JP5762764B2 - 細胞画像解析システム - Google Patents
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Description
しかるに、これらの万能細胞が分化し、他の細胞に変化したことを顕微鏡観察しながら肉眼で確認することは、非常に困難である。分化する細胞が多種多様であり、細胞画像を肉眼で観察しただけでは、細胞画像中における細胞の種類を判別することが難しい。
このため、従来、万能細胞が分化して他の細胞に変化したことを確認するためには、分化した細胞を一旦取り出して増殖させ、増殖させた細胞に対して分子統計学的な解析を行うことによって、その分化した細胞の種類を特定するという手法を用いる必要があり、顕微鏡観察しながら分化した細胞の種類を特定することが困難であった。
DNAインターカレータは、DNAの二本鎖間に挿入される蛍光試薬である。培養した細胞にDNAインターカレータであるDAPIやPIで核を染色する。染色した細胞を、例えば、プレパラートに固定あるいはマルチウェルやシャーレ等の容器に収容して標本を作成し、顕微鏡を備えた撮像装置を介して画像を取得する。
取得した画像から核を認識して、各々の細胞を特定し、特定した細胞毎に、核内の蛍光量を測定する。蛍光量の測定は、核の画像ピクセル毎の輝度値の合計値と核内の画像ピクセルの最高輝度値との2つのパラメータから輝度の散布図を作図する。これにより、散布図上に各々の細胞が点として表される。散布図上に表された細胞集団における個々の細胞の相対的な輝度値からG1期、S期、G2期、M期、M期以後に層別することができる。また、プレパラート標本毎にG1期、S期、G2期、M期、M期以後のそれぞれに該当する細胞の割合を算出する、即ち、細胞周期における各期に該当する細胞の割合を算出することも可能である。
DNAインターカレータを用いると、DNA量=細胞画像輝度、の関係が成り立つ。このため、以下の分析方法を用いることによって細胞周期の特定が可能となる。
即ち、細胞周期の各期においては、DNA量と核の凝集度が異なる。このDNA量と核の凝集度を、核の画像ピクセル毎の輝度値の合計値と核内の画像ピクセルの最高輝度値で測定する。
G1期においては、染色体が2本ある。このときのDNA量を2Nとする。S期においては、DNAの合成期にあり、2Nから4Nに増える過程にある。G2期においては、分裂前の準備期間にあり、DNA量がG1期の2倍に増えた状態(4N)となる。また、M期においては、核が凝集するので明るくなる。
そこで、G1期,S期,G2期は、DNA量(=DAPIの輝度の総和)によって特定する。DNAに直接結びつくタイプの蛍光試薬を用いると、蛍光量(核領域の輝度の総和)=DNA量となる。
M期は核の明るさで判断する。分裂期にある細胞は、輝度が明るく核が凝集している。このため、核領域中の最大輝度で判断する。
例えば、特許文献1には、細胞の形状等からM期における細胞分裂の詳細期を特定することが可能であることが示されている。しかし、特許文献1に記載の方法は、M期における細胞分裂の詳細期のみを計測する方法であって、細胞を培養中に細胞周期における各期の時間を計測することができない。また、特許文献1の方法には、M期における細胞分裂の詳細期の時間や詳細期毎の時間を計測することについての着想がない。
非特許文献2に記載の方法は、細胞周期における特定の時期にのみ存在する2種類のタンパク質に、それぞれ融合しうる2種類の蛍光タンパク質からなるFUCCIと呼ばれる蛍光プローブを細胞の核に導入して、細胞周期を可視化する方法である。FUCCIを導入された細胞は、G1期では赤色に光り、S期、G2期、M期では緑色に光る。非特許文献2に記載の方法を用いれば、G1期とそれ以外の期の時間を計測することが可能である。また、FUCCIには、DAPIなどの蛍光試薬とは異なり、細胞毒性がないので、細胞周期の1サイクルの時間(世代時間)のみならず、細胞を生きたままの状態にして長時間計測することができる。
しかし、非特許文献3に記載の方法では、細胞周期マーカーに毒性があるため、細胞を生きたままの状態では解析できず、細胞周期における各期を特定することができない。また、非特許文献3に記載の方法も、M期における細胞分裂の詳細期の時間や詳細期毎の時間を計測することができない。
このため、例えば、iPS細胞が樹立した細胞とその他の細胞との識別、iPS細胞が樹立した細胞と樹立後に分化した細胞との識別、iPS細胞が樹立した後に分化した細胞ごとの識別等や、細胞周期における細胞の状態の変化の正確な把握をすべく、細胞分裂に関する時間情報の定量化や細胞追跡のニーズが高まっている。
固定状態(死んだ状態)の細胞からは、固定状態の前後の時点における細胞の状態を正確に把握することができず、前後の時点における細胞の状態は、一般に統計的に推測することができるに過ぎないのに対し、細胞が生きたままの状態で観察すれば、現時点の前後の時点における細胞の状態を正確に把握することができる。
iPS細胞などを含む幹細胞は、分裂と分化(「幹=元の状態」から、特定の種類の細胞に変化する状態)を繰り返していくが、特に、分化がどのように進行するのかを観察するためには、生きた細胞を観察途中で殺す(=固定する)ことができない。
また、生きたままの細胞を観察することによって、細胞集団の中で特異な細胞を抽出することができる。例えば、がん細胞などでは、極く少数の細胞だけが分裂時に異常を起こす場合がある。また、iPS細胞も作成方法によっては、がん化しやすくなることが知られている。このような細胞集団内における特異な細胞の抽出と解析を行うためには、個々の細胞に対して時間の経過にともなう状態の変化を辿るためにも、生きたままの細胞を解析することが必要である。
図1は本発明の一実施形態にかかる細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
本実施形態の細胞画像解析システムは、画像取得装置1と、細胞画像解析装置2と、培養装置(図示省略)と、電動ステージ(図示省略)を有する。
画像取得装置1は、蛍光顕微鏡、共焦点レーザ蛍光顕微鏡など、細胞の蛍光画像を観察する顕微鏡を用いて構成されており、顕微鏡観察光学系1aと、撮像手段1bを有する。
