MX2011012807A - Composiciones y metodos para administracion de vacunas contra virus del dengue. - Google Patents

Abstract

Las modalidades de la presente invención reportan composiciones y métodos para vacunar a un sujeto contra los virus del dengue. En algunas modalidades, las composiciones de vacuna pueden ser administradas por introducción intradérmica. En ciertas modalidades, la introducción intradérmica en un sujeto de una vacuna contra el virus del dengue puede incluir uno o más aumentos intradérmicos después de la vacuna inicial. Otras modalidades incluyen inyección intradérmica de una composición de vacuna contra el virus del dengue, en donde la composición proporciona protección contra dos o más de DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA ADMINISTRACION DE VACUNAS CONTRA VIRUS DEL DENGUE PRIORIDAD Esta solicitud reclama el beneficio bajo 35 USC § 1 19(e) de la solicitud de patente de E.U.A. provisional serie No. 61/183,020 presentada el 01 de junio de 2009, que se incorpora aquí para referencia en su totalidad.

CAMPO TECNICO Modalidades de la presente invención reportan composiciones y métodos para administrar una vacuna a un sujeto contra virus del dengue. En algunas modalidades, las composiciones de vacuna pueden ser administradas por inyección ¡ntradérmica. En ciertas modalidades, la inyección intradérmica en un sujeto de una vacuna contra el virus de dengue puede incluir uno o más refuerzos intradérmicos después de la vacunación. Otras modalidades incluyen la inyección intradérmica de una composición de vacuna contra el virus del dengue en donde la composición proporciona protección contra más de un serotipo - de virus del dengue, tal como DEN-1 , DEN-2, DEN-3 y DEN-4.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Vacunas para la protección contra las infecciones virales se han utilizado con eficacia para reducir la incidencia de la enfermedad humana. Una de las tecnologías de más éxito de las vacunas virales es inmunizar animales o humanos con una cepa debilitada o atenuada del virus (un "virus atenuado vivo"). Debido a la replicación limitada después de la inmunización, la cepa atenuada no causa enfermedad. Sin embargo, la replicación viral limitada es suficiente para expresar el repertorio completo de antígenos virales y puede generar respuestas inmunes de larga duración y potentes para el virus. Por lo tanto, en la exposición posterior a una cepa patógena del virus, el individuo inmunizado es protegido de la enfermedad. Estas vacunas virales atenuadas, vivas son algunas de las vacunas más exitosas usadas en salud pública.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Modalidades de la presente . invención generalmente se refieren a métodos y composiciones para inducir protección en un sujeto contra el virus del dengue, por ejemplo, la administración de una vacuna a un sujeto contra los virus del dengue. Algunas modalidades pueden incluir la introducción de una composición de vacuna a un sujeto a través de inyección intradérmica (ID). De acuerdo con estas modalidades, la composición de vacuna puede ser introducida a un sujeto por vía intradérmica, por ejemplo, para proteger contra uno o más de un serotipo del dengue (por ejemplo, la protección cruzada). En ciertas modalidades, una composición de vacuna puede incluir, pero no limitarse a, una « dosis única de un serotipo de virus del dengue (por ejemplo, Deva 4) administrada a un sujeto. En otras modalidades, una composición de vacuna puede incluir, pero no limitarse a, una dosis inicial de un serotipo de virus del dengue (por ejemplo, Deva 4 u otro serotipo) y después uno o más refuerzos de la misma, una combinación o un serotipo diferente pueden ser administrados a un sujeto.

Otros aspectos aquí pueden referirse a la inducción de una respuesta celular inmune en un sujeto, por ejemplo, al introducir una composición de vacuna a un sujeto vía introducción intradérmica en donde la composición de vacuna incluye, pero no se limita a, una vacuna contra el virus del dengue. De acuerdo con estas modalidades, composiciones descritas se pueden administrar por vía intradérmica a un sujeto para la modulación de la producción del anticuerpo de neutralización en el sujeto contra serotipos del virus del dengue. Algunos aspectos se refieren a relaciones de composición predeterminadas (por ejemplo 1 :1 , 1 :2, 1 :4, cualquier relación entre dos o más serotipos se contempla) de los diversos serotipos del virus del dengue o fragmentos de los mismos o composiciones atenuada de los mismos en una composición de vacuna sencilla a fin de incrementar la protección cruzada en un sujeto contra algunos o todos los serotipos del virus del dengue cuando el sujeto se administra con la composición de vacuna única intradérmicamente.

En ciertas modalidades, algunas ventajas de la utilización de introducción intradérmica de una vacuna contra el virus de dengue pueden incluir, pero no se limitan a, protección múltiple contra algunos o todos los serotipos del virus del dengue en un sujeto, costos reducidos mediante el uso de pequeñas dosis en comparación con inyección subcutánea, modulación de anticuerpos producidos contra algunos o todos los serotipos del virus del dengue en un sujeto y dolor reducido en un sitio de administración en un sujeto administrado con una composición de vacuna contra el virus del dengue.

