JP5737936B2 - Ｍｓｃ成長調節用の低剛性ゲル - Google Patents

Description

本発明は、柔らかいゲルを用いて幹細胞の進展を調節する方法を提供するものである。具体的には、本発明は、最適化した粘弾性特性を有するゲルを用いて幹細胞の進展を調節するための方法、組成物および装置を提供するものである。

成人間葉系幹細胞には、自己複製して間葉系組織の複数の細胞系統に分化する能力がある。このため、損傷組織の代替や抗癌剤の運搬体など、これらの細胞を臨床応用することが検討されている。それにもかかわらず、現時点での成人間葉系幹細胞の応用例は前臨床段階に限られている。１つには、これらの細胞が体外では急激に老化してしまい、その増殖とエンジニアリングに制約が生じることがその理由である。テロメラーゼを導入して間葉系幹細胞を不死化することで、老化の加速に関する課題が解決されると報告されている。しかしながら、間葉系幹細胞を組織に移植すると、この細胞が持つ無制限の自己複製能がゆえに成長の制御がきかなくなる場合がある。実際、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの環境において、テロメラーゼ導入間葉系幹細胞の形質転換が観察された。

よって、成人間葉系幹細胞の成長を調節することが、これらの細胞を臨床応用する上での重要な段階の１つである。

本発明は、柔らかいゲルを用いて幹細胞の進展を調節する方法を提供するものである。具体的には、本発明は、最適化した粘弾性特性を有するゲルを用いて幹細胞の進展を調節するための方法、組成物および装置を提供するものである。

別の実施形態では、本発明は、フィブリンまたはフィブリノゲンタンパク質を含む組成物を重合することで、前記フィブリンまたはフィブリノゲンタンパク質の濃度が１〜２０ｍｇ／ｍｌの柔らかいフィブリンマトリックスを生成する工程と、接着タンパク質を含む組成物を前記柔らかいフィブリンマトリックスにコーティングする工程と、を含む、剛性（rigidity）が０．１〜２．５ｋＰａの範囲にあるフィブリンマトリックスを製造する方法を提供するものである。

別の実施形態では、本発明は、前記間葉系幹細胞集団を剛性が０．１〜２．５ｋＰａの範囲にあるゲルマトリックスにて培養する工程を含む、間葉系幹細胞集団を保存する方法を提供するものである。

別の実施形態では、本発明は、剛性が１５０〜７５０Ｐａの範囲にあるゲルマトリックスと、脂肪細胞誘導培地と、を含み、前記ゲルまたはマトリックスが、１型コラーゲン、フィブロネクチンまたはこれらの組み合わせでコーティングされている、間葉系幹細胞の成長を調節するための装置を提供するものである。

別の実施形態では、本発明は、ゲル化剤と、アクリルアミド−ビスアクリルアミド混合物とを含むゲルマトリックスであって、１型コラーゲン、フィブロネクチンまたはこれらの組み合わせでコーティングされ、剛性が１５０〜７５０Ｐａの範囲にある、ゲルマトリックスを提供するものである。

一実施形態では、本発明は、ゲル化剤を含むゲルマトリックスであって、１型コラーゲン、フィブロネクチンまたはこれらの組み合わせでコーティングされ、かつ、所定の剛性で維持されたゲルマトリックス中に、間葉系幹細胞を懸濁させる工程と、ゲルマトリックスを成長調節因子に曝露する工程と、を含む、間葉系幹細胞の進展を調節する方法を提供するものである。

別の実施形態では、本発明は、体性幹細胞の膜上のインテグリンと結合する細胞外物質を含むゲルマトリックスであって、体内で同じタイプの体性幹細胞の主な体内生物学的微細環境の弾性と実質的に類似の弾性を有するゲルマトリックスに体性幹細胞を接触させ、体性幹細胞の生物活性を体外で持続させるための栄養物質を体性幹細胞に与えることを含む、体外で体性幹細胞に休眠状態を誘導または維持し、生物活性を持続させるための方法を提供するものである。

図面の簡単な説明
Ａ．ポリアクリルアミド支持体の機械的特性。アクリルアミド（データ線付近のパーセントで表示）とビスアクリルアミド（架橋剤として表示）との割合を変えてポリアクリルアミドゲルの剛性率を測定した。ポリマーの質量が一定であるとき、架橋剤が増えるにつれて剛性率（Ｇ’）（単位はパスカル）も増加する。アクリルアミドの濃度を３から１２％に高めた場合も、硬さに１０から５０，０００Ｐａの大きな範囲が生じる。実線は、それぞれの架橋が弾性的に有効な場合のゴム状ネットワークの理論的な硬さを示す。Ｂ．硬いマトリックスまたは柔らかいマトリックスでのｈＭＳＣの細胞形状とＦ−アクチン構造。Ｃ．柔らかいゲルおよびガラスでのｈＭＳＣの細胞形状とＦ−アクチン構造。 ｈＭＳＣへのＢｒｄＵ取り込み。 マトリックスの剛性が脂肪細胞分化に対しておよぼす影響。Ａ．陽性細胞の百分率を示すグラフ。各々の組で、１本目の棒がオイルレッドＯ染色を示し、２本目の棒はＰＰＡＲγ２染色を示す。 硬いゲルまたは柔らかいゲルに播種したアストロサイトのＦ−アクチン構造。 柔らかいゲルから硬いゲルへのＲｈｏ活性増大の定量化。さまざまな硬さのポリアクリルアミドゲルにアストロサイトを播種した。ＲｈｏのＧＴＰ装填（GPT-loading)レベルを定量化した。 硬いマトリックスのほうが黒色腫細胞により広がりがある。面積の代表的な図表。 同じ効率で柔らかいゲルと硬いゲルに接着した黒色腫細胞。 硬いゲルでの大きめの黒色腫細胞の集団。 本発明のさまざまな実施形態による弾性の異なるいくつかの支持体上のヒトＭＳＣの画像を示す。 本発明のさまざまな実施形態によるさまざまな弾性の支持体でのヒトＭＳＣへのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込み量を示す。 本発明のさまざまな実施形態による準３Ｄ環境が幹細胞の形状および増殖に対しておよぼす影響を示す図である。 本発明のさまざまな実施形態による脂肪生成誘導培地に対するヒトＭＳＣの応答を示す。 本発明のさまざまな実施形態による骨誘導培地を用いてのヒトＭＳＣの刺激後にアリザリンレッドＳで可視化したカルシウム沈着。 本発明のさまざまな実施形態による、成人幹細胞で休眠状態、分化、増殖を誘導するための系を調製するための流れ図を示す。 本発明による系の実施形態の概略図を示す。

発明の詳細な説明
本発明は、剛性が０．０１〜５０ｋＰａの範囲にあるゲルおよびマトリックス、その製造方法ならびに、これを含む間葉系幹細胞集団を保存する方法または間葉系幹細胞集団について研究する方法を提供するものである。

別の実施形態では、フィブリンまたはフィブリノゲンタンパク質を含む組成物を重合することで、フィブリンまたはフィブリノゲンタンパク質の濃度が３〜１０ｍｇ／ｍＬの柔らかいフィブリンマトリックスを生成する工程と、接着タンパク質を含む組成物を柔らかいフィブリンマトリックスにコーティングすることで、剛性が１５０〜７５０Ｐａの範囲にあるフィブリンマトリックスを製造する工程と、を含む、剛性が１５０〜７５０Ｐａの範囲にあるフィブリンマトリックスを製造する方法が得られる。

別の実施形態では、本発明のゲルまたはマトリックスにて形質転換細胞を培養することで、形質転換細胞の休眠状態を誘導する工程を含む、形質転換細胞の休眠状態を誘導する方法が得られる。別の実施形態では、形質転換細胞が癌細胞である。別の実施形態では、形質転換細胞が腫瘍細胞である。別の実施形態では、形質転換細胞が当該技術分野において周知の他のタイプの形質転換細胞である。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

本発明による方法および組成物の別の実施形態では、間葉系幹細胞集団のテロメラーゼの長さを維持する。「維持する」とは、別の実施形態では、長さに実質的な変化がないことを示す。別の実施形態では、この表現は、長さに測定可能な変化がないことを示す。別の実施形態では、この表現は、長さの点で増殖能に影響するだけの十分な変化がないことを示す。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

本発明による方法および組成物の別の実施形態では、間葉系幹細胞集団を休眠期に維持する。「休眠」とは、別の実施形態では、有意な複製がないことを示す。別の実施形態では、この表現は、大部分の細胞が細胞周期を停止していることを示す。別の実施形態では、細胞がＧ１期で停止している。別の実施形態では、細胞がＧ２期で停止している。別の実施形態では、「休眠」とは、この表現に対して当該技術分野において認められた他の定義を示す。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

一実施形態では、幹細胞が骨髄由来のヒト間葉系細胞である場合、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は弾性が約２５０Ｐａであり、コラーゲンとフィブロネクチンとの混合物を含む。別の実施形態では、コラーゲンがラット尾コラーゲンであり、フィブロネクチンがヒトフィブロネクチンである。コラーゲンとフィブロネクチンとの比は可変であり、一実施形態では、コラーゲン対フィブロネクチンの比が５：１前後である。コラーゲンとフィブロネクチンに上記以外の比を用いてもよい。コラーゲンならびにフィブロネクチンを他のソースから得ることも可能であり、コラーゲンとフィブロネクチン以外の物質を用いて弾性を持たせるとともに、細胞の休眠状態が誘導されるよう細胞膜表面にあるインテグリンと結合させてもよいことは、当業者には自明であろう。

本発明の実施形態によれば、細胞外物質（ＥＣＭ）と接触している幹細胞が、支持体の弾性を検知するようにＥＣＭを支持体と結合することによって、適切な明らかな弾性をＥＣＭに持たせる。これと対応して、支持体は、ＥＣＭと結合されたときの弾性が、ＥＣＭと接触している幹細胞に検知される材料であってもよい。いくつかの実施形態では、支持体がガラスである。他の実施形態では、支持体が、弾性２５０Ｐａのゲルまたは弾性７５００Ｐａのゲルである。これらのゲルはポリアクリルアミドゲルであってもよく、当業者間で周知のように、ポリアクリルアミドゲルの弾性は、ゲル配合物中のアクリルアミドとビスアクリルアミドの濃度を変えるなどの方法で変更できるものである。本発明の方法で使用できる、さまざまな弾性を有するゲルの製造は、本明細書を踏まえたうえで当業者には自明であろう。

幹細胞周辺の体内環境から生理的な状態の組織の試料を抽出した後、その組織試料の剛性率を測定することで、幹細胞の体内生物環境の弾性を判断することができる。ラット組織およびウシ組織の弾性を調製および測定するための例示としての手法が、本明細書に記載されている。以下の表１に、さまざまなタイプの組織の弾性をあげておく。

一実施形態では、２５０Ｐａのゲル上のヒトＭＳＣは、自らの運命を判断する更なるシグナルを待つ休眠期にある。一実施形態では、ｈＭＳＣには脂肪細胞分化（化学的因子によって誘導）が生じ、他の実施形態では、細胞周期に戻る（細胞が硬い表面に結合することで誘導）か、あるいは骨分化（化学的誘導と硬い支持体の両方が必要であるように見える）する。脂肪細胞分化因子を用いて柔らかいゲルで培養した細胞を刺激すると、一実施形態では、非常に多くの細胞内に脂質滴が蓄積される。一実施形態では、骨芽細胞分化に化学的誘導が必要である。機械的刺激と化学的刺激との同調の必要性は、一実施形態では、ヒトＭＳＣがいかにして骨髄などの対応する組織に区分けされながらも自発的分化に耐えることができるのかを説明するものである。

別の実施形態では、マトリックスの弾性と同様に、どの細胞外リガンドを選択するかということもヒトＭＳＣの接着と分化に大きく影響する。コラーゲン１型は、骨や脂肪をはじめとするさまざまな組織に見られ、細胞接着実験用の支持体として日常的に用いられている。一実施形態では、２５０Ｐａのゲルで、コラーゲン単独では多数の細胞の効率的な接着を保証できない。一実施形態では、コラーゲンＩ型とフィブロネクチンとの１０：１の比の混合物を用いることで、分化の潜在性に影響することなく２５０Ｐａのゲルに対する細胞の最適な接着が得られる。

ヒトＭＳＣには、マトリックスメタロプロテアーゼの発現を変えることで自らの微細環境を再構築する能力があり、一実施形態では、これが初期の強い接着を達成した後に効率的な分化を促進するのに役立つ。

一実施形態では、柔らかいゲルでヒトＭＳＣを培養すると、丸い表現型が発生してヒトＭＳＣでのＤＮＡ合成が劇的に減少する。これは、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞、ウシ大動脈内皮細胞、ＮＲＫ上皮細胞などの他の増殖細胞型（いずれも柔らかいゲルで培養した場合に分裂を続ける）とは対照的である。このように、２５０Ｐａのゲルでの幹細胞の休眠状態は、通常の細胞質分裂の形状誘導に失敗した結果ではなく、むしろ支持体コンプライアンスに対してこれらの細胞が持つ特定の感度である。したがって、一実施形態では、Ｇ’が２５０Ｐａのフィブロネクチン／コラーゲンゲルに幹細胞を懸濁させることを含む、細胞を休眠期に維持する方法が得られる。

一実施形態では、非増殖性ヒトＭＳＣにタンパク質ゲルマトリックス被覆ガラス支持体を提示すると、これらの細胞は紡錘体の形を発生させて、再び細胞周期に入る。別の実施形態では、硬い支持体の存在が、柔軟なマトリックスからの物理的な合図に優先する。一実施形態では、化学的誘導のない２５０Ｐａの柔らかいゲルには、神経突起状の隆起を持つニューロンの表現型を呈する有意な細胞集団が存在しない。

一実施形態では、特定の表現型を有する細胞分化が、支持体の弾性に応じて調節される。別の実施形態では、機械的特性だけでは幹細胞の分化には至らない。これは、体内の複数の組織が同様の弾性を有するためである。たとえば、脳、脂肪、骨髄組織はすべて貯蔵弾性率が２００Ｐａ前後であるが、いずれも特有の細胞集団を維持している。別の実施形態では、体内でのヒトＭＳＣは数十年間にわたって個々の骨髄に貯蔵され、それでもなお多分化能を保持している。一実施形態では、ヒトＭＳＣを硬い組織培養プラスチック上にて体外で培養し、数継代にわたって多分化能を保持する。一実施形態では、細胞によって機械的な刺激と化学的な刺激の両方が統合され、その応答が判断される。別の実施形態では、化学的な刺激が支持体の力学による影響に優先し得るが、他の実施形態では、不適切な機械的環境によって化学的アゴニストに対する正常な細胞応答が妨害される。一実施形態では、休眠状態の細胞は、その物理的環境と化学的環境の両方が骨形成を刺激するものに変化した場合にのみ骨芽細胞に分化する。したがって、一実施形態では、適切な弾性を有するマトリックスには、増殖と分化を促進する機械的な刺激と化学的な刺激の両方に対して応答する多能性骨髄間葉系幹細胞の休眠状態の集団を維持する機能がある。

本発明のさまざまな実施形態による、体性幹細胞で休眠状態、分化、増殖を誘導するための系の実施形態を調製するための流れ図を図１４に示す。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて、総容量が５００μｌになるようにアクリルアミドとビスアクリルアミドの溶液を調製する。一実施形態では、アクリルアミドとビスアクリルアミドの濃度を調節することで、広範囲にわたる剛性が得られる。ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）と過硫酸アンモニウムを用いて重合を開始し、ゲルを形成する。工程６０１の「アクリルアミド／ビスアクリルアミド（ポリアクリルアミド）溶液」では、重合したゲルの滴（たとえば、約２００μｌ）を、事前に３−アミノプロピルトリメトキシシランおよびグルタルアルデヒドで修飾したガラス製カバーガラスに載せる。工程６０２の「Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのトルエン溶液での重層」では、２％アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのトルエン溶液１５μｌ前後を工程６０１の溶液に適用し、工程６０３の「上側のカバーガラス」では、クロロシラン処理したカバーガラスを滴の上に載せる。工程６０４の「カバーガラスの除去」では、重合完了後に上側のカバーガラスを取り除き、任意選択により１０〜１５分ほどゲルに紫外線を照射する（図示せず）。工程６０５の「ＥＣＭリガンド」では、ゲル上のＮ−スクシンイミドアクリレートを、細胞外マトリックスリガンド（一実施形態ではコラーゲン１型０．１ｍｇ／ｍｌとフィブロネクチン０．０２ｍｇ／ｍｌの混合物）と反応させる。以後の工程（図示せず）で、ゲルをＰＢＳで３回洗浄し、幹細胞を細胞に播種する工程６０６の「ゲル上の細胞」までＰＢＳ中に残しておく。この材料に骨髄由来間葉系幹細胞を播種すると、増殖または分化を引き起こす化学的な刺激の存在下であっても細胞は休眠状態になる。

