JPWO2019021472A1 - 細胞特定方法、細胞集団の製造方法及び細胞特定システム - Google Patents

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Abstract

本発明の方法は、体細胞の初期化に必要な初期化因子をコードする核酸と初期化因子と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞を含む第１細胞集団について発光レポータータンパク質に係る発光画像を取得することと、第１細胞集団を複数の第２細胞集団に分割することと、第２細胞集団について発光レポータータンパク質に係る発光画像を取得することと、第１細胞集団のなかから注目細胞を選択することと、複数の第２細胞集団における注目細胞を特定することとを含む。

Description

本発明は、細胞特定方法、細胞集団の製造方法及び細胞特定システムに関する。
ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞は、初期化因子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８及びＬ−ｍｙｃ）を導入した体細胞を培養することで作製される。初期化因子が導入された体細胞は、培養期間を経てリプログラミングされる。ｉＰＳ細胞の作製効率は低く、初期化因子を導入した細胞のうち、ｉＰＳ細胞になるのは一部の細胞であることが知られている。
Eirini P. Papapetrou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009 Aug; 106(31):12759-64. Stoichiometric and temporal requirements of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc expression for efficient human iPS induction and differentiation.では、蛍光タンパク質で標識した初期化因子を細胞内に発現させ、それらの発現量を解析している。Papapetrou et al.は、初期化因子Ｏｃｔ４を含むベクターを、他の初期化因子Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃを含むベクターよりも多い量で細胞に導入して、Ｏｃｔ４を他の初期化因子よりも多量に発現させると、リプログラミング効率が向上することを報告する。
ｉＰＳ細胞の作製効率が低い理由の一つは、ｉＰＳ細胞を長期間培養すると、ｉＰＳ細胞が多分化能を失いやすくなるからであると考えられる。
日本国特開２０１４−１７６３６４号公報には、発光を用いて幹細胞の状態を解析する方法が記載されている。この文献には、細胞の分化マーカー遺伝子又は未分化マーカー遺伝子を標的としたプロモーターアッセイによって、ｉＰＳ細胞から各種臓器への分化誘導段階における分化状態を解析する方法が記載されている。この方法によると、個々のｉＰＳ細胞の分化状態の均質性を評価することが可能である。
ｉＰＳ細胞の作製効率は低いことから、ｉＰＳ細胞の株を樹立するには、ｉＰＳ細胞の継代を繰り返し行うことが必要であるとされている。
国際公開第２００９／０３２１９４号には、Ｗｎｔ馴化培地を用いて、ｉＰＳ細胞を高い効率で樹立する方法が記載されている。この文献には、フローサイトメトリーやアフィニティ分離等を利用して初期化因子を導入した細胞集団のなかからｉＰＳ細胞を選択できることが記載されている。この方法によると、フローサイトメトリーやアフィニティ分離等によってｉＰＳ細胞のみを継代することが可能であると思われる。しかしながら、フローサイトメトリーやアフィニティ分離によって細胞を分離することは、コストや手間がかかる。
ｉＰＳ細胞の株を樹立するには、初期化因子を導入した細胞からなるコロニーのうち、形態が良いコロニーの中央部にある細胞を継代することが推奨されている。しかしながら、コロニーの中央部にある全ての細胞は必ずしもｉＰＳ細胞ではないと推定されている。従って、コロニーの中央部にある細胞を継代すると、ｉＰＳ細胞とｉＰＳ細胞でない細胞とは区別されずに継代される。ｉＰＳ細胞とｉＰＳ細胞でない細胞とを区別せずに継代すると、継代後のどの細胞がｉＰＳ細胞であるかコストや手間をかけずに特定することは困難であった。
本発明は、注目細胞、（例えば、ｉＰＳ細胞）を含む第１細胞集団を分割して複数の第２細胞集団を得たときに、複数の第２細胞集団におけるどの細胞が注目細胞であるかを簡便に特定することを目的とする。
本発明の一つの側面によれば、体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の初期化因子をコードする核酸と、前記複数種類の初期化因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞を含む第１細胞集団の少なくとも一部について、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第１発光画像を取得することと、前記第１細胞集団を複数の第２細胞集団に分割することと、少なくとも１つの前記第２細胞集団について、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第２発光画像を取得することと、前記第１発光画像に基づいて、前記第１細胞集団のなかから注目細胞を選択することと、前記第１発光画像と前記第２発光画像とに基づいて、前記複数の第２細胞集団における前記注目細胞を特定することとを含む、細胞特定方法が提供される。
本発明の別の側面によれば、上記側面に記載した方法を実行することと、
前記実行により特定された前記注目細胞を培養して培養細胞集団を得ることとからなるサイクルを繰り返すことを含む、細胞集団の製造方法が提供される。
本発明の別の側面によれば、体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の初期化因子をコードする核酸と、前記複数種類の初期化因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞を含む第１細胞集団であって注目細胞を含む前記第１細胞集団の少なくとも一部について、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第１発光画像と、前記第１細胞集団を分割した複数の第２細胞集団のうち少なくとも１つについて、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第２発光画像とを生成する発光画像生成装置と、プロセッサーとを備え、前記プロセッサーは、前記発光画像生成装置から前記第１発光画像及び前記第２発光画像を取得し、前記第１発光画像における前記注目細胞の位置情報を取得し、前記第１発光画像と前記第２発光画像とに基づいて、前記第２発光画像における前記注目細胞の位置情報を特定する、細胞特定システムが提供される。
図１は、本発明の一実施形態に係る細胞特定方法の主な処理の流れを示す図である。 図２は、図１に示すＳ１乃至Ｓ６を概略的に示す模式図である。 図３Ａは、第１発光画像（色Ａ）の一例を示す模式図である。 図３Ｂは、第１発光画像（色Ｂ）の一例を示す模式図である。 図４Ａは、第２発光画像（色Ａ）の一例を示す模式図である。 図４Ｂは、第２発光画像（色Ｂ）の一例を示す模式図である。 図５Ａは、第１発光強度の差の例と第２発光強度の差の例とを示す模式図である。 図５Ｂは、第１発光強度比の例と第２発光強度比の例とを示す模式図である。 図６Ａは、第１及び第３関心領域が選択された第１発光画像の一例を示す模式図である。 図６Ｂは、第２及び第４関心領域が選択された第２発光画像の一例を示す模式図である。 図７は、本発明の一実施形態に係る細胞特定システムの一例を示す模式図である。 図８は、実施例にて使用したベクターＡの構成を示す模式図である。 図９は、実施例にて使用したベクターＢの構成を示す模式図である。 図１０Ａは、第１細胞集団を示す位相差画像である。 図１０Ｂは、ＭＡ−Ｌｕｃｉ２ルシフェラーゼに起因する発光を示す第１発光画像（緑色）である。 図１０Ｃは、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因する発光を示す第１発光画像（赤色）である。 図１１は、第２細胞集団を示す位相差画像である。 図１２Ａは、第１関心領域（緑色）が選択された、図１０Ｂに示された第１発光画像（緑色）である。 図１２Ｂは、第１関心領域（赤色）が選択された、図１０Ｃに示された第１発光画像（赤色）である。 図１３は、第１関心領域（赤色）（６１０ＡＬＰ）及び（緑色）（ＢＰ４９５−５４０）の各々について取得された輝度値（発光強度）を示すグラフである。 図１４は、第１関心領域（赤色）及び（緑色）の各々について取得された輝度値（発光強度）から求めた第１発光強度比（Ｒａｔｉｏ（ＢＰ４９５−５４０輝度値／６１０ＡＬＰ輝度値））を示すグラフである。 図１５Ａは、第２関心領域（緑色）が選択された、ＭＡ−Ｌｕｃｉ２ルシフェラーゼに起因する発光を示す第２発光画像（緑色）である。 図１５Ｂは、第２関心領域（赤色）が選択された、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因する発光を示す第２発光画像（赤色）である。 図１６は、第２関心領域（赤色）（６１０ＡＬＰ）及び（緑色）（ＢＰ４９５−５４０）の各々について取得された輝度値（発光強度）を示すグラフである。 図１７は、第２関心領域（赤色）及び（緑色）の各々について取得された輝度値（発光強度）から求めた第２発光強度比（Ｒａｔｉｏ（ＢＰ４９５−５４０輝度値／６１０ＡＬＰ輝度値））を示すグラフである。 図１８Ａは、培養を開始した時点の注目細胞を示す明視野画像である。 図１８Ｂは、培養してから５時間後の注目細胞を示す明視野画像である。 図１８Ｃは、培養してから１０時間後の注目細胞を示す明視野画像である。 図１８Ｄは、培養してから１６時間後の注目細胞を示す明視野画像である。 図１８Ｅは、培養してから２０時間後の注目細胞を示す明視野画像である。 図１８Ｆは、培養してから２２時間後の注目細胞を示す明視野画像である。
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の説明は、本発明を説明することを目的とし、本発明を限定することを意図しない。
＜１．細胞特定方法の説明＞
図１は、本発明の一実施形態に係る細胞特定方法の説明の主な処理の流れを示す。
本発明の一実施形態に係る細胞特定方法は、図１に示されるとおり、
体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の初期化因子をコードする核酸と、前記複数種類の初期化因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞を含む第１細胞集団を準備することと（Ｓ１）、
前記第１細胞集団の少なくとも一部について、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第１発光画像を取得することと（Ｓ２）、
前記第１細胞集団を複数の第２細胞集団に分割することと（Ｓ３）、
少なくとも１つの前記第２細胞集団について、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第２発光画像を取得することと（Ｓ４）、
前記第１発光画像に基づいて、前記第１細胞集団のなかから注目細胞を選択することと（Ｓ５）、
前記第１発光画像と前記第２発光画像とに基づいて、前記複数の第２細胞集団における前記注目細胞を特定することと（Ｓ６）
を含む。
図２は、図１に示すＳ１乃至Ｓ６を概略的に示す模式図である。以下、図２を用いてＳ１乃至Ｓ６について説明する。
＜１−１．第１細胞集団の準備＞
図２のＳ１に示すように、第１細胞集団１を準備する。第１細胞集団１は、体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の初期化因子をコードする核酸と、複数種類の初期化因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞を含む。
第１細胞集団１は、例えば、「体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の初期化因子をコードする核酸」と「複数種類の初期化因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸」とが導入された細胞を培養することで得られる。以下の説明において、前者の核酸を「初期化因子をコードする核酸」、後者の核酸を「発光レポータータンパク質をコードする核酸」ともいう。核酸は、例えば、ＤＮＡである。また、核酸は、遺伝子と同じ意味を有していてもよい。第１細胞集団はコロニーとも表現される。第１細胞集団１は、「初期化因子をコードする核酸」と「発光レポータータンパク質をコードする核酸」とが導入された細胞を培養して得られた複数の細胞集団のうちの１つの細胞集団であってもよい。