En algunas modalidades, una vacuna de dosis única contra el virus de dengue puede incluir uno o más serotipos del virus del dengue. De acuerdo con estas modalidades, un sujeto puede ser tratado con al menos una inyección o inyecciones adicionales intradérmicas administradas en un lugar separado de la primera inyección, por ejemplo, al lado o en un sitio anatómico separado en el sujeto. Además, al menos una inyección o inyecciones adicionales intradérmicas se pueden realizar en menos de 30 días después de la primera administración al sujeto. Composiciones de vacuna de estas y otras modalidades descritas aquí pueden incluir dos o más serotipos del virus del dengue en una relación predeterminada.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar aún más ciertas modalidades. Algunas modalidades pueden ser mejor entendidas por referencia a uno o más de estos dibujos solo o en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas.

La figura 1 representa un ejemplo de un dispositivo de inyección ¡ntradérmica disponible en la actualidad.

La figura 2 representa ejemplos de sitios de inyección en un sujeto que tiene introducción ¡ntradérmica de una vacuna contra el virus del dengue.

La figura 3 representa una comparación gráfica de barras de la inyección subcutánea contra la inyección ¡ntradérmica de una vacuna contra el virus del dengue y el valorador de anticuerpo de neutralización producido contra los diferentes serotipos del virus del dengue después de una administración principal.

La figura 4 representa una comparación gráfica de barras de la inyección subcutánea contra la inyección ¡ntradérmica de una vacuna contra el virus del dengue y el valorador de anticuerpo de neutralización producido contra diferentes serotipos del virus del dengue después de una segunda administración de refuerzo.

La figura 5 representa una gráfica de histograma de inmunizaciones subcutánea e ¡ntradérmica con una vacuna contra un serotipo del virus del dengue en ratones.

Figuras 6A y 6B representan representaciones gráficas de un experimento de desafío que usan dos serotipos diferentes del virus del dengue en una población de ratones inmunes al serotipo del dengue tras la vacunación de los ratones con otro serotipo del virus dengue.

Definiciones Como se usa aquí, "una" o "un" puede significar uno o más de un elemento.

Como se usa aquí, el recipiente puede incluir, pero no limitarse a, tubo de ensayo, tubo de mini o micro-fuga, canal, vial, placa de micro-valoración o contenedor.

Como se usa aquí la especificación, "sujeto" o "sujetos" pueden incluir pero no están limitados a mamíferos tales como humanos o mamíferos, domesticados o salvajes, por ejemplo perros, gatos, otros animales domésticos (por ejemplo, hámster, conejillo de indias, ratón, rata), hurones, conejos, cerdos, caballos, vacas, perros de la pradera, o animales de zoológico.

Como se usa aquí, "aproximadamente" puede significar más o menos diez por ciento.

Como se usa aquí, "virus atenuado" puede significar un virus que demuestra signos clínicos reducidos o sin signos clínicos de la enfermedad cuando se administra a un sujeto tal como un mamífero (por ejemplo, humano o un animal).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN En las siguientes secciones, varias composiciones ejemplares y métodos se describen a fin de detallar varias modalidades. Será evidente para una persona con experiencia en la técnica que la práctica de las diversas modalidades no requiere el empleo de todos o algunos de los detalles específicos descritos aquí, sino que las concentraciones, tiempos y otros detalles específicos pueden modificarse a través de la experimentación de rutina. En algunos casos, métodos bien conocidos o componentes no se han incluido en la descripción.

Ciertos aspectos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, la administración de composiciones de vacuna contra el virus del dengue.

Las modalidades de la presente invención generalmente se refieren a métodos y composiciones para inducir protección en un sujeto contra serotipos del virus del dengue. Otras modalidades pueden incluir la introducción de una composición de vacuna a un sujeto a través de inyección intradérmica (ID) en donde la composición de vacuna introducida por vía intradérmica induce una protección cruzada contra algunos o todos los serotipos de dengue. En ciertas modalidades, la composición de vacuna comprende una sola dosis de una vacuna contra el serotipo 4 del virus del dengue (DENVax 4) administrada a un sujeto. En otras modalidades, la composición de vacuna comprende una dosis inicial de DENVax 4 entonces, uno o más refuerzos de la vacuna administrada a un sujeto.