したがって、一実施形態では、体性幹細胞の膜上のインテグリンと結合する細胞外物質を含むゲルマトリックスであって、体内で同じタイプの体性幹細胞の主な体内生物学的微細環境の弾性と実質的に類似の弾性を有するゲルマトリックスに体性幹細胞を接触させ、体性幹細胞の生物活性を体外で持続させるための栄養物質を体性幹細胞に与えることを含む、体外で体性幹細胞に休眠状態を誘導または維持し、生物活性を持続させるための方法が得られる。

本発明の方法では、さまざまな方法で幹細胞を適当なＥＣＭと接触させることができる。たとえば、本明細書で説明するように、支持体に結合された層をＥＣＭで形成してもよく、このＥＣＭ上に幹細胞を載せてもよい。あるいは、適切な明らかな弾性を幹細胞に与える支持体とＥＣＭを結合している構造を細胞に載せるなどの方法で、支持体に結合されたＥＣＭに細胞を載せた上で、細胞上のＥＣＭと接触させてもよい。

別の実施形態では、栄養物質を含むものであっても含まないものであってもよい、支持体に結合された第１の配合物と、栄養物質を含み、かつ支持体に結合されていない第２の配合物という２種類のＥＣＭ配合物があってもよい。幹細胞を適当なＥＣＭ（支持体と、任意選択により、支持体とＥＣＭとを連結するための連結材料を含む）と接触させるための構造および構成については、図６などを含めて本明細書で説明しており、本明細書を踏まえたうえで当業者には自明である。

本発明による方法の実施形態では、細胞に休眠状態が誘導され、非休眠期から休眠期に遷移するように、休眠期にない幹細胞を本発明の方法に基づいてＥＣＭと接触させる。他の実施形態では、細胞で休眠状態が維持され、休眠期から遷移しないように、休眠状態の幹細胞を本発明の方法に基づいてＥＣＭと接触させる。

したがって、一実施形態では、ゲル化剤を含むゲルマトリックスであって、１型コラーゲン、フィブロネクチンまたはこれらの組み合わせでコーティングされ、かつ、所定の剛性で維持されたゲルマトリックス中に、間葉系幹細胞を懸濁させる工程と、ゲルマトリックスを成長調節因子に曝露する工程と、を含むことにより、化学的因子または物理的因子への曝露が、間葉系幹細胞が分化しようとしている微細環境でのＥＣＭの剛性に合わせたゲルマトリックスの剛性増大につながる、間葉系幹細胞の進展を調節する方法が得られる。

別の実施形態では、８０％を超える細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、少なくとも８０％の細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、７０％を超える細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、少なくとも７０％の細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、７５％を超える細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、少なくとも７５％の細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、８２％を超える細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、少なくとも８２％の細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、８５％を超える細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、少なくとも８５％の細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、８７％を超える細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、少なくとも８７％の細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、９０％を超える細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、少なくとも９０％の細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、９２％を超える細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、少なくとも９２％の細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、９３％を超える細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、少なくとも９３％の細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、９４％を超える細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、少なくとも９４％の細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、９５％を超える細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、少なくとも９５％の細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、９６％を超える細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、少なくとも９６％の細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、９７％を超える細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、少なくとも９７％の細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、９８％を超える細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、少なくとも９８％の細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、９９％を超える細胞が細胞周期を停止している。別の実施形態では、少なくとも９９％の細胞が細胞周期を停止している。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、複製が組織培養皿での複製に比して５０％減少する。別の実施形態では、複製が組織培養皿に比して６０％減少する。別の実施形態では、複製が組織培養皿に比して６５％減少する。別の実施形態では、複製が組織培養皿に比して７０％減少する。別の実施形態では、複製が組織培養皿に比して７５％減少する。別の実施形態では、複製が組織培養皿に比して８０％減少する。別の実施形態では、複製が組織培養皿に比して８５％減少する。別の実施形態では、複製が組織培養皿に比して９０％減少する。別の実施形態では、複製が組織培養皿に比して９５％減少する。別の実施形態では、複製が組織培養皿に比して９７％減少する。別の実施形態では、複製が組織培養皿に比して９７％を超えて減少する。別の実施形態では、複製が組織培養皿に比して９８％を超えて減少する。別の実施形態では、複製が組織培養皿に比して９９％を超えて減少する。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明の方法は、組織培養装置において後で（本発明のゲルまたはマトリックスの存在下での培養後など）間葉系幹細胞集団を蒔く工程をさらに含む。別の実施形態では、組織培養装置が誘導培地を含む。別の実施形態では、後で蒔く工程が化学的誘導を用いて実施される。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、剛性が１５０〜７５０Ｐａの範囲にあるゲルまたはマトリックスで間葉系幹細胞を培養することで、間葉系幹細胞の増殖または分化について研究する工程を含む、間葉系幹細胞の増殖または分化について研究する方法が得られる。

本発明による方法および組成物の脂肪細胞集団は、別の実施形態では脂肪細胞を含む集団である。別の実施形態では、集団には脂肪細胞が豊富に含まれる。別の実施形態では、集団が部分的に精製された脂肪細胞集団である。別の実施形態では、脂肪細胞を生物学的ソース（biological source)から単離した後に、精製または濃縮工程が続く。別の実施形態では、生物学的ソースからの単離後に培養が続く。別の実施形態では、生物学的ソースからの単離後に培養および精製または濃縮工程が続く。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物の細胞集団を、本発明による方法および組成物のゲルまたはマトリックスの存在下で培養する。別の実施形態では、ゲルまたはマトリックス中で細胞集団を培養する。別の実施形態では、ゲルまたはマトリックス上で細胞集団を培養する。別の実施形態では、ゲルまたはマトリックスの入った組織培養装置にて細胞集団を培養する。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

「間葉系幹細胞集団」とは、別の実施形態では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む集団を示す。別の実施形態では、この集団にはＭＳＣが豊富に含まれる。別の実施形態では、集団が部分的に精製されたＭＳＣ集団である。別の実施形態では、ＭＳＣを生物学的ソースから単離した後に、精製または濃縮(enrichment)工程が続く。別の実施形態では、生物学的ソースからの単離後に培養が続く。別の実施形態では、生物学的ソースからの単離後に培養および精製または濃縮工程が続く。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

本発明による方法および組成物の「間葉系」細胞は、別の実施形態では、骨髄から単離または精製される。別の実施形態では、細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である。別の実施形態では、細胞が脂肪組織から単離または精製される。別の実施形態では、細胞が軟骨から単離または精製される。別の実施形態では、細胞が当該技術分野において周知の他の任意の組織から単離または精製される。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物のゲルまたはマトリックスは、硬さが１５０〜７５０パスカル（Ｐａ）である。別の実施形態では、本発明による方法および組成物のゲルまたはマトリックスは、剛性率が１５０〜７５０Ｐａである。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物のゲルまたはマトリックスは、硬さが生体組織と同等である。別の実施形態では、生体組織が骨髄である。別の実施形態では、生体組織が脂肪組織である。別の実施形態では、生体組織が当該技術分野において周知の他の任意の生体組織である。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

一実施形態では、本明細書に記載のゲルマトリックスは、その構造および濃度に応じてさまざまな強度のゲルを形成でき、別の実施形態では、さらにイオン強度やｐＨ、温度などの環境要因にも応じてさまざまな強度のゲルを形成できる。一実施形態では、加振力が材料の動きに対しておよぼす影響を判断することで、粘度とゲルの挙動の組み合わせ（これを「粘弾性」と呼ぶ）について検討する。別の実施形態では、弾性係数（Ｇ’）、粘性係数（Ｇ’’）、複素粘度（η^＊）が、本明細書に記載の方法を用いて変更する対象となるパラメータであり、別の実施形態では、いずれも応力またはひずみのどちらかを経時的に変更することで分析される（表１）。これらのパラメータは、最大応力と最大ひずみとの比である複素弾性率（Ｇ^＊）と、応力と歪みの位相が異なる角度である位相角（ω）とから導かれる。

一実施形態では、本明細書に記載のゲルマトリックスにおいて、剪断応力によって生じる変形の中には、弾性であって力を取り除くとゼロに戻るものがある。一実施形態での溶媒による鎖のすべり変位（sliding displacement）によって生じる変形など、弾性以外の変形は、力を取り除いてもゼロに戻らない。一定の力の下では、一実施形態での弾性変位も一定に維持されるのに対し、すべり変位が続くため、増加する。

一実施形態では、「弾性の」または「弾性」という表現やこれと似たような用語は、本明細書に記載のゲルマトリックスの物性すなわち、機械力下でのゲルの変形しやすさと、変形力を取り除いたときにゲルマトリックスがもとの形状を保つ機能を示す。別の実施形態では、「弾性係数」とはヤング率を示し、（ａ）材料の一軸応力と（ｂ）これに付随する、その軸に沿った通常のひずみとの比を示す尺度である。

剛性率（ひずみの変化に起因）は、剪断応力と剪断ひずみの比である。剛性率も上記と同様で、
Ｇ^＊＝Ｇ’＋ｉＧ’’
という複素関係にある。

式中、Ｇ^＊は複素剛性率であり、Ｇ’は同位相の貯蔵弾性率、ｉは材料関連の要因、Ｇ’’は同様の方向での位相が異なる損失弾性率である。；Ｇ^＊＝Ｅ（Ｇ’２＋Ｇ’’２）。これらのパラメータ同士が交差する周波数は材料に特異の緩和時間（τ）に相当する。

一実施形態では、小さな振幅かつ可変の角周波数を用いる振動剪断流での測定によって、本明細書に記載のゲルマトリックスの線形粘弾性特性を判断する。ここでのＧ’とＧ’’の値は、かなりの部分が水溶液中のセルロース誘導体の濃度と代表的な粘度値の大きさによって決まる。したがって、下記では角周波数ωを大きくした場合のＧ’とＧ’’の相対的な動きのみ考慮する。別の実施形態では、水溶液中のセルロース誘導体の濃度１．５〜２％（ｗ／ｗ）、温度２０℃前後で、セルロース誘導体に対するＧ’およびＧ’’の挙動は、低角周波数（ω）では貯蔵弾性率Ｇ’のほうが損失弾性率Ｇ’’よりも小さいが、角周波数が大きくなるにつれてＧ’がＧ’’よりも大幅に増加するような挙動となる。別の実施形態では、特定の角周波数を超えるＧ’が最終的にＧ’’より大きくなり、よって、角周波数の値が大きい溶液のほうが優勢に弾性反応をする。この挙動を、本明細書に記載の調節方法で減弱または変化させる。

別の実施形態では、「弾性」という用語は、変形が可逆性であるか否かを問わず、応力による材料の変形しやすさを決める物性を示す。本明細書で使用する場合、弾性と剛性は反比例するが、この材料の弾性（剛性）については、Rheometrics, Piscataway, NJから入手可能なRFS III fluids spectrometer rheometerを用いて、振動剪断ひずみ２％、周波数１０ラジアン／秒で測定できる。細胞および他の生理学的組織の弾性と他の１０のレオロジー特性を、当業者間で周知の多岐にわたる方法で測定可能である。このような方法は、一例としてレオメータまたは原子間力顕微鏡の使用を伴うものであってもよい。（たとえば、Engler AJ, Rehfeldt F, Sen S, Discher DE, "Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation," Methods Cell Biol. 2007;83:521-45、15 Yeung T, Georges PC, Flanagan LA, Marg B, Ortiz M, Funaki M, Zahir N, Ming W, Weaver V, Janmey PA, "Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion, " Cell Motil Cytoskeleton. 2005 Jan;60(l):24-34を参照のこと）。

一実施形態では、「固有粘度（［η^＊］）」という用語は、還元粘度の範囲を濃度ゼロに外挿したものを示す。還元粘度と同様に、固有粘度も濃度の逆数の単位（ｍＬｇ^−１など）を有する。

一実施形態では、剛性または硬さが、観察または測定されるＧ’値を示す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物のゲルまたはマトリックスに、接着タンパク質を含む溶液をコーティングする。別の実施形態では、接着タンパク質がコラーゲンである。別の実施形態では、接着タンパク質が１型コラーゲンである。別の実施形態では、接着タンパク質がフィブロネクチンである。別の実施形態では、接着タンパク質が当該技術分野において周知の他の任意の接着タンパク質である。別の実施形態では、ゲルまたはマトリックスに、接着タンパク質の組み合わせを含む溶液をコーティングする。別の実施形態では、ゲルまたはマトリックスに、コラーゲンおよびフィブロネクチンを含む溶液をコーティングする。別の実施形態では、ゲルまたはマトリックスに、Ｉ型コラーゲンおよびフィブロネクチンを含む溶液をコーティングする。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物のコラーゲンが組換えコラーゲンである。別の実施形態では、コラーゲンが生物学的ソースから精製される。別の実施形態では、コラーゲンが１型コラーゲンである。別の実施形態では、コラーゲンが、当該技術分野において周知の他の任意のタイプのコラーゲンである。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物のフィブロネクチンが組換えフィブロネクチンである。別の実施形態では、フィブロネクチンが生物学的ソースから精製される。別の実施形態では、フィブロネクチンが１型フィブロネクチンである。別の実施形態では、フィブロネクチンが、当該技術分野において周知の他の任意のタイプのフィブロネクチンである。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

本発明による方法および組成物のゲル化剤が、別の実施形態では、アクリルアミドである。別の実施形態では、ゲル化剤がアクリルアミド−ビスアクリルアミド混合物である。別の実施形態では、ゲル化剤がアクリルアミドを含む。別の実施形態では、ゲル化剤がアクリルアミド−ビスアクリルアミド混合物を含む。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物のアクリルアミドゲルのアクリルアミド：ビスアクリルアミド比が１００：１から３０：１の間である。別の実施形態では、アクリルアミド：ビスアクリルアミド比が１００：１から３０：１の間にある溶液から、アクリルアミドゲルを調製する。別の実施形態では、当該比が１００：１から２０：１の間である。別の実施形態では、アクリルアミド：ビスアクリルアミド当該比が１００：１から４０：１の間である。別の実施形態では、当該比が１００：１から５０：１の間である。別の実施形態では、当該比が１００：１から６０：１の間である。別の実施形態では、当該比が１００：１から７０：１の間である。別の実施形態では、当該比が１２０：１から３０：１の間である。別の実施形態では、当該比が１２０：１から４０：１の間である。別の実施形態では、当該比が１２０：１から５０：１の間である。別の実施形態では、当該比が１２０：１から６０：１の間である。別の実施形態では、当該比が１２０：１から７０：１の間である。別の実施形態では、当該比が９０：１から２０：１の間である。別の実施形態では、当該比が９０：１から３０：１の間である。別の実施形態では、当該比が９０：１から４０：１の間である。別の実施形態では、当該比が９０：１から５０：１の間である。別の実施形態では、当該比が９０：１から６０：１の間である。別の実施形態では、当該比が８０：１から２０：１の間である。別の実施形態では、当該比が８０：１から３０：１の間である。別の実施形態では、当該比が８０：１から４０：１の間である。別の実施形態では、当該比が８０：１から５０：１の間である。

別の実施形態では、当該比が３０：１である。別の実施形態では、当該比が２０：１である。別の実施形態では、当該比が２５：１である。別の実施形態では、当該比が３５：１である。別の実施形態では、当該比が４０：１である。別の実施形態では、当該比が４５：１である。別の実施形態では、当該比が５０：１である。別の実施形態では、当該比が５５：１である。別の実施形態では、当該比が６０：１である。別の実施形態では、当該比が６５：１である。別の実施形態では、当該比が７０：１である。別の実施形態では、当該比が７５：１である。別の実施形態では、当該比が８０：１である。別の実施形態では、当該比が８５：１である。別の実施形態では、当該比が９０：１である。別の実施形態では、当該比が９５：１である。別の実施形態では、当該比が１００：１である。

