JP5825153B2 - 低級アルコール検出試薬及びそれを用いた低級アルコール検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、新規な非酵素系の低級アルコール検出試薬及びそれを用いた低級アルコール検出方法に関する。更に詳しくは、本発明は、目的物である低級アルコールが低濃度であっても、呈色反応を用いることにより、簡易且つ確実に目的物を検出可能である非酵素系の低級アルコール検出試薬及びそれを用いた低級アルコール検出方法に関する。

従来より、被検液中における目的物の検出や濃度の測定において、呈色反応を利用する種々の検出試薬やそれを用いた検出方法が知られている。
例えば、目的物がアルコール（エタノール）である場合には、次の方法が知られている。エタノール含有試料（被検液）を、酸素、水及びアルコールオキシターゼの存在下に酵素反応させることにより過酸化水素を発生させる。そして、この過酸化水素と、４−アミノアンチピリン及びフェノールを、ペルオキシターゼの存在下に酵素反応させることにより赤色キノン色素を発色させるエタノール測定方法等が知られている（特許文献１参照）。

特開２０１０−１４２２２３号公報

しかしながら、従来のアルコール検出試薬は酵素系の試薬であるために、検出条件が限定されやすいうえ、劣化が起こりやすく長期の保存が困難であるという問題点がある。そのため、酵素を含有せず、劣化の起こりにくい非酵素系の検出試薬が求められている。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、新規な非酵素系の低級アルコール検出試薬及びそれを用いた低級アルコール検出方法を提供することを目的とする。

上記問題点を解決するために、請求項１に記載の発明は、被検液と混合した際の呈色反応を用いることにより、低級アルコールを検出するための低級アルコール検出試薬であって、
塩基性フクシンと、亜硫酸水素ナトリウムと、塩化水素と、水と、を含有しており、
検出を行う前記低級アルコールは、炭素数２〜４のアルコールであることを要旨とする。

請求項２に記載の発明は、請求項１において、前記塩基性フクシンを１００質量部とした場合に、
前記亜硫酸水素ナトリウムの含有割合が５０〜４００質量部であり、
前記塩化水素の含有割合が５０〜４００質量部であることを要旨とする。
請求項３に記載の発明は、請求項１又は２において、検出を行う前記低級アルコールは、プロパノールであることを要旨とする。
請求項４に記載の発明は、請求項１又は２において、検出を行う前記低級アルコールは、１−プロパノールであることを要旨とする。

請求項５に記載の発明は、低級アルコール検出方法であって、請求項１乃至４のうちのいずれか一項に記載の低級アルコール検出試薬を用いることを要旨とする。

請求項６に記載の発明は、請求項５において、溶媒としてリン酸緩衝液を含む被検液中の低級アルコールを検出することを要旨とする。

本発明の低級アルコール検出試薬は、非酵素系の試薬であるため、検出条件を幅広く設定することができると共に、既存の酵素系試薬に比べて劣化の心配が少なく、長期の保存が可能である。また、本発明の検出試薬は、特定の成分により試薬が構成されているため、目的物である低級アルコールが低濃度であっても、呈色反応を用いることにより、簡易且つ確実に目的物を検出することができる。
本発明の低級アルコール検出方法は、新規な非酵素系の低級アルコール検出試薬を用いており、目的物である低級アルコールが低濃度であっても、呈色反応を用いることにより、簡易且つ確実に目的物を検出することができる。そのため、バイオエタノールやバイオプロパノールを生産する酵素又は微生物の改良や新規探索分野において好適に利用することができる。また、リン酸緩衝液中の低級アルコールの検出に優れるため、リン酸緩衝液下で安定な酵素等の探索に好適に用いることができる。更には、大規模な酵素等の探索にかかるコストを従来の酵素系試薬を用いた場合よりも大幅に低減することができる。

呈色反応の時間と吸光度の関係を示すグラフである。 リン酸緩衝液の濃度と吸光度の関係を示すグラフである。

ここで示される事項は例示的なものおよび本発明の実施形態を例示的に説明するためのものであり、本発明の原理と概念的な特徴とを最も有効に且つ難なく理解できる説明であると思われるものを提供する目的で述べたものである。

以下、本発明を詳しく説明する。
［１］低級アルコール検出試薬
本発明の低級アルコール検出試薬は、被検液と混合した際の呈色反応を用いることにより、低級アルコールを検出するための試薬である。そして、この低級アルコール検出試薬は、塩基性フクシンと、亜硫酸水素ナトリウムと、塩化水素と、水と、を含有することを特徴とする。

