JP5816237B2 - 分子または粒子を検出するアッセイにおけるダイナミックレンジを拡張するための方法またはシステム - Google Patents
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Description
本明細書には、流体試料中のアナライト分子または粒子の濃度を決定するために使用される分析アッセイおよびシステムのダイナミックレンジを拡張するためのシステムおよび方法が記載されている。
この出願は、Rissinらの、「Methods and Systems for Extending Dynamic Range in Assays for the Detection of Molecules or Particles」と題された、2011年2月11日に出願された、米国仮特許出願第61/441,894号の利益を主張するものである。またこの出願は、Rissinらの、「Methods and Systems for Extending Dynamic Range in Assays for the Detection of Molecules or Particles」と題された、2010年3月24日に出願された、米国特許出願第12/731,136号の一部継続出願であり、該一部継続出願は、Rissinらの、「Methods and Systems for Extending Dynamic Range in Assays for the Detection of Molecules or Particles」と題された、2010年3月1日に出願された、米国仮特許出願第61/309,165号の利益を主張するものである。上記出願のそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
試料中の標的アナライト分子を迅速かつ正確に検出することができ、特定の場合においては定量することもできる方法およびシステムは、現代における分析測定の礎となっている。かかるシステムおよび方法は、学術的および工業的研究、環境アセスメント、食品安全性、医療診断、ならびに化学的、生物学的および放射線学的な兵器剤の検出などの多くの分野で採用されている。かかる技術の有利な特徴には、特異性、スピードおよび感度が含まれ得る。
本明細書には、流体試料中のアナライト分子または粒子の濃度を決定するために使用される分析方法およびシステムのダイナミックレンジを拡張するためのシステムおよび方法が記載されている。本発明の主題は、いくつかの場合において、相互に関連する製品、特定の問題に対する代替的解決、および/または、一つまたは二つ以上のシステムおよび/または物品の複数の異なる使用を伴う。
本発明の他の側面、態様および特徴は、添付の図面と併せて考慮すると、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。添付の図面は概略図であって、縮尺通りに描くことを意図していない。明確化の目的のため、すべての図においてすべての構成要素に番号を付してはおらず、また描写が、当業者に本発明を理解させるために必要でない場合、本発明のそれぞれの態様のすべての構成要素が示されてもいない。本文に言及されているすべての特許出願および特許は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書に含まれる記載と参照により組み込まれた文書との間に矛盾がある場合、本明細書が、定義を含め、制するものである。
本明細書には、流体試料中のアナライト分子または粒子(例えば、細胞、細胞小器官および他の生物学的または非生物学的な微粒子など)の濃度を決定するために使用される分析アッセイ方法およびシステムのダイナミックレンジを拡張するためのシステムおよび方法が記載されている。本発明の主題は、いくつかの場合において、相互に関連する製品、特定の問題に対する代替的解決、および/または、一つまたは二つ以上のシステムおよび/または物品の複数の異なる使用を伴う。以下の考察の多くがアナライト分子を対象としているが、これは例としてのみのものであり、例えば微粒子形態のアナライトなど、他の材料を検出および/または定量してもよいことは理解されるはずである。アナライト分子および粒子のいくつかの典型的な例は、本明細書に記載されている。