各々のアクリルアミド：ビスアクリルアミド比が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物のアクリルアミドゲルの合計アクリルアミド濃度が３〜５％である。別の実施形態では、合計アクリルアミド濃度が３〜５％である溶液から、アクリルアミドゲルを調製する。別の実施形態では、合計アクリルアミド濃度が２％である。別の実施形態では、当該濃度が２．５％である。別の実施形態では、当該濃度が３％である。別の実施形態では、当該濃度が３．５％である。別の実施形態では、当該濃度が４％である。別の実施形態では、当該濃度が４．５％である。別の実施形態では、当該濃度が５％である。別の実施形態では、当該濃度が５．５％である。別の実施形態では、当該濃度が６％である。別の実施形態では、当該濃度が２〜５％である。別の実施形態では、当該濃度が２．５〜５％である。別の実施形態では、当該濃度が３．５〜５％である。別の実施形態では、当該濃度が２〜４％である。別の実施形態では、当該濃度が２〜４．５％である。別の実施形態では、当該濃度が２〜５％である。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物のゲル化剤がフィブリンタンパク質である。別の実施形態では、ゲル化剤がフィブリノゲンタンパク質である。別の実施形態では、フィブリノゲンが凝固因子の枯渇したものである。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物のゲルまたはマトリックスにおける組換えフィブリンまたはフィブリノゲンタンパク質の当該濃度が３〜１０ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が３〜１２ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が３〜９ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が３〜８ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が３〜７ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が３〜６ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が２〜１２ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が２〜１０ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が２〜９ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が２〜８ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が２〜７ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が２〜６ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が４〜１２ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が４〜１０ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が４〜９ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が４〜８ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が４〜７ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が５〜１２ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が５〜１０ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が５〜９ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が５〜８ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が２ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が２．５ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が３ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が３．５ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が４ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が４．５ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が５ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が６ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が７ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が８ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が９ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が１０ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が１１ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態では、当該濃度が１２ｍｇ／ｍＬである。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物のフィブリンまたはフィブリノゲンタンパク質が、変温動物のフィブリンまたはフィブリノゲンタンパク質である。別の実施形態では、フィブリンまたはフィブリノゲンタンパク質が、恒温動物のフィブリンまたはフィブリノゲンタンパク質である。別の実施形態では、フィブリンまたはフィブリノゲンが魚由来のものである。別の実施形態では、フィブリンまたはフィブリノゲンがサケ由来のものである。別の実施形態では、フィブリンまたはフィブリノゲンが、当該技術分野において周知の他の任意の魚由来のものである。別の実施形態では、フィブリンまたはフィブリノゲンが、当該技術分野において周知の他の任意の変温動物由来のものである。別の実施形態では、フィブリンまたはフィブリノゲンが哺乳動物由来のものである。別の実施形態では、フィブリンまたはフィブリノゲンが、ヒトフィブリンまたはフィブリノゲンである。別の実施形態では、フィブリンまたはフィブリノゲンが、ウシフィブリンまたはフィブリノゲンである。別の実施形態では、フィブリンまたはフィブリノゲンが、当該技術分野において周知の他の任意の哺乳動物由来のものである。別の実施形態では、フィブリンまたはフィブリノゲンが、当該技術分野において周知の他の任意の恒温動物由来のものである。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、ゲル化剤がアガロースである。別の実施形態では、ゲル化剤が寒天である。別の実施形態では、ゲル化剤がグリコサミノグリカンである。別の実施形態では、ゲル化剤がコラーゲンである。別の実施形態では、ゲル化剤がカラギーンである。別の実施形態では、ゲル化剤がカラギーナンである。別の実施形態では、ゲル化剤がローカストビーンガムである。別の実施形態では、ゲル化剤がグリセリンである。別の実施形態では、本発明による方法および組成物のゲル化剤が、当該技術分野において周知の他の任意のゲル化剤である。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

本発明による方法および組成物のゲルまたはマトリックスが、別の実施形態では、２次元ゲルまたはマトリックスである。別の実施形態では、ゲルまたはマトリックスが、３次元ゲルまたはマトリックスである。別の実施形態では、ゲルまたはマトリックスが、当該技術分野において周知の他の任意のタイプのゲルまたはマトリックスである。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物のゲルまたはマトリックスが、動物血清をさらに含む。別の実施形態では、動物血清がウシ胎仔血清である。別の実施形態では、動物血清が仔ウシ血清である。別の実施形態では、動物血清がウマ血清である。別の実施形態では、動物血清が、当該技術分野において周知の他の任意のタイプの成長因子含有動物血清である。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物のゲルまたはマトリックスが、プロテアーゼ阻害剤をさらに含む。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物のプロテアーゼ阻害剤が、ペプチダーゼの機能を阻害する。別の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤がタンパク質である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤が、システインプロテアーゼ阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）、トリプシン阻害剤、トレオニンプロテアーゼ阻害剤、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤である。別の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤が、自殺阻害剤、遷移状態阻害剤またはキレート化剤である。

別の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤が、大豆トリプシン阻害剤（ＳＢＴＩ）である。別の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤がＡＥＢＳＦ−ＨＣｌである。別の実施形態では、阻害剤がε−アミノカプロン酸である。別の実施形態では、阻害剤がα１−抗キモトリプシンである。別の実施形態では、阻害剤が抗トロンビンＩＩＩである。別の実施形態では、阻害剤がα１−抗トリプシン（α１−プロテイナーゼ阻害剤）である。別の実施形態では、阻害剤がＡＰＭＳＦ−ＨＣｌ（４−アミジノフェニル−メタンスルホニル−フルオリド）である。別の実施形態では、阻害剤がアプロチニンである。別の実施形態では、阻害剤がベンズアミジン−ＨＣｌである。別の実施形態では、阻害剤がキモスタチンである。別の実施形態では、阻害剤がＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスフェート）である。別の実施形態では、阻害剤がロイペプチンである。別の実施形態では、阻害剤がPEFABLOC（登録商標） SC（４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩）である。別の実施形態では、阻害剤がＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）である。別の実施形態では、阻害剤がＴＬＣＫ（１−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−２−ヘプタノンＨＣｌ）である。別の実施形態では、阻害剤がＴＰＣＫ（１−クロロ−３−トシルアミド−４−フェニル−２−ブタノン）である。別の実施形態では、阻害剤が卵白（オボムコイド）由来のトリプシン阻害剤である。別の実施形態では、阻害剤が大豆由来のトリプシン阻害剤である。別の実施形態では、阻害剤がアプロチニンである。別の実施形態では、阻害剤がイセチオン酸ペンタミジンである。別の実施形態では、阻害剤がペプスタチンである。別の実施形態では、阻害剤がグアニジウムである。別の実施形態では、阻害剤がα２−マクログロブリンである。別の実施形態では、阻害剤が亜鉛のキレート化剤である。別の実施形態では、阻害剤がヨード酢酸である。別の実施形態では、阻害剤が亜鉛である。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物で用いるプロテアーゼ阻害剤の量が、０．１ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤の量が０．２ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、この量が０．３ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が０．４ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が０．６ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が０．８ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が１ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が１．５ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が２ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が２．５ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が３ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が５ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が７ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が１０ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が１２ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が１５ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が２０ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が３０ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が５０ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が７０ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が１００ｍｇ／リットルである。

別の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤の量が０．１〜１ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤の量が０．２〜１ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が０．３〜１ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が０．５〜１ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が０．１〜２ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が０．２〜２ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が０．３〜２ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が０．５〜２ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が１〜２ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が１〜１０ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が２〜１０ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が３〜１０ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が５〜１０ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が１〜２０ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が２〜２０ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が３〜２０ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が５〜２０ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が１０〜２０ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が１０〜１００ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が２０〜１００ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が３０〜１００ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が５０〜１００ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が１０〜２００ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が２０〜２００ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が３０〜２００ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が５０〜２００ｍｇ／リットルである。別の実施形態では、当該量が１００〜２００ｍｇ／リットルである。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物で用いるプロテアーゼ阻害剤の量が、１０００ｋ．ｉ．ｕ．（カリクレイン不活性化単位）／リットルである。別の実施形態では、当該量が１０ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が１２ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が１５ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が２０ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が３０ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が４０ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が５０ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が７０ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が１００ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が１５０ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が２００ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が３００ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が５００ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が７００ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が１５００ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が３０００ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が４０００ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。別の実施形態では、当該量が５０００ｋ．ｉ．ｕ．／リットルである。

プロテアーゼ阻害剤の各々の量が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物のプロテアーゼ阻害剤で標的されるプロテアーゼが、セリンプロテアーゼである。別の実施形態では、プロテアーゼがトリプシンである。別の実施形態では、プロテアーゼがキモトリプシンである。別の実施形態では、プロテアーゼがカルボキシペプチダーゼである。別の実施形態では、プロテアーゼがアミノペプチダーゼである。別の実施形態では、プロテアーゼが、十二指腸または小腸で機能する他の任意のプロテアーゼである。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

本発明による方法および組成物の間葉系幹細胞集団が、別の実施形態では、成人間葉系幹細胞集団である。別の実施形態では、間葉系幹細胞集団が若年間葉系幹細胞集団である。別の実施形態では、間葉系幹細胞集団が乳児間葉系幹細胞集団である。別の実施形態では、間葉系幹細胞集団が胎児間葉系幹細胞集団である。別の実施形態では、間葉系幹細胞集団がヒト間葉系幹細胞集団である。別の実施形態では、間葉系幹細胞集団が、当該技術分野において周知の任意の動物由来のものである。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、目的の細胞型が幹細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が造血幹細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が脂肪細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が内皮前駆細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が神経幹細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が成人組織内に存在する前駆細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が成人組織内に存在する膵前駆細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が再生ネイティブβ細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が胃腸幹細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が肝膵上皮幹細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が表皮幹細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が腸上皮幹細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型がレチナール幹細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型がニューロン上皮幹細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が筋肉幹細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が内皮幹細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が末梢血幹細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が、当該技術分野において周知の他の任意のタイプの幹細胞である。

別の実施形態では、目的の細胞型が前駆細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が軟骨前駆細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が脂肪前駆細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が骨髄間質前駆細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が筋原性前駆細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が骨原性前駆細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が腱前駆細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が、当該技術分野において周知の他の任意のタイプの前駆細胞である。

別の実施形態では、目的の細胞型が後代細胞型である。別の実施形態では、目的の細胞型が軟骨細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が間質細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が筋管細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が骨細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が腱細胞である。別の実施形態では、目的の細胞型が、当該技術分野において周知の他の任意の後代細胞型である。

別の実施形態では、本発明の方法が、誘導培地で間葉系幹細胞をインキュベートする工程をさらに含む。別の実施形態では、誘導培地が幹細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が骨芽細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が造血幹細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が脂肪細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が内皮前駆細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が神経幹細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が成人組織内に存在する前駆細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が成人組織内に存在する膵前駆細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が再生ネイティブβ細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が胃腸幹細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が肝膵上皮幹細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が表皮幹細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が腸上皮幹細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地がレチナール幹細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地がニューロン上皮幹細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が筋幹細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が内皮幹細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が末梢血幹細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が当該技術分野において周知の他の任意のタイプの誘導培地である。

別の実施形態では、誘導培地が前駆細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が軟骨前駆細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が脂肪前駆細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が骨髄間質前駆細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が筋原性前駆細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が骨原性前駆細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が腱前駆細胞誘導培地である。別の実施形態では、誘導培地が、当該技術分野において周知の他の任意のタイプの前駆細胞である。

別の実施形態では、誘導培地が当該技術分野において周知の他の任意のタイプの誘導培地である。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

本発明による方法および組成物の培養する工程を、別の実施形態では、少なくとも５日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を少なくとも４日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を少なくとも６日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を少なくとも７日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を少なくとも８日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を少なくとも１０日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を少なくとも１２日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を少なくとも１５日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を少なくとも２０日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を少なくとも２５日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を少なくとも３０日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を少なくとも３５日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を少なくとも４０日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を少なくとも５０日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を少なくとも６０日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を、４日間を超えて実施する。別の実施形態では、培養する工程を、６日間を超えて実施する。別の実施形態では、培養する工程を、７日間を超えて実施する。別の実施形態では、培養する工程を、８日間を超えて実施する。別の実施形態では、培養する工程を、１０日間を超えて実施する。別の実施形態では、培養する工程を、１２日間を超えて実施する。別の実施形態では、培養する工程を、１５日間を超えて実施する。別の実施形態では、培養する工程を、２０日間を超えて実施する。別の実施形態では、培養する工程を、２５日間を超えて実施する。別の実施形態では、培養する工程を、３０日間を超えて実施する。別の実施形態では、培養する工程を、３５日間を超えて実施する。別の実施形態では、培養する工程を、４０日間を超えて実施する。別の実施形態では、培養する工程を、５０日間を超えて実施する。別の実施形態では、培養する工程を、６０日間を超えて実施する。別の実施形態では、培養する工程を４日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を６日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を７日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を８日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を１０日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を１２日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を１５日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を２０日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を２５日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を３０日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を３５日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を４０日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を５０日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を６０日間実施する。別の実施形態では、培養する工程を、６０日間を超えて実施する。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明のゲルまたはマトリックスで間葉系幹細胞集団を培養する工程の前に、組織培養装置にて間葉系幹細胞を培養する工程を実施する。別の実施形態では、組織培養装置が皿である。別の実施形態では、組織培養装置がプレートである。別の実施形態では、組織培養装置がフラスコである。別の実施形態では、組織培養装置が瓶である。別の実施形態では、組織培養装置が管である。別の実施形態では、組織培養装置が、当該技術分野において周知の他の任意のタイプの組織培養装置である。別の実施形態では、培養する工程の前に、たとえば本発明のゲルまたはマトリックスの非存在下で、組織培養液にて間葉系幹細胞を培養する工程を実施する。別の実施形態では、組織培養装置または組織培養液にて細胞を培養する工程を、生体試料からの間葉系幹細胞集団の単離後に実施する。別の実施形態では、生体試料からの間葉系幹細胞集団の精製後に培養する工程を実施する。別の実施形態では、生体試料での間葉系幹細胞集団の濃縮後に培養する工程を実施する。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明のゲルまたはマトリックスにて間葉系幹細胞集団を培養する工程を、生体試料からの間葉系幹細胞集団の単離直後に実施する。別の実施形態では、生体試料からの間葉系幹細胞集団の精製直後に培養する工程を実施する。別の実施形態では、生体試料での間葉系幹細胞集団の濃縮直後に培養する工程を実施する。「直」は、別の実施形態では、先に組織培養装置で培養することのない培養工程を示す。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

本発明による方法および組成物の前駆細胞集団が、別の実施形態では、造血幹細胞集団である。別の実施形態では、前駆細胞集団が内皮細胞前駆体集団である。別の実施形態では、前駆細胞集団が衛星細胞集団（筋細胞前駆体など）である。別の実施形態では、前駆細胞集団が吻側細胞移動路の一過性増殖神経前駆細胞の集団である。別の実施形態では、前駆細胞集団が骨髄幹細胞集団である。別の実施形態では、前駆細胞集団が当該技術分野において周知の他の任意の前駆細胞集団である。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

「前駆細胞集団」とは、別の実施形態では、前駆細胞を含む集団を示す。別の実施形態では、集団には前駆細胞が豊富に含まれる。別の実施形態では、集団が部分的に精製された前駆細胞集団である。別の実施形態では、前駆細胞を生物学的ソースから単離した後に、精製または濃縮工程が続く。別の実施形態では、生物学的ソースからの単離後に培養が続く。別の実施形態では、生物学的ソースからの単離後に培養および精製または濃縮工程が続く。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明のゲルまたはマトリックスにて形質転換細胞を培養することで、形質転換細胞を分化細胞型に分化させる工程を含む、形質転換細胞を分化細胞型に分化させる方法が得られる。別の実施形態では、分化細胞型が前駆細胞である。別の実施形態では、分化細胞型が後代細胞型である。別の実施形態では、分化細胞型が組織細胞型である。別の実施形態では、分化細胞型が上記の細胞型のうちの１つである。別の実施形態では、分化細胞型が当該技術分野において周知の他の任意のタイプの分化細胞型である。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明の方法で調製される細胞または細胞集団を被検体での損傷組織の代替に使用する。別の実施形態では、本発明の方法で調製される細胞または細胞集団を抗癌剤の運搬体として使用する（Kassem M, Ann N Y Acad Sci. 2006 May, 1067:436-42）。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

