JP5823985B2

JP5823985B2 - 赤血球を治療するためのアルギニン含有組成物および方法

Info

Publication number: JP5823985B2
Application number: JP2012553994A
Authority: JP
Inventors: ジー．エリクソンダニエル; エー．トンプソンジェフリー
Original assignee: ビアセル，リミティドライアビリティカンパニー
Priority date: 2010-02-16
Filing date: 2011-02-16
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2031-02-16
Also published as: JP2013519731A; CN106135195A; CA2789709C; US8980542B2; CA2789709A1; US20110256522A1; EP2536416B1; CN102869364A; WO2011103179A1; EP2536416A1

Description

本出願は、２０１０年２月１６日に出願した米国特許仮出願番号６１／３３８，２６３、および２０１０年８月４日に出願した米国特許仮出願番号６１／３７０，７１３の利益を請求し、そしてそれらの両方は、それら全体について参照により本明細書中に組み込まれる。

全血は、身体組織に栄養、電解質、抗体、熱および酸素を運ぶために、心臓、動脈、静脈および毛細血管を通って循環する生体組織である。全血は、血漿と呼ばれるタンパク質性の体液に懸濁された赤血球（ＲＢＣ）、白血球および血小板を含む。仮に凝固を防止するために処理され、および容器中に静置することを認められるなら、ＲＢＣは、容器の底に沈殿し、血漿が上部に残存し、および白血球が、ＲＢＣの上で層を形成するであろう。遠心分離は、一般的にこの分離を促進するために使用される。血小板リッチ血漿は、その後除去されおよび例えば、血小板、凝固因子、アルブミン、免疫グロブリンなどを分離するためのさらなる処理のための滅菌バッグ内に移される。

通常の輸血使用のためにもっとも重要な組成物は、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）またはＲＢＣであり、そしてそれは、身体全体に酸素を運びおよび血液にその赤色を与える鉄含有タンパク質の複合体であるヘモグロビンを含む。ＲＢＣが構成される血液量のパーセンテージは、「ヘマトクリット」と呼ばれる。成人男性における平均ヘマトクリットは、４７％である。２または３滴の血液中に、約１０億のＲＢＣが存在し、および６００ＲＢＣごとに、約４０の血小板および１の白血球が存在する。

骨髄で産生され、ＲＢＣは、徐核され、連続的に生産され、分解されおよび破壊される両凹面のディスクである。両凹面のディスク形状は、肺における酸素の捕捉および組織におけるその放出のための最大の表面積を提供するため、ＲＢＣの機能に重要である。細胞は、柔軟であり、および毛細血管床の微小管を通過するために曲がることができる。細胞は、徐核されおよびミトコンドリアを欠くため、それらは、細胞の修復処理を実行できず、およびエネルギーのために嫌気的なリン酸化に依存しなければならない。循環系で平均１２０日後、細胞は老化しおよび末梢血単球または細網内皮系の定着性マクロファージにより貪食される。

ＲＢＣは、血漿を除去することにより全血から調製される。患者に輸血する場合、血液量の増加を最小限にしつつヘマトクリットを上昇させ、そしてそれは、特に、うっ血性心不全を伴うような患者に重要である。細胞は、典型的に、元の量の約半分で懸濁し；調製物は、濃縮赤血球（ｐａｃｋｅｄｒｅｄｃｅｌｌ）と呼ばれる。ＲＢＣの輸血から最も恩恵を受ける患者は、腎不全、悪性腫瘍、消化管出血などの疾患由来の慢性の難治性貧血または外傷または手術由来の急性の出血を伴うものを含む。

患者は、全血のすべての成分をほとんど必要としないので、血液を成分に分離しおよび特定の状態および疾患のために患者より必要とされる一部のみ輸血することが血液バンクにおける通常の業務である。「血液成分療法」として呼ばれるこの治療は、複数の患者が血液のそれぞれのユニットから利益を受けることを可能にする。残念ながら、治療のための血液成分の分離は、マーカー２，３‐ジホスホグリセラート（２，３‐ＤＰＧ）の減少、酸素フリーラジカルの産生の増加および形態の変化により特徴付けられる貯蔵損傷（ｌｅｓｉｏｎ）を引き起こし、有害である。

全血の貯蔵のための標準溶液は、シトレート‐ホスフェート‐デキストロース溶液（ＣＰＤ）およびシトレート‐ホスフェート‐デキストロース‐アデニン溶液（ＣＰＤＡ）を含む。シトレートまたはヘパリンなどの他の抗凝固剤は、凝固を防ぐために必要である。血液は、冷蔵温度ですら代謝機能を維持する生体組織であるため、デキストロースなどのエネルギー源を供給することが必要であるとみなされてきた。ホスフェートイオンは、デキストロース利用から産生されるラクテートをバッファーに使用することができる。

過去１５年にわたる細胞保存溶液についての改良は、全血またはＲＢＣの冷蔵貯蔵寿命を２１から４２日まで増加してきた。細胞の多くが老化しておりおよびレシピエント内の輸血に際してすぐに貪食されるであろうから、４２日後、血液は廃棄される。赤血球は、５または６週間、貯蔵で生き残ることを示すかもしれないが、それらは、溶血および／またはそれらの生存時間および組織に酸素を受容し、輸送し、および放出（ｕｎｌｏａｄ）するためのそれらの能力を傷つける生化学的および生体力学的な変化により特徴付けられる貯蔵損傷を急速に発生する。そのため、採血から３週間または未満以内で全血および血液製品を使用することが望ましい。

レシピエントに輸血する場合、全血または濃縮赤血球懸濁液中の血液細胞が、増加された時間貯蔵できおよび機能性を残存できる溶液のための要求が依然としてある。また次善として機能する血液およびＲＢＣを若返らせるための方法のための要求も依然としてある。

ＲＢＣを採取しおよび貯蔵するための方法は、輸血に先立って血液バンク業務を改善するための課題であり続ける。ＲＢＣは、４℃で４２日間貯蔵できるが、しかしこの期間を超えると、ＲＢＣ貯蔵損傷が、抗凝固溶液および血液添加剤の改善にも関わらず生じる。ＲＢＣのもっとも顕著な貯蔵損傷は、ａ）２，３‐ＤＰＧの欠乏であり、酸素親和性について増加に至り、組織に酸素を放出（ｏｆｆｌｏａｄ）するための血液の能力について減少に至る；ｂ）細胞生存率を減少し、脆弱性を増加し、および変形能を減少する形態学的な変化であり、微小循環を通過するための細胞の能力に強い影響を与え；およびｃ）熱、細胞障害、および組織機能不全を招く生化学物質の放出である。これらの貯蔵損傷は、主に細胞エネルギー（すなわち、アデノシントリホスフェート、またはＡＴＰ）および減少したエネルギー代謝に関連する乳酸蓄積に起因する。

２，３‐ＤＰＧ欠乏およびＡＴＰ減少の速度を遅らせる実験的な添加溶液は知られている。例えば、Ｄａｗｓｏｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｇＣｌｉｎＢｉｏｌＲｅｓ．１９８５；１９５：３４９‐６８；Ｄａｗｓｏｎｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ１９８４Ｊｕｌ‐Ａｕｇ；２４（４）：３２７‐９；Ｄａｗｓｏｎｅｔａｌ．，ＨｕｍＰａｔｈｏｌ．Ｍａｒ；１４（３）：２１３‐７；Ｄａｗｓｏｎｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ１９８１Ｍａｙ‐Ｊｕｎ；２１（３）：２８５‐９０；およびＤａｗｓｏｎｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ１９８１Ｍａｒ‐Ａｐｒ；２１（２）：２１５を参照。これらの実験的な溶液は、典型的に一連の無機リン酸塩およびイノシンを含む。溶液はある程度２，３‐ＤＰＧレベルを維持することが可能であるが、溶液成分の要件は、それらの有用性を制限するいくつかの問題を引き起こした。一つの問題は、イノシンの低い溶解性であり、そしてそれは、後に輸血前に細胞を洗浄することを必要とするＲＢＣに添加されるスラリーを生じる。他の問題は、ヒポキサンチンおよび尿酸などの強力に毒性の分解生成物の形成を引き起こす生化学的進行である。さらに、輸血製品は、輸血前に一時間加温しなければならず、そしてそれは、現在の血液バンク業務においてそのような添加溶液の実用性に強い影響を与える。好ましい実施態様では、本明細書中で開示された血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、これらの問題の一またはそれ以上に取り組む。