以下の項目には、流体試料中のアナライト分子または粒子の濃度の度合いを決定するために使用される分析方法/システムのダイナミックレンジを拡張するための典型的な方法およびシステムが記載されている。いくつかの態様において、採用した分析方法は、低濃度で単一のアナライト分子を個々に単離し検出することができる。いくつかの場合において、分析方法は、基板(例えば、プレート、チップ、光ファイバー表面など)の表面内または表面上の複数の区画に、複数のアナライト分子を空間的に分離することを含む。低濃度範囲において、少なくともいくつかの区画に少なくとも一つのアナライト分子が含まれると同時に、かかる区画の統計的に有意な割合にはアナライト分子が含まれないように、アナライト分子が空間的に分離されてよい。ダイナミックレンジを拡張するための本発明の方法/システムとともに使用してもよい方法/システムは本明細書に記載されている。
本発明のアッセイ方法およびシステムは、特定の態様において検出/定量化を容易にするために、それぞれの区画がゼロまたは一つまたは二つ以上のいずれかのアナライト分子を含む(comprise)/含む(contain)ように、複数の区画にアナライト分子を空間的に分離する工程を採用する。さらに、いくつかの態様においては、それぞれの区画が単独にアドレスされうるようなやり方で、区画を含む物品が設定されている。複数の区画に複数のアナライト分子を空間的に分離するための典型的な態様が本明細書に記載されているが、他の多くの方法を潜在的に採用してもよい。
システムはまた、複数の区画の少なくとも一部をアドレスするよう設定された少なくとも一つの検出器も含んでもよい。システムは、アドレスされたそれぞれの区画にアナライト分子または粒子が存在するか否かを示す少なくとも一つの信号を生成することができる。システムは、それぞれの区画でアナライト分子または粒子の数に伴い変化する強度レベルを測定できる能力を有する。
(2)さらに、光ファイバーをアレイすることによって、ファイバー間の信号「クロストーク(cross-talk)」がない、隣接する槽中の分子を同時にまたは非同時に励起することができる性能が提供されてもよい。
(3)すなわち、一つのファイバー中に伝送される励起光は隣接するファイバーに漏れ出さない。
本発明はまた、前記の少なくともいくつかのアッセイ工程および/または信号/データ処理工程を実施するよう設定された流体試料中のアナライト分子または粒子の濃度の度合いを決定するためのシステムを含む。
当業者には十分理解されるだろうが、大多数のアナライト分子および粒子は、本発明の方法およびシステムを使用して検出され、任意に定量化されてもよく;基本的に、結合リガンドに対して固定化されるように作製することが可能な任意のアナライト分子は、本発明を使用して潜在的に調査することができる。アナライト分子を含んでもよい、潜在的に関心のある、特定のより具体的な標的について、以下に言及する。以下に列挙されたものは典型例であって、これらに限定されるものではない。
本発明のいくつかの態様において、アナライト分子は表面(例えば、捕捉物の表面、区画(例えば反応槽)の表面など)に対して固定化されてもよい。複数のタイプの結合リガンドに暴露する前、同時、または後に、アナライト分子は表面に対して固定化されてもよい。いくつかの態様において、表面に対するアナライト分子の固定化は、表面から(例えば反応槽から)アナライト分子を取り除くことを考慮せずに、溶液から任意の過剰な結合リガンドを除去するのに役立ってもよい。一般に、捕捉成分は、分子、粒子もしくは複合体の固定化、検出、定量化および/または分析の目的で、分子、粒子もしくは複合体を固体の支持体に付着させる。
いくつかの態様において、アッセイは少なくとも一つの結合リガンドを含んでもよい。より詳細に後述するが、結合リガンドは、アナライト分子と結びつくおよび/または他の結合リガンドと結びつくことができる、任意の好適な分子、粒子などから選択してもよい。特定の結合リガンドは、直接的(例えば検出可能な実体を介して)または間接的のいずれかで、検出を容易にできる成分を含むことができる。成分が例えば前駆標識剤分子を標識剤分子(例えばアッセイで検出される薬剤)に変換することによって、間接的な検出を容易にしてもよい。いくつかの態様において、結合リガンドは酵素成分(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなど)を含んでもよい。本明細書中に考察したとおり、第一のタイプの結合リガンドは、追加の結合リガンド(例えば第二のタイプなど)とともに使用しても、使用しなくてもよい。