間葉系幹細胞の増殖能および分化能を判断するための方法は当該技術分野において周知であり、たとえば、Baxter MA et al (Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion. Stem Cells. 2004;22(5):675-82)、Liu L et al (Telomerase deficiency impairs differentiation of mesenchymal stem cells. Exp Cell Res. 2004 Mar 10;294(1):1-8)、Bonab MM et al (Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 2006 Mar 10:7:14)に記載されている。各々の可能性が、本発明による別の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物には、間葉系幹細胞の不死化がないという利点がある。別の実施形態では、間葉系幹細胞集団からの癌細胞の発生がないという利点がある。別の実施形態では、標的細胞が複数の細胞型に分化する能力が保持されるという利点がある。別の実施形態では、細胞の増殖能が保持されるという利点がある。別の実施形態では、細胞が造血細胞の成長を支援する能力が保持されるという利点がある。別の実施形態では、接触阻害を必要とすることなく標的細胞が分化できるという利点がある。別の実施形態では、分化は増殖阻害の結果である。各々の可能性が、本発明による別の実施形態を表す。

一実施形態では、休眠状態の体性幹細胞の増殖を誘導するための方法が得られる。同じタイプの幹細胞の体内で自然に生じる微細環境の弾性よりも弾性の低い物質に幹細胞を接触させることが、幹細胞の増殖を誘導する上で効果的であることが見いだされている。よって、本発明の実施形態は、細胞膜表面のインテグリンと結合する化合物を含み、かつ、体性幹細胞と同じタイプの体内体性幹細胞の生物学的微細環境における主な物質の弾性より小さい、幹細胞にとって明らかな弾性を有する物質に体性幹細胞を接触させることを含む。たとえば、剛性が１ギガパスカル（ヒトまたは動物のほとんどの組織タイプよりもはるかに低い弾性）を超え、細胞のインテグリンと接触している材料でコーティングされたスライドガラスに休眠状態の幹細胞を載せることで、休眠状態の幹細胞の増殖を誘導できる。他の実施形態では、幹細胞の体内での自然な微細環境における弾性の０．１未満の、細胞にとって明らかな弾性を有する物質に細胞を接触させることで、幹細胞の増殖を誘導できる。他の実施形態では、幹細胞の体内での自然な微細環境における弾性の約０．５倍未満（約０．４から約０．５倍など）である幹細胞にとって明らかな弾性を有する物質に幹細胞を接触させることで、増殖を誘導できる。

実施形態では、体外で幹細胞およびそれに由来する細胞の増殖を促進し、生物活性を持続させるための成長因子や血清などを含む栄養・成長物質を細胞に与えてもよい。特定の細胞型向けの栄養・成長物質の配合物が当業者間で周知であり、本発明のこの態様を実施するにあたって特定タイプの幹細胞向けの周知の栄養・成長物質を変える必要はない。

本発明の他の態様と同様に、この増殖誘導態様の実施形態は、ＭＳＣをはじめとする幹細胞を用いて実施できるものである。ＭＳＣは、本明細書で説明するように生体組織から収集したものであってもよいし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養および低温で冷凍した（cryogenically frozen）幹細胞などの他のソース由来のものであってもよい。このような細胞は、天然に生じる休眠期にあってもよいし、人工的に誘導した休眠期であってもよく、たとえば、本発明の方法を用いて休眠状態を誘導または維持した細胞を含むものであってもよい。したがって、本発明の方法で増殖を誘導できる細胞としては、骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、腎幹細胞、肝幹細胞、骨格筋由来幹細胞、骨由来幹細胞、歯髄ＭＳＣ、心筋由来ＭＳＣ、滑液由来ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ、当業者が本明細書を踏まえたうえで同定可能な他のタイプの細胞があげられる。

本発明による幹細胞の増殖は可逆性であり、細胞に休眠状態と増殖状態を交互に誘導できるものである。たとえば、本発明の方法を用いて、細胞表面のインテグリンと結合する化合物を含み、細胞の体内での微細環境の弾性とほぼ同じ細胞にとっての弾性を有する材料に幹細胞を接触させるなどの方法で、幹細胞で休眠状態を誘導および維持してもよい。次に、インテグリンと結合する化合物を含み、細胞の体内での微細環境の弾性よりも細胞にとっての弾性が実質的に低い材料に細胞を接触させることで、細胞で増殖を誘導すればよい。その上で、得られる娘細胞を、インテグリン結合化合物を含み、細胞の体内での微細環境とほぼ同じ細胞にとっての弾性を有する材料と接触させることで、休眠状態を誘導および維持してもよい。

別の実施形態では、本発明の方法で増殖幹細胞を休眠期に誘導する。その上で、上述したようにこれらの休眠状態の細胞の増殖を誘導することができる。

本発明はさらに、本発明の方法で生物活性が持続され、休眠状態が誘導された状態または維持される、体性幹細胞の分化を誘導するための方法を提供するものである。本発明のこの態様の実施形態は、このような細胞を、所定の細胞型への細胞の分化を刺激するよう選択された化学的な刺激を含む分化材料と接触させる工程と、分化刺激細胞の生物活性を持続させるための分化細胞栄養物質を細胞に与える工程とを含む。いくつかの実施形態では、弾性が意図した分化の標的細胞の自然な微細環境の弾性よりも低い材料と幹細胞を接触させることで、たとえば体外で体性幹細胞の増殖を誘導する（または可能にする）ことを含む工程を、接触させる工程の前に加えてもよい。

本発明によって生物活性が持続された休眠状態の幹細胞または増殖幹細胞に、周知の方法または本明細書を踏まえた上で当業者らには自明の方法を用いて、分化を誘導してもよい。たとえば、本明細書で詳細に説明するように、幹細胞がヒト骨髄由来間葉系幹細胞の場合、弾性が２５０Ｐａ前後の支持体で（実施例１で説明するような）脂肪生成培地と細胞を接触させることで脂肪細胞への細胞の分化を実施してもよい。さまざまな組織タイプのレオロジーならびに、幹細胞を誘導してさまざまなタイプの細胞に分化させるのに用いる分化培地に関して本明細書から得られる情報あるいは本明細書に記載されたような情報を使用すれば、本発明の方法を用いて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞から少なくとも以下の細胞型のうちの１つまたは複数への分化を誘導できることは、当業者であれば自明であろう。骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、膵島β細胞、ニューロン細胞。一般に、さまざまな組織タイプのレオロジーならびにさまざまな幹細胞型からさまざまなタイプの細胞への分化を誘導するのに用いられる分化培地に関する情報を使用すれば、本明細書にて識別する幹細胞型のいずれにおいても、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、膵島β細胞、ニューロン細胞または別の細胞型のうちの１つまたは複数への分化を誘導することについて、当業者には容易に分かるであろう。

本発明のこの態様の実施形態では、細胞の生物活性を持続させるための栄養を含む培地と分化細胞を接触させる。たとえば、本発明の方法を用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化を誘導する場合、得られる脂肪細胞を、その生物活性を維持するために栄養培地と接触させてもよい。栄養培地には、ＤＭＥＭ（低ブドウ糖）、ウシ胎仔血清、インスリンを含むものを使用できる。他の栄養培地ならびに、これと分化細胞を接触させるための方法は、当業者であれば本明細書を踏まえたうえで自明であろう。

本発明は、体性幹細胞の休眠状態および持続可能な生物活性を誘導または維持するための人工系をさらに提供するものである。実施形態では、この系は、幹細胞を接触させるための細胞外物質（ＥＣＭ）リガンド物質、ＥＣＭリガンド物質と結合した支持体材料、幹細胞に栄養を与えてその生物活性を持続させるための培地を含む。ＥＣＭリガンド物質は、支持体材料に結合すると、同じタイプの体内幹細胞の生物学的微細環境における主な体内材料の弾性と同じような弾性を有する。この系の実施形態は、本明細書に記載の本発明の方法によって休眠状態が誘導され、どのような細胞型でも休眠状態を誘導できるものであってもよい。たとえば、系の実施形態は、体性幹細胞または胚性幹細胞、ヒト幹細胞または動物幹細胞、間葉系体性幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄由来ＭＳＣ、腎幹細胞、肝由来幹細胞、骨格筋由来ＭＳＣ、骨由来ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、心筋由来ＭＳＣ、滑液由来ＭＳＣまたは臍帯ＭＳＣで休眠状態を誘導できるものであってもよい。

実施形態では、ＥＣＭリガンド物質が支持体に結合して幹細胞と接触すると、本明細書において詳細に説明するように、幹細胞が休眠状態に入るよう誘導する方法でＥＣＭ材料が幹細胞表面のインテグリンと結合する。

本発明のこのような系の実施形態では、ＥＣＭリガンド材料を支持体材料と結合させる結合材料があってもよい。たとえば、支持体材料がポリアクリルアミドゲルを含み、ＥＣＭがコラーゲン−フィブロネクチン混合物を含む場合、結合材料は、具体的にはアクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含むＮＨＳであってもよい。支持体材料および細胞外物質の性質に応じて、当業者であれば結合材料を容易に確定できるであろう。これは本発明の系のさまざまな実施形態で支持体材料とＥＣＭとを結合させるのに用いられる架橋剤として特徴付けられるものであってもよい。

本発明の実施形態では、ＥＣＭリガンド層を支持体に結合すると、ＥＣＭリガンド層は、ＥＣＭリガンド層と接触している幹細胞と同じタイプの体内幹細胞の生物学的微細環境における主な物質の弾性と実質的に類似の幹細胞にとって明らかな弾性を有する。ＥＣＭリガンド層のこの明らかな弾性は、支持体の弾性とは独立したものであってもよいし、ほぼ独立したものであっても、支持体の弾性に左右されるものであってもよい。実施形態では、支持体の弾性が、ＥＣＭリガンド層に接触している幹細胞と同じタイプの体内幹細胞の生物学的微細環境における主な物質の弾性と実質的に類似であり、ＥＣＭリガンド層によって、幹細胞は、自らが結合する支持体の弾性と実質的に同じ弾性を得られる。

本発明の人工系は、多岐にわたる構造を用いて実現できるものである。実施形態では、支持体材料がマトリックスを形成し、ＥＣＭがマトリックスに分散される。実施形態では、支持体マトリックスの材料をＥＣＭと結合するための結合材料も支持体マトリックスに分散できるものである。たとえば、一実施形態によれば、ラット尾由来のコラーゲン（０．５ｍｇ／ｍｌ）とヒト由来のフィブロネクチン（０．１ｍｇ／ｍｌ）との５：１混合物ならびに、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）架橋剤を、ポリアクリルアミドゲルに分散させる。ゲルについては、構造の弾性が約２５０Ｐａになるように配合する。骨髄由来ＭＳＣをポリアクリルアミド−ＮＨＳ−フィブロネクチン−コラーゲン構造と接触させると、これらの細胞は休眠状態に入るよう誘導される。構造と接触しているＭＳＣに好適な栄養物質が供給されると、休眠期におけるその生物活性が維持される。

実施形態では、支持体材料が層を形成し、ＥＣＭが支持体層と直接または間接的に結合される層を形成する。他の実施形態では、結合材料が、ＥＣＭリガンド層と支持体層とを結合させる結合層を形成する。結合層は、支持体の弾性をＥＣＭリガンド層に、ＥＣＭリガンド層がその弾性を休眠状態が誘導される幹細胞に提示できるような方法で提示する機能を果たすものであってもよい。一実施形態では、結合層が、これらの機能を果たす適切な架橋用組成物ならびに他の材料を含む。たとえば、カップリング層が、ＮＨＳを含むものであってもよく、特定の実施形態では、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含むものであってもよい。

実施形態では、支持体材料がポリアクリルアミドゲルである。当該技術分野において周知のように、ゲル中のアクリルアミドおよびビスアクリルアミドの濃度を変えることで、ポリアクリルアミドゲルの弾性を調節してもよい。本発明の系で用いられるポリアクリルアミドまたは他のゲルまたは支持体材料をどのように生成するかについては、本明細書を踏まえたうえで当業者には自明であろう。

本明細書を踏まえたうえでいずれ分かるように、実施形態では他の構造を利用してもよい。たとえば、上述したようなＥＣＭ層に幹細胞を播種し、細胞を含む系を培地に沈めることでこの細胞をＥＣＭ層に定着させ、実施例１でさらに説明するような適切な明らかな弾性を有する別のＥＣＭ層を細胞の上に載せることで、準３Ｄ構造を作製してもよい。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物の利点に、マトリックスまたはゲルのタンパク質分解に対する耐性がある。別の実施形態では、細胞による活発な再構築に対する耐性が利点である。別の実施形態では、哺乳類（ヒトまたはウシなど）のフィブリンと比較して、哺乳類のニューロンによって分泌されるプロテアーゼに対する変温動物（サケなど）のフィブリンの耐性が利点である。別の実施形態では、哺乳類（ヒトまたはウシなど）のフィブリンと比較して、変温動物（サケなど）のフィブリンからの感染症の出現率が低いという利点がある。各々の可能性が、本発明による別の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物の標的細胞が不死化したＭＳＣである。

別の実施形態では、不死化したＭＳＣを本発明のゲルまたはマトリックスで培養することで、不死化したＭＳＣの成長停止を誘導する工程を含む、不死化ＭＳＣの成長停止を誘導する方法が得られる。別の実施形態では、不死化したＭＳＣを本発明のゲルまたはマトリックスで培養することで、不死化したＭＳＣ集団の成長を阻害する工程を含む、不死化したＭＳＣ集団の成長を阻害する方法が得られる。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物の標的細胞が形質転換細胞である。別の実施形態では、形質転換細胞が黒色腫細胞である。別の実施形態では、形質転換細胞が、当該技術分野において周知の他の任意のタイプの形質転換細胞である。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

本明細書で提供する場合、Ｍ２細胞は、硬い支持体ほど大きなサイズと大きめの細胞集団を呈する。別の実施形態では、細胞集団の増加が、硬い支持体での細胞成長が増加した結果である。別の実施形態では、集団の増加が、柔らかい支持体での細胞死が増加したことによるものである。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、形質転換細胞を本発明のゲルまたはマトリックスで培養することで、形質転換細胞の成長停止を誘導する工程を含む、形質転換細胞の成長停止を誘導する方法が得られる。別の実施形態では、形質転換細胞を本発明のゲルまたはマトリックスで培養することで、形質転換細胞集団の成長を阻害する工程を含む、形質転換細胞集団の成長を阻害する方法が得られる。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物の柔らかい支持体が、標的細胞におけるＧＴＰタンパク質の不活性ＧＤＰ結合形態の増加につながる。別の実施形態では、ＧＴＰタンパク質がＲｈｏである。別の実施形態では、ＧＴＰタンパク質がＲａｃである。別の実施形態では、ＧＴＰタンパク質がＣｄｃ４２である。別の実施形態では、ＧＴＰタンパク質が、当該技術分野において周知の他の任意のＧＴＰタンパク質である。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、Ｒｈｏファミリメンバが、接着斑の形成によってシグナルを伝達する。別の実施形態では、Ｒｈｏの活性化がｐ２１^{ＷＡＦ１／ｃｌｐ１}の発現を阻害する。別の実施形態では、ｐ２１の阻害がサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）を活性化する。別の実施形態では、Ｒｈｏの活性化が、別のＣＤＫ阻害剤であるｐ２７^Ｋｌｐ１の発現抑制と分解を誘導する。別の実施形態では、Ｒｈｏの活性化がＲＯＣＫを誘導し、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路が活性化される。別の実施形態では、この経路が、ＲａｓによるサイクリンＤ１転写を誘導する。別の実施形態では、これが、Ｇ１期の進行を誘導する。一緒に、Ｒｈｏの活性化もＧ１期の進行につながることが分かった。別の実施形態では、ＲａｃまたはＣｄｃ４２の活性化がサイクリンＥｌおよびサイクリンＤｌを発現促進し、Ｇ１期の進行につながる。別の実施形態では、Ｒｈｏファミリの低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化が、細胞周期の進行を促進するシグナル形質導入につながる。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明の方法および本発明の組成物の柔らかい支持体が、標的細胞のアクトミオシン系の収縮性を減少させる。別の実施形態では、これは、標的細胞を誘導して増殖を中止させる。別の実施形態では、これは、増殖を再開するためのさらなる刺激に適するものになるよう標的細胞を誘導する。別の実施形態では、これは、最終分化を開始するためのさらなる刺激に適するものになるよう標的細胞を誘導する。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法および組成物の柔らかい支持体がアクトミオシンの活性化を誘導する。別の実施形態では、柔らかい支持体が、Ｒｈｏによって調節されるアクトミオシンを誘導する。別の実施形態では、柔らかい支持体がミオシンＩＩを誘導する。別の実施形態では、柔らかい支持体が、Ｒｈｏによって調節されるミオシンＩＩを誘導する。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本発明による方法の組成物および組成物が、Ｒｈｏファミリメンバの活性化因子をさらに含む。別の実施形態では、組成物が、Ｒｈｏファミリメンバの阻害剤をさらに含む。別の実施形態では、ＲｈｏファミリメンバがＲｈｏである。別の実施形態では、ＲｈｏファミリメンバがＲａｃである。別の実施形態では、ＲｈｏファミリメンバがＣｄｃ４２である。別の実施形態では、Ｒｈｏファミリメンバが当該技術分野において周知の他の任意のＲｈｏファミリメンバである。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。別の実施形態では、組成物がアクトミオシンの活性化因子をさらに含む。別の実施形態では、組成物がアクトミオシンの阻害剤をさらに含む。別の実施形態では、組成物がミオシンＩＩの活性化因子をさらに含む。別の実施形態では、組成物がミオシンＩＩの阻害剤をさらに含む。各々の可能性が、本発明による別個の実施形態を表す。