Otros aspectos de la presente invención incluyen la modulación de la respuesta inmune a una vacuna contra el virus del dengue administrado intradérmicamente en comparación con vía subcutánea a un sujeto. Las vacunas contra el virus del dengue pueden incluir una composición que comprende relaciones de los serotipos del virus del dengue, virus del dengue atenuados vivos, o fragmentos de los mismos, tales como proteínas o ácidos nucleicos derivados u obtenidos de los serotipos del virus del dengue. Las relaciones de los diversos serotipos pueden ser iguales o ciertos serotipos pueden ser representados más que otros dependiendo de la necesidad o la exposición o la exposición potencial al virus. De acuerdo con estas modalidades, la relación puede ser 1 :2, 1 :3, 1 :4, 1 :10, 1 :20, 1 :1 :1 , 1 :2:2, 1 :2:1 , 1 :1 :1 :1 , 1 :2:1 :2, 1 :3:1:3, 2:3:3:3, 5:4:5:5, 1 :2:2 o cualquier relación para cualquiera de los serotipos 1 , 2, 3 y/o 4, dependiendo de, por ejemplo, el número de serotipos representados en la formulación, la respuesta predeterminada y el efecto deseado. Se contempla que cualquier formulación de serotipo de virus del dengue se puede usar para generar una vacuna (por ejemplo, virus atenuado, etc.) de uso en la administración intradérmica de un sujeto que lo necesita. Se contempla que algunas formulaciones pueden ser más efectivas que otras cuando se introducen por vía intradérmica que otras formulaciones.

En otras modalidades, las composiciones de las formulaciones de vacuna contra el virus del dengue pueden ser introducidas por vía intradérmica a un sujeto-, antes, durante o después de la exposición al virus del dengue por el sujeto. De acuerdo con estas modalidades, un sujeto puede recibir una sola inyección intradérmica o más de una inyección que comprende una formulación del virus del dengue, de manera opcional, seguido por una o más inyecciones adicionales. Aplicaciones ¡ntradérmicas de formulaciones descritas en este documento pueden ser combinadas con cualquier otro tratamiento antiviral o el modo de administración de la vacuna (por ejemplo, inyección subcutánea) a un sujeto. En algunas modalidades, se contempla que la introducción intradérmica de una formulación contemplada en este documento puede ser administrada a cualquier región apropiada del cuerpo de un sujeto (por ejemplo, brazo, cadera, etc.) Además, la administración intradérmica de formulaciones de vacuna aquí como administraciones primarias o de refuerzo puede ocurrir en el mismo día, días consecutivos, semanalmente, mensualmente, bi-mensualmente u otro régimen de tratamiento apropiado.

Métodos Amplificación de ácido nucleico Los ácidos nucleicos pueden utilizarse en cualquier formulación o se utilizan para generar cualquier formulación contemplada aquí. Secuencias de ácido nucleico utilizadas como una plantilla para la amplificación pueden ser virus aislados (por ejemplo, virus del dengue), de acuerdo con metodologías estándar. Una secuencia de ácido nucleico puede ser ADN genómico o fraccionado o ARN de células completas. Donde el ARN se utiliza, puede ser deseable convertir el ARN a un ADNc complementariamente. En algunas modalidades, el ARN es ARN de células completas y se utiliza directamente como el molde para la amplificación. Cualquier método conocido en la técnica para amplificación de moléculas de ácido nucleico se contempla (por ejemplo, PCR, LCR, Qbeta replicasa, etc.).

Proteínas o péptidos expresados Los genes pueden expresarse en cualquier número de diferentes sistemas de expresión de ADN recombinante para generar grandes cantidades del producto polipéptido, que puede ser purificado y utilizado en los métodos y composiciones registrados aquí. Cualquier método conocido en la técnica para generar y utilizar los constructos se contempla. En ciertas modalidades, los genes o fragmentos de genes que codifican uno o más polipéptidos puede ser insertados en un vector de expresión por la clonación estándar o técnicas subclonación conocidos en la técnica.

Las proteínas, péptidos y/o anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden ser detectado o analizado por todos los medios conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, los métodos para la separación y el análisis de moléculas se pueden utilizar tal como electroforesis en gel o métodos de cromatografía en columna.

Electroforesis Electroforesis se puede utilizar para separar las moléculas (por ejemplo, moléculas grandes tal como las proteínas o ácidos nucleicos) en función de su tamaño y carga eléctrica. Hay muchas variaciones de electroforesis conocidas en la técnica. Una solución a través de la cual se mueven las moléculas puede ser libre, por lo general en tubos capilares, o puede ser embebido en una matriz o cualquier otro material conocido en la técnica. Matrices comunes pueden incluir, pero no se limitan a, geles de poliacrilamida, geles de agarosa, espectrómetro de masas, papel secante y filtro.

Algunas modalidades, que usan un gen o fragmento de genes que codifica un polipéptido puede ser insertado en un vector de expresión mediante técnicas de subclonación estándar. Un vector de expresión se puede utilizar que produce el polipéptido recombinante tal como una proteína de fusión, que permite una rápida purificación de afinidad de un péptido o proteína. Ejemplos de dichos sistemas de expresión de proteínas de fusión son el sistema de S-transferasa glutationa (Pharmacia, Piscataway, NJ), el sistema de proteína de unión maltosa (NEB, Beverly, MA), el sistema FLAG (IBI, New Haven, CT), y el sistema 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA).