上記低級アルコール検出試薬は、塩基性フクシン、亜硫酸水素ナトリウム、塩化水素及び水を主成分とする。そして、塩基性フクシン、亜硫酸水素ナトリウム、塩化水素及び水の含有割合の合計は、検出試薬全体を１００質量％とした場合に、通常８０〜１００質量％、好ましくは９０〜１００質量％、より好ましくは９５〜１００質量％である。

低級アルコール検出試薬における上記亜硫酸水素ナトリウムの含有割合は、上記塩基性フクシンを１００質量部とした場合に、５０〜４００質量部であることが好ましく、より好ましくは５０〜２００質量部、更に好ましくは５０〜１００質量部である。
上記塩化水素の含有割合は、上記塩基性フクシンを１００質量部とした場合に、５０〜４００質量部であることが好ましく、より好ましくは５０〜２００質量部、更に好ましくは５０〜１００質量部である。
上記水の含有割合は、上記塩基性フクシンを１００質量部とした場合に、８０００〜４００００質量部であることが好ましく、より好ましくは９０００〜３３０００質量部、更に好ましくは９７００〜３１６００質量部である。

本発明の低級アルコール検出試薬には、上記塩基性フクシン、亜硫酸水素ナトリウム、塩化水素及び水以外にも、本発明の効果を阻害しない範囲において、他の成分を含有させてもよい。他の成分としては、例えば、リン酸等が挙げられる。これらは、１種のみ含有されていてもよいし、２種以上含有されていてもよい。
低級アルコール検出試薬がリン酸を含有する場合、その含有割合は、上記塩基性フクシンを１００質量部とした場合に、１〜２０００質量部であることが好ましく、より好ましくは１００〜１５００質量部、更に好ましくは１００〜１１００質量部である。

特に、本発明の低級アルコール検出試薬は、塩基性フクシン、亜硫酸水素ナトリウム、塩化水素及び水からなり、塩基性フクシンを１００質量部とした場合に、亜硫酸水素ナトリウムの含有割合が５０〜４００質量部（特に５０〜２００質量部、更には５０〜１００質量部）、塩化水素の含有割合が５０〜４００質量部（特に５０〜２００質量部、更には５０〜１００質量部）、水の含有割合が８０００〜９９００質量部（特に９０００〜９９００質量部、更には９７００〜９８５０質量部）であるものとすることができる。
更には、本発明の低級アルコール検出試薬は、塩基性フクシン、亜硫酸水素ナトリウム、塩化水素、リン酸及び水からなり、塩基性フクシンを１００質量部とした場合に、亜硫酸水素ナトリウムの含有割合が５０〜４００質量部（特に５０〜２００質量部、更には５０〜１００質量部）、塩化水素の含有割合が５０〜４００質量部（特に５０〜２００質量部、更には５０〜１００質量部）、リン酸の含有割合が１〜２０００質量部（特に１００〜１５００質量部、更には１００〜１１００質量部）、水の含有割合が８０００〜４００００質量部（特に３００００〜３３０００質量部、更には３１０００〜３１６００質量部）であるものとすることができる。

本発明における低級アルコール検出試薬により検出を行う低級アルコールは、炭素数２〜４のアルコールとする。
また、低級アルコール検出試薬により検出可能な、被検液における低級アルコールの濃度は、０．０３質量％以上、特に０．０５〜１００質量％とすることができる。

尚、本発明の低級アルコール検出試薬の調製方法は特に限定されない。例えば、上述の各成分を、所定の割合となるように混合することで調製することができる。また、調製時における各成分の形態は特に限定されず、水溶液の形態で調製に用いてもよい。

［２］低級アルコール検出方法
本発明の低級アルコール検出方法は、上述の本発明の低級アルコール検出試薬を用いることを特徴とする。尚、低級アルコール検出試薬については、上述の説明をそのまま適用することができる。

本発明を用いた低級アルコールの検出は、被検液と低級アルコール検出試薬とを混合し、検出試薬が混合された被検液が発色した場合に、低級アルコールが含有されていると判定されるものである。

低級アルコール検出試薬と被検液との混合比［検出試薬の質量：被検液の質量］は、発色が確認できる量比であれば特に限定されない。具体的には、例えば、１：（５〜２０）であることが好ましく、より好ましくは１：（５〜１５）、更に好ましくは１：（９〜１１）である。この混合比が上記範囲である場合、低級アルコールをより確実に検出することができる。

低級アルコール検出試薬と被検液との混合時間は特に限定されないが、呈色反応を十分に進行させるという観点、及び、迅速に目的物を検出するという観点から、２４時間以下（特に１時間以下、更には２〜３０分間）とすることができる。

本発明の検出方法に用いられる被検液のｐＨは特に限定されないが、例えば、ｐＨ６．３〜８．３であることが好ましく、より好ましくはｐＨ６．８〜７．８、更に好ましくはｐＨ７．０〜７．６である。