アクリルアミドゲルを重合するための方法が、当該技術分野において周知である。別の実施形態では、ＴＥＭＥＤ（FisherBiotech CAS Ｎｏ．１１０１８９）１．５μｌと１０％過硫酸アンモニウム５μｌを、適量のＨ_２Ｏと一緒に加えて最終容量を１，０００μｌにし、この溶液をピペットでカバーガラスに滴下し、上側のカバーガラスを溶液の上に載せ、続いて１０分後に剥がす。各々の方法が、本発明による別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、接着タンパク質をゲルまたはマトリックスに架橋させるために、ヘテロ二官能性架橋剤を利用する。別の実施形態では、ヘテロ二官能性架橋剤がスルホ−ＳＡＮＰＡＨ（スルホスクシンイミジル６（４’−アジド−２’−ニトロフェニル−アミノ）ヘキサノエート、Pierce Ｎｏ．２２５８９）である。別の実施形態では、ヘテロ二官能性架橋剤が、当該技術分野において周知の他の任意のヘテロ二官能性架橋剤である。別の実施形態では、スルホ−ＳＡＮＰＡＨを以下のように使用する。１ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＳＡＮＰＡＨをＨ_２Ｏに溶解し、この溶液２００μｌをピペットでゲル表面に滴下する。続いて、ポリアクリルアミドゲルを紫外線ランプの６インチ下に配置し、１０分間照射する。次に、これを２００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．６）３ｍＬずつで３回洗浄する。最後のＨＥＰＥＳ溶液を吸引した後、０．１４ｍｇ／ｍｌの魚フィブロネクチン溶液（Sea Run Holdings, South Freeport, ME）または０．１４ｍｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンを２００μｌピペットでポリアクリルアミドゲルの上に滴下する。次に、ゲルを入れたマルチウェルプレートを５℃で４時間インキュベートする。各々の方法が、本発明による別個の実施形態を表す。

本発明の別の態様では、上述したような系をアセンブルするあるいは、本発明の方法を実施するために、構成要素のキットを提供してもよい。一実施形態では、このようなキットは、別々の構成要素として、（１）支持体または支持体を作製するための材料と、（２）任意選択により、カップリング層を形成および／または適用するための材料と、（３）ＥＣＭリガンド材料を生成および／または適用してＥＣＭリガンド層を形成するための材料とを含む。支持体の構成要素は、たとえば、所定の弾性のポリアクリルアミドゲル、ゲルの弾性を所定の弾性または弾性の範囲に調節するための材料を含むポリアクリルアミドゲル、あるいは所望の弾性を有するゲルまたは他の好適な支持体を作製するための材料を含むものであってもよい。実施形態では、キットは、ＥＣＭリガンド層と、任意選択により支持体をＥＣＭリガンド層に結合するためのカップリング層の適用を容易にする目的で、ゲルを実装または保持するための装置を含む。当業者であれば本明細書を踏まえたうえで明らかなように、保管、輸送およびアセンブリを容易にする目的で、本発明のキットのさまざまな構成要素を組み合わせてもよい。

また、このようなキットの実施形態は、ＥＣＭリガンド層を形成および／または適用するための材料を含むものであってもよい。たとえば、キットは、支持体への直接塗布用のＥＣＭリガンド材料を含むものであってもよい。他の実施形態では、キットは、ＥＣＭリガンド層の材料の個々の構成要素または成分を、これを形成してキットの他の構成要素に適用するための指示と一緒に含むものであってもよい。任意選択により、キットは、ＥＣＭリガンド層に支持体を結合するためのカップリング層をアセンブルして適用するための材料および指示を含むものであってもよい。特定の実施形態では、ヒト骨髄由来ＭＳＣで休眠状態を誘導するための本発明による系のキットは、
（ａ）ガラス製ペトリ皿（または支持体を支えて残りの構成要素を保持するための他の装置）と、
（ｂ）適量のアクリルアミドおよびビスアクリルアミドをはじめとして、支持体として機能する硬度約２５０Ｐａのポリアクリルアミドゲルを形成するための材料と、
（ｃ）カップリング層を形成する目的でゲルに適用するための（ｃ）アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）架橋剤と、
（ｄ）１：５フィブロネクチン−コラーゲン細胞外物質を生成するための実施例１で特定する材料をはじめとして、ＥＣＭリガンド層を形成するための材料と、を含む。

実施形態では、本発明のキットは、指定タイプの幹細胞に休眠状態を誘導するための弾性を持たせて配合されたポリアクリルアミドゲルと、ゲルへの適用向けに架橋用組成物を含む溶液と、指定タイプの細胞の表面におけるインテグリンと結合するよう配合された細胞外物質と、任意選択により、細胞を休眠状態に誘導するのに好適な栄養物質（利用者が調製してもよい）と、を含む。

キットのいくつかの実施形態では、キットは、弾性とＥＣＭリガンドの両方を提供する材料からなる１つの層を含む。別の実施形態では、キットは、以下の材料からなる３つの層を含むものであってもよい。
ａ）系に弾性を与えるゲル支持体、
ｂ）ＥＣＭリガンド、
ｃ）ＥＣＭリガンドを支持体に結合するための架橋剤。

本発明のキットの実施形態では、キットの構成要素を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の入った袋またはプラスチックパッケージなどの容器に入れる。いくつかの実施形態では、容器には、アジ化ナトリウムなどの保存剤も含むようにしてもよい。保管時などに構成要素をキット内で水和させておいてもよい。いくつかの実施形態では、容器を適当なスキャフォルド（scaffold）で密封および／または保護し、系の損傷を回避する。キットを約２℃から約８℃などの低温で輸送してもよい。

本発明によるキットの実施形態では、利用者は容器を開いてキットの構成要素を組織培養プレートなどの適当な物質に載せることができる。また、利用者は、構成要素の上にある硬質の材料を除去してＥＣＭリガンドを曝露し、ＰＢＳなどの緩衝液で構成要素を洗浄することができる。これによって利用者は、細胞と、培地と、必要に応じて血清とを含む細胞懸濁液を用いて、系に細胞を播種することができる。

本発明の系および方法は、体内ならびに体外で実施できるものである。このような系は、たとえば、幹細胞を体内で休眠状態に維持するための特定の組織または循環系への挿入用の多孔性構造を含むものであってもよい。たとえば、幹細胞、対応するＥＣＭならびに任意選択により結合材料を、休眠状態を誘導または維持するために幹細胞にとっての適当な弾性を有し、かつ、体内での栄養が細胞に達することができ、細胞によって発現されるタンパク質および他の因子がマトリックスに残れるようにするだけの十分な多孔性を有するポリマーマトリックスに分散させてもよい。他の実施形態は、幹細胞の休眠状態を誘導または維持し、宿主に移植できるカセットまたは他の装置を含むものであってもよい。

本発明の別の態様は、体外で生物活性が持続させた休眠状態の幹細胞を包含する。このような幹細胞の例として、体性幹細胞または胚性幹細胞、ヒト幹細胞または動物幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄由来ＭＳＣ、腎幹細胞、肝由来幹細胞、骨格筋由来ＭＳＣ、骨由来ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、心筋由来ＭＳＣ、滑液由来ＭＳＣまたは臍帯ＭＳＣがあげられる。実施形態では、本発明の系または方法を用いて、幹細胞を休眠期に誘導または維持し、このような休眠状態の幹細胞の生物活性を持続させる。

したがって、一実施形態では、剛性が１５０〜７５０Ｐａの範囲にあるゲルマトリックスと、脂肪細胞誘導培地と、を含み、前記ゲルまたはマトリックスが、１型コラーゲン、フィブロネクチンまたはこれらの組み合わせでコーティングされる、間葉系幹細胞の成長を調節するための装置が得られる。

他の実施形態では、上述したいずれかの方法のゲルおよびマトリックスは、本発明の組成物のゲルまたはマトリックスの特徴のいずれかを有する。各々の特徴が、本発明による別個の実施形態を表す。

実験の詳細について
実施例１：さまざまな組織の剛性の測定と、組織の剛性に近いポリアクリルアミドゲルの調製
材料および実験方法
ポリアクリルアミドゲルの調製
硬さを変化させるために、ポリマー質量を一定の７．５％とし、ビスアクリルアミド濃度を０．０１％、０．０３％または０．３％に変化させて、アクリルアミドおよびビスアクリルアミド（Fisher Biotech, Loughborough, Leicestershire, UK）溶液を調製した。０．５％アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Sigma, St. Louis, MS）を含有するトルエンの非水性層下のアクリルアミド、ビスアクリルアミド、過硫酸アンモニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を、以下のようにして化学修飾した２枚のカバーガラス間で重合した：０．１ＮのＮａＯＨを２００μｌのピペットで滴下し、直径２５ｍｍのガラス製カバーガラス（Fisherbrandカタログ番号１２−５４５−１０２；Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）の表面を５分間覆った。ＮａＯＨ溶液を吸引し、３−ＡＰＴＭＳ（３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Sigma社のＮｏ．28-1778、Sigma, St. Louis, MO）２００μｌを３分間適用した。このガラス製カバーガラスを脱イオン水で十分にすすいで残っている３−ＡＰＴＭＳ溶液を洗い流し、０．５％ｖグルタルアルデヒド（Sigma社のＮｏ．G7651）水溶液２００μｌを２０分間カバーガラスに加えた。このガラス製カバーガラスを水ですすぎ、直径１８ｍｍのガラス製カバーガラスを組織培養皿内のパラフィルムの上に載せ、１０容量％のSurfasilをクロロホルムに入れた溶液（Pierce社のＮｏ．42800、Pierce, Rockford, IL）数滴をカバーガラスのそばでパラフィルムにピペットで滴下した。蓋を半分閉じた組織培養皿を減圧デシケーター内に１０分間おいた。

ゲルの表面で取り込まれたＮ−スクシンイミジルアクリレートを０．２ｍｇ／ｍｌのラミニン（Collaborative Biomedical, Bedford, MA）と反応させ、接着リガンドの均一なコーティングを生成した。ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄して微量の未重合溶媒を除去した後、ポリアクリルアミド（ＰＡ）ゲルの入ったウェルを培養液で満たし、３７℃で一晩平衡させた。

材料スキャフォルドの粘弾性の特性決定
ひずみ制御型rheometrics fluids spectrometer III（Rheometrics, Piscataway, NJ）でゲルの動的剛性率を測定した。２枚の鋼板の間で５００μＬの試料を重合し、振動（１ｒａｄ／ｓ）剪断ひずみ２％で、同位相の剪断応力から弾性抵抗を表す値である剛性率Ｇ’（ω）を計算で求めた。組織の動的剛性率についても同様にして測定した。ステンレスパンチを使用して、直径８ｍｍの試料を切り出し、プレート間に配置した。ひずみ２％で振動させて短期Ｇ’（ω）を測定した。また、定常ひずみ１０％を適用し、試料を３０秒間弛緩させて、長期剛性率Ｇ（ｔ）を測定した。

結果
ポリアクリルアミドゲルを調製し、Ｉ型コラーゲン０．１４ｍｇ／ｍｌと魚のフィブロネクチン０．１４ｍｇ／ｍｌの混合物をコーティングした。アクリルアミドとビスアクリルアミドの濃度を調節して、広範囲にわたる剛性を達成した（図１Ａ）。ポリアクリルアミドゲルの剛性は、ゲル上の細胞外マトリックスの量と分布には影響しない。ｉｎ ｖｉｔｒｏ流量計も使用して、間葉系幹細胞と関連のある組織の弾性特性を判断した（表１）。Ｇ’が２００Ｐａ（本明細書では「柔らかいゲル」の一例として使用し、そのように称する）または７５００Ｐａ（本明細書では「硬いゲル」の一例として使用し、そのように称する）のポリアクリルアミドゲルを調製した。柔らかいゲルは、骨髄と脂肪組織の剛性を模している。

このようにして、生体組織の剛性を模すポリアクリルアミドゲルを調製した。

実施例２：柔らかいゲルおよび硬いゲル上でのｈＭＳＣの細胞の形状とＦ−アクチン構造
材料および実験方法
コラーゲン１型およびフィブロネクチンでコーティングした硬いゲルまたは柔らかいゲルのいずれかに、ｈＭＳＣを低密度で播種した。細胞をＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清中にて２４時間インキュベートし、固定し、Alexa Fluor 488ファロイジンで染色した。

結果
細胞外マトリックスの剛性がｈＭＳＣ（ヒト間葉系幹細胞）の形状とＦ−アクチン構造におよぼす影響を調査した。さまざまな剛性のマトリックス上にて血清の存在下で細胞を２４時間インキュベートし、接着および拡散できるようにした。硬いゲルまたはガラスに播種したｈＭＳＣは、（Alexa Fluor 488ファロイジン染色で示されるように）紡錘形になり、ストレスファイバと皮質のＦ−アクチンが認められたのに対し、柔らかいゲルに播種した細胞は見た目が丸く、ストレスファイバは存在せず、Ｆ−アクチン凝集体（図１Ｂ〜図１Ｃ）が含まれていた。

このように、ｈＭＳＣは、その形状とＦ−アクチン構造に影響する細胞外マトリックスの剛性を検知する。

実施例３：柔らかいゲルでのｈＭＳＣ増殖の阻害
材料および実験方法
ｈＭＳＣをＢｒｄＵ（Invitrogen, Carlsbad, CA）と一緒に血清の存在下にて一晩インキュベートした。細胞を固定し、ＢｒｄＵ（Invitrogen）で免疫染色した。無作為に選択した視野において５０個を超える細胞を３回カウントした。

結果
細胞周期の進行を示すマーカーとして、ｈＭＳＣでの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン５’−トリホスフェート（ＢｒｄＵ）取り込みを測定した（図２）。柔らかいゲル、硬いゲルまたはガラスの表面（本発明者らは、そのすべての表面にコラーゲン１型およびフィブロネクチンをコーティングした）に、細胞を低密度で播種した。対照として、ガラス表面の集密細胞も調製した。予想どおり、ガラス表面に低密度で播種したｈＭＳＣがＢｒｄＵを効率よく取り込んだことから、増殖レベルが高いことが分かる。ガラス表面で細胞が集密していた場合は、接触阻害が原因で極めてわずかなｈＭＳＣしかＢｒｄＵを取り込まなかった。硬いゲル上ではｈＭＳＣの４２％がＢｒｄＵを取り込んだことから、大きな細胞集団が増殖していることが分かるが、これはガラス表面に低密度で播種した細胞と比較すると有意に低かった。一方、柔らかいゲル上では、トリパンブルー染色が認められないことから評価して細胞が生存可能であったにもかかわらず、ｈＭＳＣによるＢｒｄＵの取り込みはなされなかった。さらに、マトリックス上に低密度で播種したｈＭＳＣのインキュベーションを継続すると、マトリックスの剛性に応じて異なる細胞密度が得られ、より硬いマトリックス上でより高い細胞密度が得られた。

