JP5723285B2 - グリコサミノグリカンの検出法及びそのための分子プローブ - Google Patents
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Description
2.標的分子とプローブの結合力が微小な場合の複合体の検出が困難である。
3.スクリーニング時にプローブをあらかじめ標識する必要性がある。
4.標識操作によるプローブの失活や標的物質への結合力を阻害するリスクがある。
(2)固相に固定されているグリコサミノグリカンの存在下で、前記分子プローブと前記試料を接触させる(1)記載の検出法。
(3)前記試料中のグリコサミノグリカンを固相に固定した後、前記分子プローブと接触させる(1)記載の検出法。
(4)グリコサミノグリカンを被験物質と接触させた後、N-(9-アクリジニル)マレイミドを添加し、発生した蛍光を測定することを含む、グリコサミノグリカンに特異的に結合する物質のスクリーニング法。
(5)グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有する物質を含む分子プローブと被験者からの試料を接触させた後、N-(9-アクリジニル)マレイミドを添加し、発生した蛍光を測定することを含む、グリコサミノグリカンが診断マーカーとなる疾患の検査法。
(6)グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有する物質を含む分子プローブ及びN-(9-アクリジニル)マレイミドを含む、グリコサミノグリカン検出キット。
(7)さらに、グリコサミノグリカンを含む(6)記載のキット。
(8)グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有する物質を含む分子プローブ及びN-(9-アクリジニル)マレイミドを含む、グリコサミノグリカンに特異的に結合する物質のスクリーニングキット。
(9)さらに、グリコサミノグリカンを含む(8)記載のキット。
(10)グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有する物質を含む分子プローブ及びN-(9-アクリジニル)マレイミドを含む、グリコサミノグリカンが診断マーカーとなる疾患の検査キット。
(11)さらに、グリコサミノグリカンを含む(10)記載のキット。
(12)グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有する物質を含む分子プローブであって、(1)記載の検出法、(4)記載のスクリーニング方法又は(5)記載の検査法に使用される前記分子プローブ。
(13)グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有する物質が、以下の(a)又は(b)のペプチドである(12)記載の分子プローブ。
(a)配列番号1のアミノ酸配列(RTRGSTREFRTGC)からなるペプチド。
(b) 配列番号1のアミノ酸において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有するペプチド。
(14)以下の(a)又は(b)のペプチド。
(a)配列番号1のアミノ酸配列(RTRGSTREFRTGC)からなるペプチド。
(b) 配列番号1のアミノ酸において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有するペプチド。
I. and Lindahl, U.,Mol. Cell. Biochem. 48,161-182,1982)
グリコサミノグリカンを特異的に認識する物質は、2008年8月19日第28回日本糖質学会年会(つくば)口頭発表及び要旨集p.79に報告されているファージディスプレイ法、Kuppeveltらの方法(Van Kuppevelt, T. H. et al.,J. Biol. Chem.
273,12960-12966,1998)などに報告されているスクリーニング法などにより、探索することができる。
451-452(1973))。NAMは、Agric. Biol. Chem., 42(4), 793-798, 1978に合成法が記載されているが、市販もされおり、入手可能である。
(b) 配列番号1のアミノ酸において1若しくは数個(2、3、4、5、6個程度)のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有するペプチド。
・配列番号1のアミノ酸配列における1番目から8番目までのアミノ酸からなる連続した配列のC末端にシステインを付加したアミノ酸配列からなるペプチド
・配列番号1のアミノ酸配列における1番目から9番目までのアミノ酸からなる連続した配列のC末端にシステインを付加したアミノ酸配列からなるペプチド
・配列番号1のアミノ酸配列における1番目から10番目までのアミノ酸からなる連続した配列のC末端にシステインを付加したアミノ酸配列からなるペプチド
・配列番号1のアミノ酸配列における1番目から11番目までのアミノ酸からなる連続した配列のC末端にシステインを付加したアミノ酸配列からなるペプチド
(a)及び(b)のペプチドは、公知の化学合成法、遺伝子工学的手法により、製造することができる。
2.本発明の検出法で使用するNAMによる分子プローブの検出限界は、数pmol程度と非常に感度が高い。
3.プローブ結合から蛍光による検出までの操作手順が少なく、簡便かつ迅速な検出が可能である。このことは、ELISA法やウェスタンブロッティング法のような一般的な免疫生化学的方法では、操作の過程でプローブが標的である硫酸化糖鎖から剥離してしまう可能性を最小限に抑える効果がある。
4.蛍光標識試薬として使用するNAMは、遊離のチオール基を有する対象物質と結合しなければ蛍光を発しないため、測定値を干渉することがない。
