JP5800234B2 - 微細藻類濃度決定方法 - Google Patents

Description

本発明は，藻類の濃度の決定方法および装置に関し、特に、藻類の濃度を非破壊的に測定する方法および装置に関する。

近年、地球温暖化を抑制するため、温室効果ガスの一つである二酸化炭素の排出量の削減が課題とされている。
二酸化炭素を削減する手段として、植物の光合成を利用する方法がある。植物の中でも、特に微細藻類は、陸生植物と比較して高い増殖力を有するため、有望な二酸化炭素の削減手段として注目されている。

例えば、油成分を内部で生成し蓄積する微細藻類を用いて、発電所や工場で二酸化炭素の排出量を抑えながら燃料を合成するプロセスが検討されているほか、微細藻類の光合成を利用した二酸化炭素の有効利用が研究されている。

ところで、微細藻類に吸収される二酸化炭素量は、微細藻類の増殖量に依存する。このため、簡便な増殖量の評価方法が求められている。
一般的に、微細藻類の増殖量を評価するには、微細藻類が分散した液体（以下、「微細藻類の溶液」ということがある。）のうち、微細藻類を含む一定量の溶液をサンプリングし、その中に含まれる微細藻類を遠心分離機あるいはろ過等で分離して乾燥させ、その重量を測ることによって行われる。
また、より簡易な方法として、サンプリングされた微細藻類の溶液の吸光度を測定する方法もある（特許文献１）。吸光度は、溶液の透明度を反映する物理量であるため、ある波長における吸光度と乾燥重量の相関を予め求めておくことによって、測定した吸光度の値から乾燥重量を求めることが可能となる。

特開２０００−５０８６１

しかしながら、上述した２つのいずれの方法も、微細藻類が繁殖しているサンプル（見本）から一定量の溶液を抽出する「サンプリング」が必要となる。このサンプリング（抽出）は、サンプルという、微細藻類が繁殖する生態系を侵食していることにほかならず、サンプルの量を減少させるばかりか、雑菌等の混入によりサンプリングの前後で生態系を変化させてしまう恐れがある。
また、増殖速度を求めるためには、一定時間ごとに乾燥重量を測りその差をとるのが一般的であるが、上述したサンプリングを行って分離・乾燥または吸光度測定を実行するといった作業を繰り返し行うことは、作業者にとって大きな負担となる。

本発明は，以上のような問題点を解消するためになされたものであり、より簡便で非破壊的に溶液に含まれる微細藻類の濃度を決定する方法および装置を提供することを目的とする。

上述した目的を達成するために、本発明は、画像による微細藻類濃度決定方法を提供するものである。
より具体的には、本発明に係る微細藻類濃度決定方法は、微細藻類の溶液を撮影するステップと、撮影された前記微細藻類の溶液の画像から前記微細藻類の溶液の色空間を構成するパラメータの値を抽出するステップと、前記画像から抽出された前記微細藻類の溶液の前記色空間を構成するパラメータの値と、前記色空間を構成するパラメータの値と前記微細藻類の濃度とを関係づける検量線とに基づいて、前記微細藻類の濃度を決定するステップとを有し、前記微細藻類の溶液を撮影するステップは、色見本とともに前記微細藻類の溶液を撮影するステップを含み、前記色空間を構成するパラメータの値を抽出するステップは、前記画像に含まれる前記色見本の色空間を構成するパラメータの値に基づいて前記微細藻類の溶液の前記色空間を構成するパラメータの値を補正するステップを含み、前記微細藻類の濃度を決定するステップは、補正された前記微細藻類の溶液の前記色空間を構成するパラメータの値と前記検量線とに基づいて、前記微細藻類の濃度を決定するステップを含むことを特徴とする。

