JP5789262B2 - 生体分子を定量化するための方法 - Google Patents
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Description
近年、質量分析は大きな技術的進歩を成し遂げ、そしてますます広く適用されてきている(R. AebersoldおよびM. Mann, Nature 422 (6928), 198 (2003), B.F. Cravatt, G.M. Simon,およびJ.R. Yates, 3rd, Nature 450 (7172), 991 (2007))。しかし、高解像度質量分析法による、ゲノム、細胞、組織または生物によって発現されるタンパク質などの生体分子の完全補完物、例えば腫瘍プロテオームの正確な定量化は、なお未成熟である(F. Bertucci, D. Birnbaum,およびA. Goncalves, Mol Cell Proteomics 5 (10), 1772 (2006), J.M. Koomen, E.B. Haura, G. Beplerら, Mol Cell Proteomics 7 (10), 1780 (2008))。
好ましい態様において、前記標準混合物中の前記の1つまたは前記の複数の参照生体分子は前選択され、そして前記質量分析は、単一または複数イオンモニタリングにより、この/これらの前選択された参照生体分子をターゲットとする。
(i)異なる細胞タイプの細胞、例えば異なる細胞タイプの初代細胞または異なる細胞タイプの細胞株の細胞;
(ii)同じ細胞タイプの細胞、例えば同じ細胞タイプの初代細胞または同じ細胞タイプの細胞株の細胞;
(iii)異なる細胞株由来の細胞;
(iv)同じ細胞株由来の細胞;
(v)異なる細胞系譜の細胞;
(vi)同じ細胞系譜の細胞;
(vii)異なる細胞培養由来の細胞であって、培養が異なる培養条件に供されている、前記細胞;または
(viii)同じ細胞培養由来の細胞であって、培養中の細胞が同じ培養条件に供されている、前記細胞
の集団であってもよい。
本発明、方法のすべての側面にしたがって、試料は好ましくはヒト試料であり、そして
細胞、例えば腫瘍細胞、例えば血液関連腫瘍細胞;
全組織または組織の選択された部分;
健康な組織;
疾患、例えば慢性炎症、代謝疾患、特に糖尿病、心臓血管疾患に関連する組織、腫瘍組織、例えば乳癌組織、他の癌腫組織、肉腫組織、神経内分泌腫瘍組織、血液関連腫瘍組織、リンパ腫組織、奇形腫組織、脳腫瘍組織、例えば神経膠芽腫または星状細胞腫組織;
細胞または組織の細胞内区画、例えばミトコンドリア、細胞核、
体液;
上記の抽出物;ならびに
上記から選択されるタンパク質分画、例えば濃縮膜タンパク質、糖タンパク質、リン酸化タンパク質、アセチル化タンパク質、ユビキチン化タンパク質、他の修飾を伴うタンパク質、およびタンパク質複合体
からなる試料またはヒト試料の群より選択されてもよいことが、さらに認識されるであろう。
本明細書に提供するのは、とりわけ、生物学的試料、例えば腫瘍組織等における、1つまたは複数の生体分子、あるいは生体分子の完全補完物、例えばゲノム、細胞、組織または生物によって発現されるタンパク質を包括的に定量化することを原理的に可能にする方法である。この方法によって、数百または数千の同位体標識された生体分子を正しい量で効率的に産生することが可能になり、そして試料中の数百または数千の対応する生体分子、例えば腫瘍組織中のタンパク質を、1日で質量分析によって定量化するための、標準混合物中の参照生体分子として、これらの標識生体分子を用いることが可能になる。これは、本明細書において、グレードIIの浸潤性腺管癌患者由来の乳癌組織に対して、例示的に立証される。しかし、この新規方法は、より広く適用可能であり、経済的であり、そして実験室においてより容易に適用可能であり、したがって、臨床研究のための魅力的なツールとなっている。
用語「標識型」は、本明細書において、同位体標識型を含む。好ましくは、標識型は、生体分子の化学的または代謝的同位体標識型であり、そして最も好ましくは、代謝的同位体標識型である。
異なる細胞集団を形成する細胞は、例えばDNA、RNA、細胞表面マーカー発現、遺伝子発現、生化学特性、酵素活性、振る舞い、増殖、アポトーシス、栄養必要性、組織形成、または上に定義する相違の顕在化である任意の他の特徴の改変によって区別可能である。