顕微鏡観察光学系1aは、光源、照明レンズ、複数種類の励起フィルタをターレット等に備えた励起光切換手段、対物レンズ、吸収フィルタ、結像レンズ等、を備えた一般的な蛍光顕微鏡、共焦点レーザ蛍光顕微鏡における照明光学系及び観察光学系(図示省略)で構成されており、試料の像を撮像素子1b2の撮像面に結像する。
撮像手段1bは、撮像時間制御手段1b1と撮像素子1b2を有する。撮像素子1b2は、顕微鏡観察光学系1aを介して結像された細胞像を撮像する。撮像時間制御手段1b1は、撮像素子1b2が所定の時間的間隔でもって断続的に撮像動作を行うように制御する。
このような構成により、画像取得装置1は、細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する色の異なる2つの蛍光タンパク、又は、細胞周期の期に応じて異なる色を発する1つの蛍光タンパクが導入された生細胞の画像を所定の時間的な間隔でもって時系列に取得する。
電動ステージ(図示省略)は、XYステージ等で構成されており、生細胞を収容したディシュやマイクロプレートを画像取得装置1における撮像位置に搬送する。
なお、顕微鏡観察における一視野に入らない生細胞に対しては、XYステージ等を用いて撮像位置に生細胞が位置するようにすることで、広範囲に生細胞の画像を取得することも可能になっている。あるいは、XYステージを用いる代わりに、撮像素子1b2をラインセンサ方式のTDI(Time Delay Integration:移動積分スキャン)カメラで構成することによって、広範囲に生細胞の画像を取得することができるようにしてもよい。
画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、細胞領域特定手段2a、細胞周期の期検出手段2b、細胞周期の期の時間計測手段2c、M期内の詳細期検出手段2d、M期内の詳細期の時間計測手段2e、細胞周期の期の時間比較手段2f、M期内の詳細期の時間比較手段2g、同定手段2hとして機能させるように構成されている。
データテーブル2t−1は、予め蛍光タンパクを導入するとともに蛍光タンパクとは別の所定の蛍光試薬で染色した、生細胞と同種の細胞の画像を画像取得装置1を介して取得し、細胞領域特定手段2aを介して細胞領域として特定したデータテーブル作成用画素群における所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量(即ち、データテーブル作成用画素群を構成する各画素の蛍光輝度を合計した値)及び蛍光輝度の最大値(即ち、データテーブル作成用画素群を構成する画素のうち、最も蛍光輝度が高い画素の蛍光輝度)を用いて、細胞周期の期を分類するとともに、データテーブル作成用画素群における所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値とデータテーブル作成用画素群における蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量との対応付けを行うことによって得られた、蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量に対応する細胞周期の期が格納されている。
細胞周期は、細胞分裂を起こす期であるM期と、M間とM期との間の期であるI期に分けられる。さらに、I期は、DNA合成の準備期であるG1期と、DNAが合成されて、染色体の複製が行われる期であるS期、S期とM期との間の細胞分裂の準備期であるG2期に分けられる。また、細胞周期から外れた期としてG0期がある。
細胞分裂後(post M期)は、分裂した個々の細胞内のDNAが少なくなる。そして、G1期では、DNAの合成のために必要な酵素が活性化される。このため、G1期においては、図2(a)に示すように、蛍光輝度の総量が小さくなっている。
なお、細胞は、通常、G1期おける酵素の活性化によりS期に移行するが、細胞分裂を続けない細胞は、G0期に移行する。
S期においては、細胞内でDNAが合成されて染色体が複製される。このため、図2(a)に示すように、蛍光輝度の総量が増加している。
G2期においては、細胞分裂の準備の最終段階として、細胞内でタンパク質の合成が増加する。但し、この段階では、染色体は凝集していない。このため、図2(a)に示すように、蛍光輝度の総量が大きく、且つ、蛍光輝度の最大値が小さくなっている。
このような相関関係は、DAPIなどの蛍光試薬を用いて染色した、大量の細胞集団における夫々の細胞領域として特定した画素群における蛍光輝度の総量及び細胞領域として特定した画素群内における最大蛍光輝度をプロットした散布図を作成し、散布図における相対的な値を用いて判別できる。しかし、DAPIなどの蛍光試薬を用いる方法では、細胞を長時間生きたままの状態にしておくことが出来ない。
例えば、所定の蛍光試薬であるDNAインターカレータとして、ヘキスト、DRAQ5を用いて細胞核を染色する。なお、後述するように、この細胞には、細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する色の異なる2つの蛍光タンパク、又は、細胞周期の期に応じて異なる色を発する1つの蛍光タンパクとしてFUCCIも導入されている。
画像取得装置1を介して細胞画像を取得する。次いで、取得した細胞画像から細胞画像解析装置2の細胞領域特定手段2aを介して細胞における細胞核の領域を特定する。
次いで、細胞領域特定手段2aが細胞における細胞核の領域として特定したデータテーブル作成用画素群における蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値をパラメータとした散布図を作成する(図2(a))。これにより、散布図上に細胞集団をなす各々の細胞が点として表される。次いで、散布図における細胞集団をなす各々の細胞の相対的な輝度値からG1期,S期,G2期,M期,post M期(分裂後)を層別する。
次に、G1期及びpost M期(分裂後)の範囲における輝度の最大値の平均値(μ)と標準偏差(シグマ:σ)を計算する。そして、輝度の最大値の平均値μから±3σの範囲をG1期の範囲、それ以外をpost M期(分裂後)の範囲とする。
同様に、G2期及びM期の範囲における輝度の最大値の平均値(μ)と標準偏差(シグマ:σ)を計算する。そして、輝度の最大値の平均値μから±3σの範囲をG2期の範囲、それ以外をM期の範囲とする。