培養は、既知の方法によって行うことができる。培養は、培地交換などの操作のための時間を除いて、顕微鏡上で行ってもよい。培養は、例えば、第１細胞集団１の短径が１ｍｍを超える程度まで続けてもよい。第１細胞集団１の短径が１ｍｍを超える程度まで続けると、体細胞を高い効率でリプログラミングできると考えられる。「リプログラミング」は、分化細胞が多能性幹細胞に変わる現象、又は分化細胞を初期化することを指す。第１細胞集団１は、例えば、２ｍｍ以下の長径と１ｍｍ以上の短径とを有する。第１細胞集団１の長径は、第１細胞集団１の重心と第１細胞集団１の外周上の２点とを通る一つの直線において、上記２点間の距離が最大となる長さである。第１細胞集団１の短径は、上記２点間の距離が最小となる長さである。
本明細書において、細胞集団の重心は、細胞集団について取得された明視野画像中の、以下の座標に設定される点であると定義される。
Figure 2019021472
座標中、ｎは明視野画像を構成するピクセルの数を表し、ｘｉはｉ番目のピクセルにおけるｘ座標を表し、ｙｉはｉ番目のピクセルにおけるｙ座標を表し、Ｂｉはｉ番目のピクセルにおける輝度を二値化した値を表す。ｎ及びｉは、何れも１以上の整数である。ｎ及びｉは、ｎ≧ｉを満たす。第１細胞集団１の重心は、例えば、ｃｅｌｌＳｅｎｓ（セルセンス；オリンパス）を用いて設定することが可能である。
培養は、例えば、「初期化因子をコードする核酸」及び「発光レポータータンパク質をコードする核酸」を体細胞に導入してから２０乃至３０日目まで続けてもよい。培養は、例えば、「初期化因子をコードする核酸」及び「発光レポータータンパク質をコードする核酸」を体細胞に導入してから２０乃至２５日目まで続けてもよい。培養は、例えば、ラミニンで被覆されたプレート内で、単核球増殖培養用培地を用いて行う。単核球増殖培養用培地は、例えば、StemFit without C培地（味の素）にサイトカインを添加した培地である。培地としては、ＡＫ０２培地（味の素）にＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ−３Ｌ、及びＣＳＦを添加した培地を用いてもよい。
「初期化因子をコードする核酸」及び「発光レポータータンパク質をコードする核酸」が導入された細胞は、例えば、「初期化因子をコードする核酸」及び「発光レポータータンパク質をコードする核酸」が導入された体細胞、又は「初期化因子をコードする核酸」及び「発光レポータータンパク質をコードする核酸」が導入された体細胞を培養した細胞である。「初期化因子をコードする核酸」及び「発光レポータータンパク質をコードする核酸」が導入された体細胞を培養すると、「初期化因子をコードする核酸」を発現することで体細胞のリプログラミングが誘導される。従って、体細胞はｉＰＳ細胞に変化し得る。
体細胞は、生殖細胞以外の細胞である。体細胞は、例えば、分化した細胞である。体細胞としては、例えば、ヒト末梢血単核球細胞（以下、ＰＢＭＣという；ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を用いることができるが、これに限定されるものではない。
「初期化因子をコードする核酸」及び「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、既存の遺伝子導入方法を用いて体細胞に導入してもよい。例えば、「初期化因子をコードする核酸」及び「発光レポータータンパク質をコードする核酸」をベクターに組み込み、エレクトロポレーションによってベクターを体細胞に導入してもよい。エレクトロポレーションには、Ａｍａｘａ（Ｌｏｎｚａ）を用いることができる。
「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、発光レポータータンパク質が複数種類の初期化因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成される。具体的には、例えば、「発光レポータータンパク質をコードする核酸」と「初期化因子をコードする核酸」とが同じタイミングで転写されるように「発光レポータータンパク質をコードする核酸」を構成する。より具体的には、「発光レポータータンパク質をコードする核酸」と「初期化因子をコードする核酸」とをそれぞれ同一種類のプロモーターと連結させることが好ましい。「発光レポータータンパク質をコードする核酸」と「初期化因子をコードする核酸」とは、各々個別のベクターに組み込んでもよく、同一のベクターに組み込んでもよい。ベクターとしては同一種類のベクターを用いることが好ましい。
「発光レポータータンパク質をコードする核酸」と「初期化因子をコードする核酸」とは同一のベクターに組み込むことが好ましい。「発光レポータータンパク質をコードする核酸」と「初期化因子をコードする核酸」とは、同一のプロモーターによって転写されることがより好ましい。「発光レポータータンパク質をコードする核酸」と「初期化因子をコードする核酸」とが同一のプロモーターによって転写される場合、「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、例えば、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列やＩＲＥＳ配列などを介してポリシストロニックに「初期化因子をコードする核酸」と連結されるように構成されることがより好ましい。「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、２Ａ配列を介してポリシストロニックに「初期化因子をコードする核酸」と連結されるように構成されることが好ましい。「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、リンカー配列を介して「初期化因子をコードする核酸」と連結されるように構成されてもよい。リンカー配列としては、既知の配列を用いることができる。リンカー配列は、例えば、グリシンをコードする複数の核酸とセリンをコードする複数の核酸とからなる。なお、「発光レポータータンパク質をコードする核酸」の位置は、初期化因子と発光レポータータンパク質とが共に発現可能な位置であればよく、「初期化因子をコードする核酸」の上流であってもよいし、下流であってもよい。
「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、発光レポータータンパク質が複数種類の初期化因子のうち１種類と共に発現するように構成されてもよく、発光レポータータンパク質が複数種類の初期化因子と共に発現するように構成されてもよい。発光レポータータンパク質が複数種類の初期化因子と共に発現する場合、「発光レポータータンパク質をコードする核酸」と「初期化因子をコードする核酸」とは、それぞれ上述した２Ａ配列、ＩＲＥＳ配列、又はリンカー配列を介して連結されてもよい。複数の「初期化因子をコードする核酸」は、それぞれ上述した２Ａ配列、ＩＲＥＳ配列、又はリンカー配列を介して連結されてもよい。
発光レポータータンパク質は初期化因子と共に発現されるため、発光レポータータンパク質をコードする遺伝子の発現のタイミング及び発現量等は、初期化因子のそれらに対応しているとみなすことができる。
「複数種類の初期化因子をコードする核酸」は、各々個別のベクターに組み込まれていてもよい。「複数種類の初期化因子をコードする核酸」のうち２以上の核酸が、１つのベクターに組み込まれていてもよい。「複数種類の初期化因子をコードする核酸」を１つのベクターに組み込む場合、例えば、「複数種類の初期化因子をコードする核酸」は口蹄疫ウイルスの２Ａ配列やＩＲＥＳ配列などを介してポリシストロニックに連結することが好ましい。「複数種類の初期化因子をコードする核酸」は、リンカー配列を介して連結してもよい。
「体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の初期化因子」としては、体細胞のリプログラミングを誘導することが知られている初期化因子の組み合わせを使用することができる。「体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の初期化因子」としては、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、及びＬ−ｍｙｃから適切な組み合わせを選ぶことができ、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８及びＬ−ｍｙｃの組み合わせを使用することができる。体細胞のリプログラミングに必要な初期化因子の数は、例えば、３〜６種類である。
「発光レポータータンパク質（luminescent reporter protein）」は、例えば、蛍光タンパク質又は化学発光レポータータンパク質である。
蛍光タンパク質は、励起光の照射によって蛍光を放出するタンパク質である。発光レポータータンパク質として蛍光タンパク質を使用した場合、蛍光タンパク質をコードする核酸の発現によって細胞内に生じた蛍光タンパク質の電子は、細胞に照射された励起光によって励起状態になり、蛍光を放出して基底状態になる。従って、蛍光に基づいて、蛍光タンパク質をコードする核酸と共に発現した初期化因子の発現状態等を推定することができる。蛍光タンパク質は、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ、又はｍＣｈｅｒｒｙである。
化学発光レポータータンパク質は、励起光を照射しないで光を発するように機能するタンパク質である。化学発光レポータータンパク質は、基質との化学反応によって発光を引き起こす。化学発光レポータータンパク質は、好ましくは生物発光レポータータンパク質、例えば、ルシフェラーゼである。
発光レポータータンパク質としてルシフェラーゼを使用した場合、ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって細胞内に生じたルシフェラーゼタンパク質は、細胞に対して提供されたルシフェリンと反応し、その結果ルシフェリンが発光する。従って、発光に基づいて、ルシフェラーゼと共に発現した初期化因子の発現状態等を推定することができる。化学発光レポータータンパク質の発現に起因した発光は、励起光を使用せずに観察可能である。また、励起光を使用せずに観察可能であるため、細胞に対して低侵襲な方法で初期化因子の発現強度を定量することができる。化学発光レポータータンパク質は、細胞毒性を引き起こしにくい。さらに、化学発光レポータータンパク質の発現に起因した発光は、退色がなく、定量性にも優れている。また、化学発光レポータータンパク質は、発現が誘導され次第即座に成熟する。そのため、化学発光レポータータンパク質は初期化因子の発現状態等をレポートするのに適している。ルシフェリンとしては、ホタルルシフェリン、バクテリアルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、ヴァルグリン、セレンテラジン等、何れの系が用いられてもよい。
ルシフェラーゼとしては、例えば、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ、クリックビートル、ＭＡ−Ｌｕｃｉ２、ＳｆＲＥ１等を含む甲虫ルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼ、エクオリン、カイアシルシフェラーゼ、発光エビルシフェラーゼ等を含む海洋性ルシフェラーゼ、バクテリアルシフェラーゼ、渦鞭毛藻ルシフェラーゼなど、各種のルシフェラーゼが用いられ得る。具体的には、例えば、ルシフェラーゼとして、緑色の発光をもたらすＥｌｕｃルシフェラーゼ、赤色の発光をもたらすＣＢＲルシフェラーゼ、青色の発光をもたらすウミシイタケルシフェラーゼを使用することができる。特にホタル由来のルシフェラーゼやクリックビートルなどの甲虫由来のルシフェラーゼはＡＴＰ要求性であり、生物反応が失われた死細胞では光らないので、アポトーシス等で培養期間中に失活した細胞を除いた生きた細胞を選択的に撮像できる点で望ましい。発光レポータータンパク質をコードするレポーター遺伝子は、市販されるものを使用することができる。
また、発光レポータータンパク質として使用されるルシフェラーゼは、高い発光強度を有するように改変された改変体ルシフェラーゼであってもよい。改変体ルシフェラーゼとしては、例えば、シブイロヒゲボタルに由来するルシフェラーゼを改変した、改変型赤色変異体Ａ（日本国特開２０１３−８１４５９号公報）、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼ（日本国特開２０１４−１８１９１号公報）などを使用することができる。