また、本発明の低級アルコール検出方法においては、呈色反応を十分に進行させるという観点から、検出試薬が混合された被検液を加熱する工程を備えていてもよい。
加熱温度は特に限定されないが、例えば、５０℃以下（特に２０〜４０℃）とすることができる。
加熱時間は特に限定されないが、例えば、２４時間以下（特に１時間以下、更には２〜３０分間）とすることができる。

本発明における呈色反応による発色の確認方法としては、目視による確認の他、分光光度計を用いた方法が挙げられる。
分光光度計を用いる場合は、例えば、５４０〜５５０ｎｍの波長について吸光度を測定することにより、低級アルコールの有無を確認することができる。この際、アルコール濃度と吸光度の関係を示す検量線を予め求めておくことにより、未知の濃度の目的物における濃度を測定することができる。
更に、吸光度測定の際には、プレートリーダーを用いて行うことが好ましい。この場合、複数の被検液について連続して吸光度測定を行うことができ、目的物の検出や濃度測定を簡易且つ迅速に行うことができる。

また、本発明の検出方法においては、被検液の溶媒にリン酸緩衝液が含まれている場合には、溶媒が水のみであって、同濃度の目的物（低級アルコール）が含まれる被検液と比べて、得られる発色の程度の差（即ち吸光度の差）が大きくなる傾向にある。そのため、本発明の低級アルコール検出方法は、リン酸緩衝液下で安定な酵素等の探索に好適に用いることができる。
尚、溶媒として用いられるリン酸緩衝液のｐＨは特に限定されないが、例えば、ｐＨ６．３〜８．３であることが好ましく、より好ましくはｐＨ６．８〜７．８、更に好ましくはｐＨ７．０〜７．６である。

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。ここで、「部」及び「％」は、特記しない限り質量基準である。

［１］低級アルコール検出試薬（実施例１）の調製
塩基性フクシン１００部と、亜硫酸水素ナトリウム１００部と、塩化水素１００部と、水９７００部とを混合することにより、実施例１の検出試薬を調製した。

［２］吸光度測定（ａ）
以下に示す被検液と参照液を用いて、下記の吸光度測定を行った。
＜被検液及び参照液＞
被検液ａ（アルコール濃度：３％）；蒸留水と１−プロパノールとの混合液
参照液ａ（アルコール濃度：０％）；蒸留水
＜吸光度測定＞
上記［１］で調製した実施例１の検出試薬と、被検液（又は参照液）とを質量比（検出試薬：被検液）で１：１０となるように混合した後、２０℃×１０分間（又は２０分間）の条件にて、呈色反応を進行させた。その後、分光光度計（テカンジャパン社製、型名「Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ」）により、波長５４６ｎｍの吸光度を測定し、その結果を表１及び図１（呈色反応の時間と吸光度の関係を示すグラフ）に示した。尚、この吸光度は、上記測定を５回行った際の平均値である。

表１及び図１によれば、呈色反応時間が１０分間の場合、アルコール０％の参照液ａの吸光度は０．３９であり、３％のプロパノールを含有する被検液ａの吸光度は０．６１であり、その差が０．２２であった。
また、呈色反応時間が２０分間の場合、アルコール０％の参照液ａの吸光度は０．４８であり、３％のプロパノールを含有する被検液ａの吸光度は０．９２であり、その差が０．４４であった。
この結果、アルコールの含有の有無によって吸光度に顕著な差が生じることが確認できた。また、呈色反応時間が１０分間の場合よりも、２０分間の場合の方が吸光度の差が大きくなることが確認できた。
そして、実施例１の低級アルコール検出試薬を用いて呈色反応させることにより、被検液中の低濃度アルコールの有無を十分に検出できることが確認できた。尚、分光光度計を用いた目的物の検出には、吸光度の差が通常０．０５（特に０．１）以上あれば十分である。

［３］低級アルコール検出試薬（実施例２）の調製
塩基性フクシン１００部と、亜硫酸水素ナトリウム４００部と、塩化水素４００部と、リン酸１１００部と、水３１３００部とを混合することにより、実施例２の検出試薬を調製した。

［４］吸光度測定（ｂ）
以下に示す被検液と参照液を用いて、下記の吸光度測定を行った。
＜被検液及び参照液＞
被検液（アルコール３％）
ａ；蒸留水と１−プロパノールとの混合液
ｂ；１２．５ｍＭリン酸緩衝液と１−プロパノールとの混合液
ｃ；２５ｍＭリン酸緩衝液と１−プロパノールとの混合液
参照液（アルコール０％）
ａ；蒸留水
ｂ；１２．５ｍＭリン酸緩衝液
ｃ；２５ｍＭリン酸緩衝液
＜吸光度測定＞
上記［３］で調製した実施例２の検出試薬と、上記各被検液（又は参照液）とを質量比（検出試薬：被検液）で１：１０となるように混合した後、４０℃×２．５時間の条件にて、呈色反応を進行させた。その後、分光光度計（テカンジャパン社製、型名「Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ」）により、波長５４６ｎｍの吸光度を測定し、その結果を表２及び図２（リン酸緩衝液の濃度と吸光度の関係を示すグラフ）に示した。尚、この吸光度は、上記測定を５回行った際の平均値である。