Formulaciones farmacéuticas Cualquier formulación farmacéutica conocida en la técnica de una vacuna se contempla aquí. En ciertas modalidades, una formulación puede contener uno o más serotipos DEN en diferentes relaciones, dependiendo de la exposición predeterminada o la existencia de los subtipos de virus del dengue. Se contempla que las formulaciones pueden contener otros agentes de uso en la vacunación de un sujeto, incluyendo pero no limitado a, otros ingredientes activos o inactivos o composiciones conocidas por una persona con experiencia en la técnica.

Kits Otras modalidades conciernen kits de uso con los métodos (por ejemplo, métodos de aplicación o administración de una vacuna) y composiciones que se describen aquí. Algunas modalidades conciernen kits que tienen composiciones de vacunas de uso para prevenir o tratar sujetos que, expuestos o que se sospecha haber estado expuesto a uno o más virus del dengue. En ciertas modalidades, un kit puede contener una o más de una formulación de serotipos del virus del dengue (por ejemplo, vacunas atenuadas) en relaciones predeterminadas. Kits pueden ser portátiles, por ejemplo, capaz de ser transportados y utilizados en áreas remotas tal como instalaciones militares o aldeas remotas. Otros kits pueden ser de utilidad en un centro de salud para tratar un sujeto que ha sido expuesto a uno o más virus del dengue o sospechosos de estar en riesgo de exposición al virus del dengue.

Kits también pueden incluir un recipiente adecuado, por ejemplo, frascos, tubos, tubos de mini- o microfuga, tubo de prueba, matraz, botella, jeringa u otro contenedor. Cuando un componente adicional o el agente se proporcionan, el kit puede contener uno o más contenedores adicionales en los que este agente o componente se puede colocar. Kits aquí también usualmente incluirán un medio para contener el agente, composición y cualquiera de otros contenedores de reactivo para venta comercial. Dichos contenedores pueden incluir inyección o contenedores de plástico moldeados por soplado en los cuales los frascos deseados se retienen. Opcionalmente, uno o más agentes adicionales, tales como agentes inmunogénicos o de otros agentes anti-virales, anti-hongos y antibacterianos pueden ser necesarios para las composiciones se describe, por ejemplo, para las composiciones de su uso como una vacuna contra uno o más · microorganismos adicionales.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar ciertas modalidades presentadas aquí. Debe tenerse en cuenta por las personas con experiencia en la materia que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas para funcionar bien en las prácticas aquí descritas. Sin embargo, aquellos de experiencia en la técnica deben, en vista de la presente descripción, apreciar que muchos cambios se pueden hacer en ciertas modalidades las cuales se describen y aún obtienen un resultado probable o similar sin desviarse de la esencia y alcance aquí.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Estudios anteriores revelan que la infección natural con cada serotipo DEN (virus del dengue) se conduce a una protección de larga duración contra la fiebre del dengue causada por el serotipo homólogo. En ciertas modalidades, la administración de una vacuna efectiva contra el dengue imita la infección natural y puede servir como un modo de administrar vacunas contra el virus del dengue. Modalidades reportadas aquí pueden referirse a una ruta de infección natural de infección del virus del dengue (DEN), similar al suministro intradérmico por el huésped de transporte, la picadura de un mosquito. En ciertas modalidades, la inyección intradérmica para depositar los virus de vacuna en el mismo tejido se puede utilizar. La piel es un órgano altamente accesible y representa una barrera inmune efectiva, se atribuye principalmente a la presencia de células de Langerhans (CL) que residen en la epidermis. La inmunización de la piel produce un amplio intervalo de respuestas inmunes, incluyendo humoral, celular y mucosal y tiene el potencial para derivar el efecto de inmunidad pre-existente en la inmunogenicidad de vacunas administradas.

Algunas modalidades para administración intradérmica (ID) de las vacunas tetravalentes de dengue en un sujeto que necesita de dicho tratamiento se reportan. Un método ejemplar de administración intradérmica se realiza en cuatro macacos Cynomologous administrados con una DENVax 5:5:5:5 (vacuna contra el virus del dengue) por administración intradérmica. Para lograr una dosis equivalente de virus, 0.15 mi de la vacuna se deposita ID en tres sitios separados cercanamente usando un inyector de chorro libre de aguja (véase figura 1 y 2, posterior). Figura 1 representa un dispositivo de inyección intradérmica (por ejemplo, PharmaJet®) utilizado para inoculaciones intradérmicas.

Figura 2 ilustra los sitios de inoculación de la post vacunación de los macacos Cynomolgus con dispositivo PharmaJet. Los animales se refuerzan 60 días más tarde con la misma formulación, por la misma ruta. Las muestras de suero se colectan a intervalos predeterminados, los días 15, 30, 58, 74 y 91 y se analizaron para detectar la presencia de anticuerpos de neutralización dirigidos contra los cuatro serotipos del dengue. PRNT (prueba de neutralización de reducción de placa, conocida en la técnica para la cuantificación de los niveles de anticuerpos de neutralización anti-DEN) se realizaron en las muestras de suero.

