形態から把握できる技術的思想を付記する。
（付記１）
複数のデングウイルス血清型に対する、被験体における防御を誘導するための方法であって、該方法は、デングウイルスに対する単回用量ワクチンを、皮内導入によって被験体に投与する工程、複数のデングウイルス血清型に対する、該被験体における防御を誘導する工程を包含する、方法。
（付記２）
デングウイルスに対する前記ワクチンの少なくとも１回のさらなる皮内注射を投与する工程をさらに包含する、付記１に記載の方法。
（付記３）
デングウイルスに対する前記単回用量ワクチンは、１種以上のデングウイルス血清型を含む、付記１に記載の方法。
（付記４）
少なくとも１回のさらなる皮内注射は、前記被験体の別個の部位に行われる、付記１に記載の方法。
（付記５）
少なくとも１回のさらなる皮内注射は、前記被験体への１回目の投与後３０日未満に行われる、付記１に記載の方法。
（付記６）
前記ワクチンは、所定の比で少なくとも２種のデングウイルス血清型を含む、付記１に記載の方法。
（付記７）
前記ワクチンは、４種全てのデングウイルス血清型を含む、付記１に記載の方法。
（付記８）
前記被験体に少なくとも１種の免疫原性因子を投与する工程をさらに包含する、付記１に記載の方法。
（付記９）
前記免疫原性因子は、少なくとも１種のＴｏｌｌレセプター（ＴＬＲ）リガンドを含む、付記８に記載の方法。
（付記１０）
デングウイルス血清型に対して被験体を防御するための組成物であって、該組成物は、少なくとも２種のデングウイルス血清型の所定の比の、皮内（ＩＤ）投与される単回用量組成物を含む、組成物。
（付記１１）
前記組成物は、１種以上の生弱毒化デングワクチンの１０ ^２ 〜１０ ^５ ｐｆｕの範囲において皮下投与される組成物と比較して、濃度が１０％以上低下している、付記１０に記載の組成物。
（付記１２）
前記組成物は、４種全てのデングウイルス血清型を含む、付記１０に記載の組成物。
（付記１３）
前記４種の血清型は、所定の比にある、付記１２に記載の組成物。
（付記１４）
少なくとも１種の免疫原性因子をさらに含む、付記１０に記載の組成物。
（付記１５）
少なくとも１種のＴｏｌｌレセプター（ＴＬＲ）リガンドもしくは他のアジュバントをさらに含む、付記１０に記載の組成物。
（付記１６）
前記少なくとも１種のＴｏｌｌレセプターリガンドは、ＣｐＧ−ＯＤＮ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、イミキモド、イヌリン由来アジュバント、Ｔｏｌｌレセプター４リガンドであるＭＰＬ、Ｔｏｌｌレセプター３リガンドであるポリＩ：Ｕ、熱不安定性エンテロトキシン、熱不安定性エンテロトキシンの非毒性変異体、およびこれらの組み合わせを含む、付記１５に記載の組成物。
（付記１７）
デングワクチン組成物を被験体に投与するためのシステムであって、該システムは、デングウイルスに対するワクチン組成物および該ワクチン組成物を、被験体への非注射法によって皮内に導入し得、該デングワクチン組成物を該被験体に投与し得る装置を含む、システム。
（付記１８）
前記非注射法は、ニードルなしかつシリンジなしである、付記１７に記載のシステム。
（付記１９）
ワクチンキットであって、該キットは、
１種以上のデングウイルス血清型を含む、デングウイルスに対する少なくとも１種のワクチン組成物；および
被験体への該組成物の皮内投与を可能にする少なくとも１つの装置
を含む、キット。
（付記２０）
少なくとも１種の免疫原性因子をさらに含む、付記１９に記載のキット。
（付記２１）
少なくとも１種のＴｏｌｌレセプターリガンドをさらに含む、付記１９に記載のキット。

Claims (14)

1. 被験体において複数のデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導する方法に用いるための、デングウイルスに対する単一の免疫原性組成物であって、前記単一の免疫原性組成物に含まれるウイルスはデングウイルスのみであり、かつ前記単一の免疫原性組成物は３種以上の異なるデングウイルス血清型を含み、前記方法は、前記単一の免疫原性組成物を、少なくとも１回目の皮内導入によって被験体に投与する工程、および複数のデングウイルス血清型に対する被験体における免疫応答を誘導する工程を包含する、免疫原性組成物。