このように、柔らかいマトリックスは、血清の存在下であってもｈＭＳＣの増殖を阻害する。

実施例４：柔らかいゲル上のｈＭＳＣには脂肪細胞に分化できる能力がある
材料および実験方法
脂肪細胞の分化研究
コラーゲン１型＋フィブロネクチンをコーティングした９６ウェルの組織培養プレートに、３．５×１０^４個／ウェルの密度で、細胞懸濁液からのｈＭＳＣを播種した。１０％ＦＣＳ（成長培地、「ＧＭ」）を含有するＤＭＥＭ中にて細胞を２４時間インキュベートした後、Adipogenic Induction Medium（ＡＩＭ）（ＧＭ、デキサメタソン１μＭ、インドメタシン２００μＭ、インスリン１０μｇ／ｍｌ、メチルイソブチルキサンチン０．５ｍＭ）で３日間（3 for days）（２細胞周期）インキュベートし、続いてAdipogenic Maintenance Medium（ＧＭ、１０μｇ／ｍｌのインスリン）に維持して、この細胞から脂肪細胞への分化を誘導した。ＡＩＭに切り替えた８日後、オイルレッドＯ染色（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）または抗ＰＰＡＲγ２抗体を用いるＰＰＡＲγ２での免疫染色のいずれかによって、脂肪細胞分化を評価した。無作為に選択した視野で５０個を超える細胞を３回カウントした。抗ＰＰＡＲｙ２抗体については、Dr. Mitchell A. Lazar, University of Pennsylvaniaから提供を受けた。

結果
柔らかいゲルでのｈＭＳＣの生存度を確認するために、これらの細胞が脂肪細胞に分化する能力を、（ａ）脂肪生成の重要な転写因子の１つであるペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ２（ＰＰＡＲγ２）の免疫染色、（ｂ）脂質の蓄積を測定するためのオイルレッドＯ染色という２通りの方法で測定した。ウシ胎仔血清含有培地にてデキサメタソン、インドメタシン、３−イソブチル−１−メチル−キサンチン、インスリンの混合物によって、ガラス表面の集密なｈＭＳＣの脂肪細胞への分化を誘導すると、４０％前後の細胞で脂肪細胞の表現型（図３Ａ）が認められた。対照的に、柔らかいゲルでは、誘導ありの場合に分化率が８０％を超え、ガラスでの場合よりも有意に高かったが、誘導なしでは脂肪細胞分化が観察されなかった。さらに、ガラスに低密度で播種したｈＭＳＣでは高レベルの増殖が認められ（図２）、脂肪細胞には分化しなかった（図３Ｂ）。これらの結果は、ｈＭＳＣが最終分化の要件として細胞周期から逸脱する必要があろうことをさらに示すものである。

このように、柔らかいゲルに低密度で播種したｈＭＳＣは十分に生存可能であり、脂肪細胞分化に適している。

実施例５：硬いゲルまたは柔らかいゲルのいずれかに播種したアストロサイトのＦ−アクチン構造
マトリックスの剛性に対する細胞の応答をさらに特徴付けて定量化するために、細胞外マトリックスの硬さがＦ−アクチン構造に対しておよぼす影響をアストロサイトでも試験した。Sprague-Dawleyラット胚から、以下のようにして初代アストロサイトを単離した。時期調節して妊娠させた（timed-pregnant）Sprague-Dawleyラットから帝王切開で胚（Ｅ１７〜Ｅ１９）を取り出し、皮質を除去した。組織をトリプシン／ＤＮａｓｅ中にて３７℃で消化し、遠心処理（１０００ｇ×５分間）し、濾過して細胞懸濁液を得た。ニューロンとグリア細胞の両方を含む培養では、細胞を支持体に直接載せた。頻回トリプシン処理する培養下で初代アストロサイト培養を１４日間維持し、ニューロンを除去した。実験に用いた培養は、ＧＦＡＰ免疫細胞化学で求めた場合のアストロサイトが９８％を超えていた。Ham’s F12（Sigma）および５％ウシ胎仔血清（Hyclone, Logan, UT）を加えたダルベッコ変法イーグル培地（BioWhittaker, East Rutherford, NJ）にて、３７℃で５％ＣＯ_２のインキュベーターで細胞を７日間成長させた後、同じく５％ウシ胎仔血清、ｌ−グルタミン２ｍＭ、ストレプトマイシン５０ｍｃｇ／ｍＬ、ペニシリン５０単位／ｍＬを加えたNeurobasal（Gibco, Carlsbad, CA）でさらに５日間培養した。

硬い（１１ｋＰａ）または柔らかい（１５０Ｐａ）ポリアクリルアミドゲル上にて血清の存在下で細胞を４８時間インキュベートし、接着および拡散できるようにした。細胞を固定し、Ｆ−アクチン構造をファロイジンで可視化した。図４に示されるように、硬いゲルに載せたアストロサイトでストレスファイバと皮質のＦ−アクチンが観察された。対照的に、柔らかいゲルに載せたアストロサイトでは、ストレスファイバは存在せず、皮質のアクチンシェルだけが観察された。このように、柔らかいゲル上のアストロサイトはマトリックスの可撓性を検知し、結果としてストレスファイバを呈さなかった。

実施例６：柔らかいゲル上のアストロサイトにおける低レベルのＲＨＯ ＧＴＰ装填
材料および実験方法
Rhotekinプルダウンアッセイ
細胞を氷冷Tris緩衝生理食塩水で洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのTris、ｐＨ７．２、１％Triton X-100、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、各１０μｇ／ｍｌのロイペプチンおよびアプロチニン、１ｍＭのＰＭＳＦ）に溶解した。細胞可溶化物を４℃で１０分間１３０００×ｇで遠心処理して清澄化し、同容量の可溶化物をＧＳＴ−ＲＢＤ（２０μｇ）ビーズと一緒に４℃で４５分間インキュベートした。ビーズを緩衝液Ｂ（１％Triton X-100、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、各１０μｇ／ｍｌのロイペプチンおよびアプロチニン、０．１ｍＭのＰＭＳＦを含有するTris緩衝液）で４回洗浄した。結合したＲｈｏタンパク質を、ＲｈｏＡに対するモノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology）を用いるウェスタンブロットで検出した。AlphaImager（商標）システム（Alpha Innotech）を用いてデンシトメトリー分析を実施した。異なる試料のＲｈｏ活性（ＧＴＰ結合Ｒｈｏの濃度）を比較できるよう、ＲＢＤ結合Ｒｈｏの量を細胞可溶化物中のＲｈｏの総量で正規化した。

結果
アストロサイトにおける柔らかいゲルで誘導したストレスファイバの喪失がＲｈｏの失活と関連するのか否かを判断するために、さまざまな剛性のポリアクリルアミドゲルにアストロサイトを播種し、血清の存在下で４８時間インキュベートした。細胞可溶化物を調製し、精製GST-RhotekinおよびRhotekinプルダウンアッセイを用いてＲｈｏのＧＴＰ装填をアッセイした。ＧＴＰ結合ｖｓ．総Ｒｈｏの比を計算した。柔らかいゲル上のアストロサイトではＧＴＰ結合Ｒｈｏが低レベルであった（図５）ことから、柔らかいマトリックスでアストロサイトのＲｈｏ活性が減弱することで、この細胞でのストレスファイバの欠如につながることが分かる。

実施例７：黒色腫細胞は細胞外マトリックスの剛性に基づいて拡散を調節する
材料および実験方法
コラーゲン１型とフィブロネクチンの混合物でコーティングしたさまざまな剛性のマトリックスに、Ｍ２細胞を低密度で播種した。２４時間のインキュベーション後、細胞の境界を追跡して細胞面積を測定した。無作為に選択した視野で３０個を超える細胞を３回カウントした。

結果
形質転換細胞が細胞外マトリックスの剛性の度合いに応じて自己の挙動を調節するのか否かを試験するために、Ｍ２細胞と呼ばれるヒト黒色腫細胞系で、剛性が細胞拡散に対しておよぼす影響を測定した。図６に示されるように、Ｍ２細胞は硬い支持体ほど大きなサイズになった。このように、形質転換Ｍ２細胞には、マトリックスの機械的特性に応じて自己の挙動（細胞拡散など）を調節する能力がある。

実施例８：柔らかいゲルでの黒色腫細胞の減量
マトリックスの剛性がＭ２細胞集団のサイズに対しておよぼす影響を判断するために、柔らかいゲルまたは硬いゲルにＭ２細胞を播種（各々同数）し、１型コラーゲンとフィブロネクチンの混合物でコーティングした。血清の存在下で２４時間のインキュベーション後、両方のゲルでＭ２細胞が完全に接着および拡散した時点で、各々の支持体に対する細胞接着効率を評価した。図７に示されるように、柔らかいゲルと硬いゲルとで接着細胞数に有意な差はなかったことから、マトリックスの剛性はＭ２細胞の接着に影響しないことが分かる。７２時間のインキュベーション後、同数の細胞が各々の支持体に接着した（図７）が、インキュベーションが４８時間延びたことで、硬いゲルに有意に大きな細胞集団が生じた（図８）。７２時間のインキュベーション後、柔らかいゲルと硬いゲルとの間で培地に浮遊している細胞の数に顕著な差は認められなかった。

これらの結果は、柔らかい支持体に対するｈＭＳＣの応答を定量化する方法をさらに実証するものである。

実施例９：生存度と自己複製を減弱させることなくｈＭＳＣを長期にわたって保つ目的での柔らかいゲルの使用
材料および実験方法
１型コラーゲンとフィブロネクチンの混合物でコーティングした、Ｇ’が２００Ｐａ前後の柔らかいポリアクリルアミドゲルを、実施例１で説明したようにしてカバーガラスで調製した。ポリアクリルアミドゲルまたはガラス製カバーガラスの外での細胞接着を防止するために１％アガロースゲルで覆った６ウェルのプレートに、ポリアクリルアミドゲルを入れる。５×１０^４ 個の２継代目のｈＭＳＣを、柔らかいポリアクリルアミドゲルに播種するか、１型コラーゲン＋フィブロネクチンでコーティングした６ウェルの組織培養プレートに直接播種し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）加ＤＭＥＭにてインキュベートする。同じｈＭＳＣ試料を、１０％ＦＣＳと１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するＤＭＥＭに懸濁させ、従来のプロトコールに従って液体窒素蒸気下で凍結状態に保った（Gordon SL et al, Cryobiology. 2001 Sep;43(2):182-7）。集密度９０％に達した後、組織培養プレートに直接蒔いた細胞をトリプシン処理し、新しい６ウェルの組織培養プレートにて細胞５×１０^４個／ウェルの密度で継代培養する。組織培養プレートの細胞が１０継代に達するまで、これらの細胞を維持する。柔らかいポリアクリルアミドゲルに蒔いた細胞に、７日間で２回、１０％ＦＣＳを加えた新鮮なＤＭＥＭを供給しなおす。組織培養プレートに維持したｈＭＳＣが１０継代に達したら、液体窒素蒸気中で保存したｈＭＳＣを解凍して、細胞懸濁液を生成する。

結果
柔らかいゲルにて休眠期での長期保存対象としたｈＭＳＣの生存度を判断するために、組織培養プレートに維持したｈＭＳＣが１０継代に達するまで、ｈＭＳＣを柔らかいゲルで保存する。これらの細胞の生存度を液体窒素蒸気中で保存した細胞と比較する。柔らかいゲルまたは組織培養プレートのいずれかに接着した細胞をトリプシン処理する一方、液体窒素中で保存した細胞を解凍して、細胞懸濁液を生成する。細胞懸濁液のトリパンブルー染色によって生存度を判断する。このように、柔らかいゲルでの保存は、ｈＭＳＣの生存度を維持する効果的な手段なのである。

柔らかいゲルでのｈＭＳＣ保存長期インキュベーションの増殖能を測定するために、柔らかいゲルに維持した細胞、組織培養プレートに維持した細胞または液体窒素蒸気中で凍結状態に維持した細胞を調製し、１型コラーゲン＋フィブロネクチンでコーティングした組織培養プレートに各ソースの細胞を蒔きなおし、血清およびＢｒｄＵの存在下で１２時間インキュベートして、ＢｒｄＵ取り込みアッセイを実施する。細胞を固定し、細胞を抗ＢｒｄＵ抗体（Invitrogen）と一緒にインキュベートすることによってＢｒｄＵで免疫染色する。

実施例１０：分化を減弱させることなくｈＭＳＣを長期にわたって保つ目的での柔らかいゲルの使用
材料および実験方法
骨芽細胞分化アッセイ
コラーゲン１型＋フィブロネクチンでコーティングした９６ウェルの組織培養プレートに、１０継代のｈＭＳＣ懸濁液を細胞１０^３個／ウェルの密度で播種する。細胞をＧＭにて２４時間インキュベートした後、培地を骨形成誘導培地（ＯＩＭ）（ＧＭ、アスコルビン酸−２−ホスフェート５０μＭ、ｐ−グリセロリン酸塩１０ｍＭ、デキサメタソン１００ｎＭ）に切り替え、３週間にわたって３日ごとに培地を交換することで、細胞の骨芽細胞への分化を誘導する。アセトン／クエン酸塩で細胞を固定し、Fast Blue RR／ナフトール（Sigma-Aldorich、キット番号８５）でアルカリホスファターゼ活性染色して、骨芽細胞分化を評価する。

結果
次に、柔らかいゲルにて休眠期での長期保存対象としたｈＭＳＣの分化能を測定する。柔らかいゲルまたは組織培養プレートで保存したｈＭＳＣをトリプシン処理し、生成（generated）懸濁液を生成する。これと平行して、液体窒素中で保持したｈＭＳＣを解凍することで、細胞懸濁液を調製する。実施例４で説明したようにして、脂肪細胞分化を評価する。

付随研究で、事前に組織培養皿に蒔いてトリプシン処理することなく、柔らかいゲルで直接ｈＭＳＣをインキュベートした後、脂肪細胞の生成を測定する。

付随研究で、柔らかいゲル、組織培養プレートまたは凍結保存したものから調製した細胞懸濁液で、破骨細胞の生成を測定する。

付随研究で、事前に組織培養皿に蒔いてトリプシン処理することなく、柔らかいゲルで直接ｈＭＳＣをインキュベートした後、破骨細胞の生成を測定する。

実施例１１：マトリックス剛性による幹細胞成長の調節へのＲｈｏファミリ低分子量ＧＴＰ結合タンパク質およびアクトミオシン系の関与
材料および実験方法
Ｒｈｏファミリアッセイ
Ｇ’が２００Ｐａ前後のポリアクリルアミドゲル（柔らかいゲル）とＧ’が７５００Ｐａ前後のポリアクリルアミドゲル（硬いゲル）をカバーガラスで調製し、このゲルとカバーガラスを１型コラーゲンとフィブロネクチンの混合物でコーティングする。ポリアクリルアミドゲルまたはカバーガラスの外での細胞接着を防止するために１％アガロースゲルで覆った６ウェルのプレートに、ポリアクリルアミドゲルまたはカバーガラスを入れる。５×１０^４個のｈＭＳＣをポリアクリルアミドゲルまたはカバーガラスに播種した後、血清の存在下で２４時間インキュベートする。細胞のプルダウンアッセイを実施して、Ｒｈｏ、ＲａｃおよびＣｄｃ４２のＧＴＰ装填レベルを調査する（それぞれの活性化アッセイキット（Upstate Biotech, Charlottesville, VA）を使用）。