いくつかの態様において、第一のタイプの結合リガンドと第二のタイプの結合リガンドとを提供してもよい。いくつかの態様において、結合リガンドの少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、少なくとも五つ、少なくとも八つ、少なくとも十、またはそれ以上のタイプを提供してもよい。複数の捕捉物(そのうちのいくつかは少なくとも一つのアナライト分子と結びついている)が複数のタイプの結合リガンドに暴露されているとき、複数の固定化アナライト分子の少なくともいくつかは、結合リガンドのそれぞれのタイプの少なくとも一つと結びついていてもよい。さまざまな異なるやり方で結合リガンドが互いに相互作用するように、結合リガンドを選択してもよい。最初の例で、第一のタイプの結合リガンドはアナライト分子と結びつくことができてもよく、第二のタイプの結合リガンドは第一のタイプの結合リガンドと結びつくことができてもよい。かかる態様において、第一のタイプの結合リガンドは、アナライト分子との結びつきに役立つ第一の成分と、第一のタイプの結合リガンドを有する第二のタイプの結合リガンドとの結びつきに役立つ第二の成分とを含んでもよい。特定の態様において、第二の成分はビオチンであり、第二のタイプの結合リガンドは酵素またはビオチンと結びつく酵素成分を含む。
以下の例には、実施例2〜10で使用された材料が記載されている。光ファイバー束は、Schott North America(マサチューセッツ州サウスフ゛リッシ゛)から購入した。非強化ガラスシリコーンシートは、Specialty Manufacturing(ミシガン州サギノー)から購入した。塩化水素酸、無水エタノール、および分子生物学グレードのツイーン−20は、Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントルイス)から購入した。直径2.7μmの、カルボキシルで終端された磁気ビーズは、Varian社(カリフォルニア州レークフォレスト)から購入した。1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)、N−ヒドロキシスルホスクシンイミド(NHS)、およびSuperBlock(登録商標)T-20 Blocking Bufferは、Thermo Scientific(イリノイ州ロックフォード)から購入した。ストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ(SβG)は、Invitrogen、Sigma-Aldrichから購入し、また標準的なプロトコルを用いて社内でコンジュゲート化した。レゾルフィン−β−D−ガラクトピラノシド(RGP)は、Invitrogen(カリフォルニア州カールスバッド)から購入した。ファイバー研磨機および研磨用の消耗品は、Allied High Tech Products(カリフォルニア州ランチョドミンゲス)から購入した。PSAに対するモノクローナル捕捉抗体、PSAに対するモノクローナル検出抗体、および精製PSAは、BiosPacificから購入した。ChromalinkTMビオチン化試薬は、Solulink社(カリフォルニア州サンディエゴ)から購入した。精製DNAは、Integrated DNA Technologiesから購入した。
以下には、典型的なアナライトであるSβG捕捉のためにビオチンにより機能的にされた直径2.7μmの磁気ビーズの調製について、限定されない例が記載されている。メーカーの使用説明書に従い、DNA捕捉プローブ(5’−NH2/C12−GTT GTC AAG ATG CTA CCG TTC AGA G−3’)により機能化されたビーズを調製した。0.5MのNaClと0.01%のツイーン−20とを含むTE緩衝液中、1μMのビオチン化相補DNA(5’−ビオチン−C TCT GAA CGG TAG CAT CTT GAC AAC−3’)とともに、このビーズを終夜インキュベートした。インキュベート後、ツイーン−20を0.01%含むPBS緩衝液中、三回洗浄した。100μL中、ウェルあたり400,000ビーズとなるように、マイクロタイタープレートに、ビーズストックを分配した。マイクロタイタープレートのウェルから緩衝液を吸引した。ビーズを再懸濁し、ツイーン−20を0.05%含むSuperblock中さまざまな濃度のSβGとともにビーズを5時間インキュベートした。その後、ビーズを分離し、ツイーン−20を0.1%含む5×PBS緩衝液で6回洗浄した。