5.一般的に,標的物質を可視化する方法としてプローブを使用する場合に、プローブをHRPやビオチン、FITCなどの物質によって標識をして、標的物質と結合した複合体の状態を検出するが、しばしば標識操作により、本来のプローブの標的物質への結合能が失われてしまうことがある。しかし、本発明の検出法では、分子プローブをあらかじめ標識する必要がないため、標識操作によるプローブの失活や、標識によるプローブの標的物質への結合を阻害するなどの現象を防ぐことができ、硫酸化糖鎖に限らず、これまで検出が困難であった生体内負電荷分子に対しても応用が可能である。
ブタ小腸由来ヘパリン糖鎖:ナカライテスク,Acros Organics(アメリカ);アンチトロンビンIII:Hyphen BioMed(フランス);NAM:東京化成工業;マウス脳由来cDNAライブラリー:Spring Bioscience(アメリカ)
(プローブの作製方法)
アンチトロンビンIII(AT-III)アフィニティーカラムを作製した後,ブタ小腸由来ヘパリンを供して,AT-III結合型ヘパリン糖鎖を精製し,得られたヘパリンをビオチン化した後にストレプトアビジンプレートに固定化した。この固定化糖鎖を標的として,マウス脳由来cDNAライブラリーを導入したファージディスプレイ法(2008年8月19日第28回日本糖質学会年会(つくば)要旨集p.79)により,これと相互作用するペプチドをスクリーニングし,得られた分子をプローブとした。得られた分子は、HappY(Heparin-associated
peptide Y)と命名され、そのアミノ酸配列を配列番号3に、それをコードするDNAの塩基配列を配列番号2に示す。
実験方法
ヘパリン糖鎖の固定化
ブタ小腸由来のヘパリン糖鎖に対してギ酸アンモニウムと水素化シアノホウ素ナトリウムを加え,70℃で2日間の反応を2度繰り返し,糖鎖の還元末端にアミノ基を導入した。反応液は脱塩操作を行った後,糖鎖の還元末端に存在するアミノ基特異的にビオチンを導入した。反応液は脱塩操作を行った後,陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより,目的のビオチン化糖鎖を精製した。この精製糖鎖をストレプトアビジンがコーティングされたプラスチックプレートに供し,4℃で一晩反応させた後,リン酸緩衝生理食塩水を添加して十分に洗浄し,固定化ヘパリン糖鎖とした。
2%ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水100 μlにプローブを4.23 nmol加えて溶解し,固定化ヘパリン糖鎖に添加した。また,ヘパリンとの結合が既知のアンチトロンビンIII(AT-III)145 pmolを同様に添加した。
25℃で3.5時間反応させた後,素早く洗浄し(300 mM NaClを1ウェル当たり200μl使用して4回洗浄した後,リン酸緩衝生理食塩水を1ウェル当たり200μl使用して2回洗浄),0.2 mM NAM(N-(9-acridinyl)
maleimide)を含む50 mMホウ酸緩衝液(pH 8.8)100 μlを加えて,遮光した状態で10分間反応させた。蛍光プレートリーダーを用いて,励起波長:355 nm,蛍光波長:460 nmで蛍光強度を測定した。
NAMは遊離のチオール基(SH基)と反応すると強い青色蛍光を発し,pH 3 - 10の水溶液中で反応が定量的に進行する。固定化ヘパリンに結合した遊離のチオール基をもつプローブは,この実験系において,ヘパリンと結合能がないウシ血清アルブミンを含む溶液のみのコントロールと比較して,有意な差でNAMにより検出することができた(図1)。
実験方法
L-システインを1 pmolから10 nmolまで段階的に96穴プレートにそれぞれ分注し, 0.2 mM NAM(N-(9-acridinyl) maleimide)を含む50 mMホウ酸緩衝液(pH 8.8)100 μlを加えて,遮光した状態で10分間反応させた。蛍光プレートリーダーを用いて,励起波長:365 nm,蛍光波長:435 nmで蛍光強度を測定した。それぞれのL-システインの量に対する蛍光強度をプロットし,検量線を作成した。
L-システインを10 pmolから3 nmol含む溶液における蛍光強度のプロットを元に,最小二乗法により算出した近似直線は,寄与率(R2)が0.998となり,濃度依存的な蛍光強度の増加を示した(図2)。この傾向は,10 pmolから300 pmolの場合(図3)と比較してもほぼ同様の結果であったことから,本法によりNAMを用いて遊離のチオール基が検出できる範囲は,10 pmol〜3 nmolである。
実験方法
1.ヘパリン糖鎖の固定化
実施例1「固定化ヘパリン糖鎖のプローブによる検出」と同様にヘパリン糖鎖を固定した。
2%ウシ血清アルブミンを含む溶液100 μlにプローブを42.3 pmol,126 pmol, 423 pmol,1.26 nmol加えてそれぞれ溶解し,固定化ヘパリン糖鎖に添加した。
25℃で3.5時間反応させた後,素早く洗浄し(300 mM NaClを1ウェル当たり200μl使用して4回洗浄した後,リン酸緩衝生理食塩水を1ウェル当たり200μl使用して2回洗浄),0.2 mM NAM(N-(9-acridinyl) maleimide)を含む50 mMホウ酸緩衝液(pH 8.8)100 μlを加えて,遮光した状態で20分間反応させた。蛍光プレートリーダーを用いて,励起波長:365 nm,蛍光波長:435 nmで蛍光強度を測定した。
実験方法
1.ヘパリン糖鎖の固定化
実施例1「固定化ヘパリン糖鎖のプローブによる検出」と同様にビオチン化ヘパリン糖鎖を精製し,水溶液とした。この溶液0.5 μl,1 μl,2.5 μl,5 μlをリン酸緩衝生理食塩水で希釈して,ストレプトアビジンがコーティングされたプラスチックプレートにそれぞれ供し,4℃で一晩反応させた後,リン酸緩衝生理食塩水を添加して十分に洗浄し,固定化ヘパリン糖鎖とした。