Se ha demostrado que los valoradores de anticuerpos de neutralización son significativamente más altos después de la administración ID en comparación con la administración SC después de una administración primaria (véase figura 3) o después de una administración secundaria (véase figura 4). Dado que los sitios se espacian estrechamente en la misma zona, y cada inoculo se compone de cuatro virus, este modo de suministro de vacuna se asemeja mucho a una sola administración de DENVax. Figura 3 ilustra un 50% de valoradores de medio geométrico PRNT en el día 58 (58 días después de la administración primaria). Figura 4 ilustra un 50% valoradores de medio geométrico PRNT en el día 74 (14 días después de la administración secundaria en el Día 60). Como se puede observar en las figuras, los valoradores de anticuerpos de neutralización a los cuatro virus del dengue son mayores después de administración intradérmica contra la subcutánea. Además, el número de animales que demuestran respuestas de anticuerpos de neutralización ("seroconversión", definida como PRNT> 10) es mayor después de la primera dosis de la vacuna (véase el cuadro 1 , el porcentaje de animales que se seroconvierten a cada uno de los cuatro serotipos del dengue se muestra después de la inmunización primaria y secundaria).

CUADRO 1 Seroconversión de primates no humanos después de la inmunización del dengue % de conversión DEN-1 DEN-2 DEN-3 DEN-4 Cebador Refuerzo Cebador Refuerzo Cebador Refuerzo Cebador Re fuerzo 5:5:5:5 87.5% 100.0% 100.0% 100.0% 75.0% 100.0% 50.0% 100.0% SC 5:5:5:5 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% ID Los animales inmunizados se analizan para la protección contra el desafío con virus de dengue tipo silvestre. En macacos cynomolgus, la infección de virus de dengue tipo silvestre conduce a la replicación del virus y la viremia, pero sin signos clínicos. En el día 91 , dos monos se desafían DENV-I (serotipo 1 del virus del dengue) y dos monos desafiados con DEN-2 (serotipo 2 del virus del dengue). Muestras de suero se colectan diariamente durante 1 1 días después del desafío. Los niveles de ARN del virus del- dengue se miden en las muestras por tecnología de reacción de cadena de polimerasa en tiempo real cuantitativo (q- rtPCR) y valoradores de virus viable se miden por el aislamiento del virus y la formación de placa en células Vero. Los resultados se muestran en los cuadros 2 y 3. Anticuerpos de neutralización contra DEN-1 en el día 91 , justo antes del desafío ("Pre-desafío") y el día 105, 14 días después del desafío ("Post"). Viremia se da como el número de días que el virus DEN-1 vivo se puede aislar de muestras de sangre ("Duración") y el Iog10 del valorador pico aislado de cada animal. El ARN viral es dado como el número de días de ARN viral que se puede detectar en las muestras de suero ("Duración") y los niveles de ARN virales pico en cada mono, expresado como el Iog10 del número de genomas de ARN virales detectados.

CUADRO 2 Respuestas después del desafío con DEN-1 mono Formulación DEN-1 PRNT Viremia ARN viral Pre- Post Duración Pico Duración Pico desafío CY0174 5:5:5:5 SC 240 240 0 0 0 0 CY181 5:5:5:5 SC 640 61440 0 0 5 5.6 CY0192 5:5:5:5 ID 1920 1280 0 0 0 0 CY0194 5:5:5:5 ID 7680 1920 0 0 0 0 CY0061 Controles 1 2560 6 2.0 9 5.7 CY0193 Controles 25 2560 3 2.7 7 6.4 CY0058 Controles 1 640 5 2.9 7 5.5 CY0073 Controles 1 1280 5 3.6 10 6.2 CUADRO 3 Respuestas después del desafío con DEN-2 mono Formulación DEN-2 PRNT Viremia ARN viral Pre- Post Duración Pico Duración Pico desafío CY0172 5:5:5:5 SC 3413 3413 0 0 1 3.9 CY0177 5:5:5:5 SC 853 533 0 0 0 0 CY0198 5:5:5:5 ID 240 320 0 0 0 0 CY0201 5:5:5:5 ID 1920 1600 0 0 0 0 CY0088 Controles 6 10240 6 2.3 8 5.1 CY0199 Controles 1 3840 5 1.8 9 4.7 CY0065 Controles 1 10240 5 2.9 8 5.8 CY0104 Controles 1 10240 4 2.4 8 5.7 Después del desafío, los anímales inmunizados ID y SC se protegen completamente de viremia inducida con DEN-1 o DEN-2 (en comparación con los animales de control que demuestran viremia significativa de larga duración). En todos los animales inmunizados ID, pero no todos los animales inmunizados SC, también hay una ausencia de replícación de ARN viral y la falta de un incrementó en valorador de anticuerpo después del desafío (en comparación con los animales ID a los CY0181 inyectados SC, CY0172 o los animales de control). Estos datos sugieren que la protección es "esterilización" y evita la replicación del virus tras el desafío.