本発明によれば、微細藻類の溶液の画像から微細藻類の濃度を決定するので、サンプリングを行うことなく、より簡便で非破壊的に微細藻類の濃度を決定することができる。

図１は、本発明の第１の実施の形態に係る微細藻類濃度決定方法の手順を示すフローチャートである。 図２は、本発明の第１の実施の形態に係る微細藻類濃度決定方法における色情報の抽出の手順を示すフローチャートである。 図３は、Ｒの階調およびＧの階調それぞれと藻類濃度との関係を示す相関図である。 図４は、本発明の第２の実施の形態に係る微細藻類濃度決定方法の手順を示すフローチャートである。 図５は、本発明の第３の実施の形態に係る微細藻類濃度決定装置の構成を示すブロック図である。

以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
なお、「藻類」とは、一般に、光合成を行う生物のうち、陸上植物（コケ植物、シダ植物、種子植物）を除いたものの総称であり、このうち拡大鏡を使わなければ見えないような小さな藻類を「微細藻類」と呼ぶ。本明細書においては、「微細藻類」は、水等の培地に分散可能な大きさを有する藻類を指すものとする。いわゆる植物プランクトンは微細藻類の一例である。また、微細藻類が培地中に分散したものを「微細藻類の溶液」と呼ぶ。

［第１の実施の形態］
本発明の第１の実施の形態に係る微細藻類濃度決定方法は、図１に示すように、大きく分けて、（１）微細藻類の溶液を撮影する撮影ステップＳ１と、（２）撮影された画像から色に関する情報を抽出する色情報抽出ステップＳ２と、（３）微細藻類の溶液の画像から抽出された色に関する情報から微細藻類の濃度を決定する決定ステップＳ３とからなる。

（１）撮影ステップＳ１
撮影ステップＳ１は、ガラス等の容器内で培養されている微細藻類の溶液（サンプル）を、容器のままデジタルカメラ等の撮像機器によって撮影するステップである。
サンプルを収容する容器は、例えば、フラスコのように、ガラス等の透明な材料からできた容器が望ましい。
微細藻類の溶液を撮影する際には、撮影環境の影響を少なくするために照明器具の配置を毎回同じにすることが望ましい。撮影環境が変わってしまうような場合は、後述するように、撮影時にサンプルの横に色見本（例えば，白，黄，赤の３種）を置いておき，一緒に撮影することにより後で補正するようにしてもよい。

（２）色情報抽出ステップＳ２
色情報抽出ステップＳ２は、撮影ステップＳ１において撮影した画像の色に関する情報（色情報）を抽出するステップである。
画像の色情報としては、様々な色空間を構成するパラメータの値を用いることができる。色空間を構成するパラメータとしては、例えば、ＲＧＢ（またはＲＧＢカラーモデル）の「赤（Ｒ：Ｒｅｄ）」、「緑（Ｇ：Ｇｒｅｅｎ）」、「青（Ｂ：Ｂｌｕｅ）」や、ＨＳＶモデル（ＨＳＢモデルとも呼ばれる。）の「色相（Ｈｕｅ）」、「彩度（Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ・Ｃｈｒｏｍａ）」、「明度（Ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ・Ｌｉｇｈｔｎｅｓｓ・Ｖａｌｕｅ）」、ＨＬＳモデルの「色相（Ｈｕｅ）」、「彩度（Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）」、「輝度（Ｌｉｇｈｔｎｅｓｓ／Ｌｕｍｉｎａｎｃｅ または Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）」などが挙げられる。
ＲＧＢ等の色情報は、例えばフォトショップ（登録商標）などの画像処理用ソフトウエアを使えば得ることができる。

色情報の抽出について、ＲＧＢによる解析を例に、図２を参照してさらに詳しく説明する。
まず、モニタ上で、撮影された画像のうち微細藻類の溶液が写っている所定の領域（微細藻類の溶液が写っている部分の一部または全部）を指定し、この指定された領域内の画素ごとに、Ｒ，Ｇ，Ｂそれぞれの色成分の階調（例えば０から２５５の２５６段階）を取得する（Ｓ２−１）。次に、その領域内の画素の、Ｒ，Ｇ，Ｂそれぞれの階調のヒストグラムを取得する（Ｓ２−２）。そして、Ｒ，Ｇ，Ｂそれぞれの色成分の階調の平均値を画像の色情報として計算する。
本実施の形態においては、平均値を求めて後述する微細藻類の濃度の決定に用いるものとする。しかしながら、平均値に限らず、中央値や最大値等を色情報として用いてもよいことは言うまでもない。