試料中の生体分子、例えばポリペプチドを同定し、そして/または定量化するため、本発明の方法において、多様な質量分析系を使用してもよい。高い質量正確性、高い感度および高い解像度を持つ質量分析装置には、限定されるわけではないが、マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析装置、エレクトロスプレーイオン化飛行時間型(ESI-TOF)質量分析装置、フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析装置(FT-ICR-MS)、およびOrbitrap分析装置が含まれる。MSの他の様式には、イオントラップおよび三重四極子質量分析装置が含まれる。イオントラップMSにおいて、分析物を、エレクトロスプレーイオン化またはMALDIによってイオン化し、そして次いで、イオントラップ内に入れる。次いで、イオントラップからの選択的放出に際して、トラップされたイオンをMSによって別個に分析してもよい。また、イオントラップを上述の質量分析装置の他のタイプと組み合わせてもよい。
当業者はさらに、疾患と関連することが知られるマーカーおよび関連がまだ知られていないマーカーの分析に、本発明の方法を容易に適用可能である。
1.試料中の1つまたは複数の生体分子を定量化するための方法であって
前記試料中の前記の1つまたは前記の複数の生体分子の量を決定し;そして標準混合物中の複数の生体分子の中の1つまたは複数の参照生体分子の量に対して、該量を比較する工程を含み、前記の複数の生体分子が、少なくとも2つの異なる細胞集団からの抽出によって得られており;
前記の1つまたは前記の複数の参照生体分子が、前記の1つまたは前記の複数の生体分子の標識型である、前記方法。
3.前記の1つまたは前記の複数の生体分子、および前記の1つまたは前記の複数の参照生体分子の量を、質量分析によって決定する、項目1または2の方法。
6.前記比較工程が、前記の1つまたは前記の複数の生体分子の単数または複数のピーク、および前記の1つまたは前記の複数の参照生体分子の対応する単数または複数のピーク間の強度比を決定する工程を含む、項目3〜5のいずれか一項の方法。
8.前記標準混合物中の前記の1つまたは前記の複数の参照生体分子の量をあらかじめ決定する、項目7の方法。
少なくとも2つの異なる細胞集団から、1つまたは複数の参照生体分子を含む複数の生体分子を抽出する
工程を含む、前記方法。
複数の生体分子の中に1つまたは複数の参照生体分子を含み、前記の複数の生体分子が、少なくとも2つの異なる細胞集団からの抽出を通じて得られている
前記使用。
(i)異なる細胞タイプの細胞、例えば異なる細胞タイプの初代細胞または異なる細胞タイプの細胞株の細胞;
(ii)同じ細胞タイプの細胞、例えば同じ細胞タイプの初代細胞または同じ細胞タイプの細胞株の細胞;
(iii)異なる細胞株由来の細胞;
(iv)同じ細胞株由来の細胞;
(v)異なる細胞系譜の細胞;
(vi)同じ細胞系譜の細胞;
(vii)異なる細胞培養由来の細胞であって、培養が異なる培養条件に供されている、前記細胞;または
(viii)同じ細胞培養由来の細胞であって、培養中の細胞が同じ培養条件に供されている、前記細胞
の集団である、項目1〜10、12または14のいずれか一項の方法、項目11または14の標準混合物、あるいは項目13または14の使用。
19.それぞれ、項目(i)、(ii)、(iii)および(iv)にしたがった同じまたは異なる細胞株が、癌腫細胞株、肉腫細胞株、リンパ腫細胞株、白血病細胞株、生殖細胞腫瘍細胞株、および芽腫細胞株より選択される、項目18の方法、標準混合物、または使用。
細胞、例えば腫瘍細胞、例えば血液関連腫瘍細胞;
全組織または組織の選択された部分;
健康な組織;
疾患、例えば慢性炎症、代謝疾患、特に糖尿病、心臓血管疾患に関連する組織、腫瘍組織、例えば乳癌組織、他の癌腫組織、肉腫組織、神経内分泌腫瘍組織、血液関連腫瘍組織、リンパ腫組織、および奇形腫組織;
細胞または組織の細胞内区画、例えばミトコンドリアまたは細胞核;
体液;
上記の抽出物;ならびに
上記から選択されるタンパク質分画、例えば濃縮膜タンパク質、糖タンパク質、リン酸化タンパク質、アセチル化タンパク質、ユビキチン化タンパク質、他の修飾を伴うタンパク質、およびタンパク質複合体
からなる試料群より選択される
先行する項目いずれか一項の方法、標準混合物、または使用。