このようにして定めた、輝度の最大値、輝度の合計値に対応するG1期,G2期,S期,M期,post M期(分裂後)をコンピュータの記憶領域に格納する。
上記細胞の核には、例えば、細胞周期におけるそれぞれ異なる特定の時期にのみ存在するGemininとCdt1という2種類のタンパク質にそれぞれ融合しうる2種類の蛍光タンパク質からなるFUCCIと呼ばれる蛍光プローブが導入されている。
細胞領域特定手段2aが細胞における細胞核の領域として特定したデータテーブル作成用画素群における蛍光のうち、Gemininに融合した蛍光タンパク質であるmAG1から発する緑色の光、Cdt1に融合したたんぱく質であるmkO2から発する赤色の光について、1サイクルの細胞周期分の時間において所定のピッチで取得された夫々の画像から検出する。なお、ここでは、緑色の光、赤色の光の特性の変化が1回りする時間を1サイクルとする。これにより、図2(b)に示すような緑色の光、赤色の光のそれぞれにおける時間に対する輝度値の総量の特性を示すグラフが得られる。
このとき、細胞領域特定手段2aが細胞における細胞核の領域として特定した画素群において、上述の蛍光試薬を用いた方法により、図2(a)に示すように、蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値が得られるとともに、その細胞周期の期が層別されている。
次いで、図2(c)において、細胞周期のG1期,S期,G2期,M期に分けられたそれぞれの期間における緑色の光、赤色の光の輝度値の総量の比や、緑色の光と赤色の光の輝度値の総量の増加量を算出し、算出値をコンピュータの記憶領域に格納する。
これにより、データテーブル用画素群における蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の増加量に対応する細胞周期の期がコンピュータの記憶領域に格納された、データテーブル2t−1が作成される。
上述したように、本実施形態の細胞画像解析システムにおいては、画像取得装置1が、撮像時間制御手段1b1等を介して生細胞の画像を一定の時間的間隔で時系列に取得する。このため、撮像時間制御手段1b1が制御する一定の時間的間隔に、細胞画像解析装置2において解析した画像の数を掛け合わせることで、所望の時間を算出することができる。
詳しくは、細胞周期の期の時間計測手段2cは、細胞周期の期検出手段2bが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に変化するまでの解析対象となった画像の数をカウントし、その画像数を撮像時間制御手段1b1において定められた所定の時間的間隔に掛け合わせる。これにより、世代期間が算出される。
即ち、細胞周期の期の時間計測手段2cは、細胞周期の期検出手段2bが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次の期に変化するまでの解析対象となった画像の数をカウントし、その画像数を撮像時間制御手段1b1において定められた所定の時間的間隔に掛け合わせる。これにより、細胞周期の期の時間が算出される。
即ち、ここでの「細胞周期の期の時間」とは、当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に変化するまでの世代時間、当該生細胞の細胞周期の期が次の期に変化するまでの期の時間のいずれも相当しうる。
M期においては、有糸分裂と細胞質分裂が行われる。M期は、有糸分裂の段階に応じて、前期・前中期・中期・後期・終期に分けられる。
前期では、図3(a)に示すように、染色体3aが凝縮し、セントロゾーム(中心体)3bが2つ構成され、微小管3cが伸びる。前中期では、図3(b)に示すように、核膜3dが消失し、染色体3aが赤道面へ移動し始める。中期では、図3(c)に示すように、染色体3aが赤道面上に並ぶ。後期では、図3(d)に示すように、染色体3aが分離し始め、極方向に移動を開始する。終期では、図3(e)に示すように、染色体3aが両極へ移動を完了し凝集がなくなるとともに、新しい核膜3dが形成される。その後、細胞質分裂は、終期の間に始まる。そして、図3(f)に示すように、細胞質分裂により、細胞が2つに分裂する。
そこで、本実施形態の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置2に備わるコンピュータの記憶領域に、M期における生細胞の形態的特徴要素に対応するM期内の詳細期を格納したデータテーブル2t−2を備えている。そして、M期内の詳細期検出手段2dが、細胞周期の期検出手段2bが検出した当該生細胞の細胞周期の期がM期である場合に、当該生細胞の形態的特徴要素を、M期における生細胞の形態的特徴要素に対応するM期内の詳細期が格納されたデータテーブル2t−2と照合することによって、当該生細胞のM期内の詳細期を検出するようにしている。
即ち、M期内の詳細期の時間計測手段2eは、M期内の詳細期検出手段2dが検出した当該生細胞のM期内の詳細期が次の詳細期に変化するまで、またはM期の終期が次の細胞周期の期であるG1期に変化するまでの解析対象となった細胞画像の数をカウントし、その画像数を撮像時間制御手段1b1において定められた所定の時間的間隔に掛け合わせる。これにより、M期内の詳細期の時間が算出される。
なお、ここでの「第一の期の時間」及び「第二の期の時間」としては、例えば、互いに同一世代内における異なる二つの細胞周期の期同士の時間や、互いに異なる二つの世代における一つの細胞周期の期同士の時間が相当しうる。
なお、ここでの「第一の詳細期の時間」と「第二の詳細期の時間」としては、例えば、互いに同一世代のM期内における異なる二つの詳細期の時間や、互いに異なる二つの世代における一つのM期内の詳細期の時間が相当しうる。
同定手段2hは、さらに、細胞周期の期の時間計測手段2cが計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、M期内の詳細期の時間計測手段2eが計測した当該生細胞のM期内の詳細期の時間、細胞周期の期の時間比較手段2fが比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、M期内の詳細期の時間比較手段2gが比較した当該生細胞のM期内の異なる詳細期同士の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、細胞分裂、細胞の成長度、細胞集団の層別、細胞集団の成長度、細胞の性質の少なくともいずれかを同定する。