一つの態様では、本開示は、血液貯蔵および／または若返らせる組成物を提供する。一つの実施態様では、組成物は、Ｄ‐リボースおよびＬ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニン（および好ましくはＬ‐アルギニン）を含む。場合により、組成物は、さらにピルビン酸ナトリウム、無機リン酸塩、およびイノシンの一またはそれ以上を含んでもよい。好ましい実施態様では、組成物は水性溶液である。そのような組成物を使用するための方法が、また開示される。

他の実施態様では、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、７５‐１５００ｍＭＬ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニン（および好ましくはＬ‐アルギニン）；および７５‐１５００ｍＭイノシンを含み、ここで組成物は、水性溶液である。場合により、組成物は、例えば、７５‐１５００ｍＭの濃度でＤ‐リボースをさらに含んでもよい。場合により、組成物は、例えば、７５‐１５００ｍＭの濃度でピルビン酸ナトリウムをさらに含んでもよい。場合により、組成物は、例えば、７５‐１５００ｍＭの濃度で無機リン酸塩をさらに含んでもよい。血液を貯蔵しおよび／または若返らせるために使用される場合、組成物は、２．５‐５０ｍＭＬ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニン（および好ましくはＬ‐アルギニン）；２．５‐５０ｍＭイノシン；および場合により２．５‐５０ｍＭＤ‐リボース、２．５‐５０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および／または２．５‐５０ｍＭ無機リン酸塩の最終濃度を提供するために、一般的に約３０倍希釈される。

ある好ましい実施態様では、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、１５０‐９００ｍＭＬ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニン（および好ましくはＬ‐アルギニン）；および１５０‐９００ｍＭイノシンを含み、および組成物は、水性溶液である。場合により、組成物は、例えば１５０‐９００ｍＭの濃度でＤ‐リボースをさらに含んでもよい。場合により、組成物は、例えば１５０‐９００ｍＭの濃度でピルビン酸ナトリウムをさらに含んでもよい。場合により、組成物は、例えば１５０‐９００ｍＭの濃度で無機リン酸塩をさらに含んでもよい。血液を貯蔵しおよび／または若返らせるために使用される場合、組成物は、５‐３０ｍＭＬ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニン（および好ましくはＬ‐アルギニン）；および５‐３０ｍＭイノシン；および場合により５‐３０ｍＭＤ‐リボース、５‐３０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および／または５‐３０ｍＭ無機リン酸塩の最終濃度を提供するために、一般的に約３０倍希釈される。

他の実施態様では、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、３００‐６００ｍＭＬ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニン（および好ましくはＬ‐アルギニン）；および３００‐６００ｍＭイノシンを含み、および組成物は、水性溶液である。場合により、組成物は、例えば３００‐６００ｍＭの濃度でＤ‐リボースをさらに含んでもよい。場合により、組成物は、例えば３００‐６００ｍＭの濃度で、ピルビン酸ナトリウムをさらに含んでもよい。場合により、組成物は、３００‐６００ｍＭの濃度で、無機リン酸塩をさらに含んでもよい。血液を貯蔵しおよび／または若返らせるために使用される場合、１０‐２０ｍＭＬ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニン（および好ましくはＬ‐アルギニン）；および１０‐２０ｍＭイノシン；および場合により１０‐２０ｍＭＤ‐リボース、１０‐２０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および／または１０‐２０ｍＭ無機リン酸塩の最終濃度を提供するために、一般的に約３０倍希釈される。

ある実施態様では、Ｌ‐アルギニンとイノシンのモル比は、０．５：１‐１．５：１である。他のある実施態様では、Ｌ‐アルギニンとイノシンのモル比は、０．８：１‐１．２：１である。ある好ましい実施態様では、Ｌ‐アルギニンとイノシンのモル比は、１：１である。

他の実施態様では、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、３００ｍＭＬ‐アルギニン；３００ｍＭイノシン；３００ｍＭＤ‐リボース；３００ｍＭピルビン酸ナトリウム；および３００ｍＭ無機リン酸塩を含み、ここで組成物は水性溶液である。血液を貯蔵しおよび／または若返らせるために使用される場合、組成物は、１０ｍＭＬ‐アルギニン；１０ｍＭイノシン；１０ｍＭＤ‐リボース；１０ｍＭピルビン酸ナトリウム；および１０ｍＭ無機リン酸塩の最終濃度を提供するために、一般的に約３０倍に希釈される。

ある実施態様では、本明細書中に記載されたような血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、塩化ナトリウム、デキストロース、アデニン、マンニトール、クエン酸ナトリウム、およびクエン酸の一またはそれ以上をさらに含んでもよい。

一つの例では、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、Ｌ‐アルギニン、イノシン、Ｄ‐リボース、ピルビン酸ナトリウム、無機リン酸塩、塩化ナトリウム、デキストロース、アデニン、およびマンニトールを含む添加溶液であってもよい。そのような添加溶液は、ＡＣＤ、ＣＰＤ、ＣＰＤＡ‐１およびそれらの組合せからなる群から選択される抗凝固剤を含む血液を貯蔵しおよび／または若返らせるために、特に有用である。

他の例では、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、Ｌ‐アルギニン、イノシン、Ｄ‐リボース、ピルビン酸ナトリウム、無機リン酸塩、塩化ナトリウム、デキストロース、アデニン、クエン酸ナトリウム、およびクエン酸を含む添加溶液であってもよい。そのような添加溶液は、ＣＰ２Ｄ抗凝固剤を含む血液を貯蔵しおよび／または若返らせるために、特に有用である。

ＲＢＣを貯蔵しおよび／または若返らせるための方法は、本明細書中に記載される。追加的な方法が、例えば、米国特許出願公開第２００７／０１１１１９１Ａ１（Ｓｔ．Ｃｙｒｅｔａｌ．），米国特許第７，６８７，４６８（Ｓｔ．Ｃｙｓｅｔａｌ．），およびこれとともに同日に出願された、表題「ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥ‐ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＴＲＥＡＴＩＮＧＲＥＤＢＬＯＯＤＣＥＬＬＳ」（代理人整理番号３７４．０００３０１０１）である、同時係属中の米国特許出願シリアル番号に記載されている。

他の態様では、本開示は、貯蔵されたＲＢＣの抗酸化防御を改善するための方法をさらに提供する。

一つの実施態様では、本方法は、本明細書中で記載されたようにＲＢＣと血液貯蔵および／または若返らせる組成物とを接触させることを含む。

他の実施態様では、本方法は、ＲＢＣおよび抗凝固剤を含む組成物と本明細書中で記載されたような添加溶液とを接触させることを含み、ここで抗凝固剤は、ＡＣＤ、ＣＰＤ、ＣＰＤＡ‐１、およびそれらの組合せからなる群から選択される。

他の実施態様では、本方法は、ＲＢＣおよび抗凝固剤を含む組成物と本明細書中で記載されたような添加溶液とを接触させることを含み、ここで抗凝固剤は、ＣＰ２Ｄである。

本出願内に記載された技術は、好ましい実施態様では、イノシンに関連する溶解性障害を引き起こさず、高いレベルの分解生成物を生産せず、および／または輸血前にＲＢＣの加温を必要としないＲＢＣ貯蔵および／または若返らせる組成物を記載する。本明細書中に記載された貯蔵および／または若返らせる組成物は、デノボ合成およびＡＴＰを含むプリンヌクレオチドの代謝のサルベージを助けるために役立つことができるペントースカルボハイドレート（例えば、Ｄ‐リボース）を含む。貯蔵および／または若返らせる組成物は、また無機リン酸塩含み、そしてそれは加リン酸分解のための基質として供給でき；および／またはピルビン酸ナトリウムを含み、そしてそれはＮＡＤのためのソースとして供給できおよび１，３‐ジホスホグリセラートを２，３‐ＤＰＧまたは３‐ホスホグリセラートのいずれかに変換することを可能にする。一つの実施態様では、Ｌ‐アルギニンは、イノシンを完全に溶解するために利用される。

定義
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびそれらのバリエーションは、これらの用語が明細書および請求項で現れた場合、限定的な意味を有しない。

本明細書中で使用される「一つ（ａ）」、「一つ（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、「少なくとも一つ（ａｔｌｅａｓｔｏｎｅ）」および「一またはそれ以上（ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ）」は、互換的に使用される。