（３）決定ステップＳ３
決定ステップＳ３は、色情報抽出ステップＳ２において抽出した画像の色に関する情報（色情報）から容器内で培養されているサンプルの濃度を決定するステップである。
この決定ステップＳ３に先だち、色情報と微細藻類の濃度との関係を後述する方法によって予め求めておく。
色情報抽出ステップＳ２において抽出された色情報を上述した色情報と微細藻類の濃度との関係に当てはめることによって、容器に入った微細藻類のサンプルの濃度を決定することができる。

＜色情報と微細藻類の濃度との関係の求め方＞
色情報と微細藻類の濃度との関係は、概念的には、色空間から濃度への写像である。具体的に色情報と微細藻類の濃度との関係を取得する手法としては、例えば、濃度が既知の微細藻類の溶液（サンプル）の入った容器を複数用意し、それらの容器を撮影した画像の所定領域（微細藻類の溶液が写っている部分の一部または全部）の色情報、例えば、Ｒ、Ｇ、Ｂの階調の平均値等を求め、その値と微細藻類の濃度を関連付けることが考えられる。このような関係は、例えば、検量線や対照表といった形式で表現することができる。

サンプルの濃度は、例えば、公知の吸光法等によって求めることができる。また、濃度が既知のサンプルを用意する代わりに、サンプルの入った容器を撮影した後にその容器内の微細藻類を分離乾燥し、その重量を計測することによって、撮影後に濃度を求めるようにしてもよい。
また、所定の体積のサンプルの乾燥重量を、濃度とともに、または濃度に代えて、色情報と関係づけておくことによって、画像の色情報から所定の容積の容器に収容された微細藻類の乾燥重量を決定することもできる。

なお、色情報と微細藻類の濃度との関係を求めるときに用いる容器と、本実施の形態に係る方法によって濃度を決定するときに用いる容器とは、その大きさ、形状、材質（透明な材質から形成されていることが望ましい。）等が同じ、同種類のものであることが望ましい。さらに、色情報と微細藻類の濃度との関係を求めるときの撮影条件と本実施の形態に係る方法によって濃度を決定するときの撮影条件もできるだけ近いものとすることが望ましい。

図３に、従来より用いられている吸光度から求めた微細藻類の濃度と画像から抽出される色成分との相関図を示す。この相関図は、藻類としてクロロコッカムリトラーレを用いたものであり、横軸は濃度（ｇ／Ｌ）、縦軸はＲＧＢ色空間モデルによる色成分の階調の平均値を表す。
図３によれば、Ｒの平均値およびＧの平均値は、ともに従来法の測定値をよく追従していることがわかる。さらに、高濃度領域では、先に飽和してしまうＲ値（図３（ａ））よりＧ値（図３（ｂ））の方が有効であることがわかる。なお、Ｂ値については、低い濃度で飽和してしまうので、Ｂの階調と濃度との相関については割愛するが、極低濃度領域で変化が見られる。このことからＲＧＢの各成分ごとに得意な濃度領域があり、ＲＧＢにより濃度を評価できることがわかる。

＜第１の実施の形態の変形例１＞
以上のように、本実施の形態においては、微細藻類の溶液の画像から微細藻類の濃度を決定することができるが、藻類の種類がわかれば、藻類濃度（重量濃度（ｇ／Ｌ））を決定した後は、重量濃度から細胞濃度（個／Ｌ）を求めることができる。さらには、一定量のサンプルに含まれる微細藻類の乾燥重量や、予めわかっている細胞濃度と二酸化炭素固定量の比例関係に基づいて二酸化炭素吸収量を算出することができる。