EJEMPLO 2 En otro ejemplo, una formulación DENVax optimizada suministrada en diferentes lugares y con diferentes tiempos será probada en primates no humanos. Grupos de ocho macacos Cynomolgus serán inmunizados con una formulación DENVax que contiene 1 x 105 placas que forman unidades (pfu), 1 x 04 pfu, 1 x 105 pfu y 1 x 105 pfu de DENVax-l, DENVax-2, DENVax-3 y DENVax-4, respectivamente (abreviado 5:4:5:5). Dos dosis se administrarán en 0.1 mi ID. Los grupos serán inmunizados con una dosis en cada brazo en el día 0, una dosis en un brazo en el día 0 y una dosis en el otro brazo en el día 7, o una dosis en un brazo en el día 0 y una dosis en el otro brazo en el día 60. Estos grupos serán comparados con un grupo'que recibe la misma dosis (5:4:5:5) en tres sitios en el mismo son en el día 0 y tres sitios en el otro brazo en el día 60, así como un grupo que recibe la misma dosis en una única inmunización SC de 0.5 mi sencilla en un brazo en el día 0 y en el otro brazo en el día 60. Un grupo de control será inmunizado con excipientes de vacuna solamente (no virus de vacuna). Después de la inmunización, las muestras de sangre serán recolectadas en los días 0, 7 (para viremia pico), 15, 30, 60 y 90 para poner a prueba los anticuerpos de neutralización contra los cuatro serotipos del virus del dengue por PRNT50. PBMCs colectados en los días 30, 60, 90 también serán monitoreados para secreción IFN-? por un ensayo de ELISPOT. En el día 90, dos animales de cada grupo serán desafiados con el tipo silvestre de virus DEN-1 , DEN-2, DEN-3 o DEN-4. Animales desafiados serán monitoreados para detectar signos clínicos y la temperatura (dos veces al día), cambios en el consumo de alimentos (una vez al día) y el peso corporal (semanal). Además, todos los animales serán desangrados diariamente durante 11 días post-desafío para monitorear la viremia y los parámetros hematológicos. Una vez más, la velocidad y la duración de las respuestas PRNT a los cuatro virus DEN y la protección después del desafío del día 90 será evaluada. Se cree que la administración intradérmica en múltiples sitios y en distintas ubicaciones anatómicas puede ser más efectiva que la administración subcutánea como un bolo sencillo. Múltiples sitios pueden ofrecer la exposición de la vacuna a más células que presentan antígeno. Distintas ubicaciones anatómicas puede permitir el acceso de vacuna a ganglios linfáticos múltiples. Además, inmunizaciones de refuerzo de vacunas contra el dengue sólo se han administrado después del desarrollo de respuestas de anticuerpos en ratones, primates y los ensayos clínicos humanos, treinta días o más. En este momento, los anticuerpos de neutralización inhiben la respuesta a las vacunas virales vivas. Se ha demostrado previamente que los primates reforzados un mes después de la inmunización primaria es menos efectiva que la dosificación cuatro meses después de la inmunización primaria. Se especula que los niveles altos de anticuerpos homólogos y heterólogos que circulan después de la inmunización inicial pueden inhibir la replicación viral en una segunda dosis. Mientras la inmunización prolongada (dos meses o más) puede evitar esta inhibición, no se ha probado si el régimen de inmunización acelerado con intervalos de inmunización más corta, antes de que el desarrollo de potentes respuestas de anticuerpos de neutralización pueda ser ventajoso. Tal régimen acortado puede ser una ventaja en países endémicos o para los viajeros, donde la exposición al virus del dengue en medio de las inmunizaciones que pueden ponerlos en riesgo de la enfermedad.

EJEMPLO 3 En otro ejemplo, un ensayo clínico humano se ha iniciado, estudiando la seguridad e inmunogenicidad de dos formulaciones DENVax, administradas en 0.1 mi ya sea por inyección ID o SC. Grupos de 12 personas serán inmunizadas con, por ejemplo, una formulación de DENVax de dosis baja (8 x 103 pfu, 5 x 103 pfu, 1 x 104 pfu y 2 X 105 pfu de DENvax-1 , -2, -3 y -4, respectivamente) o una dosis alta (2 x 104 pfu, 5 x 104 ufp, 1 x 105 pfu y 3 x 105 pfu de DENVax-1 , -2, -3 y -4, respectivamente) de DENVax ID o SC en los días 0 y 90. Dos grupos de control serán inyectados SC o ID con solución salina regulada de pH con fosfato. Los pacientes serán monitoreados para cualquier evento adverso, y cualquier cambio significativo en los parámetros hematológicos o de química sanguínea. Muestras de suero serán recolectadas para medir replicación del virus de vacuna y neutralizar las respuestas de anticuerpo en intervalos periódicos .EJEMPLO 4 Inmunogenicidad y eficacia de DENVax intradérmicamente administrada en ratones AG129. En otro ejemplo, se realizaron dos estudios para comparar el efecto de la vía de administración de inmunogenicidad y eficacia de DENVax en ratones AG129. En un ejemplo, se comparó la inmunogenicidad de DENVax-4 monovalente (por ejemplo, vacuna contra un serotipo de virus del Dengue) en ratones AG129 midiendo las respuestas de anticuerpo neutralizante tras la inyección SC bajo la piel en la espalda o inyección ID en la planta de la pata con una aguja y una jeringa. Grupos de 8 ratones AG129 fueron inyectados ID o SC con 105 PFU/dosis de vacuna. DENVax-4 quimérica en volumen final de 50µ? y 100µ?, respectivamente. Seis semanas después del cebado, animales de cada grupo de tratamiento fueron reforzados a través de la ruta ID o SC correspondiente con 105 PFU de DENVax-4 o TFA. Ratones fueron desangrados el día 31 y 58 y los sueros recolectados se combinaron para medir las respuestas de anticuerpo neutralizante.