2%ウシ血清アルブミンを含む溶液100 μlにプローブを4.23 nmol加えて溶解し,固定化ヘパリン糖鎖に添加した。
25℃で3.5時間反応させた後,素早く洗浄し(300 mM NaClを1ウェル当たり200μl使用して4回洗浄した後,リン酸緩衝生理食塩水を1ウェル当たり200μl使用して2回洗浄),0.2 mM NAM(N-(9-acridinyl)
maleimide)を含む50 mMホウ酸緩衝液(pH 8.8)100 μlを加えて,遮光した状態で10分間反応させた。蛍光プレートリーダーを用いて,励起波長:365 nm,蛍光波長:435 nmで蛍光強度を測定した。
0.5 μlビオチン化ヘパリン水溶液を用いて糖鎖を固定化したものに比べて,1 μlビオチン化ヘパリン水溶液を用いた場合に,蛍光強度の増加がみられた(図5)。このことから,試料中の糖鎖をビオチン化しプレートに固定化することにより,本法での定量が可能であることを示した。また,2.5 μl以上のビオチン化ヘパリン水溶液で飽和していた。
配列番号1は、グリコサミノグリカン(ヘパリン、ヘパラン硫酸)に特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有する物質(ペプチド)のアミノ酸配列(RTRGSTREFRTGC)を示す。
<配列番号2>
配列番号2は、グリコサミノグリカン(ヘパリン、ヘパラン硫酸)を特異的に認識するペプチド、HappY(Heparin-associated peptide
Y)をコードするDNAの塩基配列(CGGACGCGTGGGTCGACCCGGGAATTCCGGACCGGT)を示す。
<配列番号3>
配列番号3は、グリコサミノグリカン(ヘパリン、ヘパラン硫酸)を特異的に認識するペプチド、HappY(Heparin-associated peptide
Y)のアミノ酸配列(RTRGSTREFRTG)を示す。
Claims (14)
- グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有する物質を含む分子プローブと試料を接触させた後、N-(9-アクリジニル)マレイミドを添加し、発生した蛍光を測定することを含む、グリコサミノグリカンの検出法。
- 固相に固定されているグリコサミノグリカンの存在下で、前記分子プローブを前記試料と接触させる請求項1記載の検出法。
- 前記試料中のグリコサミノグリカンを、
抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィーを利用して精製するか、
アルカリ性下で水素化ホウ素ナトリウム処理してグリコサミノグリカンを遊離し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製した後、
固相に固定し、前記分子プローブと接触させる請求項1記載の検出法。 - グリコサミノグリカンを遊離のチオール基を有する被験物質と接触させた後、N-(9-アクリジニル)マレイミドを添加し、発生した蛍光を測定することを含む、グリコサミノグリカンに特異的に結合する物質のスクリーニング法。
- グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有する物質を含む分子プローブと被験者からの試料を接触させた後、N-(9-アクリジニル)マレイミドを添加し、発生した蛍光を測定することを含む、グリコサミノグリカンが診断マーカーとなる疾患の検査法。
- グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有する物質を含む分子プローブ及びN-(9-アクリジニル)マレイミドを含む、グリコサミノグリカン検出キット。
- さらに、グリコサミノグリカンを含む請求項6記載のキット。
- グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有する物質を含む分子プローブ及びN-(9-アクリジニル)マレイミドを含む、グリコサミノグリカンに特異的に結合する物質のスクリーニングキット。
- さらに、グリコサミノグリカンを含む請求項8記載のキット。
- グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有する物質を含む分子プローブ及びN-(9-アクリジニル)マレイミドを含む、グリコサミノグリカンが診断マーカーとなる疾患の検査キット。
- さらに、グリコサミノグリカンを含む請求項10記載のキット。
- グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有する物質を含む分子プローブであって、請求項1記載の検出法、請求項4記載のスクリーニング方法又は請求項5記載の検査法に使用される前記分子プローブ。
- グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有する物質が、以下の(a)又は(b)のペプチドである請求項12記載の分子プローブ。
(a)配列番号1のアミノ酸配列(RTRGSTREFRTGC)からなるペプチド。
(b) 配列番号1のアミノ酸において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有するペプチド。 - 以下の(a)又は(b)のペプチド。
(a)配列番号1のアミノ酸配列(RTRGSTREFRTGC)からなるペプチド。
(b) 配列番号1のアミノ酸において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、グリコサミノグリカンに特異的に結合することができ、かつ遊離のチオール基を有するペプチド。
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