発光レポータータンパク質と共に発現する初期化因子が２種類以上（例えば、２〜６種類）である場合、２種類以上の初期化因子と共に発現する発光レポータータンパク質のそれぞれは、他の何れの発光レポータータンパク質とも識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有する。即ち、２種類以上の発光レポータータンパク質は、互いに識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有する。ここで発光特性は、例えば、発光波長である。このように、２種類以上の発光レポータータンパク質は、互いに識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有するため、後の工程で取得される発光画像において、発光レポータータンパク質のそれぞれの発現に起因する発光の情報は、他の何れの発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の情報とも分別される。また、発光画像に基づいて、発光レポータータンパク質のそれぞれの発現に起因する発光の発光強度は、個別に（即ち、発光レポータータンパク質の種類毎に）定量されることが可能である。
互いに識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有する２種類以上の発光レポータータンパク質としては、例えば、上述した化学発光レポータータンパク質及び蛍光タンパク質より選択された２種類以上のタンパク質を使用することができる。
「初期化因子をコードする核酸」は、一例としては、Ｏｃｔ３／４をコードする核酸を含む第１のベクター、Ｓｏｘ２をコードする核酸とＫｌｆ４をコードする核酸とを含む第２のベクター、及びＬ−ｍｙｃをコードする核酸とＬｉｎ２８をコードする核酸とを含む第３のベクターから構成されるベクターセットを用いて、体細胞に導入することができる。ここで、第１のベクター、第２のベクター、及び第３のベクターの少なくとも一つは、ベクターに含まれる「初期化因子をコードする核酸」と共に発現することが可能な位置で「発光レポータータンパク質をコードする核酸」を含む。
「初期化因子をコードする核酸」及び「発光レポータータンパク質をコードする核酸」に加えて、「リプログラミング効率を高める追加の因子をコードする核酸」を体細胞に導入してもよい。「リプログラミング効率を高める追加の因子」としては、リプログラミング効率を高めることが知られている因子、例えば、ドミナントネガティブ変異を導入したマウスｐ５３、ＥＢＮＡ１を使用することができる。
上述の第１乃至第３のベクターから構成されるベクターセットを用いて「初期化因子をコードする核酸」を体細胞に導入する場合、ドミナントネガティブ変異を導入したマウスｐ５３をコードする核酸を含む第４のベクター、及びＥＢＮＡ１をコードする核酸を含む第５のベクターをベクターセットに更に組み込んでもよい。
「初期化因子をコードする核酸」及び「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、宿主の染色体に組み込まれずに持続的に発現可能な形態で導入されることが好ましい。例えば、「初期化因子をコードする核酸」及び「発光レポータータンパク質をコードする核酸」は、エピソーマルベクターの形態で体細胞に導入されることが好ましい。これら核酸をエピソーマルベクターの形態で体細胞に導入すると、これら核酸は培養中に細胞から抜けるため、「初期化因子をコードする核酸」及び「発光レポータータンパク質をコードする核酸」の両方を含まないｉＰＳ細胞を得ることができる。この場合、エピソーマルベクターは、市販されているものを使用してもよいし、市販されているエピソーマルベクターに「発光レポータータンパク質をコードする核酸」を組み込むことにより改変ベクターを調製してこれを使用してもよい。市販されている初期化因子を含むエピソーマルベクターとしては、例えば、ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３−Ｆ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いることができる。
また、上述した「リプログラミング効率を高める追加の因子」も、エピソーマルベクターの形態で体細胞に導入されることが好ましい。この場合、エピソーマルベクターは、市販されているもの、例えば、ｐＣＥ−ｍｐ５３ＤＤ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＸＢ−ＥＢＮＡ１（Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用することができる。
＜１−２．第１発光画像の取得＞
図２のＳ２に示すように、第１細胞集団１の少なくとも一部について、発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第１発光画像２を取得する。図２のＳ２において、破線は第１細胞集団１の外周を示し、高発光強度細胞１ａ’は、高い発光強度を示す１以上の細胞である。
第１発光画像２は、第１細胞集団１の少なくとも一部を撮像した１以上の発光画像である。第１発光画像２は、１枚の発光画像でもよく、複数の発光画像であってもよい。第１発光画像２が複数の発光画像である場合、後述する注目細胞の選択において、複数の発光画像のなかから選択された１以上の発光画像を第１発光画像２として用いてもよい。複数の発光画像のそれぞれは、例えば、他の何れの発光画像とも異なる領域を撮像した画像であってもよく、経時的に撮像された複数の発光画像であってもよい。
発光画像は、好ましくは、第１細胞集団１の全体を撮像することで取得される。発光画像は、第１細胞集団１の一部を撮像することで取得されてもよい。
発光画像を取得することは、好ましくは、第１細胞集団１の内部に撮影の焦点位置を合わせることを含む。第１細胞集団１の内部に撮影の焦点位置を合わせると、第１細胞集団１の内部にある細胞に起因する発光を観察することが可能である。
発光画像を取得することは、遮光環境下において実施されることが好ましい。より具体的には、発光画像を取得することは、発光を撮像するための遮光環境下において、外部からの影響が少ない方法で実施されることが好ましい。発光画像は、遮光環境下で適宜フィルターを使用して取得することができる。
検出する発光レポータータンパク質が１種類の化学発光レポータータンパク質である場合には、第１発光画像２は、遮光環境下でフィルターを使用せずに取得してもよい。
検出する発光レポータータンパク質が複数種類である場合及び検出する発光レポータータンパク質が蛍光タンパク質である場合のうち少なくとも一方の場合には、発光画像は、遮光環境下で、適宜フィルターを使用して分光した後に取得することが好ましい。なお、発光画像は、フィルターで分光せず、複数種類の発光レポータータンパク質の発現に起因する発光が重なり合った画像として取得することも可能である。また、発光画像は、カラーＣＣＤカメラまたはカラーＣＭＯＳカメラを用いて、カラー画像として取得することも可能である。また、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングにより広範囲の領域（５０乃至５００個のコロニーを包括する領域）における発光量の分布をマクロ撮影してから、関心ある部位についてのみミクロ撮影することで、発光画像を得てもよい。なお、発光画像は冷却ＣＣＤカメラを用いて取得してもよい。
以下、発光レポータータンパク質が蛍光タンパク質である場合における撮像方法の一例を説明する。先ず、第１細胞集団１に励起光を照射する。励起光は、例えば、光源と光源から放射された光のなかから励起光を分光する励起光フィルターとによって照射される。その後、第１細胞集団１における細胞は蛍光を放出する。その後、蛍光を分光するフィルターを介して、カメラで蛍光を撮像する。
カメラの露出時間は、例えば、１０ミリ秒乃至１秒間であるが、十分な蛍光シグナルを検出できるように適宜調整することができる。
発光画像は、経時的に繰り返し撮像することで得られてもよい。撮像は、任意の間隔で連続的に行なわれる。撮像は、一般的には１０乃至３０分の間隔で実施される。また、１回の撮像の時間は任意に設定される。撮像する間隔は、発光画像が撮像素子により解析可能な程度の画像を生じるための露光時間より長い任意の時間間隔である。以上、発光レポータータンパク質が蛍光タンパク質である場合における撮像方法を説明した。
以下、発光レポータータンパク質が化学発光レポータータンパク質である場合における撮像方法の一例を説明する。化学発光レポータータンパク質は、ルシフェラーゼであるとする。先ず、第１細胞集団１にルシフェリンを提供する。具体的には、例えば、第１細胞集団１を含む容器にルシフェリンを加える。その後、ルシフェリンが細胞内に移行して細胞内のルシフェラーゼとルシフェリンとが反応することで、ルシフェリンが化学発光を放出する。その後、化学発光を分光するフィルターを介して、カメラで発光を撮像する。
カメラ露出時間は、例えば、３乃至５分間とするが、十分な発光シグナルを検出できるように適宜調整することができる。
発光画像は、経時的に繰り返し撮像することで得られてもよい。撮像は、任意の間隔で連続的に行なわれる。撮像は、一般的には１０乃至３０分の間隔、例えば、１０分の間隔で実施される。また、１回の撮像の時間は任意に設定される。撮像する間隔は、発光画像が撮像素子により解析可能な程度の画像を生じるための露光時間より長い任意の時間間隔である。以上、発光レポータータンパク質が化学発光レポータータンパク質である場合における撮像方法を説明した。
発光画像は、発光イメージング装置を用いて取得することができる。発光イメージング装置は、例えば、発光に応じた特定の波長を有した光を主に通過させるフィルターと、フィルターを透過した光を電気信号に変換する撮像素子と、電気信号から発光画像を作り出す処理部とを含む。発光イメージング装置が有する培養機能を実行している間に撮像機能を所望のタイミングで実行することで、培養の全ての過程において発光画像を取得することができる。発光イメージング装置としては、後述する発光画像生成装置、又は発光イメージングシステムを使用することができる。発光イメージング装置は、例えば、発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス）である。
好ましくは、発光画像に加えて明視野画像を取得する。より好ましくは、発光画像の取得とほぼ同じタイミングで明視野画像を取得する。明視野画像とは、発光に基づくことなく、照明光を用いて取得される画像であり、細胞又はコロニーの位置及び形態等を観察することができる画像である。明視野画像は、位相差観察画像や微分干渉（ＤＩＣ）観察画像を含む。明視野画像は、発光画像の取得とほぼ同じタイミングで取得してもよいし、発光画像の取得からは独立して任意のタイミングで取得してもよい。上記の発光イメージングシステム（ＬＶ２００）のような自動化されたシステムにおいては、十分な遮光条件下で、発光画像と明視野画像の両方の撮像機能を、予め指定したタイミングで切り替えながら実行することも可能である。
好ましくは、第１発光画像２は、複数の発光画像から選択された１枚の画像であり、複数の発光画像のそれぞれは、他の何れの発光画像とも第１細胞集団１の厚さ方向の位置が異なる平面を示す画像である。第１細胞集団１の表面にある細胞と第１細胞集団１の内部にある細胞とは異なる発光を示すことがある。従って、上記の複数の発光画像を取得すると、第１細胞集団１の表面にある細胞と第１細胞集団１の内部にある細胞とから後述する注目細胞を選択することが可能である。
＜１−３．第１細胞集団の分割＞
図２のＳ３に示すように、第１細胞集団１を複数の第２細胞集団３に分割する。
第１細胞集団１を複数の第２細胞集団３に分割することは、例えば、第１細胞集団１を複数のサブ集団に分離することである。第１細胞集団１を複数の第２細胞集団３に分割することは、例えば、第１細胞集団１と液体とを含む細胞含有液を撹拌することで行ってもよく、レーザーマイクロダイセクションによって行ってもよい。細胞含有液を撹拌することは、例えば、細胞含有液をピペッティングすることである。細胞含有液はピペッティングされると、細胞含有液は細胞懸濁液になる。細胞懸濁液はプレートに出してもよい。液体は、StemFit+Y培地であってもよい。StemFit+Y培地は、StemFit（味の素）にＹ−２７６３２を添加した培地である。
第１細胞集団１を複数の第２細胞集団３に分割すると、少なくとも１つの第２細胞集団３は高発光強度細胞１ａ’を含む。高発光強度細胞１ａ’は、例えば、後述する注目細胞である。第１細胞集団１を複数の第２細胞集団３に分割すると、第２細胞集団３における注目細胞の位置を把握することが困難となりやすい。