以下には、マイクロウェルアレイの調製について、限定されない例が記載されている。30ミクロン、9ミクロンおよび1ミクロンサイズのダイヤモンド研磨フィルムを使用する研磨機で、順に、長さ約5cmの光ファイバー束を研磨した。研磨されたファイバー束を、0.025MのHCl溶液中で130秒間化学的エッチングした直後、反応を停止するために浸水させた。平均して1分間あたり約1.5〜1.7μmの速度で、ウェルはエッチングされたことになる。したがって、深さ3.25μmのウェルは約115〜130秒間で生成される。エッチングの不純物を除去するために、エッチングされたファイバーを5秒間超音波処理し、水中で5分間洗浄した。その後、ファイバーを真空下で乾燥し、ガラス表面の汚れを落とし活性化するため、5分間空気プラズマに晒した。その表面を疎水的にするために、シラン2%溶液中アレイを30分間シラン化した。いくつかの場合において、良好な封を維持しながらウェル中に単一のビーズを保持するように、ウェルの寸法(例えば3.25±0.5μm)を設定した。
以下には、マイクロウェル中にビーズをロードすることについて、限定されない例が記載されている。エッチングされたウェル中にビーズをロードする前に、ビーズを、アナライト分子を含む流体試料に暴露してもよい。ファイバー束のエッチングされたウェルにビーズの溶液をアプライするため、汚れていないPVC管類(1/16”I.D. 1/8”O.D.)および汚れていない熱収縮チューブ(3/16”ID)を約1cmの長さに切断した。ビーズ溶液を保持するための容器を作るため、まずPVC管類の一片を、ファイバー束のエッチングされた一端上に置き、続いて密封を提供するために、PVC管類とファイバー束との間の接合部分の周囲に熱収縮チューブを取り付けた。濃縮されたビーズ溶液の10μLを、PVC管類で作られた容器にピペットで入れた。エッチングされたウェル中にビーズを押し付けるため、その後、ファイバー束を3000rpm(〜1300g)で10分間遠心した。遠心後、PVC管類/熱収縮チューブアセンブリを取り外した。過剰なビーズ溶液を洗い落とすため、ファイバー束の遠位端をPBS溶液中に沈め、続いて脱イオン化水でその表面を洗った。ビーズ濃度が10μLあたり200,000であった態様において、50,000ウェルのアレイのうち、単一のビーズに占有されているウェルは典型的には40〜60%という結果になった。
以下には、マイクロウェルのアレイ中にビーズおよび酵素標識ビーズをロードおよび検出することについて、限定されない例が記載されている。蛍光画像を取得するために、水銀光源とフィルターキューブ(filter cube)と対物とCCDカメラとを含む特注で作った画像システムを使用した。特注の冶具を使用してファイバー束のアレイを顕微鏡のステージに取り付けた。β−ガラクトシダーゼの基質(RPG)の液滴を、シリコーンガスケット材料上に垂らし、ファイバーアレイの遠位端を接触させるように置いた。機械的基盤は、エッチングされた光ファイバーアレイの遠位端に接触しているシリコーンシートを正確に移動させ、単離されたフェムトモーラーの反応槽のアレイを作った。暴露時間1011ミリ秒で、577nmで蛍光画像を取得した。それぞれのファイバー束アレイにつき、五つのフレーム(フレームあたり30秒で)を要した。マイクロウェルアレイのそれぞれのウェル内における酵素活性の有無を決定するために、画像分析ソフトウェアを使用して蛍光画像を分析した。MathWorks MATLABおよびMathWorks Image Processingツールボックスを使用する先進の画像処理ソフトウェアを使用して、データを分析した。ソフトウェアは、取得した画像フレームを整列させ、反応槽を同定し、ビーズを有する反応槽を位置付け、所定の時間にわたって反応槽強度の変化を測定するものである。全データフレームにわたって十分な強度増大を有するビーズを含む反応槽を計数し、同定された反応槽すべてのパーセンテージとして活性反応槽の最終数を報告する。