Inmunización de DENVax-4 vía la ruta ID produce una respuesta de anticuerpo neutralizante 5 veces mayor a DEN-4 después que el refuerzo en comparación con la respuesta inducida por la vía SC (por ejemplo, véase figura 4). La respuesta anti-DEN-4 producida por cualquier vía de inmunización tuvo una marcada actividad neutralizante cruzada contra DEN-3 pero no contra serotipos DEN-1 o DEN-2. La figura 4 representa las respuestas de anticuerpo neutralizante tras la inmunización primaria y secundaria de ratones AG129 con DENVax-4 quimérico. Los ratones fueron desangrados el día 31 y 58 y los sueros recogidos se combinaron para medir las respuestas de anticuerpos neutralizantes mediante el ensayo de reducción de placa (PRNT50).

Dos semanas después del refuerzo de los animales de cada grupo se dividió en dos grupos y se desafió con 106PFU de DEN-I (cepa de virus de Mochizuki) o virus DEN-2 (cepa C de Nueva Guinea). Animales desafiados fueron controlados para signos clínicos de enfermedad y las tasas de supervivencia fueron grabadas durante un período de 5 semanas. Ratones inmunizados por la vía ID no mostraron signos de enfermedad después del desafío DEN-1 (figura 5A). En el grupo inmunizado SC sólo un ratón sucumbió a la infección mientras que el resto de los animales no tiene aparentes signos de infección (figura 5B). Por el contrario, todos los animales de control sucumben a la infección en el día 13 después del desafío DEN-1 (figura 5A). Tras el desafío DEN-2, todos los animales inmunizados con DENVax-4 únicamente por la vía SC sucumbieron a la infección en el día 25 con el tiempo de supervivencia medio (MST) de 19.5 días en comparación con los ratones de control (TFA) que todos sucumben en el día 17 (MST = 12.5 días) post-desafío (figura 5B). En contraste, el cincuenta por ciento de los ratones inmunizados de ID DENVax-4 sobrevivieron a la infección hasta el final del periodo de vigilancia de 5 semanas (figura 5B). Las figuras 5A y 5B representan supervivencias de ratones AG129 inmunes DENVax-4 tras el desafío con el virus DEN-1 (a) o DEN-2 (b). Animales desafiados fueron controlados por signos clínicos de la enfermedad y las tasas de supervivencia fueron grabadas durante un período de 5 semanas.

En un segundo estudio, inmunogenicidad de vacuna DENVax tetravalente administrada SC o ID en ratones (por ejemplo, AG129) fue probada. Grupos de ratones AG129, seis por cada grupo fueron inyectados SC o ID con DENVax en 10?µ? o 50µ? (volumen final), respectivamente. Ratones fueron inmunizados con DENVax en un nivel de dosis 5:4:5:5 (105 PFU de DENVax-1 , -3 y -4 y 104 PFU de DENVax-2) de vacunas quiméricas compuestas. Todos los animales inmunizados recibieron una inyección de refuerzo de inoculación post-primaria de 42 días 5:4:5:5 DENVax. Se recolectaron muestras de sangre en los días 42 y 56 para medir las respuestas de anticuerpos neutralizantes para cada serotipo de virus DEN. Como se representa en el cuadro 4, respuestas de anticuerpos primaria y secundaria de neutralización para los cuatro serotipos DEN fueron inducidas. Tras el refuerzo, los valoradores de anticuerpo neutralizante anti-DEN-1 , DEN-3 y DEN-4 aumentaron 2, 5 y 2 veces, respectivamente en el grupo de ratones inyectados ID en comparación con los animales SC inmunizados. Respuestas neutralizantes al virus DEN-2 fueron comparables en ambos grupos. Inmunización vía SC resultó en un perfil de respuestas de anticuerpo neutralizante dominante contra DEN-1 > DEN-2> DEN-3> DEN-4, con valoradores neutralizantes 5120, 1280, 640 y 80, respectivamente. La jerarquía de respuestas de anticuerpos de neutralización después de la administración ID se ha desplazado como sigue; DEN-1 > DEN-3> DEN-2> DEN-4 con valoradores de anticuerpo neutralizante 10240, 3840, 1280 y 160, respectivamente.