第１細胞集団１を複数の第２細胞集団３に分割することは、好ましくは、後述する注目細胞を播種することである。注目細胞を播種することは、具体的には、例えば、第１細胞集団１のうち注目細胞を含む部分をピペットで吸い上げて、吸い上げた部分を新たな液体中でピペッティングし、吸い上げた部分と液体との細胞懸濁液をプレートに出すことである。吸い上げた部分を液体中でピペッティングすると、吸い上げた部分が複数の第２細胞集団３に分割される。従って、細胞懸濁液をプレートに出すことは、複数の第２細胞集団３をプレートに出すことである。注目細胞を播種した後に、複数の第２細胞集団３を培養してもよい。即ち、第１細胞集団１を複数の第２細胞集団３に分割することは、注目細胞を播種し、複数の第２細胞集団３を培養することであってもよい。
第２細胞集団３の各々は、例えば、数個乃至数十個の細胞を含む。好ましくは、第２細胞集団３の各々は３乃至１０個の細胞を含んでいる。第２細胞集団３が含む細胞数が少ないと、第２細胞集団３は増殖しにくい。第２細胞集団３が含む細胞数が多いと、後述する注目細胞以外の細胞を多く含む可能性が高いため、注目細胞をｉＰＳ細胞とした場合、ｉＰＳ細胞の株を樹立することが難しくなる可能性がある。
なお、分割した第２細胞集団３は、第１細胞集団１を含むプレートとは別のプレートに出してもよい。プレートとしては、上述したラミニンで被覆されたプレートを用いてもよい。
＜１−４．第２発光画像の取得＞
図２のＳ４に示すように、少なくとも１つの第２細胞集団３について、発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第２発光画像４を取得する。図２のＳ２において、破線は第２細胞集団３の外周を示す。第２発光画像４において、高発光強度細胞３ａ’は、高い発光強度を示す１以上の細胞である。
第２発光画像４は、少なくとも１つの第２細胞集団３を撮像した１以上の発光画像である。第２発光画像４を取得することは、「＜１−２．第１発光画像の取得＞」の欄に記載した方法と同様の方法により行うことができる。
第１発光画像２の取得から第２発光画像４の取得までの時間は短いことが好ましい。即ち、第２発光画像４を取得する時点において、第１発光画像２を取得した時点の注目細胞の発光プロファイルが変化していないことが好ましい。具体的には、第１発光画像２の取得から第２発光画像４の取得までの時間は、５乃至６０分の範囲内にある。従って、第１発光画像２と第２発光画像４とに基づいて、複数の第２細胞集団３における注目細胞を特定することが可能である。
第２発光画像４の取得は、全ての第２細胞集団３について行ってもよく、複数の第２細胞集団３のうちの一部の第２細胞集団について行ってもよい。
＜１−５．注目細胞の選択＞
図２のＳ５に示すように、第１発光画像２に基づいて、第１細胞集団１のなかから注目細胞を選択する。ここでは、高発光強度細胞１ａ’を注目細胞として選択した。
注目細胞は、発光レポータータンパク質の発現に起因した発光を示す細胞である。注目細胞は、例えば、ｉＰＳ細胞である。注目細胞は、例えば、第１発光画像２における各細胞が有する発光プロファイルに基づいて選択される。発光プロファイルは、例えば、発光強度、発光強度分布、又はこれらの組み合わせである。発光強度分布は、例えば、細胞内における発光領域の分布である。例えば、注目細胞としては、強い発光強度を示す細胞を選択してもよく、例えば、核内で強い発光強度を示す細胞を選択してもよい。注目細胞は、発光プロファイルに基づいて選択してもよく、目視によって選択してもよい。なお、発光画像を経時的に取得した場合、注目細胞は、経時的な発光強度、経時的な発光強度分布、又はこれらの組み合わせに基づいて選択してもよい。
図２のＳ５に示すように、好ましくは、注目細胞を選択することは、第１発光画像２上に、注目細胞に関する第１関心領域５を選択することを含む。より好ましくは、注目細胞を選択することは、第１発光画像２上に、注目細胞に関する第１関心領域５を選択することと、第１関心領域５に関する第１発光プロファイルを取得することとを含む。注目細胞に関する第１関心領域５を選択することは、言い換えると、注目細胞を含む領域に関する第１関心領域５を選択することである。好ましくは、第１関心領域５のうち９０％以上が細胞である。なお、第１発光プロファイルの取得は、第１関心領域５の選択の直後に行ってもよいし、あるいは、後述する「＜１−６．注目細胞の特定＞」において、第２発光プロファイルを取得するタイミングで併せて行ってもよい。
第１関心領域５は細胞を３乃至１０個含むことが好ましい。第１関心領域５が含む細胞の数と後述する第２関心領域６が含む細胞の数とは同一であることが好ましい。これらの数が同一であると、後述する、第１関心領域５と後述する第２関心領域６との評価を高い信頼度で行うことができる。好ましくは、第１関心領域５は注目細胞でない細胞を多く含まない。第１関心領域５が注目細胞でない細胞を多く含むと、注目細胞を特定することが難しくなる可能性がある。第１関心領域５は、例えば、最も高い輝度を有する領域である。第１関心領域５の形状は、特に限定されないが、例えば、矩形状である。
第１関心領域５は、例えば、第１細胞集団１の重心とその近傍とを含む領域内にある。第１細胞集団１の近傍とは、例えば、第１細胞集団１の重心から１００乃至１０００μｍの範囲内にある領域である。
第１細胞集団１のなかから注目細胞を選択することは、第１細胞集団１の明視野画像を撮像し、明視野画像に基づいて設定される第１細胞集団１の重心から１ｍｍ以内の領域から注目細胞を選択することを含むことが好ましい。第１細胞集団１の重心から１ｍｍ以内の領域から注目細胞を選択することは、第１発光画像２に基づいて注目細胞を選択する前に行ってもよい。即ち、第１発光画像２に基づいて、第１細胞集団１の重心から１ｍｍ以内の領域から注目細胞を選択してもよい。第１細胞集団１の重心の近くにある細胞は、ｉＰＳ細胞である可能性が高い。なお、ここで述べる第１細胞集団１の重心は、コロニーの重心である。
なお、第１関心領域５を２以上選択してもよい。
注目細胞の選択は、第１細胞集団１を分割した後に行ってもよく、第１細胞集団１を分割する前に行ってもよい。
以下、注目細胞を選択することの例について説明する。
［注目細胞を選択することの例１］
以下、第１発光画像２に基づいて、第１細胞集団１のなかから注目細胞を選択することの一例について説明する。この例において、発光レポータータンパク質は１種類であるとする。また、この例において、注目細胞を選択することは、第１発光画像２上に、注目細胞に関する第１関心領域５を選択することと、第１関心領域５について第１発光プロファイルを取得することとを含む。
（ｉ）第１関心領域の選択
先ず、第１発光画像２上に注目細胞に関する第１関心領域５を選択する。第１関心領域の面積は、例えば、０．０１乃至１ｍｍ２の範囲内にある。
（ｉｉ）第１発光プロファイルの取得
その後、第１関心領域５について第１発光プロファイルを取得する。
第１発光プロファイルは、例えば、発光強度、発光強度分布、発光強度分布の評価値、又はこれらの組み合わせである。発光強度は、発光レポータータンパク質の発光の波長域で検出される発光強度である。発光強度分布は、例えば、細胞内における発光領域の分布である。発光強度分布の評価値は、例えば、発光強度分布を評価した分布の評価値である。好ましくは、第１発光プロファイルは、発光強度である。第１発光プロファイルは、例えば、既存の画像解析ソフトを用いて取得することができる。画像解析ソフトは、例えば、ｃｅｌｌＳｅｎｓ（セルセンス；オリンパス）である。
以上、第１発光画像２に基づいて、第１細胞集団１のなかから注目細胞を選択することの一例について説明した。
［注目細胞を選択することの例２］
以下、図３Ａ及び図３Ｂを用いて、第１発光画像に基づいて、第１細胞集団１のなかから注目細胞を選択することの別の例について説明する。この例において、発光レポータータンパク質は２種類であり、第１発光画像は、フィルターで分光し、所定の波長域毎に取得された２枚の発光画像であるとする。２枚の発光画像は、第１発光画像（色Ａ）及び第１発光画像（色Ｂ）であるとする。２種類の発光レポータータンパク質は、第１発光レポータータンパク質及び第２発光レポータータンパク質であるとする。
図３Ａは、第１発光画像（色Ａ）２Ａの一例を示す模式図である。第１発光画像（色Ａ）２Ａは、色Ａについての第１発光画像である。色Ａは、第１発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の色である。図３Ａにおいて、高発光強度細胞１ａ’は、高い発光強度を示す１以上の細胞であり、破線は第１細胞集団１の外周を示す。
図３Ｂは、第１発光画像（色Ｂ）２Ｂの一例を示す模式図である。第１発光画像（色Ｂ）２Ｂは、色Ｂについての第１発光画像である。色Ｂは、第２発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の色である。図３Ｂにおいて、高発光強度細胞１ａ’は、高い発光強度を示す１以上の細胞であり、破線は第１細胞集団１の外周を示す。
第１発光画像（色Ａ）２Ａ及び第１発光画像（色Ｂ）２Ｂは、何れも同一の撮影範囲を有する発光画像であるとする。また、この例において、注目細胞を選択することは、第１発光画像２上に、注目細胞に関する第１関心領域５を選択することと、第１関心領域５について第１発光プロファイルを取得することとを含む。
（ｉ）第１関心領域の選択
先ず、第１発光画像２上に、注目細胞に関する第１関心領域５を選択する。具体的には、第１発光画像（色Ａ）２Ａにおいて第１関心領域（色Ａ）５Ａを選択し、第１発光画像（色Ｂ）２Ｂにおいて第１関心領域（色Ｂ）５Ｂを選択する。第１関心領域（色Ａ）５Ａ及び第１関心領域（色Ｂ）５Ｂは、互いに異なる波長域の発光を示す。第１関心領域（色Ａ）５Ａ及び第１関心領域（色Ｂ）５Ｂは、何れも同一の撮影範囲を有する。第１関心領域（色Ａ）５Ａ及び第１関心領域（色Ｂ）５Ｂのうち少なくとも一方は、発光している領域である。
（ｉｉ）第１発光プロファイルの取得
その後、第１関心領域について第１発光プロファイルを取得する。好ましくは、第１発光画像（色Ａ）２Ａ及び第１発光画像（色Ｂ）２Ｂに対してアンミキシング処理を行い、２種類の発光レポータータンパク質の発光の波長域が重なり合う部分を排除した上で、第１発光プロファイルを取得する。
具体的には、例えば、第１関心領域（色Ａ）５Ａ及び第１関心領域（色Ｂ）５Ｂについて、第１発光プロファイルを取得する。第１発光プロファイルは、一例によると、第１関心領域（色Ａ）５Ａ及び第１関心領域（色Ｂ）５Ｂの各々についての発光強度、第１関心領域（色Ａ）５Ａ及び第１関心領域（色Ｂ）５Ｂの各々についての発光強度分布の評価値、又はこれらの組み合わせである。第１発光プロファイルは、他の例によると、以下で述べる第１発光強度比、第１関心領域（色Ａ）５Ａ及び第１関心領域（色Ｂ）５Ｂの各々についての発光強度の合計である合計発光強度、第１関心領域（色Ａ）５Ａ及び第１関心領域（色Ｂ）５Ｂの各々についての発光強度分布の評価値から得られる評価値比、又はこれらの組み合わせである。第１発光強度比は、各発光レポータータンパク質の発現に起因するそれぞれの発光強度から求めた発光強度比である。好ましくは、第１発光プロファイルは、各発光レポータータンパク質の発現に起因する発光強度である。
以上、第１発光画像に基づいて、第１細胞集団のなかから注目細胞を選択することの別の例について説明した。
＜１−６．注目細胞の特定＞
図２のＳ６において、第１発光画像２と第２発光画像４とに基づいて、複数の第２細胞集団３における注目細胞を特定する。Ｓ６に示す第１発光画像２は、Ｓ５で示した第１発光画像２である。Ｓ６に示す第２発光画像４は、Ｓ４で示した第２発光画像４である。
第１発光画像２と第２発光画像４とに基づいて、複数の第２細胞集団３における注目細胞を特定することは、例えば、第１発光画像２において注目細胞が有する発光プロファイルと、第２発光画像４において第２細胞集団３における細胞が有する発光プロファイルとに基づいて、複数の第２細胞集団３からなる集合における注目細胞を特定することである。発光プロファイルは、例えば、「＜１−５．注目細胞の選択＞」の欄に記載した「発光プロファイル」である。
具体的には、第１発光画像２と第２発光画像４とに基づいて、複数の第２細胞集団３における注目細胞を特定することは、
第２発光画像４上に、第２細胞集団３に関する第２関心領域６を選択することと、
第１関心領域５について取得された第１発光プロファイルと第２関心領域６について取得された第２発光プロファイルとに基づいて、複数の第２細胞集団３のなかから注目細胞を特定することとを含む。
より具体的には、第１発光画像２と第２発光画像４とに基づいて、複数の第２細胞集団３における注目細胞を特定することは、
（ｉ）第２発光画像４上に、第２細胞集団３に関する第２関心領域を選択することと、
（ｉｉ）第２関心領域について第２発光プロファイルを取得することと、
（ｉｉｉ）第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとに基づいて、複数の第２細胞集団における注目細胞を特定することと
を含むことが好ましい。
以下、注目細胞を特定することの例について述べる。
［注目細胞を特定することの例１］