優性阻害型または恒常的活性化型Ｒｈｏでの細胞のトランスフェクション
候補Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅのｃＤＮＡをラット肝臓ｃＤＮＡライブラリからクローニングし、Ｒｈｏタンパク質のＤ／Ｎ形態またはＣ／Ａ形態を生成する変異（Qui RG et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Dec 5 ;92(25):11781-5、Lu X et al, Curr Biol. 1996 Dec 1;6(12): 1677-84）を導入し、各々のｃＤＮＡにｍｙｃ ｔａｇコード配列を加える。変異体のＲｈｏファミリタンパク質を発現している組換えアデノウイルスを作製し、これを用いてｈＭＳＣで変異体タンパク質を過発現させる。

結果
細胞外マトリックスに関する情報を伝達する上でのＲｈｏファミリタンパク質の役割をさらに研究するために、柔らかいゲルまたは硬いゲルで成長させたＭＳＣでＲｈｏファミリタンパク質の活性をアッセイする。これらのシグナルの伝達に関与している、さらに他のＲｈｏファミリタンパク質を同定する。

追加実験で、目的のＲｈｏファミリタンパク質の優性阻害（Ｄ／Ｎ）型または恒常的活性化（Ｃ／Ａ）型をｈＭＳＣで過発現させる。ＬａｃＺを発現している組換えアデノウイルスを負の対照として利用する。柔らかいゲル、硬いゲルまたはカバーガラスからのｈＭＳＣを調製し、２４時間インキュベートした後、ＬａｃＺまたはＲｈｏファミリタンパク質の変異体形態を発現するアデノウイルスに未感染または感染した状態にする。３６時間のインキュベーション後、ＢｒｄＵを培地に加え、血清含有培地で細胞をさらに１２時間インキュベートした後、固定して、抗ｍｙｃ抗体（Cell Signaling Technology, Danvers, MA）および抗ＢｒｄＵ抗体（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてｍｙｃ−ｔａｇおよびＢｒｄＵの両方で免疫染色する。未感染の細胞とＬａｃＺアデノウイルスに感染した細胞との間でのＢｒｄＵ染色陽性の細胞数を比較することで、アデノウイルス感染自体はｈＭＳＣの成長に何ら影響しないことを確認する。ＢｒｄＵ取り込み陽性の細胞数をｍｙｃ−ｔａｇ染色陽性の数と比較する。Ｒｈｏファミリタンパク質のＣ／Ａ型およびＤ／Ｎ型それぞれによって、柔らかいマトリックスで誘導した成長停止の抑制または硬いマトリックスで誘導した成長促進の抑制から、過発現したＲｈｏファミリタンパク質がマトリックス剛性によるｈＭＳＣの成長調節に関与していることが分かる。

実施例１２：マトリックス剛性による幹細胞成長の調節におけるアクトミオシンの役割を判断
特定の細胞系統に傾倒する前に柔らかいゲルでのｈＭＳＣ成長を調節する上でのアクトミオシンの役割について研究するために、コラーゲン１型とフィブロネクチンの混合物でコーティングしたカバーガラスにｈＭＳＣを２４時間播種した後、２，３−ブタンジオンモノオキシム（ＢＤＭ）２０ｍＭ、ブレビスタチン１００μＭまたはサイトカラシンＤ（ＣＤ）０．２５μＭ／ｍｌの存在下または非存在下にて、ＢｒｄＵと一緒にさらに１２時間インキュベートする。実験の間、細胞を血清の存在下にてインキュベートする。インキュベーション後、細胞を固定し、ＢｒｄＵで免疫染色する。ミオシンＩＩをＢＤＭまたはブレビスタチンによって阻害することあるいは、アクチン線維をＣＤによって破壊することがｈＭＳＣの成長に対しておよぼす影響を評価する。

実施例１３：柔らかい３次元フィブリンゲルでのｈＭＳＣの成長と分化
材料および実験方法
フィブリンゲルの調製と播種
サケフィブリノゲン（Searun Holdings, Freeport, ME）をＨ_２Ｏで再水和し、５０ｍＭのTris、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４にて３ｍｇ／ｍＬ（柔らかいゲルの場合）または１８ｍｇ／ｍＬ（硬いゲルの場合）まで希釈し、４００マイクロリットル（μｌ）のアリコートを組織培養ウェルにて２単位／ｍＬの魚トロンビン（Searun Holdings）で重合する。３ｍｇ／ｍＬと１８ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲンから調製したサケフィブリンゲルの剛性は、それぞれ２５０Ｐａと２１５０Ｐａである。１０^４個のｈＭＳＣを重合前に１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中でフィブリノゲン溶液と混合し、そこで細胞を２４時間インキュベートする。

結果
細胞を血清およびＢｒｄＵの存在下でさらに１２時間インキュベートした後、固定してＢｒｄＵ取り込みを免疫染色することで、柔らかいフィブリンゲルと硬いフィブリンゲルでのＭＳＣの増殖解析結果を評価する。

フィブリンゲルでのｈＭＳＣの分化能を脂肪細胞分化の効率で評価する。培地を３日間Adipogenic Induction Medium（「ＡＩＭ」ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、デキサメタソン１マイクロモル（ｍｃＭ）、インドメタシン２００ｍｃＭ、インスリン１０マイクログラム（ｍｃｇ）／ｍｌ、メチルイソブチルキサンチン０．５ｍＭ）に切り替えた後、この細胞をAdipogenic Maintenance Medium（ＧＭ、インスリン１０ｍｃｇ／ｍｌ）に維持することで、フィブリンゲルのＭＳＣから脂肪細胞への分化を誘導する。Adipogenic Induction Mediumに切り替えた８日後、オイルレッドＯ染色または抗ＰＰＡＲγ２免疫染色のいずれかによって、脂肪細胞分化を評価する。オイルレッドＯ染色陽性またはＰＰＡＲγ２染色陽性の細胞の比率を柔らかいフィブリンゲルと硬いフィブリンゲルとで比較する。

他の実験では、プロテアーゼ阻害剤をマトリックスに加えて、タンパク質分解または細胞による他の活発な再構築を防止または阻害する。

実施例１４：造血幹細胞の生存度を維持する目的での本発明のｈＭＳＣの使用
コラーゲン１型＋フィブロネクチンでコーティングした９６ウェルの組織培養プレートに、１０継代のＭＳＣ懸濁液を細胞１０^３個／ウェルの密度で播種する。細胞をＧＭにて２４時間インキュベートした後、上記の実施例で説明したようにして、柔らかいゲルまたはマトリックスの存在下で細胞を培養する。次に、得られる間葉系幹細胞培養を造血幹細胞培養に加え、造血幹細胞の生存度を維持する。

付随研究で、事前に組織培養皿に蒔いてトリプシン処理することなく、柔らかいゲルで直接ｈＭＳＣをインキュベートする。

実施例１５：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
概要：２５０Ｐａのポリアクリルアミドゲルに１型コラーゲンとフィブロネクチンの混合物をコーティングした。コラーゲンとフィブロネクチンでコーティングされたゲルの弾性は、骨髄および脂肪組織の弾性と同等であった。これらのゲルに低密度で播種すると、血清が存在するにもかかわらずヒトＭＳＣは細胞周期の進行を停止した。しかしながら、硬い支持体に結合すると、これらの非増殖性ヒトＭＳＣが細胞周期に再進入した。

２５０Ｐａのゲル上の非増殖性ヒトＭＳＣも、脂肪細胞誘導培地で培養すると脂肪細胞に分化でき、硬い支持体に移して骨芽細胞誘導培地と一緒にインキュベートしたところ、骨芽細胞に分化することができた。これらの結果から、２５０Ｐａのゲル上のヒトＭＳＣは休眠状態であるが、適当な刺激を受けると増殖を再開または分化を開始する能力があることが分かる。

材料および方法

材料
骨髄由来ヒト間葉系幹細胞をCambrex（Walkersville, MD）から購入した。アクリルアミドおよびビスアクリルアミド粉末をFisher Scientific（Pittsburgh, PA）から購入した。ラット尾コラーゲン１型をBD Bioscience（San Jose, CA）から購入した。ヒトフィブロネクチンについては、当該技術分野において周知の手法で精製した。（Williams EC, Janmey PA, Ferry JD, et al., "Conformational states of fibronectin. Effects of pH, ionic strength, and collagen binding," J Biol Chem. 1982;257:14973-14978）。オイルレッドＯ（ＯＲＯ）をSigma（St. Louis, MO）から入手した。Alizarin Red SをAlfa Aesar（Ward Hill, MA）から入手した。BrdU標識試薬をZymed（San Francisco, CA）から入手した。抗ＢｒｄＵ抗体およびＤＡＰＩをInvitrogen（Carlsbad, CA）から入手した。この実施例１で使用した他の化学物質はいずれも、分析グレードであった。

細胞培養
ゲルへの播種前に、組織培養プラスチックにて、Ｄ−グルコース１ｇ／Ｌ（低グルコースＤＭＥＭ）、Ｌ−グルタミン０．３ｍｇ／ｍｌ、ピルビン酸ナトリウム１００ｍｇ／Ｌおよび１０％熱失活ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む成長培地（ＧＭ）で、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を維持した。脂肪細胞分化のために、脂肪細胞誘導培地（ＧＭ、デキサメタソン１μＭ、インドメタシン２００μＭ、インスリン１０μｇ／ｍｌ、３−イソブチル−１−メチルキサンチン０．５ｍＭ）で３日間、脂肪細胞維持培地（ＧＭ、インスリン１０μｇ／ｍｌ）で１日間からなる２通りの化学的誘導サイクルに細胞を曝露した。未分化細胞をＧＭに維持し、３日ごとに供給しなおす。骨芽細胞分化のために、細胞を骨芽細胞誘導培地（ＧＭ、アスコルビン酸−２−ホスフェート５０μｍ、β−グリセロリン酸１０ｍＭ、デキサメタソン１００ｎＭ）と一緒に２４日間インキュベートした。このとき、３〜４日ごとに培地を交換した。細胞をゲル上に４．９ｃｍ^２あたり５×１０^４個の密度またはガラス上に４．９ｃｍ^２あたり１×１０^５個（集密）または４．９ｃｍ^２あたり１×１０^４個（低密度）で蒔いた。

ゲルの調製と特性決定
当該技術分野において周知の手法を、Pelham, et al. (Pelham RJ, Jr., Wang Y., "Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility," Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94:13661-13665)に記載されているようにして若干改変して、２５０Ｐａおよび７５００Ｐａのポリアクリルアミドゲルを調製した。３．０％アクリルアミドと０．２％ビスアクリルアミドの溶液（２５０Ｐａのゲル用）または７．５％アクリルアミドと０．５％ビスアクリルアミドの溶液（７５００Ｐａのゲル）を、リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）で総容量が５００μｌになるように調製した。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンおよび過硫酸アンモニウムを用いて重合を開始した。１５０μｌの滴を、事前に３−アミノプロピルトリメトキシシランおよびグルタルアルデヒドで修飾した２５ｍｍのカバーガラスに載せた。２％アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのトルエン溶液１５μｌを滴に適用し、クロロシラン処理した２５ｍｍのカバーガラスを滴の上に載せ、重合完了後にこれを取り除き、得られたゲルに１０〜１５分ほど紫外線を照射した。このゲルを６ウェルのポリスチレン組織培養プレートに入れ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。６ウェルのプレートについては、ゲルまたはカバーガラスの外での細胞接着を防止するために１％アガロースゲルで事前にコーティングしておいた。ゲル上のＮ−スクシンイミドアクリレートを、ラット尾コラーゲン１型０．１ｍｇ／ｍｌとヒトフィブロネクチン０．０２ｍｇ／ｍｌとの混合物と１時間反応させた。続いて、ゲルをＰＢＳで３回洗浄し、２４時間以内に細胞を播種するまでＰＢＳ中に残しておいた。カバーガラスをラット尾コラーゲン１型＋ヒトフィブロネクチン溶液に１時間浸し、その表面を細胞外マトリックスリガンドでコーティングした。

レオロジー測定
ポリアクリルアミドゲルの動的剛性率（Ｇ’）を測定するために、水和チャンバにて２５ｍｍの２枚の平行鋼板間でモノマー溶液５００μｌを重合した。ひずみ制御型RFS III流体スペクトロメータレオメータ（Rheometrics, Piscataway, NJ）にて、振動剪断ひずみ２％、周波数１０ラジアン／秒で、同位相の剪断応力から剛性率を計算した。関連の動物組織の動的剛性率（Ｇ’）についても測定した。ラットを解剖して組織を取得し、測定前の１時間未満の間、ＰＢＳ中にて水和状態に保った。ウシ組織を屠殺業者から購入し、氷の上に運び、水和し、３７℃まで温めた上で、測定を実施した。直径８ｍｍで厚さ２ｍｍのラット組織由来の水和試料と、直径２５ｍｍで厚さ２ｍｍのウシ組織由来の水和試料の動的剛性率（Ｇ’）を、試料に合う幾何学的形状のパラレルプレートを用いて、振動剪断ひずみ２％、周波数１０ラジアン／秒で、３７℃で測定した。各組織について３つの試料を測定した。

準３Ｄゲルシステム
Beningoらに記載されている方法を、後述するように、支持体の弾性、ＥＣＭ層の組成、細胞をカバーガラスに近接させるために用いるおもりを変更するために改変して用いて、細胞の三次元環境を模するように設計された支持体サンドイッチを作製した。（Beningo KA, Dembo M, Wang YL, "Responses of fibroblasts to anchorage of dorsal extracellular matrix receptors," Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101: 18024-18029）。２５ｍｍのゲルに細胞を播種し、４８時間かけて定着させた。余分な培地を除去し、播種したゲルの上に第２のカバーガラス（底側に２５０Ｐａのポリアクリルアミドゲルを用いる場合と用いない場合）を載せた。第２のカバーガラスの底側に、上述したコラーゲン１型とフィブロネクチンの混合物をコーティングした。細胞を第２のカバーガラスと近接させるために、滅菌した３５グラムのおもりをサンドイッチの上に３０秒間載せた。おもりを除去した後、培地を再導入し、細胞を２日間サンドイッチに保った。上側のカバーガラスを適用する前と２日後とに、細胞をすみやかに画像化した。

画像化
当該技術分野において周知の手法で免疫染色を実施した。（Funaki M, Randhawa P, Janmey PA, "Separation of insulin signaling into distinct GLUT4 translocation and activation steps," Mol Cell Biol. 2004;24:7567-7577）。ShaoおよびLazar（Shao D, Lazar MA, "Peroxisome proliferator activated receptor gamma, CCAAT/enhancer-binding protein alpha, and cell cycle status regulate the commitment to adipocyte differentiation," J Biol Chem. 1997;272:21473-21478）に記載されているようにして、２サイクルの脂肪生成誘導後または成長培地で８日間経過後に、脂肪酸を豊富に含むベシクルをＯＲＯで染色した。骨芽細胞誘導培地で２４日経過後に、カルシウムを豊富に含む細胞外マトリックスを、製造業者の指示に従ってアリザリンレッドＳで染色した。細胞をＢｒｄＵ含有培地で一晩インキュベートして、ＢｒｄＵ取り込みを測定した。細胞を固定し、製造業者の指示に従ってＢｒｄＵおよびＤＡＰＩの両方で染色した。いずれの場合も、Hamamatsu ORCAカメラ（浜松、日本）を用いてLeica DM-IRBE顕微鏡（Wetzlar, Germany）で細胞を画像化した。

投影された細胞面積を、ファロイジン染色の画像を用いて測定した。画像を８ビットに変換し、閾値処理した（thresholded）。Image Jソフトウェア（NIH, Bethesda, MD）を用いて粒度を分析した。細胞をＤＡＰＩでも染色し、その細胞がオーバーラップしていないことを確認した。単離した細胞だけをカウントした。

骨髄でレオロジー試験を実施し、休眠状態のヒトＭＳＣの蓄積を維持する上での支持体コンプライアンスの役割を研究するのに適したゲルの弾性を判断した。以下の表３に示されるように、ウシ骨髄の振動貯蔵弾性率（Ｇ’）は２２０Ｐａであった。脂肪組織のＧ’も測定し、ヒトＭＳＣの脂肪生成において支持体の硬さが果たす役割について調査した。ラット脂肪組織のＧ’は若干低めで、１５０Ｐａ前後であった。ラットの内臓脂肪と皮下脂肪のＧ’間に統計差は認められなかった。３．０％アクリルアミドおよび０．１％ビスアクリルアミドのポリアクリルアミド支持体溶液を採用し、細胞の自然な環境の弾性を模した。このポリアクリルアミド溶液は、重合後のＧ’が２５０±２５Ｐａであるが、これはラットおよびウシの組織での実測Ｇ’値に近い。実験によっては、貯蔵弾性率が７５００±２５０Ｐａ（筋肉組織のものに近い）の第２の支持体を対照として用いた。（Engler AJ, Griffin MA, Sen S, et al., "Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: pathological implications for soft or stiff microenvironments," J Cell Biol. 2004; 166:877-887）。