2. 前記方法は、デングウイルスに対する前記免疫原性組成物の少なくとも１回のさらなる皮内注射を投与する工程をさらに包含し、少なくとも１回のさらなる皮内注射は被験体の別個の解剖学的部位に対し実施される、請求項１に記載の免疫原性組成物。
3. ３種または４種のデングウイルス血清型を含み、デングウイルス血清型２およびデングウイルス血清型４が含まれる場合、デングウイルス血清型４の濃度がデングウイルス血清型２よりも高い、請求項１に記載の免疫原性組成物。
4. 前記被験体への１回目の投与後３０日未満に少なくとも１回のさらなる皮内注射が行われる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
5. ４種全てのデングウイルス血清型を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
6. 前記方法は、前記被験体に少なくとも１種の免疫原性因子を投与する工程をさらに包含し、前記免疫原性因子は少なくとも１種のＴｏｌｌレセプター（ＴＬＲ）リガンドを含み、前記少なくとも１種のＴｏｌｌレセプター（ＴＬＲ）リガンドは、ＣｐＧ−ＯＤＮ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、イミキモド、イヌリン由来アジュバント、Ｔｏｌｌレセプター４リガンドであるＭＰＬ、Ｔｏｌｌレセプター３リガンドであるポリＩ：Ｕ、熱不安定性エンテロトキシン、熱不安定性エンテロトキシンの非毒性変異体、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
7. デングウイルス血清型に対して被験体を防御するための皮内（ＩＤ）投与用の薬剤の製造における単一の免疫原性組成物の使用であって、前記免疫原性組成物に含まれるウイルスはデングウイルスのみであり、前記免疫原性組成物は、少なくとも３種のデングウイルス血清型を含み、かつ前記免疫原性組成物は皮内（ＩＤ）投与用である、使用。
8. 前記免疫原性組成物は、４種全てのデングウイルス血清型を含む、請求項７に記載の使用。
9. 前記免疫原性組成物は、少なくとも１種の免疫原性因子をさらに含む、請求項７に記載の使用。
10. 前記免疫原性組成物は、少なくとも１種のＴｏｌｌレセプター（ＴＬＲ）リガンドもしくは他のアジュバントをさらに含み、前記少なくとも１種のＴｏｌｌレセプター（ＴＬＲ）リガンドは、ＣｐＧ−ＯＤＮ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、イミキモド、イヌリン由来アジュバント、Ｔｏｌｌレセプター４リガンドであるＭＰＬ、Ｔｏｌｌレセプター３リガンドであるポリＩ：Ｕ、熱不安定性エンテロトキシン、熱不安定性エンテロトキシンの非毒性変異体、またはこれらの組み合わせを含む、請求項７に記載の使用。
11. デングウイルスに対する免疫原性組成物を被験体に投与するために用いられるシステムであって、前記システムは、前記免疫原性組成物、および、前記免疫原性組成物を被験体への非注射法によって皮内に導入可能な装置を含み、前記装置は前記免疫原性組成物を前記被験体に投与するように構成されており、前記免疫原性組成物は皮内（ＩＤ）投与用であるとともに少なくとも３種のデングウイルス血清型を含み、前記免疫原性組成物に含まれるウイルスはデングウイルスのみである、システム。
12. 前記非注射法は、ニードルおよびシリンジを使用しない、請求項１１に記載のシステム。
13. ワクチンキットであって、
    少なくとも１種の請求項１に記載の免疫原性組成物；および
    被験体への前記免疫原性組成物の皮内投与を可能にする少なくとも１つの装置
    を含む、キット。
14. 少なくとも１種のＴｏｌｌレセプターリガンドをさらに含み、前記少なくとも１種のＴｏｌｌレセプターリガンドは、ＣｐＧ−ＯＤＮ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、イミキモド、イヌリン由来アジュバント、Ｔｏｌｌレセプター４リガンドであるＭＰＬ、Ｔｏｌｌレセプター３リガンドであるポリＩ：Ｕ、熱不安定性エンテロトキシン、熱不安定性エンテロトキシンの非毒性変異体、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載のキット。