また本明細書中、エンドポイントによる数値範囲の列挙は、その範囲内に包含されたすべての数値を含む（例えば、１‐５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。

ＡＣＤ（クエン酸デキストロース）は、抗凝固剤および保存溶液であり、１Ｌあたりクエン酸三ナトリウム（二水和物）２２．０ｇ、クエン酸（一水和物）８．０ｇ、およびデキストロース（一水和物）２４．５ｇを水中に含むことが報告される。

ＣＰＤ（シトレートホスフェートデキストロース）は、抗凝固剤および保存溶液であり、１Ｌあたり、クエン酸三ナトリウム（二水和物）２６．３０ｇ、クエン酸（一水和物）３．２７ｇ、リン酸二水素ナトリウム（一水和物）２．２２ｇ、およびデキストロース（一水和物）２５．５ｇを水中に含むことが報告される。

ＣＰＤＡ‐１（シトレートホスフェートデキストロースアデニン）は、抗凝固剤および保存溶液であり、１Ｌあたり、クエン酸三ナトリウム（二水和物）２６．３０ｇ、クエン酸（一水和物）３．２７ｇ、リン酸二水素ナトリウム（一水和物）２．２２ｇ、デキストロース（一水和物）３１．９ｇ、およびアデニン０．２７５ｇを水中に含むことが報告される。

ＣＰ２Ｄ（シトレートホスフェートダブルデキストロース）は、抗凝固剤および保存溶液であり、１Ｌあたり、クエン酸三ナトリウム（二水和物）２６．３０ｇ、クエン酸（一水和物）３．２７ｇ、リン酸二水素ナトリウム（一水和物）２．２２ｇ、およびデキストロース（一水和物）５１．１ｇを水中に含むことが報告される。

ＡＳ１は、シトレートホスフェートデキストロースタイプ抗凝固剤溶液（例えば、ＣＰＤおよびＣＰＤＡ‐１）で使用するための添加溶液であり、１００ｍｌあたり、デキストロース（一水和物）２．２０ｇ、アデニン２７ｍｇ、マンニトール７５０ｍｇ、および塩化ナトリウム９００ｍｇを含むことが報告される。添加溶液は、血漿から分離された後、ＲＢＣに一般的に添加される。

ＡＳ３は、ＣＰ２Ｄ抗凝固剤溶液で使用するための添加溶液であり、１００ｍｌあたり、デキストロース（無水）１．１ｇ、アデニン３０ｍｇ、リン酸二水素ナトリウム（一水和物）２７６ｍｇ、塩化ナトリウム４１０ｍｇ、クエン酸ナトリウム（二水和物）５８８ｍｇ、およびクエン酸（一水和物）４２ｍｇを含むことが報告される。添加溶液は、血漿から分離された後、ＲＢＣに一般的に添加される。

ＡＳ５は、シトレートホスフェートデキストロースタイプ抗凝固剤溶液（例えば、ＣＰＤおよびＣＰＤＡ‐１）で使用するための添加溶液であり、１００ｍｌあたり、デキストロース（一水和物）９００ｍｇ、アデニン３０ｍｇ、マンニトール５２５ｍｇ、および塩化ナトリウム８７７ｍｇを含むことが報告される。添加溶液は、血漿から分離された後、ＲＢＣに一般的に添加される。

本発明のさまざまな実施態様の上記概要は、本発明のそれぞれの実施態様またはすべての実施を記載することを意図していない。むしろ、本発明のより完全な理解は、添付する図面を考慮して、以下の明細書および請求項を参照することにより明らかになりおよび認識されるであろう。さらに、他の実施態様が、使用されてもよくおよび本発明の範囲から逸脱せずに構造的な変化がなされてもよいことが理解されるべきである。

図１は、Ｙ軸上にプロットされたヘモグロビン飽和度（％）、およびＸ軸上にプロットされたＰ_O2（ｍｍＨｇ）で、２，３‐ＤＰＧレベル（２，３‐ＤＰＧなし、通常の２，３‐ＤＰＧレベル；および２，３‐ＤＰＧ添加）の効果を示す酸素解離曲線のグラフ図である。図２は、本発明の実施例（溶液Ａ）およびコントロールを使用するヒト血液のための２，３‐ＤＰＧレベル（ｍｍｏｌ２，３‐ＤＰＧ／赤血球１Ｌ）対貯蔵時間（日）を示すグラフ図である。図３は、本発明の実施例（溶液Ａ）およびコントロールを使用するヒト血液のためのＡＴＰレベル（ＡＴＰ、％ベースライン）対貯蔵時間（日）を示すグラフ図である。図４は、本発明の実施例（溶液Ａ）およびコントロールを使用するヒト血液のための還元型グルタチオンレベル（％ベースライン）対貯蔵時間（日）を示すグラフ図である。図５は、本発明の実施例（溶液Ａ）およびコントロールを使用するヒト血液のためのＰ５０レベル（ｍｍＨｇ）対貯蔵時間（日）を示すグラフ図である。図６は、本発明の実施例（溶液ＤおよびＥ）およびコントロールを使用するヒト血液のための２，３‐ＤＰＧレベル（ｍｍｏｌ２，３‐ＤＰＧ／赤血球１Ｌ）対貯蔵時間（日）を示すグラフ図である。図７は、本発明の実施例（溶液ＤおよびＥ）およびコントロールを使用するヒト血液のためのＡＴＰレベル（ＡＴＰ、％ベースライン）対貯蔵時間（日）を示すグラフ図である。図８は、本発明の実施例（溶液ＤおよびＥ）およびコントロールを使用するヒト血液のためのｐＨ対貯蔵時間（日）を示すグラフ図である。図９は、本発明の実施例（溶液ＤおよびＥ）およびコントロールを使用するヒト血液のための還元型グルタチオンレベル（％）対貯蔵時間（日）を示すグラフ図である。

１９１５年、輸血が、直接ドナーからレシピエントに最初に試みられた。後の第一次世界大戦までの間、業務が、血液を採取するためにシトレートグルコース溶液の使用、冷蔵の使用、および血液型検査で改善した。その後、１９６０年代‐１９７０年代において、ガラスボトル貯蔵が、耐久性のあるプラスチックバッグに代わり、より良い抗凝固剤が開発され、並びにマンニトールおよびアデニンの添加が、４２日間ＲＢＣの貯蔵を可能にして、改善が続いた。例えば、Ｂａｒｔｌｅｔｔｅｔａｌ．，Ｊ．ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９６０；３９：５６；Ｂｕｎｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９６９；４８：３１１；Ａｋｅｒｂｌｏｍｅｔａｌ．，ＳｃａｎｄＪ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９６８；２１：２４５‐２４８；およびＤｅｌｉｖｏｒｉａ‐Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９６９；１６５：６０１‐６０２を参照。今日、血液は、まだアデニンおよびシトレートを含むさまざまな抗凝固剤溶液で保存されている。血液は、４℃で保存され、可塑化された血液バッグ中に採取され、および仮に４２日内に使用されなくても、ＲＢＣ生存率が、その期間後、大きく損失するため、破棄される。ＲＢＣが死ぬとき、溶解された細胞がより耐久性のあるヘモグロビン分子を放出し、そしてそれは、低いＰ５０を有し、およびそれは、酸素の拡散に障壁を示す。今日、米国で年間輸血される約１６百万ユニットのＲＢＣがあることが推定される。

ＲＢＣは、貯蔵の間、それらの輸血後の能力に影響を及ぼす主な生化学的および生体力学的変化を受ける。近年の疫学調査は、より長く貯蔵された血液の輸血が、増加した死亡率、重篤な感染症、多臓器不全、および入院期間に関連することが示された。例えば、Ｗａｌｓｈｅｔａｌ．，Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．２００４；３２：３６４‐３７１；ＶａｎｄｅＷａｔｅｒｉｎｇｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ２００６；４６：１７１２‐１７１８；Ｖａｍｖａｋａｓｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ２０００；４０：１０１‐１０９；およびＨｅｂｅｒｔｅｔａｌ．，Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ＆Ａｎａｌｇｅｓｉａ．２００５；１００：１４３３‐１４３８を参照。ＲＢＣ貯蔵損傷は、ヒト赤血球の主な有機リン酸塩である２，３‐ＤＰＧの減少により証明される。Ｐ５０（ヘモグロビンが５０％飽和であるときの酸素（０₂）の分圧）により示されるように、細胞内の２，３‐ＤＰＧ含量は、酸素‐ヘモグロビン解離曲線の位置と互いに関係がある。従来の血液バンク条件下貯蔵された血液において、２，３‐ＤＰＧレベルは、急激に下落し、および貯蔵１０日までに、２，３‐ＤＰＧレベルは、それらのもとのレベルの２０‐２５％のみになる。貯蔵２１日の間に、それらは、それらの最初の含量の１０％に下落する（ＶａｎｄｅＷａｔｅｒｉｎｇｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ２００６；４６：１７１２‐１７１８；およびＶａｍｖａｋａｓｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ２０００；４０：１０１‐１０９）。