El cuadro 4 es una comparación de la inmunogenicidad de DENVax tetravalente que tiene la proporción 5:4:5:5 PFU de cada virus quimérica compuesto (105 PFU de DENVax-1 , -3 y -4 y 104 PFU de DENVax-2) después de inmunización SC o ID de ratones. Se recolectaron muestras de sangre en los días 42 y 56 para medir las respuestas de anticuerpos neutralizantes para cada serotipo de virus DEN.

CUADRO 4 Valoradores de anticuerpo neutralizante (GMT) DENvax DEN-1 DEN-2 DEN-3 DEN-4 Formula Cebador Refuerzo Cebador Refuerzo Cebador Refuerzo Cebador Refuerzo "-ción 5:4:5:5 1920 5120 3200 1280 1280 640 80 80 /SC 5:4:5:5 2560 10240 1280 1280 1600 3840 120 160 /ID Materiales v métodos Ratones: ratones AG129 tienen un sistema inmunitario "intacto"; deficiente para los receptores interferón (IFN)^a/ y -a. Se ha descrito infección por dengue. Otros estudios: patogénesis, tropismo celular y ADE se han examinados. Este modelo permite el desafío con DEN-1 y DEN - 2.

Primates no humanos: Cynomolgus, macacos rhesus llevan virus (viremia), pero no se manifiesta la enfermedad.

Todas' las composiciones y métodos descritas y reclamadas aquí pueden realizarse y ejecutarse sin experimentación excesiva en vista de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos se han descrito en términos de modalidades preferidas, resulta evidente para aquellos con experiencia en la técnica que variaciones pueden aplicarse a las composiciones y los métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos de los métodos descritos en este documento sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de este documento. Más específicamente, ciertos agentes que son tanto químicamente como fisiológicamente relacionados se pueden sustituir por los agentes descritos mientras que los mismos resultados o resultados similares. Todos esos sustitutos similares y modificaciones aparentes a aquellos especializadas en la técnica se consideran dentro del espíritu, el alcance y el concepto como se define en las reivindicaciones anexadas.

Claims (21)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. - Un método para inducir protección en un sujeto contra serotipos de virus del dengue múltiple, que comprende administrar una vacuna de dosis sencilla contra el virus del dengue a un sujeto por introducción intradérmica, que induce protección en el sujeto contra serotipos de virus del dengue múltiple.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende adicionalmente administrar al menos una inyección intradérmica adicional de la vacuna contra el virus del dengue.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la vacuna de dosis única contra el virus del dengue comprende uno o más serotipos del virus del dengue..

4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque al menos una inyección intradérmica adicional se realiza en un sitio separado en el sujeto.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque al menos una inyección intradérmica adicional se realiza en menos de 30 días después de la primera administración al sujeto.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la vacuna comprende al menos dos serotipos del virus del dengue en una relación predeterminada.

7. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la vacuna comprende los cuatro serotipos de virus del dengue.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende adicionalmente administrar al menos un agente inmunogénico al sujeto.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el agente inmunogénico comprende al menos un ligando del receptor Toll (TLR).

10. - Una composición para proteger un sujeto contra un serotipo de virus del dengue que comprende, una composición de dosis única administrada intradérmicamente (ID) de relación predeterminada de al menos 2 serotipos de virus del dengue.

11. - La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la composición es 10% o más reducida en concentración en comparación a la composición administrada subcutáneamente en un intervalo de 102 a 103 pfu de una o más vacunas del dengue atenuados vivos.

12. - La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la composición comprende los cuatro serotipos del dengue.

13. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque los 4 serotipos están en una relación predeterminada.

14. - La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende adicionalmente al menos un agente inmunogénico.

15. - La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende adicionalmente al menos un ligando del receptor Toll (TLR) u otro adyuvante.

16. - La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque al menos un ligando del receptor Toll comprende CpG-ODN, Poly 1 :C, imiquimod, adyuvantes derivados de inulina, MPL un ligando del receptor 4 Toll, poly 1 :1) un ligando del receptor 3 Toll, enterotoxina lábil caliente, mutantes no tóxicos de enterotoxina lábil caliente y su combinación.

17. - Un sistema para administrar una composición de vacuna del dengue a un sujeto que comprende, una composición de vacuna contra el virus del dengue y un aparato capaz de introducir intradérmicamente la composición de vacuna por un método no inyectable a un sujeto, administrar la composición de vacuna del dengue al sujeto.

18. - El sistema de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el método no inyectable es sin agujas y sin jeringas.

19.- Un kit de vacuna que comprende: al menos una composición de vacuna contra el virus del dengue que comprende uno o más serotipos del virus del dengue; y al menos un aparato capaz de administración intradérmica de la composición a un sujeto.

20.- El kit de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende adicionalmente al menos un agente inmunogénico.

21 .- El kit de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende adicionalmente al menos un ligando del receptor Toll.