また、上述した濃度決定を繰り返し、時間の経過に伴う濃度の変化を算出することにより、微細藻類の増殖速度を決定することもできる。

以上のように、本実施の形態によれば、微細藻類の溶液の画像から微細藻類の濃度を決定するので、微細藻類の溶液をサンプリングする必要がない。したがって、より簡便で非破壊的に微細藻類の濃度または乾燥重量を決定することができる。

なお、色情報と微細藻類の濃度との関係については、藻類としてクロロコッカムリトラーレを用い、色情報としてＲＧＢの階調の平均値を用いた例を示したが、本発明はこの実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内において他の藻についても容易に同様の手法が適用できる。

［第２の実施の形態］
次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。
第２の実施の形態に係る微細藻類濃度決定方法は、微細藻類の溶液を撮影する際の撮影環境の影響を除去するために、微細藻類の溶液（サンプル）の入った容器とともに色見本を一緒に撮影するとともに、画像から得られる色見本の色情報に基づいて微細藻類の色情報を補正するステップを含むものである。

サンプルとともに撮影される色見本は、例えば、白、黄、赤を含むものであるならば、白の色情報として（Ｒ，Ｇ，Ｂ＝２５５，２５５，２５５）、黄の色情報として（Ｒ，Ｇ，Ｂ＝２５５，２５５，０）、赤の色情報として（Ｒ，Ｇ，Ｂ＝２５５，０，０）のように、既知の色情報を有するものである。

本実施の形態に係る微細藻類濃度決定方法は、図４に示すように、大きく分けて、次の４つのステップを含む。すなわち、（１）色見本とともにサンプルを撮影する撮影ステップ（Ｓ１０）と、（２）撮影された色見本およびサンプルの画像から色見本およびサンプルの色情報をそれぞれ抽出する抽出ステップ（Ｓ２０）と、（３）色見本の色情報に基づいてサンプルの色情報を補正する補正ステップ（Ｓ２１）と、（４）補正されたサンプルの色情報と、予め用意された、色情報と微細藻類の濃度との関係とに基づいて、微細藻類の濃度を決定する決定ステップ（Ｓ３０）である。

（１）撮影ステップ（Ｓ１０）
撮影ステップ（Ｓ１０）では、色見本として、例えば、白（Ｒ，Ｇ，Ｂ＝２５５，２５５，２５５）、黄（Ｒ，Ｇ，Ｂ＝２５５，２５５，０）、赤（Ｒ，Ｇ，Ｂ＝２５５，０，０）を含む色見本をサンプルの近傍、例えば、サンプルの横に置いて、これらを一緒に撮影する。

（２）抽出ステップ（Ｓ２０）
次に、画像処理プログラムを使って、撮影された画像データから色見本の領域およびサンプルの領域の色情報、例えば、各領域のＲ，Ｇ，Ｂの各成分についてヒストグラムを作成し、各成分の平均値を算出する。

（３）補正ステップ（Ｓ２１）
サンプルの色情報は、色見本の色情報に基づいて次のような演算を実行することによって補正することができる。
赤の色見本から得られた色情報（ＲＧＢ値）を３行１列の行列（Ｒｒ Ｇｒ Ｂｒ）^tと表す。同様に黄および白の色見本から得られた色情報（ＲＧＢ値）をそれぞれ（Ｒｙ Ｇｙ Ｂｙ）^t、および（Ｒｗ Ｇｗ Ｂｗ）^tと表す。これらは、元々、赤（１ ０ ０）^t，黄（１ １ ０）^t，白（１ １ １）^tの色見本のもともとの値（ただし、各値は、最大階調数で規格化されている。）が、撮影環境の影響によって変換されたものである。

ここで、上記の赤、黄、白の色見本から得られた色情報に基づいて、次の３行３列の行列Ｔを定義する。

この行列Ｔに対して、赤（１ ０ ０）^t、黄（１ １ ０）^t、白（１ １ １）^tをかけると、それぞれ（Ｒｒ Ｇｒ Ｂｒ）^t、（Ｒｙ Ｇｙ Ｂｙ）^t、（Ｒｗ Ｇｗ Ｂｗ）^tが得られる。これは、行列Ｔが、本来の色から画像で得られた色情報への変換行列であることを意味している。
したがって、画像から得られた色見本の色情報から定義された変換行列Ｔの逆行列Ｔ^-1を求め、この変換行列の逆行列を画像のサンプル領域から得られた色情報（ＲＧＢ値）に掛け合わせることによって、サンプルの色情報を補正することができる。