貯蔵損傷は、重要な関心事および輸血医学における研究の主な焦点のままである。証拠は、長期間のＲＢＣの貯蔵が、減少した酸素送達となり、およびより古い血液（例えば、貯蔵１４日超）の輸血が、多臓器不全の発生のための独立したリスクファクターとして同定されてきた。例えば、（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄｅｔａｌ．，Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．１９９７；２５：７２６‐７３２；Ｍａｒｉｋｅｔａｌ．，ＪＡＭＡ，１９９３；２６９：３０２４‐３０２９；Ｒａａｔｅｔａｌ．，Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．，２００５；３３：３９‐４５；およびＺａｌｌｅｎｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．，１９９９；１７８：５７０‐５７２）を参照。

初期の研究の結果に基づき（例えば、ＶａｎｄｅＷａｔｅｒｉｎｇｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ２００６；４６：１７１２‐１７１８；およびＶａｍｖａｋａｓｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ２０００；４０：１０１‐１０９）、ＲＢＣ中の２，３‐ＤＰＧレベルが、輸血の２４時間以内に若返っていることが想定されてきた。これらの研究は、循環の問題がなくおよび正常の血液量である正常のボランティアで実施された。そのような回復は、大量出血、循環性の問題、または根底にある健康状態に関連する問題を被っている患者で起こるかどうかは知られていない。さらに、輸血後の初期の時間における重要な意味を持つ時間の間、組織に酸素を送達することが輸血されたＲＢＣにできないことが、臨床成績に重要な影響を有するかもしれない。ある研究は、輸血されるＲＢＣの年齢が、ある状態で臨床成績についてほとんどまたは全く影響を有しないことを示すが（例えば、Ｈｅｂｅｒｔｅｔａｌ．，Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ＆Ａｎａｌｇｅｓｉａ．２００５；１００：１４３３‐１４３８）、他は、ＲＢＣの貯蔵の期間が有害事象と関連することを示す、反対のことを示唆する（Ｏｓｋｉｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１９７１；３７：５２‐５８）。

文献の優勢は、貯蔵損傷を制限または逆行するであろう、輸血医学に相当な結果となるであろう、およびＲＢＣ輸血をより安全におよびより効果的にすることを助けることができるＲＢＣ貯蔵溶液（複数）の開発を提案する。例えば、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄｅｔａｌ．，Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．１９９７；２５：７２６‐７３２；Ｍａｒｉｋｅｔａｌ．，ＪＡＭＡ，１９９３；２６９：３０２４‐３０２９；Ｒａａｔｅｔａｌ．，Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．，２００５；３３：３９‐４５；Ｚａｌｌｅｎｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．，１９９９；１７８：５７０‐５７２；Ｂｕｅｔｌｅｒｅｔａｌ．，ＪＬａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１９６９；７４：３００；およびＶａｌｅｒｉｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｍ．Ｍｅｄ．，１９６９；７３：７２２‐７３３を参照。本開示されたＲＢＣ貯蔵および／または若返らせる組成物が、そのような回復性の利益を提供することが仮定される。

一つの態様では、本開示は、血液貯蔵および／または若返らせる組成物を提供する。一つの実施態様では、組成物は、Ｄ‐リボースおよびＬ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニン（および好ましくはＬ‐アルギニン）を含む。場合により、組成物は、ピルビン酸ナトリウム、無機リン酸塩、およびイノシンの一またはそれ以上をさらに含んでもよい。好ましい実施態様では、組成物は、水性溶液である。好ましい実施態様では、組成物は、ｐＨ６‐８．５を有する水性組成物である。そのような組成物を使用するための方法が、また開示されている。

他の実施態様では、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、７５‐１５００ｍＭＬ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニン（および好ましくはＬ‐アルギニン）；および７５‐１５００ｍＭイノシンを含み、ここで組成物は、水性溶液である。場合により、組成物は、例えば７５‐１５００ｍＭの濃度でＤ‐リボースをさらに含んでもよい。場合により、組成物は、例えば７５‐１５００ｍＭの濃度でピルビン酸ナトリウムをさらに含んでもよい。場合により、組成物は、例えば７５‐１５００ｍＭの濃度で無機リン酸塩をさらに含んでもよい。血液を貯蔵しおよび／若返らせるために使用する場合、組成物は、２．５‐５０ｍＭＬ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニン（および好ましくはＬ‐アルギニン）；２．５‐５０ｍＭイノシン；および場合により２．５‐５０ｍＭＤ‐リボース、２．５‐５０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および／または２．５‐５０ｍＭ無機リン酸塩の最終濃度を提供するために一般的に約３０倍に希釈される。

ある好ましい実施態様では、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、１５０‐９００ｍＭＬ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニン（および好ましくはＬ‐アルギニン）；および１５０‐９００ｍＭイノシンを含み、および組成物は、水性溶液である。場合により、組成物は、例えば１５０‐９００ｍＭの濃度でＤ‐リボースをさらに含んでもよい。場合により、組成物は、例えば１５０‐９００ｍＭの濃度でピルビン酸ナトリウムを含む。場合により、組成物は、例えば１５０‐９００ｍＭの濃度で無機リン酸塩をさらに含む。血液を貯蔵しおよび／または若返らせるために使用する場合、組成物は、５‐３０ｍＭＬ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニン（および好ましくはＬ‐アルギニン）；および５‐３０ｍＭイノシン；および場合により５‐３０ｍＭＤ‐リボース、５‐３０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および／または５‐３０ｍＭ無機リン酸塩の最終濃度を提供するために一般的に約３０倍に希釈される。

他の好ましい実施態様では、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、３００‐６００ｍＭＬ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニン（および好ましくはＬ‐アルギニン）；および３００‐６００ｍＭイノシンを含み、および組成物は、水性溶液である。場合により、組成物は、例えば３００‐６００ｍＭの濃度でＤ‐リボースをさらに含んでもよい。場合により、組成物は、例えば３００‐６００ｍＭの濃度でピルビン酸ナトリウムをさらに含んでもよい。場合により、組成物は、例えば３００‐６００ｍＭの濃度で無機リン酸塩を含んでもよい。血液を貯蔵しおよび／または若返らせるために使用する場合、組成物は、１０‐２０ｍＭＬ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニン（および好ましくはＬ‐アルギニン）；および１０‐２０ｍＭイノシン；および場合により１０‐２０ｍＭＤ‐リボース、１０‐２０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および／または１０‐２０ｍＭ無機リン酸塩の最終濃度を提供するために一般的に約３０倍に希釈される。

他の実施態様では、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、３００ｍＭＬアルギニン；３００ｍＭイノシン；３００ｍＭＤ‐リボース；３００ｍＭピルビン酸ナトリウム；および３００ｍＭ無機リン酸塩を含み、ここで組成物は、水性溶液である。血液を貯蔵しおよび／または若返らせるために使用する場合、組成物は、１０ｍＭＬ‐アルギニン；１０ｍＭイノシン；１０ｍＭＤ‐リボース；１０ｍＭピルビン酸ナトリウム；および１０ｍＭ無機リン酸塩の最終濃度を提供するために一般的に約３０倍希釈される。

一つの例では、血液貯蔵および／または若返り（ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ）組成物は、Ｌ‐アルギニン、イノシン、Ｄ‐リボース、ピルビン酸ナトリウム、無機リン酸塩、塩化ナトリウム、デキストロース、アデニン、およびマンニトールを含む添加溶液であってもよい。そのような添加溶液は、ＡＣＤ、ＣＰＤ、ＣＰＤＡ‐１およびそれらの組合せからなる群から選択される抗凝固剤を含む血液を貯蔵しおよび／または若返らせるために特に有用である。