図4は本実施形態の細胞画像解析システムを用いた前段階の処理としての生細胞への蛍光タンパクの導入から生細胞の画像の解析までの全体の処理手順の概略を示す説明図である。
全体の処理は、図4に示すように、前段階の処理としての生細胞への蛍光タンパクの導入(ステップS1)、画像取得装置1による生細胞の画像の取得(ステップS2)、細胞画像解析装置2による生細胞の画像の解析(ステップS3)の順で行う。生細胞への蛍光タンパクの導入(ステップS1)後、タイムラプス観察を行い、生細胞の画像の取得(ステップ2)と生細胞の画像の解析(ステップ3)を繰り返し行う。
蛍光タンパクの導入処理段階では、細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する色の異なる2つの蛍光タンパク、又は、細胞周期の期に応じて異なる色を発する1つの蛍光タンパクとして、FUCCI(Fluorescent Ubiqutination-based Cell Cycle Indicator: フーチ)を細胞内に導入する。そして、蛍光タンパクが導入された複数の細胞が、例えば、マルチウェルプレートに播種された状態にして、顕微鏡によりタイムラプス観察を行えるようにする。
撮像処理段階では、顕微鏡を用いて構成された細胞画像取得装置1の顕微鏡観察光学系1aが、試料中の生細胞の像を結像し、撮像素子1b2が顕微鏡観察光学系1aを介して結像された細胞像を所定の時間的間隔でもって撮像する。これにより、蛍光タンパクを導入された生細胞の画像が時系列に取得される。
図5は本実施形態の細胞画像解析システムにおける細胞画像解析装置の処理手順を示すフローチャートである。
生細胞の画像の解析処理段階では、まず、細胞画像解析装置2の細胞領域特定手段2aが、画像取得装置1が取得した画像において、蛍光輝度が所定の輝度の閾値を上回る画素群、あるいは隣接輝度との輝度差が所定の輝度差の閾値を上回る画素群を細胞領域として特定する(ステップS31)。
細胞周期チェックポイントは、次のポイントを監視し、異常が検知されたときに、チェックポイント制御因子と呼ばれるタンパク質リン酸化酵素(サイクリン依存性キナーゼ:Cdk)とサイクリンという2種類のタンパク質からなる複合体の活性を制御することによって細胞周期の進行を減速ないし停止する。
・DNA複製チェック
DNAの複製が完了してM期へ進む準備が整っているかを監視する。
・紡錘体集合チェック
紡錘体の形成が正常でM期後期に移行できるかを監視する。
・染色体分離チェック
M期終期に正常な染色体分離分配がなされたかを監視する。
・DNA損傷チェック
G1期、G1期とS期との間、S期、G2期とM期との間で機能し、DNA損傷の修復が完了したかを監視する。
G1期からS期へ移行する際のチェックポイントでは、G1期におけるDNA損傷の修復が完了したか否か、DNA複製に必要な栄養や、増殖因子が存在するか否か等を監視する。
S期チェックポイントでは、DNAの複製に不具合がないか否かを監視する。
G2期からM期へ移行する際のチェックポイントでは、DNA複製が完了したか否か、DNA損傷の修復が完了したか否か、DNA分配が可能であるか否か等を監視する。
M期チェックポイントでは、M期中期において、紡錘体の形成が完了したか否かを監視する。
例えば、がん抑制遺伝子産物p53、Rb、BRCA1は,細胞周期チェックポイント制御に関与し、多くのがん抑制遺伝子産物はヒトのがんにおいて頻繁に不活性化され、多くのがんの原因となることが多い。細胞周期チェックポイントの異常は、遺伝的不安定性をもたらし、遺伝的不安定性は多くのがん細胞における主要な特徴となっている。
このようなことから、細胞周期における各期の時間やM期における各詳細期の時間の変化は、細胞の何らかの状態の変化を示し、さらには、細胞のがん化の予兆を示すシグナルとなり得るものと考えられる。
実施例1
図6は実施例1の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図7は種類の異なる細胞ごとの世代時間を模式的に示すグラフである。
例えば、樹立したiPS細胞、iPS細胞から分化した細胞、がん細胞、卵細胞等は、それぞれの種類ごとに世代時間が異なる。
そこで、実施例1の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置2は、種類の異なる細胞ごとの世代時間を格納したデータテーブル2t−3を備えている。また、同定手段2hは、細胞周期の期の時間計測手段2cが計測した夫々の生細胞の世代時間を、種類の異なる細胞ごとの世代時間が格納されたデータテーブル2t−3と照合して、細胞の種類を特定するように構成されている。
実施例1の細胞画像解析システムによれば、細胞の種類が、世代時間から特定できるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図1に示した細胞画像解析システムと略同じである。
図8は実施例2の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図9は種類の異なる細胞ごとの世代数と世代数に応じた世代時間の合計値との相関関係を模式的に示すグラフである。
例えば、樹立したiPS細胞、iPS細胞から分化した細胞、がん細胞、卵細胞等は、それぞれの種類ごとに、世代数と世代数に応じた世代時間の合計値との相関関係が異なり、その相関関係の違いは世代数を重ねるごとに明確になる。