（４）決定ステップ（Ｓ３０）
決定ステップＳ３０では、補正ステップＳ２１において補正されたサンプルの色情報を、予め求めておいた色情報と微細藻類の濃度との関係に当てはめることによって、容器に入ったサンプルの濃度を決定する。

以上のように、本実施の形態によれば、色見本をサンプルとともに撮影し、画像から得られる色見本の色情報に基づいてサンプルの色情報を補正して、補正された色情報に基づいて濃度を決定するので、撮影環境の影響を除去することができる。したがって、撮影環境に左右されず、より高い精度で微細藻類の濃度を決定することができる。

［第３の実施の形態］
次に本発明の第３の実施の形態に係る微細藻類濃度決定装置について図５を参照して説明する。

＜装置の構成＞
本実施の形態に係る微細藻類濃度決定装置は、カメラによって撮影した培地中の微細藻類の画像からその濃度や乾燥重量を出力する装置である。この装置は、ＣＰＵ（中央処理装置）や記憶装置とからなるコンピュータ・ハードウェア装置と、各種ハードウェア装置を制御するコンピュータ・プログラムとによって構成される。

図５に、本実施の形態に係る微細藻類濃度決定装置の機能ブロック図を示す。
本実施の形態に係る微細藻類濃度決定装置は、カメラ１０と接続可能なインターフェース部２０と、装置の動作を制御する制御部２１と、キーボードやマウス、モニタ等から構成される入出力部３０と接続されるインターフェース部２２と、コンピュータを微細藻類濃度決定装置として動作させるコンピュータ・プログラムを記憶したプログラム記憶部２３と、カメラ１０によって撮影され、インターフェース部２０を介して取り込まれた画像を記憶する画像記憶部２４と、後述する色情報抽出部２１ａによって抽出された画像の色情報を記憶する色情報記憶部２５と、色情報と微細藻類の濃度との関係とを記憶した関係記憶部２６と、これらの構成要素間におけるデータおよび制御情報の通り道となるバス２７とを備えている。

ここで制御部２１は、プログラム記憶部２３に記憶されたコンピュータ・プログラムによって、画像記憶部２４に取り込まれた画像の色情報を抽出して色情報記憶部２５に記憶する色情報抽出部２１ａと、色情報記憶部２５に記憶された色情報と関係記憶部２６に記憶された関係に基づいて、カメラ１０によって撮影された微細藻類の溶液（サンプル）の濃度や乾燥重量を決定する決定部２１ｂとを含んでいる。

また、関係記憶部２６は、予め求めた色情報と微細藻類の濃度との関係を、例えば、テーブル形式で記憶しておいてもよいが、関係を近似した多項式を関数として記憶しておいてもよい。

＜装置の動作＞
上述した微細藻類濃度決定装置を用いて、次のようにして濃度を決定することができる。
まず、カメラ１０によって、微細藻類を培養している容器（例えば、三角フラスコ）を撮影する。このカメラ１０は、各画素について、色空間を構成するパラメータの値（例えば、ＲＧＢそれぞれの輝度信号）を画像データとして出力する装置である。
このようなカメラ１０は、微細藻類濃度決定装置に内蔵され、インターフェース部２０と常時接続されていてもよいし、市販のデジタルカメラのように、微細藻類濃度決定装置と別体であってもよい。
カメラ１０によって撮影された画像のデータは、インターフェース部２０を介して、画像記憶部２４に転送される。

次に、画像記憶部２４に記憶された画像をモニタ（入出力部）３０に表示して、色情報を抽出すべき領域を利用者に指定させる。利用者は、入出力部３０を構成するマウス等を操作して、画像のうち微細藻類が写っている領域を色情報を抽出すべき領域として指定する。なお、微細藻類を培養する容器の形状がほぼ一定であれば、微細藻類が写っている領域を自動で抽出するようにしてもよい。