以下の限定されない方法には、単一分子測定のダイナミックレンジを拡張することが記載されている。広範な酵素濃度(例えば濃度の範囲について表2を参照)にわたって、実施例5において前述した実験を繰り返した。試験された濃度に応じて、異なる方法により、この実験で得られた画像を分析した。例えば詳細な説明において前述したとおり、少なくとも一つのアナライト分子(例えば酵素)と結びついたビーズのパーセンテージが約50%(または45%、または40%、または35%など)未満であったとき、「オン」ビーズの総数を計数することによって、ビーズあたりの平均分子を決定した。ビーズを含んだウェルとして(白色光画像から)「オン」ビーズを同定した。最初のフレームに次いで、四つすべての連続したフレームにおいて、その蛍光は増加した。そしてその全体の蛍光は、最初のフレームから最後までで、少なくとも20%増加した。
以下の例には、ビオチン化されたPSA検出抗体および酵素コンジュゲートの調製および特性評価が記載されている。ChromalinkTMビオチン化試薬を使用して検出抗体をビオチン化した。この試薬は、リジン残基を介して抗体にビオチン基を付着させるスクシンイミジルエステル基と、抗体あたりのビオチン分子数を定量化できるビスアリールヒドラゾン発色団とを含む。抗PSA抗体上のビオチン基の平均数は7.5〜9.5に及んだ。標準的なプロトコルを使用してストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ(SβG)をコンジュゲートした。コンジュゲート分子の>80%が一つのβ−ガラクトシダーゼ分子を含んだことが、コンジュゲートのHPLC特性評価から示された(酵素/コンジュゲートの平均は1.2であった)。それぞれの酵素分子とコンジュゲートしたストレプトアビジン分子の平均数が2.7であったことが、分子量標準との比較から示された。検出抗体それぞれが多数のビオチン基を含むが、単一の検出抗体に結合した単一のタンパク質分子は多数の酵素コンジュゲートと結合できた可能性がある。しかしながら、多数の酵素コンジュゲートが単一の検出抗体分子と結合しなかったことは、単一分子レジーム(AMB<0.1)における酵素が結びついたビーズにより生成された蛍光強度の分析により示唆され:この蛍光強度は、単一分子であるβ−ガラクトシダーゼの既知の動力学と一致する。
以下の例には、磁気ビーズ上でのPSAの捕捉と酵素標識された免疫複合体の形成とが記載されている。メーカーの使用説明書に従い、PSAに対するモノクローナル抗体により機能的にされたビーズを調製した。磁気ビーズ500,000の懸濁液とともに試験溶液(100μL)を23℃で2時間インキュベートした。その後、ビーズを分離し、5×PBSと0.1%のツイーン−20とで3回洗浄した。ビーズを再懸濁し、検出抗体を含む溶液(〜1nM)とともに23℃で60分間インキュベートした。その後ビーズを分離し、5×PBSと0.1%のツイーン−20とで3回洗浄した。SβGを含む溶液(15pM)とともに23℃で30分間ビーズをインキュベートし、分離し、5×PBSと0.1%のツイーン−20とで7回洗浄した。その後、ビーズを25μLのPBSに再懸濁し、10μLのビーズ溶液をフェムトリットル容積のウェルアレイにロードした。
以下の例には、第二のアナログ分子の態様(方程式8)に関連して前述した分析を使用するデジタルとアナログとを組み合わせた酵素標識検出を実施した典型的なシステムが記載されている。前記実施例7に記載されたSβG結合アッセイ、および、拡張されたダイナミックレンジを実証する他の実施例に記載された方法および器具を使用することは、AMBのデジタル決定とアナログ決定とを組み合わせることによって達成することができる。図13Aは、ゼプトモーラーからピコモーラーにおよぶ濃度のSβGとともにインキュベートしたビオチン提示ビーズの母集団の画像から決定されたAMBを示す。特に、図13Aおよび13Bは、デジタル決定とアナログ決定とを組み合わせることによって広いダイナミックレンジを達成したことを示す。図13Aは酵素濃度に応じてAMBをプロットしたものを示す。エラーバーは、3回の反復による標準偏差である。図13Bは、酵素濃度に応じて%活性とAMB値とを含む表を示す。%活性<70%として方程式4を使用してAMBを決定し、%活性>70%として方程式8を使用してAMBを決定した。この実施例においてアナログとデジタルとの間の閾値は10fMと31.6fMとの間にある。