以下、第１発光画像２と第２発光画像４とに基づいて、複数の第２細胞集団３における注目細胞を特定することの一例について説明する。この例において、発光レポータータンパク質は１種類であるとする。また、この例において、注目細胞を選択することは、「［注目細胞を選択することの例１］」に記載した通りに行ったとした。
（ｉ）第２関心領域の選択
図２のＳ６に示すように、先ず、第２発光画像４上に、第２細胞集団３に関する第２関心領域６を選択する。即ち、第２発光画像４上に、第２細胞集団３について第２関心領域６を選択する。図２のＳ６においては、高発光強度細胞３ａ’に関する第２関心領域６を選択した。第２関心領域６は、例えば、第２細胞集団３以外の細胞を殆ど含まない。好ましくは、第２関心領域６のうち９０％以上が第２細胞集団３である。第２細胞集団３に関する第２関心領域６を選択することは、言い換えると、第２細胞集団３を含む領域として第２関心領域６を選択することである。１つの第２関心領域６は、第２細胞集団３における１以上の細胞を含む領域である。１つの第２関心領域６は、第２細胞集団３の全体を含む領域であってもよい。第２関心領域は２以上であってもよい。２以上の第２関心領域６としては、２以上の第２細胞集団３の各々に関する第２関心領域６を選択してもよい。また、１つの第２細胞集団３に関する２以上の第２関心領域６を選択してもよい。第２関心領域６は、目視によって決定してもよい。第２関心領域６の形状は、特に限定されないが、例えば、矩形状である。
好ましくは、第２関心領域６は細胞を３乃至１０個含む。第２関心領域６が含む細胞の数と第１関心領域５が含む細胞の数とは同一であることが好ましい。これらの数が同一であると、後述する、第１関心領域５と第２関心領域６との評価を高い信頼度で行うことができる。
（ｉｉ）第２発光プロファイルの取得
その後、第２関心領域６について、第２発光プロファイルを取得する。第２発光プロファイルは、第１発光プロファイルと同じ種類の発光プロファイルを含む。第２発光プロファイルは、例えば、既存の画像解析ソフトを用いて取得することができる。
（ｉｉｉ）注目細胞の特定
その後、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとに基づいて、複数の第２細胞集団３における注目細胞を特定する。具体的には、１つの第１発光プロファイルと１つの第２発光プロファイルとが一致した場合、該当する第１関心領域５と該当する第２関心領域６とは対応していると評価する。第１関心領域５と第２関心領域６とは対応していることから、第１関心領域５内の細胞と第２関心領域６内の細胞とも対応している。第１関心領域５は注目細胞を含み、第２関心領域６内の細胞は第２細胞集団３における細胞である。従って、注目細胞と第２細胞集団３における細胞とは対応している。よって、第１関心領域５と第２関心領域６とが対応していると、注目細胞と第２細胞集団３における細胞とは同一であると判断できる。以上の方法によって、複数の第２細胞集団３における注目細胞を特定する。
一方、１つの第１発光プロファイルと１つの第２発光プロファイルとが一致しなかった場合、該当する第１関心領域５と該当する第２関心領域６とは対応していないと評価する。第１関心領域５と第２関心領域６とは対応していないことから、第１関心領域５内の細胞と第２関心領域６内の細胞とも対応していない。第１関心領域５は注目細胞を含み、第２関心領域６内の細胞は第２細胞集団３における細胞である。従って、注目細胞と第２細胞集団３における細胞とは対応していない。よって、第１関心領域５と第２関心領域６とが対応していないと、注目細胞と第２細胞集団３における細胞とは同一の細胞でないと判断できる。以上の方法によると、注目細胞は第２関心領域６にないことが分かる。
具体的には、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとが一致するか否かは、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとの差に基づいて判断することができる。第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとの差は、例えば、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとの差を第１発光プロファイルで除した値に１００をかけた値の絶対値である。即ち、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとの差は％で表される。
第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとの差は、例えば、発光強度の差、分布の評価値の差、又はこれらの組み合わせである。
第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとの差が発光強度の差である場合、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとの差が１０％以下であるときに、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとが一致したと判断する。一方、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとの差が１０％より大きい場合、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとが一致していないと判断する。
以上、第１発光画像と第２発光画像とに基づいて、複数の第２細胞集団３における注目細胞を特定することの一例について説明した。
［注目細胞を特定することの例２］
以下、図４Ａ及び図４Ｂを用いて、第１発光画像２と第２発光画像４とに基づいて、複数の第２細胞集団３における注目細胞を特定することの別の例について説明する。この例において、発光レポータータンパク質は２種類であり、第２発光画像４も所定の波長域毎に取得された２枚の発光画像であるとする。２枚の発光画像は、第２発光画像（色Ａ）及び第２発光画像（色Ｂ）であるとする。２種類の発光レポータータンパク質は、第１発光レポータータンパク質及び第２発光レポータータンパク質であるとする。
図４Ａは、第２発光画像（色Ａ）４Ａの一例を示す模式図である。第２発光画像（色Ａ）４Ａは、色Ａについての第２発光画像４である。色Ａは、第１発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の色である。図４Ａにおいて、高発光強度細胞３ａ’は、高い発光強度を示す１以上の細胞であり、破線は第２細胞集団３の外周を示す。
図４Ｂは、第２発光画像（色Ｂ）４Ｂの一例を示す模式図である。第２発光画像（色Ｂ）４Ｂは、色Ｂについての第２発光画像４である。色Ｂは、第２発光レポータータンパク質の発現に起因する発光の色である。図４Ａにおいて、高発光強度細胞３ａ’は、高い発光強度を示す１以上の細胞であり、破線は第２細胞集団３の外周を示す。
第２発光画像（色Ａ）４Ａ及び第２発光画像（色Ｂ）４Ｂは、何れも同一の撮影範囲を有する発光画像であるとする。また、この例において、注目細胞を選択することは、「［注目細胞を選択することの例２］」に記載した通りに行ったとした。
（ｉ）第２関心領域の選択
先ず、第２発光画像４上に、第２細胞集団３に関する第２関心領域６を選択する。具体的には、第２発光画像（色Ａ）４Ａにおいて１以上の第２関心領域（色Ａ）６Ａを選択し、第２発光画像（色Ｂ）４Ｂにおいて１以上の第２関心領域（色Ｂ）６Ｂを選択する。第２関心領域（色Ａ）６Ａ及び第２関心領域（色Ｂ）６Ｂは、互いに異なる波長域の発光を示す。第２関心領域（色Ａ）６Ａ及び第２関心領域（色Ｂ）６Ｂは、何れも同一の撮影範囲を有する。第２関心領域（色Ａ）及び第２関心領域（色Ｂ）は、「［注目細胞の特定することの例１］」における「（ｉ）第２関心領域の選択」に記載した「第２関心領域６」であってもよい。
（ｉｉ）第２発光プロファイルの取得
その後、第２関心領域６について、第２発光プロファイルを取得する。具体的には、例えば、第２関心領域（色Ａ）６Ａ及び第２関心領域（色Ｂ）６Ｂについて、第２発光プロファイルを取得する。第２発光プロファイルは、第１発光プロファイルと同じ種類の発光プロファイルを含む。第２発光プロファイルは、例えば、各発光レポータータンパク質の発現に起因するそれぞれの発光強度から求めた発光強度比、即ち第２発光強度比である。好ましくは、第２発光プロファイルは、各発光レポータータンパク質の発現に起因する発光強度である。
（ｉｉｉ）注目細胞の特定
その後、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとに基づいて、複数の第２細胞集団３における注目細胞を特定する。具体的には、「［注目細胞の特定することの例１］」における「（ｉｉｉ）注目細胞の特定」に記載したした通り、１つの第１発光プロファイルと１つの第２発光プロファイルとが一致した場合、該当する第１関心領域５と該当する第２関心領域６とは対応していると評価し、注目細胞と第２細胞集団３における細胞とは同一であると判断することで、複数の第２細胞集団３における注目細胞を特定する。一方、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとが一致しなかった場合、該当する第１関心領域５と該当する第２関心領域６とは対応していないと評価し、注目細胞と第２細胞集団３における細胞とは同一の細胞でないと判断することで、注目細胞はこの第２関心領域６にないことを確認する。
具体的には、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとが一致するか否かは、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとの差に基づいて判断することができる。
一例によると、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとの差は、第１発光強度の差及び第２発光強度の差である。
図５Ａは、第１発光強度の差の例と第２発光強度の差の例とを示す模式図である。図５Ａは、図３Ａに示す第１発光画像（色Ａ）２Ａと、図３Ｂに示す第１発光画像（色Ｂ）２Ｂと、図４Ａに示す第２発光画像（色Ａ）４Ａと、図４Ａに示す第２発光画像（色Ｂ）４Ｂとを示す。
第１発光プロファイルは、例えば、第１発光レポータータンパク質の発現に起因する発光強度（以下、第１発光強度）と、第２発光レポータータンパク質の発現に起因する発光強度（以下、第２発光強度）とである。同様に、第２発光プロファイルも、例えば、第１発光レポータータンパク質の発現に起因する発光強度（以下、第１発光強度）と、第２発光レポータータンパク質の発現に起因する発光強度（以下、第２発光強度）とである。一例として、第１発光プロファイルである第１発光強度と第２発光プロファイルである第１発光強度との差を、第１発光プロファイルである第１発光強度で除した値に１００をかけた値の絶対値を、「第１発光強度の差」とする。一例として、第１発光プロファイルである第２発光強度と第２発光プロファイルである第２発光強度との差を、第１発光プロファイルである第２発光強度で除した値に１００をかけた値の絶対値を「第２発光強度の差」とする。第１発光強度の差及び第２発光強度の差がいずれも１０％以下である場合、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとが一致したと判断する。
一方、第１発光強度の差及び第２発光強度の差のうち少なくとも一方が１０％より大きい場合、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとが一致していないと判断する。この場合、複数の初期化因子の発現量に基づいて注目細胞を特定するため、１つの初期化因子の発現量に基づいて注目細胞を特定する場合よりも、注目細胞の特定を高い信頼度で実行することが可能である。
別の例によると、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとの差は、例えば、第１発光強度比と第２発光強度比との差である。
図５Ｂは、第１発光強度比の例と第２発光強度比の例とを示す模式図である。図５Ｂも、図３Ａに示す第１発光画像（色Ａ）２Ａと、図３Ｂに示す第１発光画像（色Ｂ）２Ｂと、図４Ａに示す第２発光画像（色Ａ）４Ａと、図４Ａに示す第２発光画像（色Ｂ）４Ｂとを示す。
第１発光強度比は、第１発光画像２に基づいて、各発光レポータータンパク質の発現に起因するそれぞれの発光強度から求めた発光強度比である。第２発光強度比は、第２発光画像４に基づいて、各発光レポータータンパク質の発現に起因するそれぞれの発光強度から求めた発光強度比である。第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとの差が第１発光強度比と第２発光強度比との差である場合、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとの差が１０％以下であるときに、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとが一致したと判断する。一方、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとの差が１０％より大きい場合、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとが一致していないと判断する。この場合、複数の初期化因子の発現量の比に基づいて注目細胞を特定するため、１つの初期化因子の発現量に基づいて注目細胞を特定する場合よりも、注目細胞の特定を高い信頼度で実行することが可能である。