他の例では、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、Ｌ‐アルギニン、イノシン、Ｄ‐リボース、ピルビン酸ナトリウム、無機リン酸塩、塩化ナトリウム、デキストロース、アデニン、クエン酸ナトリウム、およびクエン酸を含む添加溶液であってもよい。そのような添加溶液は、ＣＰ２Ｄ抗凝固剤を含む血液を貯蔵しおよび／または若返らせるために特に有用である。

本明細書中で記載される組成物が、例えば、血液を貯蔵するための方法で、使用されてもよい。ある実施態様では、本方法は、ＲＢＣ（例えば、濃縮赤血球または全血において）と本明細書中で記載されたような血液貯蔵および／または若返らせる組成物とを接触させることを含む。

代替的に、または加えて、本明細書中に記載された組成物は、例えば、血液（例えば、濃縮赤血球または全血において）を若返らせるための方法で使用されてもよい。ある実施態様では、本方法は、ＲＢＣと本明細書中で記載されたような血液貯蔵および／または若返らせる組成物とを接触させることを含む。

いくつかの実施態様では、本明細書中で開示された血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、全血の採取に際しＲＢＣに；血漿が除去される前、間、および／または後ＲＢＣに；および／または貯蔵の前、間、および／または後濃縮ＲＢＣに添加されてもよい添加溶液の形態であってもよい。

ある好ましい実施態様では、血液を若返らせるための方法は、２，３‐ＤＰＧ値が新たに採取した血液よりも低い値を有するＲＢＣ（例えば、濃縮ＲＢＣまたは全血において）を提供すること；および２，３‐ＤＰＧ値を増加するために効果的な条件下、血液貯蔵および／または若返らせる組成物でＲＢＣを混合することを含み、ここで、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、Ｌ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニンを含む。ある実施態様では、２，３‐ＤＰＧ値を増加するために効果的な条件は、４℃‐３７℃の温度で、およびある好ましい実施態様では室温の温度で、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。ある実施態様では、２，３‐ＤＰＧ値を増加するために効果的な条件は、少なくとも１０分間、好ましい実施態様では１０分間‐４８時間、ある好ましい実施態様では、１０分間‐４時間、および他の好ましい実施態様では、３０分間‐２時間、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。２，３‐ＤＰＧ値を増加するために効果的な典型的な条件は、３７℃で１０分間‐４時間、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。２，３‐ＤＰＧ値を増加するための効果的な他の典型的な条件は、室温で１０分間‐２４時間、いくつかの実施態様では、１０分間‐８時間、およびいくつかの実施態様では、１０分間‐４時間、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。好ましい実施態様では、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、本明細書中に記載された血液貯蔵および／または若返らせる組成物の一またはそれ以上を含む。

ある好ましい実施態様では、血液を若返らせるための方法は、ＡＴＰ値が、新たに採取した血液よりもより低い値を有するＲＢＣ（例えば、濃縮ＲＢＣまたは全血において）を提供すること、およびＡＴＰ値を増加するために効果的な条件下、血液貯蔵および／または若返らせる組成物でＲＢＣを混合することを含み、ここで血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、Ｌ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニンを含む。ある実施態様では、ＡＴＰ値を増加するために効果的な条件は、４℃‐３７℃の温度で、およびある好ましい実施態様では室温の温度で、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。ある実施態様では、ＡＴＰ値を増加するために効果的な条件は、少なくとも１０分間、好ましい実施態様では１０分間‐４８時間、ある好ましい実施態様では、１０分間‐４時間、および他の好ましい実施態様では、３０分間‐２時間、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。ＡＴＰ値を増加するために効果的な典型的な条件は、３７℃で１０分間‐４時間、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。ＡＴＰ値を増加するための効果的な他の典型的な条件は、室温で１０分間‐２４時間、いくつかの実施態様では、１０分間‐８時間、およびいくつかの実施態様では、１０分間‐４時間、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。好ましい実施態様では、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、本明細書中に記載された血液貯蔵および／または若返らせる組成物の一またはそれ以上を含む。

ある好ましい実施態様では、血液を若返らせるための方法は、還元型グルタチオン値が、新たに採取した血液よりもより低い値を有するＲＢＣ（例えば、濃縮ＲＢＣまたは全血において）を提供すること、および還元型グルタチオン値を増加するために効果的な条件下、血液貯蔵および／または若返らせる組成物でＲＢＣを混合することを含み、ここで血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、Ｌ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニンを含む。ある実施態様では、還元型グルタチオン値を増加するために効果的な条件は、４℃‐３７℃の温度で、およびある好ましい実施態様では室温の温度で、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。ある実施態様では、還元型グルタチオン値を増加するために効果的な条件は、少なくとも１０分間、好ましい実施態様では１０分間‐４８時間、ある好ましい実施態様では、１０分間‐４時間、および他の好ましい実施態様では、３０分間‐２時間、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。還元型グルタチオン値を増加するために効果的な典型的な条件は、３７℃で１０分間‐４時間、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。還元型グルタチオン値を増加するための効果的な他の典型的な条件は、室温で１０分間‐２４時間、いくつかの実施態様では、１０分間‐８時間、およびいくつかの実施態様では、１０分間‐４時間、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。好ましい実施態様では、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、本明細書中に記載された血液貯蔵および／または若返らせる組成物の一またはそれ以上を含む。

ある好ましい実施態様では、血液を若返らせるための方法は、酸素解離Ｐ５０値が、新たに採取した血液よりもより低い値を有するＲＢＣ（例えば、濃縮ＲＢＣまたは全血において）を提供すること、および酸素解離Ｐ５０値を増加するために効果的な条件下、血液貯蔵および／または若返らせる組成物でＲＢＣを混合することを含み、ここで血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、Ｌ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニンを含む。ある実施態様では、酸素解離Ｐ５０値を増加するために効果的な条件は、４℃‐３７℃の温度で、およびある好ましい実施態様では室温の温度で、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。ある実施態様では、酸素解離Ｐ５０値を増加するために効果的な条件は、少なくとも１０分間、好ましい実施態様では１０分間‐４８時間、ある好ましい実施態様では、１０分間‐４時間、および他の好ましい実施態様では、３０分間‐２時間、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。酸素解離Ｐ５０値を増加するために効果的な典型的な条件は、３７℃で１０分間‐４時間、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。酸素解離Ｐ５０値を増加するための効果的な他の典型的な条件は、室温で１０分間‐２４時間、いくつかの実施態様では、１０分間‐８時間、およびいくつかの実施態様では、１０分間‐４時間、血液貯蔵および／または若返らせる組成物で細胞をインキュベートすることを含む。好ましい実施態様では、血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、本明細書中に記載された血液貯蔵および／または若返らせる組成物の一またはそれ以上を含む。

他の態様では、本開示は、さらに貯蔵されたＲＢＣの抗酸化防御を改善するための方法をさらに提供する。

一つの実施態様では、本方法は、ＲＢＣと本明細書中で記載されたような血液貯蔵および／または若返らせる組成物とを接触させることを含む。

他の実施態様では、本方法は、ＲＢＣおよび抗凝固剤を含む組成物と本明細書中で記載したような添加溶液とを接触させることを含み、ここで抗凝固剤は、ＡＣＤ、ＣＰＤ、ＣＰＤＡ‐１、およびそれらの組合せからなる群から選択される。

他の実施態様では、本方法は、ＲＢＣおよび抗凝固剤を含む組成物と本明細書中に記載された添加溶液とを接触させることを含み、ここで抗凝固剤は、ＣＰ２Ｄである。

ストレスを受けたＲＢＣで２，３‐ＤＰＧ濃度を増加することにより、本明細書中に開示されたようなＲＢＣ貯蔵および／または若返らせる組成物が、酸素親和性を減少しおよび輸血後に影響を受けた組織に酸素送達を増加するであろうことが仮定される。さらに、細胞エネルギーを維持することにより、本明細書中で開示された貯蔵および若返らせる組成物は、細胞脆弱性を減少しおよび変形能を増加し、それによって、毛細血管を通る流れを改善することが仮定される。最終結果は、貯蔵損傷についての減少および輸血後に影響を受けた組織により多い酸素の送達であろう。