そこで、実施例2の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置2は、種類の異なる細胞ごとの世代数及び世代数に応じた世代時間の積算値を格納したデータテーブル2t−4を備えている。また、細胞画像解析装置2に備わる画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、さらに、細胞周期の期検出手段2bが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に到達したとき、即ち、細胞領域特定手段2aが特定した夫々の生細胞の世代が変わるごとに世代数をカウントする世代数計測手段2iとしても機能させるように構成されている。また、細胞周期の期の時間計測手段2c’は、当該世代の世代期間を算出するとともに、世代ごとの世代期間を積算するように構成されている。また、同定手段2hは、細胞周期の期の時間計測手段2c’が計測した夫々の生細胞の世代時間の積算値及び世代数計測手段2iが計測した夫々の生細胞の世代数を、種類の異なる細胞ごとの世代数及び世代数に応じた世代時間の積算値が格納されたデータテーブル2t−4と照合して、細胞の種類を特定するように構成されている。
実施例2の細胞画像解析システムによれば、細胞の種類を、一世代の世代時間からでは特定することが難しい場合であっても、特定することができるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図1に示した細胞画像解析システムと略同じである。
図10は実施例3の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図11は特定の細胞の世代数と世代数に応じた世代時間の合計値との相関関係における理想値と測定値を模式的に示すグラフである。
一般に細胞は、分裂を繰り返していくにつれて固有の形態および機能を持った細胞へと変化して行く。分化とは、この形態的機能的な細胞の変化をいう。また、一般に細胞は、未分化細胞ほど細胞周期が短く盛んに細胞分裂を繰り返す傾向がある。また、正常組織の細胞は、分化の方向は一方向である。これに対し、がん細胞は、分化の方向が逆行する幼若化・脱分化という性質を有している。また、がん細胞は、分化度の低いものほど増殖が早くて悪性度が高く、分化度の高いものほど比較的悪性度が低い傾向にある。このため、細胞の分化度や分化の安定度は、細胞のがん化やがん細胞の状態を検知する指標となると考えられる。
実施例3の細胞画像解析システムによれば、複数世代の細胞の世代時間から、細胞分化の安定度を検出することができ、細胞のがん化や、がん化した細胞の悪性度などの診断に寄与しうる。
その他の構成及び作用効果は、図1及び図8に示した細胞画像解析システムと略同じである。
図12は実施例4の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図13は種類の異なる細胞ごとのM期内の詳細期の時間を模式的に示すグラフである。
例えば、樹立したiPS細胞、iPS細胞から分化した細胞、がん細胞、卵細胞等は、それぞれの種類ごとにM期内の詳細期の時間及びM期全体の時間が異なる。
そこで、実施例4の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置2は、種類の異なる細胞ごとのM期内の時間を詳細期の時間に分けて格納したデータテーブル2t−6を備えている。また、同定手段2hは、M期内の詳細期の時間計測手段2eが計測した夫々の生細胞のM期内の詳細期の時間及びM期全体の時間を、種類の異なる細胞ごとのM期内の時間を詳細期の時間に分けて格納したデータテーブル2t−6と照合して、細胞の種類を特定するように構成されている。
実施例4の細胞画像解析システムによれば、細胞の種類が、M期内の詳細期の時間及びM期全体の時間から特定できるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図1に示した細胞画像解析システムと略同じである。
図14は実施例5の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図15は種類の異なる細胞ごとの一世代における細胞周期の各期の時間を模式的に示すグラフである。
例えば、樹立したiPS細胞、iPS細胞から分化した細胞、がん細胞、卵細胞等は、それぞれの種類ごとに一世代における細胞周期の各期の時間及び世代時間が異なる。
そこで、実施例5の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置2は、種類の異なる細胞ごとの一世代における細胞周期の時間を各期の時間に分けて格納したデータテーブル2t−7を備えている。また、同定手段2hは、細胞周期の期の時間計測手段2cが計測した一世代における夫々の生細胞の細胞周期の各期の時間及び世代時間を、種類の異なる細胞ごとの一世代における細胞周期の時間を各期の時間に分けて格納したデータテーブル2t−7と照合して、細胞の種類を特定するように構成されている。
実施例5の細胞画像解析システムによれば、細胞の種類が、一世代における細胞周期の各期の時間及び世代時間から特定できるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図1に示した細胞画像解析システムと略同じである。
図16は実施例6の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
がん化等、細胞の変化に伴い世代時間も変化するものと考えられる。
そこで、実施例6の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置2は、種類の異なる細胞ごとの異なる世代同士の世代時間の比較値(例えば、双方の世代時間の差分値)に対応する生細胞の変化情報を格納したデータテーブル2t−8を備えている。また、細胞周期の期の時間計測手段2cは、一つの生細胞における複数世代の世代時間を計測するように構成されている。また、細胞画像解析装置2に備わる画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、さらに、細胞周期の期の時間計測手段2cが計測した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段2jとしても機能させるように構成されている。また、同定手段2hは、さらに、世代時間比較手段2jが比較した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報が格納されたデータテーブル2t−8と照合することにより、当該一つの生細胞の変化を検出するように構成されている。