以上、第１発光画像２と第２発光画像４とに基づいて、複数の第２細胞集団３における注目細胞を特定することの別の例について説明した。
上述した「［注目細胞を特定することの例１］」及び「［注目細胞を特定することの例２］」によると、注目細胞の特定を高い信頼度で実行することが可能である。
なお、第１関心領域と第２関心領域とは同一の形状を有していることが好ましい。第１関心領域の形状と第２関心領域の形状とが同一である場合、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとの比較に誤差が生じにくい。領域と領域とが同一の形状を有しているということは、具体的には、２つの領域が同一の面積及び同一の形を有しているということを意味する。
以上のようにして、複数の第２細胞集団における注目細胞を特定する。
第２細胞集団３における注目細胞を特定した後に、第２細胞集団３における注目細胞を培養してもよい。培養は、「＜１−１．第１細胞集団の準備＞」で述べた方法と同様の方法によって行うことができる。
＜１−７．細胞特定方法の他の例＞
本発明の一実施形態に係る細胞特定方法の他の例によると、第１発光画像２に基づいて、第１細胞集団１のなかから注目細胞を選択することは、
第１発光画像２上に、注目細胞に関する第１関心領域５を選択することと、
第１発光画像２上に、注目細胞に関する、第１関心領域５の面積と異なる面積を有する第３関心領域７を選択することとを含み、
第２細胞集団３における注目細胞を特定することは、
第２発光画像４上に、第２細胞集団３に関する第２関心領域６を選択することと、
第２発光画像４上に、第２細胞集団３に関する第２関心領域６の面積と異なる面積を有する第４関心領域８を選択することと、
第１関心領域５について取得された第１発光プロファイルと第２関心領域６について取得された第２発光プロファイルと第３関心領域７について取得された第３発光プロファイルと第４関心領域８について取得された第４発光プロファイルとに基づいて、複数の第２細胞集団３における注目細胞を特定することとを含む。
図６Ａは、第１及び第３関心領域が選択された第１発光画像の一例を示す模式図である。図６Ａは、図２のＳ５に示した第１発光画像２である。第３関心領域７は、例えば、第１関心領域５の全体を含む領域である。あるいは、第３関心領域７は、例えば、その全体が第１関心領域５に含まれる領域であってもよい。第３関心領域７の面積は、例えば、第１関心領域５の面積に対して、１．１乃至１００倍である。
図６Ｂは、第２及び第４関心領域が選択された第２発光画像の一例を示す模式図である。図６Ｂは、図２のＳ６に示した第２発光画像４である。第４関心領域８は、例えば、第２関心領域６の全体を含む領域である。あるいは、第４関心領域８は、例えば、その全体が第２関心領域６に含まれる領域であってもよい。第４関心領域８の面積は、例えば、第２関心領域６の面積に対して、１．１乃至１００倍である。
第１発光プロファイル及び第２発光プロファイルに基づいて第１関心領域５と第２関心領域６と評価することに加え、第３発光プロファイル及び第４発光プロファイルに基づいて、第３関心領域７と第４関心領域８とを評価し、注目細胞を特定すると、第１発光プロファイル及び第２発光プロファイルのみに基づいて注目細胞を特定する場合よりも、注目細胞の特定をより高い信頼度で実行することが可能である。
好ましくは、第１関心領域と第２関心領域とは同一の形状を有し、第３関心領域と第４関心領域とは同一の形状を有する。この場合、より高い信頼度で注目細胞を特定することが可能である。
以上、細胞特定方法の他の例について述べた。
以上説明したように、一実施形態に係る細胞特定方法によると、注目細胞、例えば、ｉＰＳ細胞を含む第１細胞集団を分割して複数の第２細胞集団を得たときに、複数の第２細胞集団におけるどの細胞が注目細胞であるかを簡便に特定することができる。
＜２．細胞集団の製造方法＞
本発明の一実施形態に係る細胞集団の製造方法は、上述した細胞特定方法を実行することと、
前記実行により特定された前記注目細胞を培養して培養細胞集団を得ること
とからなるサイクルを繰り返すことを含む。
具体的には、本発明の一実施形態に係る細胞集団方法は、
上述した細胞特定方法を実行することと、
前記実行により特定された前記注目細胞を培養して培養細胞集団を得ること
とからなるサイクルを繰り返すことを含み、
次のサイクルがある場合、前記培養細胞集団は、次のサイクルの第１細胞集団として使用される。
以下、細胞集団の製造方法の具体例について説明する。
［細胞集団の製造方法の具体例］
以下、細胞集団の製造方法の具体例について説明する。この例において、実行するサイクルの合計回数は２回である。
（ｉ）細胞特定方法の実行
先ず、１回目のサイクルを開始する。
具体的には、先ず、「＜１．細胞特定方法＞」の欄で述べた細胞特定方法を実行する。具体的には、Ｓ１乃至Ｓ６を実行する。この実行により、注目細胞を特定する。
（ｉｉ）注目細胞の培養
次に、Ｓ６で特定した注目細胞を培養して培養細胞集団を得る。
注目細胞の培養は、例えば、上述した「＜１．細胞特定方法＞」の「＜１−１．第１細胞集団の準備＞」の欄に記載した培養である。
以上、１回目のサイクルが終了する。
（ｉｉｉ）細胞特定方法の実行
次に、２回目のサイクルを開始する。具体的には、先ず培養細胞集団を第１細胞集団として、「＜１．細胞特定方法＞」の欄で述べたＳ２乃至Ｓ６を実行する。この実行により、注目細胞を特定する。
（ｉｖ）注目細胞の培養
次に、Ｓ６で特定した注目細胞を培養して培養細胞集団を得る。
注目細胞の培養は、例えば、上述した「＜１．細胞特定方法＞」の「＜１−１．第１細胞集団の準備＞」の欄に記載した培養である。
以上、２回目のサイクルが終了する。
以上、細胞集団の製造方法の具体例について説明した。
好ましくは、実行するサイクルの合計回数は、２乃至１０の範囲内にあり、より好ましくは、２乃至４回の範囲内にある。実行するサイクルの合計回数が、２乃至１０の範囲内にあると、注目細胞の株を樹立させることが可能である。
また、ｎ回目（ｎは２以上の整数）のサイクルで注目細胞を選択することは、第１細胞集団の明視野画像を撮像することと、ｎ−１回目の前記サイクルの培養により増殖した細胞に明視野画像に基づいて設定される第１細胞集団の重心を設定することと、重心から１ｍｍ以内の領域から注目細胞を選択することとを含んでいてもよい。増殖した細胞に重心を設定し、重心から１ｍｍ以内の領域から注目細胞を選択すると、注目細胞をｉＰＳ細胞とした場合に、ｉＰＳ細胞の株を容易に樹立させることが可能である。
以上説明したように、一実施形態に係る細胞集団の製造方法によると、注目細胞、例えば、ｉＰＳ細胞を製造することが可能である。また、上述した「細胞集団の製造方法」によると、ｉＰＳ細胞のみを培養することが可能である。従って、高い純度のｉＰＳ細胞の株を従来のｉＰＳ細胞樹立方法よりも少ない継代回数で樹立することが可能であると考えられる。
本明細書で定義した細胞集団の重心とは、集団の輪郭からの平均的距離とは異なるものであり、細胞集団内の２次元または３次元の画像における細胞密度の中心部位である。ｉＰＳ細胞は、細胞集団としての一つのコロニー内で多様な方向へ増殖するため、コロニーの輪郭と無関係にコロニー内に異なる細胞密度からなる領域が形成される。本発明の一実施形態によると、コロニー内の細胞密度の中心部位を重心とすることで、体細胞がリプログラミングされるまでに実施される継代培養の対象（即ち、注目細胞）を、各サイクルごとにコロニーの細胞密度に基づく重心付近とすることができる。これにより、高品質なｉＰＳ細胞の継代培養が実現可能である。このように、本発明の一実施形態では、体細胞のリプログラミングの早期な時期以降、ｉＰＳ細胞として多能性が獲得されるまでの形成過程において、細胞密度に基づく重心位置をサイクルごとに決定することが技術的に重要である。
＜３．発光イメージングシステム＞
別の側面によると、本発明は、上述した「細胞特定方法」を行うための細胞特定システムを提供することができる。細胞特定システムは、具体的には、上述した第１発光画像及び第２発光画像を取得することと、第１発光画像における注目細胞の位置情報を取得することと、上述した第２細胞集団における注目細胞の位置情報を特定することとが可能である。
図７は、上述の細胞特定システムの一例を模式的に示す。以下、図７を参照しながら、細胞特定システムを説明する。図７に示すように、細胞特定システム１００は、発光画像生成装置２００と制御装置３００とを備える。
発光画像生成装置２００は、例えば、撮像素子又は光電子増倍管を備えた顕微鏡といった、画像を取得し、試料の発光の強度を定量できる装置である。顕微鏡には、発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス）が含まれ得る。
発光画像生成装置２００は、暗箱２１０を備える。発光画像生成装置２００は、暗箱２１０の中に配置された試料２２０の発光を検出する。
発光画像生成装置２００は、例えば、対物レンズ２０１と結像レンズ２０２と検出器２０３とフィルター２０４とを有する。検出器２０３は、試料２２０から放射された光を対物レンズ２０１及び結像レンズ２０２を介して検出する。検出器２０３は、ＣＣＤセンサーを含む撮像素子等、例えば、冷却ＣＣＤであってもよいし、光電子増倍管等であってもよい。フィルター２０４は、例えば、試料２２０から放出された光のうち、特定の波長域の光のみを透過させる。フィルター２０４は、例えば、光源と光源から放射された光のなかから励起光を分光する励起光フィルターであってもよい。試料２２０が蛍光タンパク質を含む場合、光源と励起光フィルターとによって試料２２０に含まれる蛍光タンパク質を励起し、試料２２０から蛍光を放出させることが可能である。
なお、フィルター２０４は省略してもよい。
発光画像生成装置２００は、第１発光画像及び第２発光画像を生成する。第１発光画像は、「初期化因子をコードする核酸」及び「発光レポータータンパク質をコードする核酸」が導入された細胞を含む第１細胞集団であって、注目細胞を含む第１細胞集団の少なくとも一部について、発光レポータータンパク質の発現に起因する発光を撮像した発光画像である。第１発光画像は、例えば、上述した「第１発光画像」である。注目細胞は、例えば、上述した「注目細胞」である。第２発光画像は、第１細胞集団を分割した複数の第２細胞集団のうち少なくとも１つについて、発光レポータータンパク質の発現に起因する発光を撮像した発光画像である。第２発光画像は、例えば、上述した「第２発光画像」である。
試料２２０は、例えば、第１細胞集団または、１以上の第２細胞集団である。
制御装置３００は、例えば、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）等の発光画像生成装置２００の動作を制御したり、発光画像生成装置２００で得られたデータの解析を行ったりする装置である。また、制御装置３００は、検出器２０３からデータを取得したりする。発光画像生成装置２００で得られたデータは、例えば、第１発光画像又は第２発光画像である。
制御装置３００は、例えば、プロセッサー３１０と、random access memory（ＲＡＭ）３２０と、記録装置３３０と、入力装置３４０と、表示装置３５０とを備える。
ＲＡＭ４２は、プロセッサー３１０の主記憶装置として機能する。記録装置３３０は、例えば、半導体メモリ、ハードディスク等である。記録装置３３０には、プロセッサー３１０で用いられるプログラム、パラメーター等が記録され得る。また、記録装置３３０には、制御装置３００を用いて得られたデータ、それに基づく解析結果等が記録され得る。入力装置３４０は、例えばキーボート、マウス、タッチパネル等を含み得る。表示装置３５０は、例えば、液晶ディスプレイ等を含み得る。
プロセッサー３１０は、細胞特定システム１００の動作に係る各種演算を行う。プロセッサー３１０は、例えば、Central Processing Unit（ＣＰＵ）、Application Specific Integrated Circuit（ＡＳＩＣ）、Field Programmable Gate Array（ＦＰＧＡ）、又はGraphics Processing Unit（ＧＰＵ）等を含み得る。プロセッサー３１０は、１つの集積回路等で構成されてもよいし、複数の集積回路等が組み合わされて構成されてもよい。