図９Ａ〜図９Ｉは、２５０Ｐａ（図９、図９Ｄ、図９Ｈ）、７５００Ｐａ（図９Ｂ、図９Ｅ、図９Ｉ）、ガラス（図９Ｃ、９Ｆおよび９Ｊ）の支持体での初期プレーティング密度２０００個／ｃｍ^２でのヒトＭＳＣの画像を示す。図９Ａ〜９Ｃに示されるように、コラーゲンＩ型およびフィブロネクチンでコーティングした支持体に細胞を蒔き、成長培地（ＧＭ）での２４時間のインキュベーション後に同位相コントラストモードで画像化した。矢印は細胞の場所を示す。図９Ｄ〜図１Ｆは、ＧＭにて７日間のインキュベーション後の同じ場所での画像を示す。画像化時には、細胞を３７℃に保った。２つの独立した実験で得られた代表的な画像を示す。図９Ｈ〜図９Ｊに示されるように、播種の２日後にヒトＭＳＣのＦ−アクチンをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ファロイジンで標識した。また、平均投影面積±標準偏差についても報告する。条件ごとに、無作為に選択した７視野で少なくとも４０個の細胞をカウントした。図９Ａ〜図９Ｆの目盛り線は９００μｍであり、図９Ｇ〜図９Ｉの目盛り線は２０μｍである。

フィブロネクチンとコラーゲンＩの混合物でコーティングした２５０Ｐａゲルで２日間経過後、図９Ａおよび図９Ｇに示されるように、ヒトＭＳＣは乱れたＦ−アクチン細胞骨格を持つ比較的小さな丸い形態を有していた。ヒトＭＳＣは平均投影細胞面積がわずか６５０±２５０μｍ^２であり、同じ接着タンパク質をコーティングしたガラスで測定された拡散面積３５００±１１００μｍ^２よりも有意に小さかった。２５０Ｐａのゲル上の線維芽細胞、内皮細胞、アストロサイトでも同様の表現型が観察された。（Yeung T, Georges PC, Flanagan LA, et al., "Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion," Cell Motil Cytoskeleton. 2005;60:24-34；Pelham RJ, Jr., Wang Y, "Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility," Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94: 13661-13665；Georges PC, Miller WJ, Meaney DF, et al., "Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures," Biophysical Journal. 2006;90:3012-3018）。培養時間を７日間まで延長すると、対応するマトリックスへの接着を強めて拡散しはじめた細胞があった。しかしながら、図１Ｄに示されるように、細胞数が目に見えて増加することはなかった。このように、柔らかいゲルによって骨髄由来ヒトＭＳＣの丸い形状が誘導され、Ｆ−アクチンと細胞周期の停止を乱された。

対照的に、２日間にわたって７５００Ｐａのゲル上に維持されたヒトＭＳＣは部分的に拡散し、投影細胞面積は２６００±１５００μｍ^２であった。図９Ｂおよび図９Ｅに示されるように、ヒトＭＳＣではいくらかのアクチン構築が認められるが、ストレスファイバはわずかしかなかった。７日後、ヒトＭＳＣの数が明らかに増加した。図９Ｈに示されるように、細胞同士の接触時にますます拡散するようになった。図９Ｃ、図９Ｆ、図９Ｉに示されるように、ガラス上のヒトＭＳＣは拡散の形態を呈し、ストレスファイバが豊富で、短時間で増殖した。

ヒトＭＳＣの増殖挙動をマトリックスの弾性によって変えることができるか否かを調査するために、図１０に示されるようにさまざまな支持体上で培養した細胞で５−ブロモ−２’−デオキシウリジン５’−トリホスフェート（ＢｒｄＵ）取り込みアッセイを実施した。図１０は、試験でのＢｒｄＵ取り込みが陽性であった細胞（多様なコンプライアンスの支持体でＢｒｄＵを用いてのインキュベーション期間中に増殖した細胞である）の比率を示している。細胞を４８時間かけて支持体に蒔いた上で、この細胞をＢｒｄＵ含有培地にて一晩インキュベートした。血清を２４時間で欠乏させた上で無血清培地にＢｒｄＵを加えたガラス（集密）以外は、期間中をとおして細胞を血清含有培地に保った。細胞の核を抗ＢｒｄＵで染色し、核を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色した。各々の支持体で少なくとも５０個のＤＡＰＩ陽性細胞のＢｒｄＵ染色を調べ、データを３回の独立した実験の平均＋ＳＥ（標準誤差）で表したところ、^＊ｐ＜０．０１で統計的有意性が確認された。

ＢｒｄＵを用いて一晩のインキュベーション後、２５０Ｐａのゲルに接着しているヒトＭＳＣには事実上ＢｒｄＵが取り込まれなかった。このように、血清が存在するにもかかわらず、ＤＮＡ複製が抑制された。（ＤＮＡの複製は、ヒトＭＳＣの細胞分裂での必要な工程である）。７５００Ｐａのゲルで、細胞の半分前後が２４時間以内に自己のＤＮＡを複製した。ガラスに低密度で播種すると、８０％を超える細胞に核ＢｒｄＵ染色が認められた。これらの結果は、支持体コンプライアンスがヒトＭＳＣでの細胞周期の進行に有意に影響し得ることを暗に意味するものである。

柔らかい支持体でのヒトＭＳＣの生存度に害がおよんだことは、血清が存在するにもかかわらず、２５０Ｐａのゲルで細胞が寄せ集まって増殖を中断したという観察結果を説明し得るものである。しかしながら、２５０ＰａのゲルではヒトＭＳＣにトリパンブルーが取り込まれなかったことから、これらの細胞が死んでいないことが分かる。柔らかいゲルで誘導した細胞周期の停止が可逆性であるか否かを判断するために、図１１Ａ〜図１１Ｄに示されるように、細胞を準３Ｄ環境においた。図１１Ａ〜図１１Ｄは、準３Ｄ環境が幹細胞の形状および増殖に対しておよぼす影響を示すものである。細胞を２５０Ｐａのゲルに播種し、血清含有培地に２日間経過後に画像化した（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。２日目に、別の２５０Ｐａのゲル（図１１Ｃ）またはカバーガラス（図１１Ｄ）のいずれかの上側の支持体を用いて、細胞を準３Ｄ環境に挟んだ。２日後、同じ場所で細胞を再度画像化した。図１１Ａ〜図１１Ｄにおいて、目盛り線は１００μｍである。

底側のゲルと同じマトリックスリガンドで各々をコーティングした２５０Ｐａのゲルまたはカバーガラスを、２５０Ｐａのゲルにて丸い非増殖ヒトＭＳＣの上に載せた。２５０Ｐａの２つのゲルに挟まれた細胞は、丸いまま残るか若干拡散した。図１１Ｃに示されるように、これらの細胞数のはっきりとした増加は観察されなかった。他方、図１１Ｄに示されるように、一番上でガラス製のカバーガラスと対向している細胞は増殖し、紡錘形になった。ヒトＭＳＣは、上側のガラス表面にしっかりと接着されると、柔らかい支持体から剥がれた。このように、２５０Ｐａのゲル上のヒトＭＳＣは、これよりも硬い支持体からの機械的な信号を受けたときに増殖を再開できるだけの能力があった。

２５０ＰａのゲルにおけるヒトＭＳＣの一時的な成長停止は、これらの細胞が分化できるのか否かという問題を提起するものである。分化は、細胞系統が制限された表現型の発現や成長停止を含めて、非常によく調整された一連のイベントによって達成される。ヒトＭＳＣの分化する系統が支持体の弾性によって特定されることが報告されている。（Engler AJ, Sen S, Sweeney HL, Discher DE, "Matrix elasticity directs stem cell lineage specification," Cell. 2006 Aug 25;126(4):677-89）。脂肪組織の弾性に匹敵する弾性２５０Ｐａのゲルで、ヒトＭＳＣの脂肪細胞の分化を試験した。

さまざまな硬さのマトリックス上の細胞を脂肪細胞分化培地で処理すると、自らの核にＢｒｄＵを取り込んだ細胞の比率と、ＯＲＯ染色で検出される脂質滴の蓄積が生じた細胞の比率との間に、反比例の関係があった。

図１２Ａおよび図１２Ｂは、脂肪生成誘導培地に対するヒトＭＳＣの応答を示すものである。図１２Ａは、ヒトＭＳＣでの脂質の蓄積に対するオイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色を示す。２５０Ｐａ、７５００Ｐａまたはガラス製の支持体の上に細胞を播種し、成長培地で８日間おく（−）か、あるいは脂肪生成誘導を２サイクル（＋）実施した。図１２Ｂは、２５０Ｐａのゲル（●）またはガラス（■）での化学的分化因子に対するヒトＭＳＣの用量応答を示す。細胞をゲルには２，０００個／ｃｍ^２の密度、ガラスには２０，０００個／ｃｍ^２の密度で播種した。各々の支持体で少なくとも５０個の細胞をカウントした。図１２Ａおよび図１２Ｂのデータを、３回の独立した実験の平均±ＳＥとして表したところ、統計的に有意である（^＊ｐ＜０．０２）。実験ＡおよびＢを異なるバッチのヒトＭＳＣで実施した。

図１２Ａに示されるように、２５０Ｐａのゲルに低密度で播種した細胞の７５％前後で脂質滴が蓄積されたのに対し、７５００Ｐａのゲルに低密度で播種した細胞では２０％前後しかなく、カバーガラスに低密度で播種した細胞の２％が脂質滴を蓄積して脂肪細胞分化培地に応答した。特に、２５０Ｐａのゲル上のヒトＭＳＣは、脂肪細胞分化培地でのインキュベーションがなければ脂質滴を蓄積しなかった。これらの結果から、柔らかいマトリックスがヒトＭＳＣの脂肪細胞分化を促進することが分かる。

ヒトＭＳＣの脂肪細胞分化は一般に、ガラス上に集密な単層膜培養を誘導することで達成される。しかしながら、誘導培地で８日経過後、ガラス上の集密細胞よりも柔らかいゲルで誘導した低密度の細胞のほうで高い比率の分化が観察された。柔らかいゲルからの機械的なシグナルが化学的に誘導した脂肪生成をどのようにして促進するのかをさらに判断するために、（１）２５０Ｐａのゲルに低密度で播種、（２）ガラス製カバースリップに密に播種するという２通りの環境で成長停止を誘導することで、２５０Ｐａのゲルでの脂肪細胞分化培地に対するヒトＭＳＣの感度を試験した。化学的誘導因子の濃度減少に応じた２通りの条件での脂肪細胞分化率を比較した。図１２Ｂに示されるように、脂肪生成因子の濃度が低下するにつれて、２５０Ｐａのゲル上のヒトＭＳＣがガラス製カバースリップ上のヒトＭＳＣの応答と同様の応答を呈した。２５０Ｐａのゲルで培養することで、低密度で播種したヒトＭＳＣが脂肪細胞分化できるようになったが、この環境は、脂肪細胞分化培地に対するヒトＭＳＣの感度には影響しなかった。

２５０Ｐａのゲルでの成長を停止したヒトＭＳＣの効率的な脂肪細胞分化は、これらの非増殖細胞が休眠状態の幹細胞のままでいるのではなく、前脂肪細胞に分化して脂肪生成系統を開始できる可能性を高めるものである。これらの細胞が休眠状態の幹細胞であるか分化した前脂肪細胞であるかを判断するために、ヒトＭＳＣを柔らかいゲルに２日間低密度で播種し、上述した準３Ｄの方法を用いてガラス製カバースリップに移し、最後に骨芽細胞誘導培地で２４日間培養した。（上述したように、接触時に硬い支持体に移った２５０Ｐａのゲル上の細胞は増殖を再開し、組織培養プラスチックでのヒトＭＳＣに典型的な紡錘状の表現型を得た）。

図１３Ａおよび図１３Ｂは、骨誘導培地での刺激後にアリザリンレッドＳで可視化したカルシウム沈着を示す。図１３Ａに示されるように、細胞を柔らかいゲルで２日間培養した後、準３Ｄの方法を用いてガラス製カバースリップに移し、さらに骨誘導培地で２４日間インキュベートした。図１３Ｂに示されるように、ヒトＭＳＣをガラス製カバースリップ上で骨誘導培地にて２４日間培養した。図１３Ａおよび図１３Ｂにおいて、目盛り線は２００μｍである。

骨芽細胞誘導培地で２４日間経過後、カルシウムを豊富に含む細胞外マトリックスは培養皿で明らかに目に見え、図１３Ａに示されるようにアリザリンレッドＳで陽性に染色された。マトリックスのミネラル化が後期の骨芽細胞分化マーカーである（Kundu AK, Putnam AJ, "Vitronectin and collagen I differentially regulate osteogenesis in mesenchymal stem cells," Biochem Biophys Res Commun 2006,347 347-357）。

比較のために、柔らかいゲルで一度も培養しなかった細胞をガラス製カバースリップに播種し、骨芽細胞誘導培地で同じ長さの時間をかけて処理した。予想どおり、これらの支持体も図１３Ｂに示されるようにカルシウム沈着では陽性に染色された。骨芽細胞誘導培地での刺激をせずにおくと、どちらの条件でもアリザリンレッドＳで染色される細胞外マトリックスは得られなかった。これらの結果から、２５０Ｐａのゲル上のヒトＭＳＣが自己の多分化能力を維持していることが分かる。したがって、これらの結果から、柔らかいゲルに播種したヒトＭＳＣは分化せずに幹細胞として休眠状態のまま残ることが確認される。

Claims (8)

1. 体外で体性幹細胞における休眠状態を誘導又は維持するための方法であって、
   体性幹細胞の膜上にあるインテグリンに結合する接着分子でコーティングされたゲル又はゲルマトリックスであって、２００〜２５０Ｐａの範囲にある剛性を有するゲル又はゲルマトリックスに、前記体性幹細胞を接触させる工程と、
   前記体性幹細胞に栄養物質を与える工程とを含む、体外で体性幹細胞における休眠状態を誘導又は維持するための方法。
2. 前記ゲル又はゲルマトリックスが、２次元又は３次元である、請求項１に記載の方法。
3. 前記体性幹細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ)である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記接触工程前に前記体性幹細胞が休眠状態にない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 体外で体性幹細胞に増殖を誘導するための方法であって、
   請求項１に記載の方法を実施して、休眠状態が誘導又は維持された体性幹細胞を得る工程と、
   体性幹細胞の表面のインテグリンに接着する接着分子でコーティングされたゲル又はゲルマトリックスであって、７５００Ｐａの剛性を有するゲル又はゲルマトリックスを含む増殖誘導材料に、前記体性幹細胞を体外で接触させる工程と、
   細胞増殖を促進するために栄養・成長物質を供給する工程と、を含む、体外で体性幹細胞に増殖を誘導するための方法。
6. 体外で体性幹細胞に分化を誘導するための方法であって、
   請求項１に記載の方法を実施して、休眠状態が誘導又は維持された体性幹細胞を得る工程又は請求項５に記載の方法を実施して、増殖している体性幹細胞を得る工程と、
   脂肪細胞誘導培地、骨形成誘導培地又はガラスと前記体性幹細胞とを接触させる工程と、
   前記分化細胞に分化細胞用栄養物質を供給する工程と、を含む、方法。
7. 前記体性幹細胞が、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞であり、前記分化細胞が、骨芽細胞又は脂肪細胞である、請求項６に記載の方法。
8. 前記体性幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、腎幹細胞、肝幹細胞、骨格筋由来幹細胞、骨由来幹細胞、
   歯髄ＭＳＣ、心筋由来ＭＳＣ、滑液由来ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ、
   及び脂肪由来ＭＳＣからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

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