この例には、血清中のPSAを測定するための、組み合わされたデジタルとアナログとのシステムおよび方法が記載されている。広いダイナミックレンジを有するPSAの濃度を決定するために、組み合わされたデジタルとアナログとのやり方を使用した。臨床的に、PSAは、前立腺癌をスクリーニングするために、および、癌を除去する手術を受けた患者における病気の生化学的再発を監視するために、使用された。前立腺全摘出術(RP)を受けた患者の血清におけるPSAレベルは、0.014pg/mLから100pg/mLを超える範囲に及ぶことが知られている。1回の試験で過半数の患者におけるPSAレベルの測定を成功させるには、4logのダイナミックレンジを有するアッセイが必要となる。実施例8に記載されたように実験を行った。図14Aおよび14Bは、デジタルおよびアナログ分析を組み合わせることによって、本発明のPSAアッセイの動作範囲が0.008pg/mLから100pg/mLにまで及んだことを示し、圧倒的多数のRP患者試料におけるPSAレベルをワンパスで正確に定量できる。特に、図14Aおよび14Bは、組み合わされたデジタルおよびアナログのPSAアッセイが4logの動作範囲と0.008pg/mLの算出されたLODを示す。PSA濃度に応じて、線形−線形空間(図14A)およびlog−log空間(図14B)にAMBがプロットされている。四重の測定に基づいた全データポイントについてエラーバーを示す。
図15は、明確に定義された酵素/ビーズ比率を有するビーズをもたらしたストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ(SβG)にかかるアッセイを使用する、校正曲線のデジタル範囲におけるポアソン分布分析の限定されない例を示す。簡潔にいうと、ビオチン化した捕捉分子によりビーズを機能化し、これらのビーズを、さまざまな濃度のSβG酵素コンジュゲートを捕捉するために使用した。ビーズをフェムトリットルアレイにロードし、アレイのウェルのRGP溶液に封をした後、反応チャンバーに蓄積された結合酵素から2.5分間蛍光が生成され、蛍光画像を30秒毎に取得した。実験の最後にアレイの白色光画像を取得した。ビーズを含むウェルを(白色光画像から)同定し、かつこれらのビーズのうちどのビーズが結合された酵素分子と関連するか(低速度撮影の蛍光画像から)決定するために、これらのイメージを分析した。fonが非線形変化であるにもかかわらず、方程式4から決定されたAMBデジタルは50%活性まで線形反応を維持していることが図15Bに示されている。特に、図15は、ポアソン統計を使用して、%活性ビーズのAMBデジタルへの変換を示している(図15A)。中央のカラムは、酵素濃度に応じてデジタル計数により決定された活性ビーズの割合である。右のカラムは、方程式4を使用して%活性ビーズから決定された、ビーズあたりの平均酵素(AMB)である。この変換は、デジタル計数方法を使用する多数の酵素分子と結びついたビーズを統計学的に説明し;(図15B)は、酵素濃度に応じて、%活性ビーズ(菱形)とAMBdigital(四角形)とをプロットしたものを示す。ポアソン分布から期待されるように、%活性ビーズは濃度が上昇するにつれて直線から逸脱する。この実験において、AMBデジタルは、約50%活性ビーズまで濃度に対して直線を有した。三回の測定にわたり標準偏差からエラーバーを決定した。
Claims (21)
- 流体試料中のアナライト分子または粒子の第一のタイプならびにアナライト分子または粒子の第二のタイプの濃度の度合いを決定するための方法であって、
複数の捕捉物の第一のタイプおよび複数の捕捉物の第二のタイプを提供すること、ここで捕捉物の第一のタイプが各々少なくとも一つのアナライト分子もしくは粒子の第一のタイプと結びついているか、またはどのアナライト分子もしくは粒子とも結びついておらず、捕捉物の第二のタイプが各々少なくとも一つのアナライト分子もしくは粒子の第二のタイプと結びついているか、またはどのアナライト分子もしくは粒子とも結びついていない;
捕捉物の少なくとも一部をアドレスし、少なくとも一つのアナライト分子または粒子の第一のタイプと結びついた捕捉物の第一のタイプのパーセンテージならびに少なくとも一つのアナライト分子または粒子の第二のタイプと結びついた捕捉物の第二のタイプのパーセンテージを決定すること;