28.少なくとも2つの異なる細胞集団の前記混合物が、各細胞集団の細胞を実質的に等しい数、含有する、項目27の方法、標準混合物、または使用。
34.前記の1つまたは前記の複数の参照生体分子が、同位体標識されている、好ましくは化学的または代謝的に同位体標識されている、そして最も好ましくは代謝的に同位体標識されている、先行する項目いずれか一項の方法、標準混合物、または使用。
36.安定同位体が、2H、13C、15N、17O、18O、33P、34Sおよびその組み合わせからなる群より選択される、項目34または35の方法、標準混合物、または使用。
実施例1:組織ホモジナイズ
浸潤性腺管癌(グレードII)の凍結試料は、Piotr Ziolkowski博士(Department of Pathology, Wroclaw Medical University, Poland)の厚意によって提供された。インフォームドコンセントにしたがった試料の分析は、地方の倫理委員会によって認可された。凍結腫瘍組織(100mg)を、0.5ml緩衝液(100mM Tris-HCl pH 7.6、0.1M DTT)中、IKA Ultra Turbaxブレンダーを最高速度(25000rpm)、4℃で用いて、ホモジナイズした。次いで、SDSをホモジネートに添加して、最終濃度4%とした。溶解物を95℃で5分間インキュベーションし、そして次いで、短時間、超音波処理した。溶解物を14,000rpmで10分間遠心分離し、そして上清を以下の工程に用いた。
ヒト乳腺上皮細胞(HMEC)をLonzaから得た。天然リジンおよびアルギニンが、重い同位体で標識されたアミノ酸、L-13C6 15N4-アルギニン(Arg10)およびL-13C6 15N2-リジン(Lys8)に置換されている、GibcoTM規定ケラチノサイト-SFM(Invitrogen)中で培養することによって、HMECをSILAC標識した。標識アミノ酸をCambridge Isotope Laboratories, Inc, USAより購入した。HCC1599、MCF7およびHCC1937を、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ)より得た。HCC2218を、American Type Culture Collection(ATCC)より購入した。天然リジンおよびアルギニンがLys8およびArg10によって置換されており、そして透析血清を補充されているRPMI中で培養することによって、HCC1599、HCC2218およびHCC1937をSILAC標識した。天然アミノ酸の代わりにLys8およびArg10を含有し、そして10%透析血清を補充されているDMEM中でMCF7を増殖させた。SILAC培地中でおよそ8倍加に渡って細胞を培養して、完全標識に到達させた。HMEC、HCC1937およびMCF7細胞の溶解を、集密以下の培養に対して行った。懸濁中で増殖するHCC2218およびHCC1599を対数増殖状態で溶解した。溶解前にすべての細胞2をPBSで洗浄し、そして4%SDS、100mM Tris-HCl pH 7.6および100mM DTTを含有する緩衝液で溶解した。溶解物を95℃で5分間インキュベーションし、そして次いで、短時間、超音波処理した。295nmの励起波長を用いて、350nmでのトリプトファン蛍光発光によって、タンパク質濃度を決定した。トリプトファンを標準として用いて、8M尿素中で測定を行った。SUPER-SILAC混合物の調製のため、等量の溶解物各々を混合し、そして以下の工程で用いた。
腫瘍溶解物の等量のタンパク質およびSILAC混合物を合わせ、そして0.1M Tris-HCl pH8.0中の8M尿素中で希釈した(およそ1:8)。試料をMicroconデバイスYM-30(Millipore)上に装填し、そして先に記載されるように(J.R. Wisniewski, A. Zougman, N. Nagarajら, Nature methods 6 (5), 359 (2009))、FASPプロトコルを行った。簡潔には、Microconデバイスを室温で15分間、14,000xgで遠心分離し、その後、尿素溶液で連続2回洗浄した。続いて、100μLの0.1M Tris-HCl、pH8.0中の8M尿素中の50mMヨードアセトアミドを溶解物に添加し、そして暗所で20分間インキュベーションした。インキュベーション後、デバイスを8M尿素で2回洗浄し、そして40mM重炭酸アンモニウムで2回洗浄した。トリプシンを1:50(μgトリプシン:μgタンパク質)の比で濃縮物に添加し、そして37℃で一晩インキュベーションした。遠心分離によって、フィルターからペプチドを収集し、そして40mM重炭酸アンモニウムで2回連続して洗浄した。280nmのUV吸光度でペプチド濃度を決定した。