実施例6の細胞画像解析装置によれば、一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値から、細胞の変化を検出することができるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図1に示した細胞画像解析システムと略同じである。
図17は実施例7の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
がん細胞等に対しては、層別化を行うことがその後の治療効果を上げるために重要であると考えられる。
そこで、実施例7の細胞画像解析システムでは、細胞周期の期の時間計測手段2c”は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測するように構成されている。また、細胞画像解析装置2に備わる画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、さらに、細胞周期の期の時間計測手段2c”が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段2j’として機能させるように構成されている。また、同定手段2hは、さらに、世代時間比較手段2j’が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の層別化情報が格納されたデータテーブル2−9と照合することにより、当該二つ以上の生細胞を層別化するように構成されている。
その他の構成は、図16に示した細胞画像解析システムと略同じである。
実施例7の細胞画像解析装置によれば、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値から、当該二つ以上の生細胞を層別化することができるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図1に示した細胞画像解析システムと略同じである。
図18は実施例18の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
実施例8の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置2は、種類の異なる細胞ごとの異なる世代同士の世代時間の比較値(例えば、双方の世代時間の差分値)に対応する生細胞の変化情報及び層別化情報を格納したデータテーブル2t−10を備えている。また、細胞周期の期の時間計測手段2c”は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測するように構成されている。また、細胞画像解析装置2に備わる画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、細胞周期の期の時間計測手段2c”が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段2j’として機能させるように構成されている。また、同定手段2hは、さらに、世代時間比較手段2j’が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報及び層別化情報が格納されたデータテーブル2t−10と照合することにより、当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける変化を検出するとともに当該二つ以上の生細胞を層別化するように構成されている。
実施例8の細胞画像解析装置によれば、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値から、当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける変化を検出すると同時に当該二つ以上の生細胞を層別化することができるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図1に示した細胞画像解析システムと略同じである。
実施例9の細胞画像解析システムでは、画像取得装置1は、投与する化学薬品、光刺激、遺伝子操作、温度・湿度・圧力・PH等の環境、培地の養分等の少なくともいずれかを異ならせた2つの計測条件下における生細胞の画像を時系列に取得するように構成されている。
また、世代時間比較手段2j(2j’)は、2つの計測条件下のそれぞれにおいて、細胞周期の期の時間計測手段2c(2c’,2c”)が計測した当該生細胞の世代時間を比較する。
その他の構成は、実施例1〜8のいずれかの細胞画像解析システムと略同じである。
さらに、上記各実施例の細胞画像解析システムにおいては、蛍光色素が、FUCCIであるのが好ましい。
なお、本発明の細胞画像解析システムは、上記実施例に記載の構成に限定されるものではなく、例えば、上記各実施例において特有の構成を任意に組み合せた構成としてもよい。
例えば、細胞画像解析装置2を介して特異な細胞が検出された場合、画像取得装置1における顕微鏡観察光学系1aの倍率を高倍率にする、あるいは、撮像時間制御手段1の撮像時間間隔を短くする等の制御をして、この特異な細胞の分裂時の詳細な画像を取得するようにしてもよい。
例えば、生細胞をG1期とG1期以外の期の長さの比で層別する場合、画像取得装置1は、当初は例えば1時間間隔のインターバルで生細胞を撮像し、細胞画像解析装置2が画像を解析する。ここで、細胞画像解析装置2がG1期からS期へ移行しそうな生細胞を検出した場合、画像取得装置1は、インターバルを例えば10分間隔に短縮して生細胞を撮像する。そして、細胞画像解析装置2がS期に移行した期の時間を測定し、その後、画像取得装置1は元のインターバル(例えば1時間間隔)で撮像する。
同様に、例えば、M期からPostM期に移行するまでの時間で層別する場合、細胞画像解析装置2がM期からPostM期へ移行しそうな生細胞を検出した場合、画像取得装置1は、インターバルを例えば5分間隔に短縮して生細胞を撮像する。そして、細胞画像解析装置2がPostM期に移行した(細胞が完全に分裂した)時間を測定し、その後、画像取得装置1は元のインターバル(例えば1時間間隔)で撮像する。