プロセッサー３１０は、検出器２０３による検出結果に基づいて第１発光画像及び第２発光画像を取得する。プロセッサー３１０は、第１発光画像及び第２発光画像を表示装置３５０に表示する。表示された第１発光画像に基づいて、ユーザーが入力装置３４０に注目細胞の位置情報を入力すると、プロセッサー３１０は、第１発光画像における注目細胞の位置情報を取得する。注目細胞の位置情報は、例えば、第１発光画像における、注目細胞に関する領域である。注目細胞に関する領域は、上述した「第１関心領域」であってもよい。以下、注目細胞の情報は、第１関心領域であるとする。
プロセッサー３１０は、例えば、第１発光画像と第２発光画像とに基づいて、第２発光画像における注目細胞の位置情報を特定する。具体的には、例えば、以下の方法が挙げられる。先ず、プロセッサー３１０は、第１関心領域について第１発光プロファイルを取得する。第１発光プロファイルは、上述した「第１発光プロファイル」であってもよい。プロセッサー３１０は、例えば、既存の画像処理ソフトを用いて第１発光プロファイルを取得する。プロセッサー３１０は、第１関心領域の情報と第１発光プロファイルとを表示装置３５０に表示してもよい。その後、プロセッサー３１０は、第２発光画像上に１以上の第２関心領域を選択する。第２関心領域は、上述した「第２関心領域」であってもよい。その後、プロセッサー３１０は、第２関心領域について第２発光プロファイルを取得する。第２発光プロファイルは、上述した「第２発光プロファイル」であってもよい。プロセッサーは、例えば、既存の画像処理ソフトを用いて第２発光プロファイルを取得する。プロセッサー３１０は、第２関心領域の情報と第２発光プロファイルとを表示装置３５０に表示してもよい。その後、第１発光プロファイルと第２発光プロファイルとに基づいて、第２発光画像における注目細胞の位置情報を特定する。第１発光プロファイルと１以上の第２発光プロファイルとに基づいて、第２発光画像における注目細胞の位置情報を特定することは、「＜１−６．注目細胞の特定＞」の欄に記載した方法と同様の方法により行うことができる。
以上説明したように、一実施形態に係る細胞特定システムによると、注目細胞を含む第１細胞集団を分割して得られた複数の第２細胞集団におけるどの細胞が注目細胞であるかを特定することができる。
＜４．他の実施形態＞
本発明に係る他の実施形態を以下に付記する。
［１］
体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の初期化因子をコードする核酸と、前記複数種類の初期化因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞を含む第１細胞集団の少なくとも一部について、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第１発光画像を取得することと、
前記第１細胞集団を複数の第２細胞集団に分割することと、
少なくとも１つの前記第２細胞集団について、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第２発光画像を取得することと、
前記第１発光画像と前記第２発光画像とに基づいて、前記複数の第２細胞集団における細胞のなかから前記第１細胞集団における細胞を特定することとを含む、
細胞特定方法。
［２］
前記第１発光画像と前記第２発光画像とに基づいて、前記第２細胞集団における細胞のなかから前記第１細胞集団における細胞を特定することは、
前記第１発光画像上に第１関心領域を選択することと、
前記第１関心領域について第１発光プロファイルを取得することと、
前記第２発光画像上に、第２細胞集団に関する第２関心領域を選択することと、
前記第２関心領域について第２発光プロファイルを取得することと、
前記第１発光プロファイルと前記第２発光プロファイルとに基づいて、前記複数の第２細胞集団における細胞のなかから前記第１細胞集団における細胞を特定することとを含む、
［１］に記載の方法。
本発明の手法を用いて、作製されたiPS細胞様コロニーを分割して得られた第２細胞集団における注目細胞の特定を行った。この実施例では、ｉＰＳ細胞の株の樹立を目指した。
＜１．第１細胞集団の準備＞
ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を解凍し、ＰＢＭＣ用培地（ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＣＳＦを添加したＡＫ０２培地（味の素））で培養した。細胞の密度を２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとし、２４ｗｅｌｌプレートを用いて培養を行った。培地交換を行わずに３７℃、５％ＣＯ２で７日間細胞を培養した後、ＰＢＭＣをコーティング剤（ｉＭａｔｒｉｘ（ニッピ））でコートした６ｗｅｌｌプレートに播種した。６ｗｅｌｌプレートに播種されたＰＢＭＣにＡｍａｘａ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、以下で説明するベクターＡ及びベクターＢ、並びに購入したｐＣＥ−ｍｐ５３ＤＤ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＥ−ｈＳＫ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、及びｐＣＸＢ−ＥＢＮＡ１（Ａｄｄｇｅｎｅ）を導入した。ＰＢＭＣにベクターを導入した後、ＰＢＭＣを培養した。
図８に示すように、ベクターＡとして、Ｏｃｔ３／４と共に、発光レポータータンパク質としてＳｆＲＥ１ルシフェラーゼが発現するベクターを調製した。具体的には、ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３ （Ａｄｄｇｅｎｅ）のｈＯＣＴ３／４の下流に、２Ａ配列を介してＳｆＲＥ１ルシフェラーゼ（ｍａｍ）（配列番号１）を組み込むことにより、ベクターＡを調製した。
以下に、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼの塩基配列を記載する。
Figure 2019021472
図９に示すように、ベクターＢとして、Ｌ−ｍｙｃ及びＬＩＮ２８と共に、発光レポータータンパク質としてＭＡ−Ｌｕｃｉ２ルシフェラーゼが発現するベクターを調製した。具体的には、ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬ（Ａｄｄｇｅｎｅ）のＬＩＮ２８の下流に、２Ａ配列を介してＭＡ−Ｌｕｃｉ２ルシフェラーゼ（ｍａｍ）（配列番号２）を組み込むことにより、ベクターＢを調製した。なお、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼは最大発光波長λｍａｘ＝６１０ｎｍの赤色光を呈し、ＭＡ−Ｌｕｃｉ２ルシフェラーゼは最大発光波長λｍａｘ＝５６０ｎｍの緑色光を呈する。
以下に、ＭＡ−Ｌｕｃｉ２ルシフェラーゼの塩基配列を記載する。
Figure 2019021472
ベクターを導入した二日後以降、１日おきに１．５ｍｌのｉＰＳ細胞用培地（ＡＫ０２培地（味の素））を加えた。ベクター導入後８日目、培地をすべて吸引し、２ｍｌのｉＰＳ細胞用培地を加えた。以後、１日おきに２ｍｌのｉＰＳ細胞用培地で培地交換した。ｉＰＳ細胞様コロニーが形成された後、終濃度１ｍＭとなるようにＤ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を培地に加えた。ここでは、ｉＰＳ細胞様コロニーを第１細胞集団ともいう。
＜２．発光イメージング法を用いた第１発光画像の取得＞
図１０Ａは、第１細胞集団を示す位相差画像である。図１０Ｂは、ＭＡ−Ｌｕｃｉ２ルシフェラーゼに起因する発光を示す第１発光画像（緑色）である。図１０Ｃは、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因する発光を示す第１発光画像（赤色）である。
上記、ｉＰＳ細胞様コロニーの発光画像の撮像を発光顕微鏡システムＬＶ２００（オリンパス）を用いて行った。２０ｘ対物レンズＬＵＣ ＰｌａｎＦＬＮ（オリンパス）を用いて、位相差画像、第１発光画像（赤色）及び第１発光画像（緑色）を取得した。画像取得にはＥＭ−ＣＣＤカメラＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス）を使用し、露出時間は位相差像の取得では２００ｍｓｅｃとし、発光像の取得では１０ｓｅｃとした。発光画像の撮像においては、ＭＡ−Ｌｕｃｉ２ルシフェラーゼに由来する緑色光とＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに由来する赤色光を分光するために、測定用フィルターとして、それぞれＢＰ４９５−５４０（Ｆｉｌｔｅｒ１）、６１０ＡＬＰ（Ｆｉｌｔｅｒ２）を使用した。
＜３．第１細胞集団の分割＞
図１１は、第２細胞集団を示す位相差画像である。
取得した位相差観察像からコロニー中心部を選択し、実体顕微鏡の観察下でピペットマンＰ−１０（ギルソン）を用いてコロニー中心部のピックアップを行った。コロニー中心部は、後述する第１関心領域（Ｎｏ．１）〜（Ｎｏ．１５）を含んでいた。コロニーのピックアップ後、ピペッティングを行うことで、シングル・セルの状態まで分割しないように注意しながら、コロニーを数個から数十個の細胞から成る細胞小塊に分割し、６ｗｅｌｌプレートに出した。この細胞小塊を第２細胞集団とした。
＜４．第２発光画像の取得＞
６ｗｅｌｌプレートに播種したコロニー分割後の細胞小塊の位相差画像及び発光画像を取得した。第２発光画像の取得は、第１発光画像の取得時と同様の条件で行った。
＜５．注目細胞の選択＞
第１発光画像に基づいて、注目細胞の選択を行った。
図１２Ａは、第１関心領域（緑色）が選択された、図１０Ｂに示された第１発光画像（緑色）である。まず、図１２Ａに示すように、注目細胞として、第１発光画像（緑色）において、ピペットマンで削り取った領域に第１関心領域（緑色）を１５個選択した。１５個の第１関心領域（緑色）を、それぞれ第１関心領域（緑色）（Ｎｏ．１）〜（Ｎｏ．１５）とした。
図１２Ｂは、第１関心領域（赤色）が選択された、図１０Ｃに示された第１発光画像（赤色）である。図１２Ｂに示すように、第１発光画像（赤色）上に第１関心領域（赤色）を１５個選択した。１５個の第１関心領域（赤色）を、それぞれ第１関心領域（赤色）（Ｎｏ．１）〜（Ｎｏ．１５）とした。以下、関心領域（Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）をＲＯＩともいう。
図１３は、図１３は、第１関心領域（赤色）（６１０ＡＬＰ）及び（緑色）（ＢＰ４９５−５４０）の各々について取得された輝度値（発光強度）を示すグラフである。これら発光強度を第１発光プロファイルとした。第１関心領域（緑色）（Ｎｏ．１）〜（Ｎｏ．１５）及び第１関心領域（赤色）（Ｎｏ．１）〜（Ｎｏ．１５）における発光強度解析を、画像解析ソフトウェアであるｃｅｌｌＳｅｎｓ（セルセンス；オリンパス）により、生きた細胞の動きに追従しながら指定した領域ごとに輝度解析した。
図１４は、第１関心領域（赤色）及び（緑色）の各々について取得された輝度値（発光強度）から求めた第１発光強度比（Ｒａｔｉｏ（ＢＰ４９５−５４０輝度値／６１０ＡＬＰ輝度値））を示すグラフである。ＢＰ４９５−５４０フィルターで分光された緑色成分の発光強度と６１０ＡＬＰフィルターで分光された赤色成分の発光強度比の算出を行った。
＜６．注目細胞の特定＞
第１発光画像と第２発光画像とに基づいて、注目細胞の特定を行った。
先ず、第２発光画像において第２関心領域を選択した。
図１５Ａは、第２関心領域（緑色）が選択された、ＭＡ−Ｌｕｃｉ２ルシフェラーゼに起因する発光を示す第２発光画像（緑色）である。図１５Ｂは、第２関心領域（赤色）が選択された、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼに起因する発光を示す第２発光画像（赤色）である。
この時、第２関心領域の大きさおよび形状が、第１関心領域と同等になるように第２関心領域を選択した。第２発光画像中に観察された５つの細胞小塊に対して各々第２関心領域を選択した。
具体的には、第２発光画像（緑色）に、５つの第２関心領域（緑色）を選択した。５つの第２関心領域（緑色）を、それぞれ第２関心領域（緑色）（Ｎｏ．１）〜（Ｎｏ．５）とした。そして、第２発光画像（赤色）上に、５つの第２関心領域（赤色）を選択した。５つの第２関心領域（赤色）を、それぞれ第２関心領域（赤色）（Ｎｏ．１）〜（Ｎｏ．５）とした。
図１６は、第２関心領域（赤色）（６１０ＡＬＰ）及び（緑色）（ＢＰ４９５−５４０）の各々について取得された輝度値（発光強度）を示すグラフである。これら発光強度を第２発光プロファイルとした。第２関心領域（緑色）（Ｎｏ．１）〜（Ｎｏ．５）及び第２関心領域（赤色）（Ｎｏ．１）〜（Ｎｏ．５）の各々における発光強度解析をｃｅｌｌＳｅｎｓ（セルセンス；オリンパス）を用いて行った。