陰イオン交換クロマトグラフィーによって、40μgのペプチドを分離した。200μlマイクロピペットチップ内に6層の3M Empore陰イオン交換ディスク(Varian、1214-5012)を積み重ねることによって、カラムを組み立てた。カラムをメタノールで活性化し、その後、1M NaOHで洗浄した。以下のpH値:11、8、6、5、4および2になるようにNaOHで滴定した、20mM酢酸、20mMリン酸、および20mMホウ酸で構成されたBritton&Robinson緩衝液中で、平衡化および溶出を行った。pH11のカラム上にペプチドを装填し、そして続いて、6つの異なるpH値の緩衝液で溶出させた。溶出したペプチドを、先に記載されるように(J. Rappsilber, Y. Ishihama,およびM. Mann, Analytical chemistry 75 (3), 663 (2003))stage-tipsに結合させた。緩衝液B(80%アセトニトリル、0.5%酢酸)を用いたLC-MS/MS前に、StageTipsからペプチドを溶出させた(J.V. Olsen, L.M. de Godoy, G. Liら, Mol Cell Proteomics 4 (12), 2010 (2005))。
StageTipsから溶出したペプチドを、ナノフローHPLC系(Proxeon Biosystems)を用いて、社内で作製した15cmカラム(内径75μm、3μm ReproSil-Pur C18-AQ媒体)上の逆相クロマトグラフィーによって分離した。HPLCを、オンラインでナノエレクトロスプレーイオン供給源(Proxeon Biosystems)を通じて、LTQ-Orbitrap質量分析装置(Thermo Scientific)に、またはLTQ-Orbitrap Velos質量分析装置(Thermo Scientific)に連結した。緩衝液A(0.5%酢酸)を用い、流速500nl/分でカラム上にペプチドを装填し、そして流速250nl/分で、190分の直線勾配で溶出させた。異なるpH値からの分画に関して、3つの異なる勾配を適用した。pH11およびpH8溶液で溶出した分画には、2〜30%緩衝液Bの勾配を適用した。pH6およびpH5溶液には5〜35%緩衝液Bを、そしてpH4およびpH2には、8〜37%緩衝液Bを適用した。直線勾配後、カラムを洗浄して90%緩衝液Bに到達させ、そして緩衝液Aで再平衡化した。LTQ-Orbitrap Velosと組み合わせたLC実行を、15cmカラム(内径75μm、1.9μm ReproSil-Pur C18-AQ媒体)で行った。5〜30%緩衝液Bの190分間の勾配を用いた。
LTQ-OrbitrapおよびLTQ-Orbitrap Velos由来の生MSファイルを、MaxQuantによって分析した(J. CoxおよびM. Mann, Nature biotechnology 26 (12), 1367 (2008))(バージョン1.0.13.12)。順方向および逆方向タンパク質配列の両方を含有するデコイIPI-ヒトデータベース、バージョン3.62に対して、MASCOT検索エンジン(バージョン2.2.04、Matrix Science)によって、MS/MSスペクトルを検索した(D.N. Perkins, D.J. Pappin, D.M. Creasyら, Electrophoresis 20 (18), 3551 (1999))。
本発明者らはまた、異なる腫瘍タイプに関するsuper-SILAC混合物を開発した。本発明者らは、神経膠芽腫および星状細胞腫に由来する5つの細胞株を組み合わせて、これらの腫瘍タイプの分析のための内部標準として利用した(表5)。本発明者らは、これを原形質性星状細胞腫(astrocytoma protoplasmaticum)の溶解物と混合し、そして結果を、単一標識星状細胞腫細胞株1321N1を含むものに比較した。この脳腫瘍において、本発明者らは、5,183タンパク質群を同定し、そしてそのうち4,318を定量化した。本発明者らの先の結果と同様に、super-SILAC混合物の比の分布は単一細胞株のものよりはるかに狭かった。定量化した脳腫瘍プロテオームの63%が、内部標準に対して非常に容易に定量化可能な2倍の比以内であり、これに対して単一細胞株に関しては48%であった(図4)。したがって、super-SILAC戦略は、広い腫瘍タイプに適用可能である。