少なくとも一つのアナライト分子もしくは粒子の第一のタイプと結びついた捕捉物の第一のタイプのパーセンテージに基づいて、少なくとも一つのアナライト分子もしくは粒子の第一のタイプと結びついていると決定されたアドレスステップの対象である捕捉物の第一のタイプのパーセンテージに少なくとも一部基づいて前記流体試料中のアナライト分子もしくは粒子の第一のタイプの濃度の度合いを決定するか、または、複数のアナライト分子もしくは粒子の第一のタイプの存在を示す測定された信号の強度に少なくとも一部基づいて前記流体試料中のアナライト分子もしくは粒子の第一のタイプの濃度の度合いを決定すること;および
少なくとも一つのアナライト分子もしくは粒子の第二のタイプと結びついた捕捉物の第二のタイプのパーセンテージに基づいて、少なくとも一つのアナライト分子もしくは粒子の第二のタイプと結びついていると決定されたアドレスステップの対象である捕捉物の第二のタイプの割合に少なくとも一部基づいて前記流体試料中のアナライト分子もしくは粒子の第二のタイプの濃度の度合いを決定するか、または、複数のアナライト分子もしくは粒子の第二のタイプの存在を示す測定された信号の強度に少なくとも一部基づいて前記流体試料中のアナライト分子もしくは粒子の第二のタイプの濃度の度合いを決定すること
を含む、前記方法。 - 複数の捕捉物が、複数のビーズを含む、請求項1に記載の方法。
- さらに、少なくとも一つのバックグラウンド信号の決定を含む、請求項1に記載の方法。
- 流体試料中のアナライト分子の濃度の度合いが、測定されたパラメータの校正曲線との比較に少なくとも一部基づく、請求項1に記載の方法。
- 校正曲線が、少なくとも一つの校正係数の決定によって、少なくとも一部形成される、請求項4に記載の方法。
- 校正係数が校正試料を用いて決定される、ここで少なくとも一つのアナライト分子と結びついている捕捉物のパーセンテージが約30%と約50%との間である、請求項5に記載の方法。
- 流体試料中のアナライト分子または粒子の第一のタイプあるいはアナライト分子または粒子の第二のタイプの濃度の度合いが、ポアソン分布の調整に少なくとも一部基づく、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも一つのアナライト分子または粒子の第一のタイプと結びついた捕捉物の第一のタイプあるいは少なくとも一つのアナライト分子または粒子の第二のタイプと結びついた捕捉物の第二のタイプのパーセンテージが、光学技術を用いて決定される、請求項1に記載の方法。
- 光学技術が、CCD検出器の使用を含む、請求項8に記載の方法。
- 流体試料中のアナライト分子または粒子の第一のタイプの濃度が、約50×10−15M未満である、請求項1に記載の方法。
- 流体試料中のアナライト分子または粒子の第二のタイプの濃度が、約50×10 −15 M未満である、請求項1または10に記載の方法。
- アナライト分子または粒子の第一のタイプあるいはアナライト分子または粒子の第二のタイプが、タンパク質または核酸である、請求項1に記載の方法。
- アナライト分子または粒子の第一のタイプあるいはアナライト分子または粒子の第二のタイプが、酵素成分を含む、請求項1に記載の方法。
- 実質的にすべてのアナライト分子または粒子の第一のタイプが少なくとも一つの結合リガンドと結びつくような条件下で、アナライト分子または粒子の第一のタイプが少なくとも一つの結合リガンドに暴露される、請求項1に記載の方法。
- 実質的にすべてのアナライト分子または粒子の第二のタイプが少なくとも一つの結合リガンドと結びつくような条件下で、アナライト分子または粒子の第二のタイプが少なくとも一つの結合リガンドに暴露される、請求項1または14に記載の方法。
- 少なくとも一つの結合リガンドが、酵素成分を含む、請求項14に記載の方法。
- 少なくとも一つの結合リガンドが、酵素成分を含む、請求項15に記載の方法。
- さらに、アナライト分子または粒子の第一のタイプを、前駆標識剤に暴露することを含む、請求項14に記載の方法。
- さらに、アナライト分子または粒子の第二のタイプを、前駆標識剤に暴露することを含む、請求項15に記載の方法。
- 前駆標識剤が、酵素成分への暴露によって、標識剤に変換される、請求項18または19に記載の方法。
- 捕捉物の第一のタイプとのアナライト分子または粒子の第一のタイプの結びつきあるいはアナライト分子または粒子の第二のタイプの結びつきが、少なくとも一つの前駆標識剤の存在を決定することによって決定される、請求項20に記載の方法。
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