図１７は、第２関心領域（赤色）及び（緑色）の各々について取得された輝度値（発光強度）から求めた第２発光強度比（Ｒａｔｉｏ（ＢＰ４９５−５４０輝度値／６１０ＡＬＰ輝度値））を示すグラフである。第２発光強度比は、ＢＰ４９５−５４０フィルターで分光された緑色成分の発光強度と６１０ＡＬＰフィルターで分光された赤色成分の発光強度とに基づいて算出した。
次に、第１関心領域について取得された第１発光プロファイルと第２関心領域について取得された第２発光プロファイルとに基づいて、第２細胞集団における注目細胞を特定した。
表３は、各第１関心領域（緑色）と各第２関心領域（緑色）との差を示す。表３において、「＊」は、第１関心領域（緑色）の発光強度と第２関心領域（緑色）の発光強度と差が１０％以内であることを示す。
Figure 2019021472
表４は、各第１関心領域（赤色）と各第２関心領域（赤色）との差を示す。表４において、「＊」は、第１関心領域（赤色）の発光強度と第２関心領域（赤色）の発光強度と差が１０％以内であることを示す。
Figure 2019021472
表５は、第１関心領域と第２関心領域との対応を示す。
Figure 2019021472
ここで、緑色成分および赤色成分の双方に着目して、第１関心領域の発光強度と第２関心領域の発光強度を比較した。比較においては、各第１関心領域の発光強度と各第２関心領域の発光強度の差を第１関心領域の発光強度で除した値に１００をかけた数字の絶対値を算出した。緑色成分および赤色成分の双方で差が１０％以内と算出された関心領域は対応があると判断することが出来る。なお、図１４と図１７を用いた発光強度比解析の結果からも、表５と同様の結果を得ることが可能である。
表５に示すように、第１関心領域（Ｎｏ．１）と第２関心領域（Ｎｏ．５）とが対応し、第１関心領域（Ｎｏ．２）と第２関心領域（Ｎｏ．２）とが対応し、第１関心領域（Ｎｏ．１１）と第２関心領域（Ｎｏ．４）とが対応することが分かった。
＜７．注目細胞の培養＞
図１８Ａは、培養を開始した時点の注目細胞を示す明視野画像である。図１８Ｂ乃至図１８Ｆは、何れも、注目細胞を培養してから所定の時間が経過した後の注目細胞を示す明視野画像である。図１８Ｂ乃至図１８Ｆは、それぞれ、培養を開始した時点から５、１０、１６、２０、及び２２時間後に撮像された。
複数の第２細胞集団における注目細胞を特定した後に、注目細胞を培養した。対応が得られていた第２関心領域（Ｎｏ．２）に含まれる細胞小塊（２）であっても、培養の継続に伴い、第２関心領域（Ｎｏ．３）に含まれる細胞小塊（３）と結合し、分離出来なくなる場合がある。このような場合には、すでに対応が得られている第２関心領域（Ｎｏ．４）に含まれる細胞小塊（４）または第２関心領域（Ｎｏ．５）に含まれる細胞小塊（５）を十分な大きさになるまで培養し、ピックアップすることで、高い純度のｉＰＳ細胞の株を樹立することが可能である。
以上に示したように、本発明を用いることで、第１細胞集団から分割して得られた複数の第２細胞集団におけるどの細胞が注目細胞であるかを簡便に特定することが出来る。また、注目細胞のみを培養することで、純度の高いｉＰＳ細胞の株を簡便に得ることが可能である。
本発明の別の側面によれば、体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の初期化因子をコードする核酸と、前記複数種類の初期化因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞を含む第１細胞集団の少なくとも一部について、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第１発光画像と、前記第１細胞集団を分割した複数の第２細胞集団のうち少なくとも１つについて、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第２発光画像とを生成する発光画像生成装置と、プロセッサーとを備え、前記プロセッサーは、前記発光画像生成装置から前記第１発光画像及び前記第２発光画像を取得し、前記第１発光画像に基づいて、前記第１細胞集団のなかから注目細胞を選択し、前記第１発光画像における前記注目細胞の位置情報を取得し、前記第１発光画像と前記第２発光画像とに基づいて、前記第２発光画像における前記注目細胞の位置情報を特定する、細胞特定システムが提供される。

Claims (20)

  1. 体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の初期化因子をコードする核酸と、前記複数種類の初期化因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞を含む第１細胞集団の少なくとも一部について、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第１発光画像を取得することと、
    前記第１細胞集団を複数の第２細胞集団に分割することと、
    少なくとも１つの前記第２細胞集団について、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第２発光画像を取得することと、
    前記第１発光画像に基づいて、前記第１細胞集団のなかから注目細胞を選択することと、
    前記第１発光画像と前記第２発光画像とに基づいて、前記複数の第２細胞集団における前記注目細胞を特定することとを含む、
    細胞特定方法。
  2. 前記発光レポータータンパク質は生物発光レポータータンパク質である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記注目細胞を選択することは、前記第１発光画像上に、前記注目細胞に関する第１関心領域を選択することを含み、
    前記複数の第２細胞集団における前記注目細胞を特定することは、
    前記第２発光画像上に、前記第２細胞集団に関する第２関心領域を選択することと、
    前記第１関心領域について取得された第１発光プロファイルと前記第２関心領域について取得された第２発光プロファイルとに基づいて、前記複数の第２細胞集団における前記注目細胞を特定することとを含む、
    請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記注目細胞を選択することは、
    前記第１発光画像上に、前記注目細胞に関する第１関心領域を選択することと、
    前記第１発光画像上に、前記注目細胞に関する、前記第１関心領域の面積と異なる面積を有する第３関心領域を選択することとを含み、
    前記複数の第２細胞集団における前記注目細胞を特定することは、
    前記第２発光画像上に、前記第２細胞集団に関する第２関心領域を選択することと、
    前記第２発光画像上に、前記第２細胞集団に関する前記第２関心領域の面積と異なる面積を有する第４関心領域を選択することと、
    前記第１関心領域について取得された第１発光プロファイルと前記第２関心領域について取得された第２発光プロファイルと前記第３関心領域について取得された第３発光プロファイルと前記第４関心領域について取得された第４発光プロファイルとに基づいて、前記複数の第２細胞集団における前記注目細胞を特定することとを含む、
    請求項１又は２に記載の方法。
  5. 前記第１関心領域と前記第２関心領域とは同一の形状を有する、請求項３に記載の方法。
  6. 前記第１関心領域と前記第２関心領域とは同一の形状を有し、前記第３関心領域と前記第４関心領域とは同一の形状を有する、請求項４に記載の方法。
  7. 前記第１関心領域は前記細胞を３乃至１０個含む、請求項３乃至６の何れか１項に記載の方法。
  8. 前記複数種類の初期化因子のうち、前記発光レポータータンパク質と共に発現する前記初期化因子は２種類以上であり、
    ２種類以上の前記初期化因子と共に発現する前記発光レポータータンパク質のそれぞれは、他の何れの発光レポータータンパク質とも識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有しており、
    前記第１発光プロファイルは、各前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光強度であり、
    前記第２発光プロファイルは、各前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光強度である、請求項３乃至７の何れか１項に記載の方法。
  9. 前記複数種類の初期化因子のうち、前記発光レポータータンパク質と共に発現する前記初期化因子は２種類以上であり、
    ２種類以上の前記初期化因子と共に発現する前記発光レポータータンパク質のそれぞれは、他の何れの発光レポータータンパク質とも識別可能に検出されることを可能にする発光特性を有する、請求項１乃至７の何れか１項に記載の方法。
  10. 前記第１細胞集団を複数の第２細胞集団に分割することは、前記注目細胞を播種することである、請求項１乃至９の何れか１項に記載の方法。
  11. 前記第１発光画像を取得することは、前記第１細胞集団の内部に撮影の焦点位置を合わせることを含む、請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法。
  12. 前記第１発光画像は、複数の発光画像から選択された１枚の画像であり、
    前記複数の発光画像のそれぞれは、他の何れの発光画像とも前記第１細胞集団の厚さ方向の位置が異なる平面を示す画像である、請求項１乃至１１の何れか１項に記載の方法。
  13. 前記第１細胞集団のなかから前記注目細胞を選択することは、前記第１細胞集団の明視野画像を撮像し、前記明視野画像に基づいて設定される前記第１細胞集団の重心から１ｍｍ以内の領域から前記注目細胞を選択することを含む、請求項１乃至１２の何れか１項に記載の方法。
  14. 前記発光レポータータンパク質と共に発現する前記初期化因子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｌ−ｍｙｃからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の方法。
  15. 前記初期化因子をコードする前記核酸と前記発光レポータータンパク質をコードする前記核酸とは、エピソーマルベクターの形態で前記細胞へ導入される、請求項１乃至１４の何れか１項に記載の方法。
  16. 前記第２細胞集団は３乃至１０個の細胞を含む、請求項１乃至１５の何れか１項に記載の方法。
  17. 請求項１乃至１６の何れか１項に記載の方法を実行することと、
    前記実行により特定された前記注目細胞を培養して培養細胞集団を得ること
    とからなるサイクルを繰り返すことを含む、細胞集団の製造方法。
  18. ｎ回目（ｎは２以上の整数）の前記サイクルで前記注目細胞を選択することは、前記第１細胞集団の明視野画像を撮像することと、ｎ−１回目の前記サイクルの前記培養により増殖した細胞に前記明視野画像に基づいて設定される前記第１細胞集団の重心を設定することと、前記重心から１ｍｍ以内の領域から前記注目細胞を選択することとを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の初期化因子をコードする核酸と、前記複数種類の初期化因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質をコードする核酸とが導入された細胞を含む第１細胞集団であって注目細胞を含む前記第１細胞集団の少なくとも一部について、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第１発光画像と、前記第１細胞集団を分割した複数の第２細胞集団のうち少なくとも１つについて、前記発光レポータータンパク質の発現に起因する発光に係る第２発光画像とを生成する発光画像生成装置と、
    プロセッサーとを備え、
    前記プロセッサーは、前記発光画像生成装置から前記第１発光画像及び前記第２発光画像を取得し、前記第１発光画像における前記注目細胞の位置情報を取得し、前記第１発光画像と前記第２発光画像とに基づいて、前記第２発光画像における前記注目細胞の位置情報を特定する、
    細胞特定システム。
  20. 前記注目細胞の位置情報を取得することは、
    前記注目細胞の位置情報として、前記第１発光画像上に選択された第１関心領域を取得することを含み、
    前記注目細胞の位置情報を特定することは、
    前記第２発光画像上に、前記第２細胞集団に関する第２関心領域を選択することと、
    前記第１関心領域について取得された第１発光プロファイルと前記第２関心領域について取得された第２発光プロファイルとに基づいて、前記第２発光画像における前記注目細胞の位置情報を特定することとを含む、
    請求項１９に記載の細胞特定システム。
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