本発明者らは、リジン(Lys4)およびアルギニン(Arg6)の重量型で、マウス肝臓腫Hepa1-6細胞を代謝標識することによって、ホスホペプチド標準を生成した。細胞を2つの集団に分け、一方をインスリンで刺激して、標準におけるインスリン依存性リン酸化部位の適切な代表を達成した(図5a)。標識ホスホペプチドを化学的に合成するのに比較して、標準はいくつかの利点を有する。まず、これは、正確な定量化に望ましい量でおおよそ存在する、数万の標準ペプチドの経済的な生成を導くはずである。第二に、これは試料プロセシング初期に試料と標準を混合することを可能にし、プロテオミクス・ワークフロー中に導入される定量化誤差を回避する。
Claims (7)
- 試料における、1つまたは複数の第一の生体分子を定量化するための方法であって、
(a)少なくとも2つの異なる細胞集団混合物から、1つまたは複数の参照生体分子を含む、複数の第二の生体分子を抽出し、ここで前記の少なくとも2つの異なる細胞集団は
(ii)異なる細胞株由来の細胞;または
(iv)培養が異なる培養条件に供されている、異なる細胞培養由来の細胞
の集団であり、
ここで、前記の1つまたは前記の複数の参照生体分子は、前記の1つまたは前記の複数の第一の生体分子の代謝的同位体標識型である
それによって標準混合物を得て;
(b)前記標準混合物を前記試料と混合し;
(c)前記試料中の前記の1つまたは前記の複数の第一の生体分子の量を決定し;そして
(d)前記標準混合物中の複数の第二の生体分子の中の1つまたは複数の参照生体分子の量に対して、該量を比較する
ここで、前記生体分子はタンパク質またはペプチドであり、そして前記の1つまたは前記の複数の第一の生体分子、および前記の1つまたは前記の複数の参照生体分子の量は、質量分析によって決定される
工程を含む、前記方法。 - 前記標準混合物中の前記の1つまたは前記の複数の参照生体分子が前選択され、そして質量分析が、単一または複数イオンモニタリングにより、これらをターゲットとする、請求項1の方法。
- 前記比較工程が、前記の1つまたは前記の複数の第一の生体分子の単数または複数のピーク、および前記の1つまたは前記の複数の参照生体分子の対応する単数または複数のピーク間の強度比を決定する工程を含む、請求項1または2の方法。
- 試料中の1つまたは複数の第一の生体分子を定量化するための標準混合物を調製するための方法であって、
少なくとも2つの異なる細胞集団の混合物から、1つまたは複数の参照生体分子を含む複数の第二の生体分子を抽出する工程を含み、
前記の少なくとも2つの異なる細胞集団が、
(ii)異なる細胞株由来の細胞;または
(iv)異なる細胞培養由来の細胞であって、培養が異なる培養条件に供されている、前記細胞
の集団であり、
前記の1つまたは前記の複数の参照生体分子が、前記の1つまたは前記の複数の第一の生体分子の代謝的同位体標識型であり、そして前記生体分子がタンパク質またはペプチドである
前記方法。 - 前記の少なくとも2つの異なる細胞集団が、細胞形態、少なくとも1つの生体分子の発現プロファイル、好ましくは複数の生体分子の発現プロファイル、および/または分化状態に関して、互いに異なる、請求項1〜4のいずれか一項の方法。
- 前記試料が
細胞、例えば腫瘍細胞、例えば血液関連腫瘍細胞;
全組織または組織の選択された部分;
健康な組織;
疾患、例えば慢性炎症、代謝疾患、特に糖尿病、心臓血管疾患に関連する組織、腫瘍組織、例えば乳癌組織、他の癌腫組織、肉腫組織、神経内分泌腫瘍組織、血液関連腫瘍組織、リンパ腫組織、および奇形腫組織;
細胞または組織の細胞内区画、例えばミトコンドリアまたは細胞核;
体液;
上記の抽出物;ならびに
上記から選択されるタンパク質分画、例えば濃縮膜タンパク質、糖タンパク質、リン酸化タンパク質、アセチル化タンパク質、ユビキチン化タンパク質、他の修飾を伴うタンパク質、およびタンパク質複合体
からなる試料群より選択される、請求項1〜5いずれかの一項の方法。 - 代謝同位体標識が、細胞培養中のアミノ酸での安定同位体標識(SILAC)である、請求項1〜6のいずれか一項の方法。
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