表２及び図２によれば、リン酸緩衝液の濃度が０ｍＭの場合、アルコール０％の参照液の吸光度は０．１３であり、３％のプロパノールを含有する被検液の吸光度は０．１７であり、その差が０．０４であった。
また、リン酸緩衝液の濃度が１２．５ｍＭの場合、アルコール０％の参照液の吸光度は０．２４であり、３％のプロパノールを含有する被検液の吸光度は０．５２であり、その差が０．２８であった。
更に、リン酸緩衝液の濃度が２５ｍＭの場合、アルコール０％の参照液の吸光度は０．５３であり、３％のプロパノールを含有する被検液の吸光度は１．１８であり、その差が０．６５であった。
この結果、リン酸緩衝液中におけるアルコールの含有の有無によって吸光度に顕著な差が生じることが確認できた。また、リン酸緩衝液の濃度が大きいほど、吸光度の差が大きくなることが確認できた。
そして、実施例２の低級アルコール検出試薬を用いて呈色反応させることにより、リン酸緩衝液中の低濃度アルコールの有無を十分に検出できることが確認できた。

［４］実施例の効果
以上のことから、実施例１及び２の低級アルコール検出試薬は、低級アルコールの検出能力に優れており、目的物である低級アルコールが低濃度であっても、呈色反応を用いることにより、簡易且つ確実に目的物を検出可能であることが分かった。また、本実施例１及び２の検出試薬は、酵素を含まない非酵素系の試薬であるため、既存の酵素系試薬に比べて検出条件を幅広く設定することができると共に、劣化の心配が少なく長期の保存が可能である。更に、本実施例の低級アルコール検出試薬は、リン酸緩衝液中の低級アルコールの検出に優れているため、リン酸緩衝液下で安定な酵素等の探索に好適に用いることができる。
尚、被検液におけるアルコール濃度が未知である場合には、予めアルコール濃度と吸光度の関係を示す検量線を求めておくことにより、その濃度を測定することができる。

前述の例は単に説明を目的とするものでしかなく、本発明を限定するものと解釈されるものではない。本発明を典型的な実施形態の例を挙げて説明したが、本発明の記述および図示において使用された文言は、限定的な文言ではなく説明的および例示的なものであると理解される。ここで詳述したように、その形態において本発明の範囲または精神から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更が可能である。ここでは、本発明の詳述に特定の構造、材料および実施例を参照したが、本発明をここにおける開示事項に限定することを意図するものではなく、むしろ、本発明は添付の特許請求の範囲内における、機能的に同等の構造、方法、使用の全てに及ぶものとする。

本発明は上記で詳述した実施形態に限定されず、本発明の請求項に示した範囲で様々な変形または変更が可能である。

本発明の低級アルコール検出試薬及びそれを用いた低級アルコール検出方法は、バイオエタノールやバイオプロパノールを生産する微生物又は酵素の改良や新規探索分野において好適に利用することができる。特に、リン酸緩衝液下での吸光度の差が顕著になることから、リン酸緩衝液下で安定な酵素等の探索に有効と考えられる。

Claims (6)

1. 被検液と混合した際の呈色反応を用いることにより、低級アルコールを検出するための低級アルコール検出試薬であって、
   塩基性フクシンと、亜硫酸水素ナトリウムと、塩化水素と、水と、を含有しており、
   検出を行う前記低級アルコールは、炭素数２〜４のアルコールであることを特徴とする低級アルコール検出試薬。
2. 前記塩基性フクシンを１００質量部とした場合に、
   前記亜硫酸水素ナトリウムの含有割合が５０〜４００質量部であり、
   前記塩化水素の含有割合が５０〜４００質量部である請求項１に記載の低級アルコール検出試薬。
3. 検出を行う前記低級アルコールは、プロパノールである請求項１又は２に記載の低級アルコール検出試薬。
4. 検出を行う前記低級アルコールは、１−プロパノールである請求項１又は２に記載の低級アルコール検出試薬。
5. 請求項１乃至４のうちのいずれか一項に記載の低級アルコール検出試薬を用いることを特徴とする低級アルコール検出方法。
6. 溶媒としてリン酸緩衝液を含む被検液中の低級アルコールを検出する請求項５に記載の低級アルコール検出方法。

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