このようにすれば、細胞へ与えるダメージを極力抑えながら、細胞周期における所望の期の時間を正確に計測することができる。
1a 顕微鏡観察光学系
1b 撮像手段
1b1 撮像時間制御手段
1b2 撮像素子
2 細胞画像解析装置
2a 細胞領域特定手段
2b 細胞周期の期検出手段
2c,2c’,2c” 細胞周期の期の時間計測手段
2d M期内の詳細期検出手段
2e M期内の詳細期の時間計測手段
2f 細胞周期の期の時間比較手段
2g M期内の詳細期の時間比較手段
2h 同定手段
2i 世代数計測手段
2j,2j’ 世代時間比較手段
2t−1,2t−2,2t−3,2t−4,2t−5,2t−6,2t−7,2t−8,2t−9 データテーブル
3a 染色体
3b セントロゾーム(中心体)
3c 微小管
3d 核膜
Claims (17)
- 細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する蛍光タンパクが導入された生細胞の画像を時系列に取得する、顕微鏡を備えた画像取得装置と、前記画像取得装置が時系列に取得した画像を用いて生細胞に対する所定の解析を行う、コンピュータを備えた細胞画像解析装置と、を有する細胞画像解析システムであって、
前記細胞画像解析装置は、前記コンピュータを、
前記画像取得装置が取得した画像において、蛍光輝度が所定の輝度の閾値を上回る画素群、あるいは隣接輝度との輝度差が所定の輝度差の閾値を上回る画素群を細胞領域として特定する細胞領域特定手段、
前記蛍光タンパクから発せられる蛍光に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブルと照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出する細胞周期の期検出手段、
前記細胞周期の期検出手段が検出した当該生細胞の細胞周期の期が別の期に変化するまでの細胞周期の期の時間を計測する細胞周期の期の時間計測手段、
前記細胞周期の期の時間を用いて、少なくとも細胞の種類を同定する同定手段、
として機能させる画像解析ソフトウェアを備え、
前記データテーブルは、
予め前記蛍光タンパクを導入するとともに前記蛍光タンパクとは別の所定の蛍光試薬で染色した、前記生細胞と同種の細胞において、前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光を用いて、前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光の輝度の総量および最大値をパラメータとした散布図を生成し、該散布図を用いて細胞周期の期を分類するとともに、前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光と、前記蛍光タンパクから発せられる蛍光との対応付けを行うことによって得られたものであることを特徴とする細胞画像解析システム。 - 前記蛍光タンパクが色の異なる2つの蛍光タンパク、又は、細胞周期の期に応じて異なる色を発する1つの蛍光タンパクであり、
前記細胞周期の期検出手段が、
前記細胞領域特定手段が細胞領域として特定した画素群における前記蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量を、予め前記蛍光タンパクを導入するとともに前記蛍光タンパクとは別の所定の蛍光試薬で染色した、前記生細胞と同種の細胞の画像を前記画像取得装置を介して取得し、前記細胞領域特定手段を介して細胞領域として特定したデータテーブル作成用画素群における前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値を用いて細胞周期の期を分類するとともに、前記データテーブル作成用画素群における前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値と前記データテーブル作成用画素群における前記蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量との対応付けを行うことによって得られた、前記蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブルと照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出することを特徴とする請求項1に記載の細胞画像解析システム。 - 前記細胞周期の期の時間が、当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に変化するまでの世代時間であることを特徴とする請求項1又は2に記載の細胞画像解析システム。
- 前記細胞周期の期の時間が、当該生細胞の細胞周期の期が次の期に変化するまでの期の時間であることを特徴とする請求項1又は2に記載の細胞画像解析システム。
- 前記細胞周期の期検出手段が検出した当該生細胞の細胞周期の期がM期である場合に、当該生細胞の形態的特徴要素を、M期における生細胞の形態的特徴要素に対応するM期内の詳細期が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該生細胞のM期内の詳細期を検出するM期内の詳細期検出手段をさらに備えることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
- 前記M期内の詳細期検出手段が検出した当該生細胞のM期内の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの詳細期の時間を計測するM期内の詳細期の時間計測手段をさらに備える請求項5に記載の細胞画像解析システム。
- 前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の第一の期から次の期に変化するまでの第一の期の時間と、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の第二の期から次の期に変化するまでの第二の期の時間とを比較する細胞周期の期の時間比較手段をさらに備える請求項1〜6のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