好ましい実施態様では、本明細書中に開示された血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、貯蔵された赤血球の抗酸化防御を維持しおよび高めるための追加的な利益を有し、それにより貯蔵損傷を減少する。貯蔵溶液は、ＲＢＣ貯蔵損傷の影響を最小限にしおよび貯蔵されたＲＢＣの機能性を改善する組成物を提供することにより血液バンクおよび輸血技術に積極的に影響を及ぼすと思われる。

２，３‐ＤＰＧおよび細胞内ＡＴＰの減少により引き起こされるＲＢＣにおける機能的変化は、よく実証されている。ＲＢＣ低温貯蔵は、ＲＢＣの４２日貯蔵までの成功をもたらしてきた。しかしながら、いくつかの現在の貯蔵溶液は、活性酸素種の形成に至る赤血球に対する時間依存的酸化攻撃、膜リン脂質に対する変性ヘモグロビンの付着、および貯蔵を通じて膜微小胞を含むヘモグロビンの放出を防止しない（Ｋａｎｉａｓｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＪｏｕｒｎａｌ，２００９；２７７：３４３‐３５６）。

自発的な脂質過酸化は、赤血球老化の主な原因の一つとして報告されてきた。例えば、Ｊｏｚｗｉｋｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ，．Ａｃｔａ．，１９９７Ｎｏｖ２８；２６７（２）：１２９‐１４２；Ｄｏｒｍａｎｄｙ，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ，１９７１；２０：４５７‐４６１；Ｈａｌｌｉｗｅｌｌｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９８４；２１９：１‐１４；Ｃｈｉｕｅｔａｌ．，ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１９８９；２６：２５７‐２７６；Ｋｎｉｇｈｔｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，１９９２；３２：３５４‐３５７；およびＪａｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９８８；９３７：２０５‐２１０を参照。一般に酸化は、細胞障害の重大な原因であり、および脂質酸化の反応最終産物の蓄積、膜タンパク質および核酸構造の改変、並びに酵素活性の低下を招く（Ｄｕｍａｓｗａｌａｅｔａｌ．，ＦｒｅｅＲｅｄ．Ｒｅｓ．，２０００，３３：５１７‐５２９）。健康な赤血球では、重大な酸化障害は、グルタチオン（ＧＳＨ）、ビタミンＥ、ビタミンＣなどの小さな抗酸化化合物、およびＧＳＨ‐ペルオキシダーゼ（ＧＳＨ‐ＰＸ）、カタラーゼ、およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）などの酵素からなる、非常に効率的な抗酸化システムにより予防されている。ＧＳＨ‐ＰＸと一緒に、還元型ＧＳＨは、ＲＢＣ中で活性化された活性酸素種の主なスカベンジャーの一つである。ＧＨＳは、細胞内非タンパク質チオールの９０％を占め、および従って、ＲＢＣのための重要な細胞内還元剤である。ＲＢＣの低温貯蔵は、ＧＳＨの時間依存的減少を引き起こし、そしてそれは次々に強力に有毒なペルオキシド（例えば、ハイドロゲンペルオキシド）の増加を招くことが報告されている。さらに、ＧＳＨ濃度の減少は、ＧＳＨ‐ＰＸの減少およびマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を含む膜脂質およびタンパク質の酸化改変の増加を併発することが示されてきた（Ｄｅｎｅｋｅｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．ＬｕｎｇＣｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９８９；２５７：Ｌ１６３‐Ｌ１７３）。好ましい実施態様では、本明細書中で開示された血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、低温貯蔵の間、ＲＢＣに対する酸化攻撃と戦う。

好ましい実施態様では、本明細書中で開示された血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、低温貯蔵されたＲＢＣのＧＳＨレベルを維持し、そしてそれは、順番に貯蔵された血液で抗酸化活性を維持する。好ましい実施態様では、本明細書中で開示された血液貯蔵および／または若返らせる組成物は、溶液中にＤ‐リボースを含み、そしてそれはＰＲＰＰ合成を刺激することによりグルコース代謝のペントースホスフェート経路の律速段階をバイパスすることを可能にする。

本発明は、以下の例により例示される。特定の例、材料、量、および手順は、本明細書中で述べたような本発明の範囲および趣旨に従って広く解釈されるべきであることを理解すべきである。

実施例１
スラリーとして、すべて３００ｍＭでＤ‐リボース、イノシン、ピルビン酸ナトリウム、および無機リン酸塩を含む貯蔵および／または若返らせる組成物を、調製した。ＲＢＣを貯蔵しおよび／または若返らせるために使用する場合、溶液を形成するためにスラリーを３０倍希釈して、１０ｍＭの最終濃度にした。組成物は、貯蔵されたＲＢＣで２，３‐ＤＰＧレベルを回復しおよびベースライン値からＡＴＰ含量を増加する有意な結果を示した。研究において、ＲＢＣを採取しおよび標準血液バンク業務に従って、４℃で平均２１日間貯蔵した。さまざまなＲＢＣ貯蔵および／または若返らせる組成物を、２１日齢貯蔵ＲＢＣに添加しおよび２，３‐ＤＰＧ濃度について試験する前に、３７℃で１‐４時間保持した。２，３‐ＤＰＧレベルを、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｒｏｐ．（Ｃａｔ．＃１０１４８３３４００１）製の２，３‐ジホスホグリセラート（ＤＰＧ）診断キットを使用してすべての例について測定した。採取時ＲＢＣの通常の２，３‐ＤＰＧ濃度は、４．０μｍｏｌ／ｍｌである。貯蔵後、平均２，３‐ＤＰＧ濃度は、０．１７μｍｏｌ／ｍｌに低下する（表１）。ＲＢＣ貯蔵および／または若返らせる組成物の添加で、通常の採取後レベルの５０％超に濃度が回復した。１．０μｍｏｌ／ｍｌへの増加を、有意な改善とみなす。この一連の実験は、ＲＢＣ貯蔵および／または若返らせる組成物によりＡＴＰ含量および２，３‐ＤＰＧレベルが増加したことを示した。血液バンク業務で採用のための本溶液の実用性は、しかしながら、イノシンの低い溶解性同様に輸血前に血液の加温（例えば、１時間）を必要とするため、制限されるかもしれない。

実験上のプロトコールを、イノシンの溶解性を増加するための方法を見出すために設計した。等モル溶液中のＬ‐アルギニンが、室温で、イノシンが５０ｍＭ超の濃度で溶液中に残るように、イノシン溶解性を高めることを見出した。それぞれ３００ｍＭのイノシン、Ｌ‐アルギニン、ピルビン酸ナトリウム、Ｄ‐リボース、および無機リン酸塩を含む貯蔵および／または若返らせる組成物を、２１日齢貯蔵ＲＢＣ内で３０倍に希釈した。一つのセットの貯蔵された血液サンプルを、室温で６０分間インキュベートし、および他を、３７℃で６０分間インキュベートした。表２に示したように、Ｌ‐アルギニンを含む貯蔵および／または若返らせる組成物は、加温にかかわらず、２，３‐ＤＰＧおよびＡＴＰレベルをうまく回復した。この結果は、室温インキュベーションを使用する２，３‐ＤＰＧおよびＡＴＰの若返りおよび輸血前にスラリーおよび赤血球の洗浄に関連する問題のない溶液を示す。

実施例２
追加的な実験上のプロトコールを、イノシン以外のヌクレオシドが、２，３‐ＤＰＧおよびＡＴＰレベルの回復をうまく助けられ、および強力に分解産物の形成、ヒポキサンチンおよび尿酸を低減できるかを決定するために設計した。グアニンのＮ９窒素とリボースのＣ１炭素により結合したグアニンからなるプリンヌクレオシドであるグアノシンを、試験ヌクレオシドとして選択した。表３は、グアノシン、ピルビン酸ナトリウム、無機リン酸塩、およびＤ‐リボースをそれぞれ最終濃度１０ｍＭで含む貯蔵および／または若返らせる組成物を使用して得られたデータを示す。

１０ｍＭグアノシン溶液を、３７℃で６０分間加熱した場合、２，３‐ＤＰＧレベルを回復可能であった。濃縮されたグアノシン組成物は、完全に可溶性でなく、および希釈に際し、ＡＴＰレベルを上昇したが、室温インキュベーション後、２，３‐ＤＰＧレベルを回復しなかった。

実施例３
表４は、無機リン酸塩およびＤ‐リボースをそれぞれ１０ｍＭで、および示した濃度でグアノシンを含む貯蔵および／または若返らせる組成物を使用して得られたデータを示す。本溶液は、ピルビン酸ナトリウムを含まなかった。３７℃で６０分間のインキュベーションで、若返りを観察した。