また、サンプルとともに色見本も一緒に撮影した場合は、微細藻類が写っている領域のみならず、色見本の領域も指定する。

画像中、微細藻類が写っている領域が指定されたならば、その領域内の色情報を抽出する。色情報としては、様々な色空間を構成するパラメータの値を用いることができるが、本実施の形態においては、第１の実施の形態と同様に、ＲＧＢ色空間モデルのＲＧＢパラメータのうち、特にＲとＧの階調からその平均値を抽出するものとして、詳細な説明は省略する。
なお、色見本の領域も指定されたときは、色情報抽出部２４ａは、第２の実施の形態において説明した手法にしたがって、すなわち、画像から得られた色情報を、変換行列Ｔの逆行列を用いて補正する処理を行う。
このようにして抽出された色情報は、色情報記憶部２５に記憶される。

このようにして色情報が抽出されると、決定部２１ｂは、関係記憶部２６に記憶された色情報と微細藻類の濃度との関係に対して、色情報記憶部２５に記憶された色情報を当てはめて演算し、微細藻類の濃度を決定する。このようにして得られた微細藻類の濃度をカメラ１０で撮影したサンプルの濃度としてモニタ（入出力部）３０に表示させる。
なお、微細藻類の濃度としては、重量濃度（ｇ／Ｌ）もしくは細胞濃度（個／Ｌ）、またはこれらの両方を出力するようにしてもよい。また、培養されるサンプルの体積が一定であれば、乾燥重量を決定して出力するようにしてもよい。

以上のように、本実施の形態にかかる微細藻類濃度決定装置によれば、微細藻類の溶液を容器ごと撮影した画像から微細藻類の濃度を決定するので、容器内の溶液（サンプル）の一部をサンプリングすることがない。したがって、サンプリングによるサンプルの減少を避けることができる。さらに、容器を開けることなく、非破壊的に微細藻類の濃度を決定することができるので、手間が省けるだけではなく、雑菌の混入を避けることができるので、微細藻類が繁殖する生態系を変化させてしまう恐れがない。

本実施の形態においては、色情報として、ＲＧＢ色空間モデルのＲＧＢパラメータ値を例に説明したが、ＲＧＢ色空間に代えて他の色空間モデルを用いてもよい。また、複数の色空間モデルを用いて微細藻類の濃度を決定するようにすれば、より高い精度で濃度を決定することができる。

本発明は、微細藻類の濃度や増殖速度の測定に利用することができる。

１０…カメラ、２０，２２…インターフェース部、２１…制御部、２１ａ…色情報抽出部、２１ｂ…決定部、２３…プログラム記憶部、２４…画像記憶部、２５…色情報記憶部、２６…関係情報記憶部、２７…バス、３０…入出力部。

Claims (1)

1. 微細藻類の溶液を撮影するステップと、
   撮影された前記微細藻類の溶液の画像から前記微細藻類の溶液の色空間を構成するパラメータの値を抽出するステップと、
   前記画像から抽出された前記微細藻類の溶液の前記色空間を構成するパラメータの値と、前記色空間を構成するパラメータの値と前記微細藻類の濃度とを関係づける検量線とに基づいて、前記微細藻類の濃度を決定するステップとを有し、
   前記微細藻類の溶液を撮影するステップは、
   色見本とともに前記微細藻類の溶液を撮影するステップを含み、
   前記色空間を構成するパラメータの値を抽出するステップは、
   前記画像に含まれる前記色見本の色空間を構成するパラメータの値に基づいて前記微細藻類の溶液の前記色空間を構成するパラメータの値を補正するステップを含み、
   前記微細藻類の濃度を決定するステップは、補正された前記微細藻類の溶液の前記色空間を構成するパラメータの値と前記検量線とに基づいて、前記微細藻類の濃度を決定するステップを含む
   ことを特徴とする微細藻類濃度決定方法。

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