- 前記M期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のM期内の第一の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの第一の詳細期の時間と、前記M期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のM期内の第二の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの第二の詳細期の時間とを比較するM期内の詳細期の時間比較手段をさらに備えることを特徴とする請求項6又は請求項6に従属する請求項7に記載の細胞画像解析システム。
- 前記同定手段が、
前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、前記M期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のM期内の詳細期の時間、前記細胞周期の期の時間比較手段が比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、前記M期内の詳細期の時間比較手段が比較した当該生細胞のM期内の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、少なくとも細胞の種類を同定することを特徴とする請求項6に従属する請求項7に従属する請求項8に記載の細胞画像解析システム。 - 前記同定手段は、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、前記M期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のM期内の詳細期の時間、前記細胞周期の期の時間比較手段が比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、前記M期内の詳細期の時間比較手段が比較した当該生細胞のM期内の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、細胞分裂、細胞の成長度、細胞集団の層別、細胞の性質の少なくともいずれかを同定することを特徴とする請求項9に記載の細胞画像解析システム。
- 前記細胞周期の期の時間計測手段は、一つの生細胞における複数世代の世代時間を計測し、
前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段として機能させ、
前記同定手段は、さらに、前記世代時間比較手段が比較した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該一つの生細胞の変化を検出することを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の細胞画像解析システム。 - 前記細胞周期の期の時間計測手段は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測し、
前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段として機能させ、
前記同定手段は、さらに、前記世代時間比較手段が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の層別化情報が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該二つ以上の生細胞を層別化することを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の細胞画像解析システム。 - 前記細胞周期の期の時間計測手段は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測し、
前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段として機能させ、
前記同定手段は、さらに、前記世代時間比較手段が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報及び層別化情報が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける変化を検出するとともに当該二つ以上の生細胞を層別化することを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の細胞画像解析システム。 - 前記画像取得装置は、投与する化学薬品、光刺激、遺伝子操作、温度・湿度・圧力・PH等の環境、培地の養分等の少なくともいずれかを異ならせた2つの計測条件下における生細胞の画像を時系列に取得し、
前記世代時間比較手段は、前記2つの計測条件下のそれぞれにおいて、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の世代時間を比較することを特徴とする請求項11〜13のいずれかに記載の細胞画像解析システム。 - 前記生細胞が、ES細胞、iPS細胞、がん幹細胞の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項1〜14のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
- 前記生細胞が、ES細胞、iPS細胞、がん幹細胞から分化した細胞の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項1〜14のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
- 前記蛍光タンパクが、FUCCIであることを特徴とする請求項1〜16のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
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