実施例４
表５は、Ｌ‐アルギニン、イノシン、Ｄ‐リボース、ピルビン酸ナトリウム、および無機リン酸塩をそれぞれ１０ｍＭの最終濃度で含む貯蔵および／または若返らせる組成物を使用して得られたデータを示す。３７℃で１０分および６０分後、若返りを観察した。

実施例５
Ｄ‐リボース、ピルビン酸ナトリウム、および無機リン酸塩をそれぞれ１０ｍＭで含む貯蔵および／または若返らせる組成物において、イノシンをさまざまな濃度のイノシンモノホスフェートに置換した場合、３７℃で６０分間のインキュベーションで、若返りを観察しなかった。

実施例６
Ｄ‐リボース、ピルビン酸ナトリウム、および無機リン酸塩をそれぞれ１０ｍＭで含む貯蔵および／または若返らせる組成物について、イノシンをさまざまな濃度のリボース‐５‐ホスフェートに置換した場合、３７℃で６０分間のインキュベーションで、若返りを確認しなかった。

実施例７
イノシン、Ｄ‐リボース、ピルビン酸ナトリウム、および無機リン酸塩をそれぞれ１０ｍＭで含む貯蔵および／または若返らせる組成物について、４℃で１０分間のインキュベーションで、若返りを観察しなかった。

実施例８：酸素解離評価
酸素解離曲線（ＯＤＣ）は、さまざまな酸素分圧でヘモグロビンのパーセント飽和の測定を提供する。ＯＤＣは、酸素で赤血球が５０％飽和になる圧力測定であるＰ５０値を提供する。

Ｓ形状Ｏ₂平衡曲線の発見および１９０４年におけるボーア効果は、血液の呼吸機能およびヘモグロビン（Ｈｂ）におけるアロステリックメカニズムに豊かなおよび継続的な研究を刺激した。ボーア効果（ＨｂＯ₂親和性のｐＨ／ＣＯ₂の影響）および相互的なホールデン効果（Ｈ⁺／Ｃｏ₂結合のＨｂＯ₂飽和の影響）は、Ｈｂオキシ‐デオキシコンフォメーションの変化およびＯ₂およびＨ⁺／ＣＯ₂結合部位の間のアロステリック相互作用に由来する。定常状態では、Ｈ⁺は、ＲＢＣ膜を横切って受動的に分配され、および細胞内ｐＨ（ｐＨｉ）の変化は、細胞外ｐＨにおける変化、Ｈｂ‐Ｏ₂飽和およびＲＢＣ有機リン酸塩含量に関連する。Ｈｂ分子は、動脈‐静脈ガス輸送におけるオキシおよびデオキシコンフォメーションの間シフトするので、それは、組織の毛細血管において、Ｏ₂を送達しおよびＣＯ₂およびＨ⁺を奪う（ｔａｋｅｕｐ）（Ｊｅｎｓｅｎ，ＡｃｔａＰｈｙｓｉｏｌＳｃａｎｄ，Ｎｏｖ．２００４，１８２（３）：２１５‐２７）。

ＲＢＣ貯蔵および／または若返らせる組成物は、好ましくは、ＡＴＰ含量を上昇し、および２，３‐ＤＰＧレベルを増加する。しかしながら、貯蔵および／または若返らせる組成物が、赤血球から組織に増加した酸素解離を招くことが望ましい。本開示されているＲＢＣ貯蔵および／または若返らせる組成物が、酸素解離を高めることについて効果的であることを示した。

２，３‐ＤＰＧが、ヘモグロビンにおけるＯ₂の結合親和性を低くし；これは、曲線を右にシフトする。酸素解離における２，３‐ＤＰＧの効果を、図１で示す。

Ｐ５０値を、ＨｅｍｏｘＡｎａｌｚｅｒ（ＴＣＳＭｅｄｉｃａｌ，ＳｏｕｔｈＨａｍｐｔｏｎＰＡ）を使用して評価した。室温および３７℃下、酸素解離の評価の概要を、表６に示した。以下にリスト化した次の貯蔵および／または若返らせる組成物のすべての試験：次の１０ｍＭ（リボース、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ‐アルギニン、無機リン酸塩、イノシン）を評価した。評価したバッグは、ＣＤＰＡ‐ＡＳ１であった。

実施例９：貯蔵実験
Ｄ‐リボース、イノシン、Ｌ‐アルギニン、ピルビン酸ナトリウム、および無機リン酸塩の３０倍濃縮ストック溶液を、溶液Ａを作るために、シトレートホスフェートデキストロース抗凝固剤溶液（ＡＳ１、ＦｅｎｗａｌｌＩｎｃ．，ＬａｋｅＺｕｒｉｃｈ，ＩＬ）で調製し、そしてそれを１０ｍＭＤ‐リボース、１０ｍＭイノシン、１０ｍＭＬ‐アルギニン、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭ無機リン酸塩の最終血液濃度を提供するために、処方した。シトレートホスフェートデキストロース抗凝固剤溶液は、報告によれは、７０ｍｌ溶液あたりクエン酸三ナトリウム１．８ｇ、デキストロース１．７８ｇ、クエン酸２０９ｍｇ、およびリン酸二水素ナトリウム１５５ｍｇを含む。溶液ＡのｐＨを、ＨＣｌを使用して６．２５に調整した。

正常なドナー由来のヒト血液を、シリンジ中に２．５ｍｌの溶液Ａを事前に満たし、およびその後、溶液Ａを含むシリンジ内に直接ドナー血液を２０ｍｌ採取することにより、溶液Ａと血液の容積比１：８で、溶液Ａ中に採取した。コントロールとして、サンプルを、溶液Ａの代わりにＡＳ１添加溶液を使用して調製した。

サンプルを、２０ｍｌバッグでヒートシールしおよび４℃で貯蔵した。２，３‐ＤＰＧレベル、ｐＨ、ＡＴＰ、およびＰ５０を本明細書中で記載したように測定し、および結果を表７および図２‐５で示した。還元型グルタチオンを、ＯｘｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ製のＢｉｏｘｙｔｅｃｈＧＳＨ‐４２０キットを使用して測定した。

実施例１０：若返り実験
添加剤として、ＡＳ３またはＡＳ５のいずれかを含む古くなった濃縮ＲＢＣ（４５‐４７日）を、米国赤十字社（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）から得た。

溶液Ｂを作るために、Ｄ‐リボース、イノシン、Ｌ‐アルギニン、ピルビン酸ナトリウム、および無機リン酸塩の３０倍濃縮ストック溶液を、ＡＳ３添加剤（Ｐａｌｌ）で調製し、そしてそれを、１０ｍＭＤ‐リボース、１０ｍＭイノシン、１０ｍＭＬ‐アルギニン、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭ無機リン酸塩の最終血液濃度を提供するように処方した。１０ｍｌの溶液Ｂを、３００ｍｌの４７日後の濃縮ＲＢＣに添加した。コントロールとして、サンプルを、溶液Ｂの代わりにＡＳ３添加剤を使用して調製した。

溶液Ｃを作るために、Ｄ‐リボース、イノシン、Ｌ‐アルギニン、ピルビン酸ナトリウム、および無機リン酸塩の３０倍濃縮ストック溶液を、ＡＳ５添加剤（Ｔｅｒｕｍｏ）で調製し、そしてそれを、１０ｍＭＤ‐リボース、１０ｍＭイノシン、１０ｍＭＬ‐アルギニン、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭ無機リン酸塩の最終血液濃度を提供するように処方した。１０ｍｌの溶液Ｃを、３００ｍｌの４５日後の濃縮ＲＢＣに添加した。コントロールとして、サンプルを、溶液Ｃの代わりにＡＳ５添加剤を使用して調製した。

若返り条件は、３７℃で混合を伴って６０分間であり、２，３‐ＤＰＧレベルを測定し、およびその結果を表８に示した。

実施例１１：貯蔵実験
貯蔵実験を、本明細書中の以下で記載したように、ＡＳ３およびＡＳ５添加溶液を、ＡＳ１添加溶液の代わりに使用したことを除いて、実施例９に記載したように行った。

溶液Ｄを作るために、Ｄ‐リボース、イノシン、Ｌ‐アルギニン、ピルビン酸ナトリウム、および無機リン酸塩の３０倍濃縮ストック溶液を、ＡＳ３添加溶液（Ｐａｌｌ）中で調製し、そしてそれを、１０ｍＭＤ‐リボース、１０ｍＭイノシン、１０ｍＭＬ‐アルギニン、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭ無機リン酸塩の最終血液濃度を提供するように処方した。正常なドナー由来のヒト血液を、シリンジ中に２．５ｍｌの溶液Ｄを事前に満たし、およびその後、溶液Ｄを含むシリンジ内に直接ドナー血液を２０ｍｌ採取することにより、溶液Ｄと血液の容積比１：８で、溶液Ｄ中に採取した。

溶液Ｅを作るために、Ｄ‐リボース、イノシン、Ｌ‐アルギニン、ピルビン酸ナトリウム、および無機リン酸塩の３０倍濃縮ストック溶液を、ＡＳ５添加溶液中で調製し、そしてそれを、１０ｍＭＤ‐リボース、１０ｍＭイノシン、１０ｍＭＬ‐アルギニン、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭ無機リン酸塩の最終血液濃度を提供するように処方した。正常なドナー由来のヒト血液を、シリンジ中に２．５ｍｌの溶液Ｅを事前に満たし、およびその後、溶液Ｅを含むシリンジ内に直接ドナー血液を２０ｍｌ採取することにより、溶液Ｅと血液の容積比１：８で、溶液Ｅ中に採取した。

コントロールとして、溶液ＤまたはＥのいずれかの代わりに、ＡＳ１添加溶液を使用することにより調製した。

サンプルを、２０ｍｌバッグでヒートシールしおよび４℃で貯蔵した。２，３‐ＤＰＧレベル、ｐＨ、Ｐ５０、およびＡＴＰを本明細書中で記載したように測定し、および結果を表９および図６‐９で示した。還元型グルタチオンを、ＯｘｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ製のＢｉｏｘｙｔｅｃｈＧＳＨ‐４２０キットを使用して測定した。

すべての特許、特許出願、および公開の完全な開示、並びに本明細書中で記載した電子的に利用可能な材料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋａｍｉｎｏａｃｉｄａｎｄｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ；およびｐｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｎｋ（ｐｄｂ）ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎｓ）は、参照により取り込まれる。前述の詳細な説明および例は、単に理解を明確にするために与えられる。不必要な制限がそこから理解されることはない。変更が、請求項により定義された発明内に含まれるであろうことが当業者に明白であるため、本発明は、示されおよび記載された正確な詳細に制限されない。

Claims

Ｄ‐リボース、イノシンおよびＬ‐アルギニンおよび／またはＤ‐アルギニンを含む、血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物。
ピルビン酸ナトリウムをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
無機リン酸塩をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
前記組成物が、水性溶液である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
前記組成物が、以下：
７５〜１５００ｍＭＤ‐リボース；
７５〜１５００ｍＭＬ‐アルギニン；および
７５〜１５００ｍＭイノシン
を含み、ここで前記組成物が、水性溶液である、請求項１に記載の組成物。
Ｌ‐アルギニンとイノシンのモル比が、０．５：１〜１．５：１である、請求項５に記載の組成物。
Ｌ‐アルギニンとイノシンの前記モル比が、０．８：１〜１．２：１である、請求項５または６に記載の組成物。
Ｌ‐アルギニンとイノシンの前記モル比が、１：１である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物。
ピルビン酸ナトリウムをさらに含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の組成物。
前記ピルビン酸ナトリウムの濃度が、７５〜１５００ｍＭである、請求項９に記載の組成物。
無機リン酸塩をさらに含む、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
前記無機リン酸塩の濃度が、７５〜１５００ｍＭである、請求項１１に記載の組成物。
３００ｍＭＬ‐アルギニン；
３００ｍＭイノシン；
３００ｍＭＤ‐リボース；
３００ｍＭピルビン酸ナトリウム；および
３００ｍＭ無機リン酸塩
を含む血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物であって、ここで前記組成物が、水性溶液である、組成物。
赤血球と請求項１〜１３のいずれか一項に記載の血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物とを接触させることを含む、血液貯蔵方法。
貯蔵された赤血球と請求項１〜１３のいずれか一項に記載の血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物とを接触させることを含む、血液を若返らせるためのインビトロ方法。
血液を若返らせるためのインビトロ方法であって、前記方法が、以下：
２，３‐ジホスホグリセラート値が、新たに採取した血液よりも低い値を有する貯蔵された赤血球を提供し；
前記２，３‐ジホスホグリセラート値を増加するために効果的な条件下、貯蔵された赤血球と請求項１〜１３のいずれか一項に記載の血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物を混合する
ことを含む、インビトロ方法。
血液を若返らせるためのインビトロ方法であって、前記方法が、以下：
アデノシントリホスフェート値が、新たに採取した血液よりも低い値を有する貯蔵された赤血球を提供し；
前記アデノシントリホスフェート値を増加するために効果的な条件下、貯蔵された赤血球と請求項１〜１３のいずれか一項に記載の血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物を混合する
ことを含む、インビトロ方法。
血液を若返らせるためのインビトロ方法であって、前記方法が、以下：
還元型グルタチオン値が、新たに採取した血液よりも低い値を有する貯蔵された赤血球を提供し；
前記還元型グルタチオン値を増加するために効果的な条件下、貯蔵された赤血球と請求項１〜１３のいずれか一項に記載の血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物を混合する
ことを含む、インビトロ方法。
血液を若返らせるためのインビトロ方法であって、前記方法が、以下：
酸素解離Ｐ５０値が、新たに採取した血液よりも低い値を有する貯蔵された赤血球を提供し；
前記酸素解離Ｐ５０値を増加するために効果的な条件下、貯蔵された赤血球と請求項１〜１３のいずれか一項に記載の血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物を混合する
ことを含む、インビトロ方法。
前記効果的な条件が、前記細胞を、４℃〜３７℃の温度で前記血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物中でインキュベートすることを含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
前記温度が室温である、請求項２０に記載の方法。
前記効果的な条件が、前記細胞を、少なくとも１０分間、前記血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物中でインキュベートすることを含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
前記時間が１０分〜４８時間である、請求項２２に記載の方法。
前記時間が１０分〜４時間である、請求項２３に記載の方法。
前記時間が３０分〜２時間である、請求項２４に記載の方法。
前記赤血球が濃縮赤血球または全血である、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
塩化ナトリウム、デキストロース、アデニン、マンニトール、クエン酸ナトリウム、およびクエン酸の一またはそれ以上をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物。
前記組成物が、Ｌ‐アルギニン、イノシン、Ｄ‐リボース、ピルビン酸ナトリウム、無機リン酸塩、塩化ナトリウム、デキストロース、アデニン、およびマンニトールを含む添加溶液である、請求項２７に記載の血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物。
前記組成物が、Ｌ‐アルギニン、イノシン、Ｄ‐リボース、ピルビン酸ナトリウム、無機リン酸塩、塩化ナトリウム、デキストロース、アデニン、クエン酸ナトリウム、およびクエン酸を含む添加溶液である、請求項２７に記載の血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物。
赤血球および抗凝固剤を含む組成物と、請求項２８に記載の血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物とを接触させることを含み、ここで前記抗凝固剤が、ＡＣＤ、ＣＰＤ、ＣＰＤＡ‐１、およびそれらの組合せからなる群から選択される、血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための方法。
赤血球および抗凝固剤を含む組成物と、請求項２９に記載の血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物とを接触させることを含み、ここで前記抗凝固剤が、ＣＰ２Ｄである、血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための方法。
赤血球と請求項１〜１３のいずれか一項に記載の血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物とを接触させることを含む、貯蔵された赤血球の抗酸化防御を改善するための方法。
赤血球および抗凝固剤を含む組成物と、請求項２８に記載の血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物を接触させることを含み、ここで前記抗凝固剤が、ＡＣＤ、ＣＰＤ，ＣＰＤＡ‐１、およびそれらの組合せからなる群から選択される、貯蔵された赤血球の抗酸化防御を改善するための方法。
赤血球および抗凝固剤を含む組成物と、請求項２９に記載の血液を貯蔵するためのおよび／または若返らせるための組成物とを接触させることを含み、ここで前記抗凝固剤が、ＣＰ２Ｄである、貯蔵された赤血球の抗酸化防御を改善するための方法。