JP5717952B2

JP5717952B2 - 顕微鏡観察用培養装置および顕微鏡観察培養システム

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Publication number: JP5717952B2
Application number: JP2009130881A
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Inventors: 本田　進; 進本田; 木村　博之; 博之木村; 中田　竜男; 竜男中田
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Description

本発明は、顕微鏡観察用培養装置および顕微鏡観察培養システムに関するものである。

従来、細胞や菌などの生体を培養しながら生存状態のまま顕微鏡観察を行うための顕微鏡観察用培養装置が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。通常、顕微鏡観察用培養装置では、温度、湿度、もしくは、ガス濃度等の培養条件が管理された環境下において顕微鏡観察が行われる。

特許文献１に記載の顕微鏡観察用培養装置は、生体試料と培養液とが収容された培養容器に５％濃度のＣＯ_２混合ガスを一定の流量で連続的に供給することにより、培養液のｐＨを中性に保つこととしている。また、特許文献２に記載の自動培養装置は、ｐＨセンサや温度センサ等により培養液のｐＨ値や温度等を検出し、検出結果に基づく培養環境の時系列データを解析することで細胞に異常があるか否かを判断することとしている。

特開２００４−１４１１４３号公報特開２００６−５５０２７号公報

しかしながら、特許文献１に記載の顕微鏡観察用培養装置では、培養容器内の培養液のｐＨ値を検出しておらず、培養液のｐＨ値を正確に一定の状態に保つ管理は行われていない。また、特許文献２に記載の自動培養装置では、検出した培養液のｐＨ値等の時系列データに基づき細胞の状態を判断するだけであり、培養液のｐＨ値を一定の状態に保つ管理は行われていない。そのため、これらの培養装置では、何等かの原因で培養液のｐＨ値が変動した場合に生体の活性に異変が生じるおそれがあり、生体の正常な生命活動を観察することができないという問題がある。

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、培地のｐＨ値を一定の状態に保ち、生体の正常な生命活動を精度よく観察することができる顕微鏡観察用培養装置および顕微鏡観察培養システムを提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、蛍光を発するｐＨ感受性物質が付与された生体試料を収容する培養容器を外気から遮断した状態で収納し、光を透過させる透明部を備えるチャンバと、前記チャンバ内に前記生体試料の培養に用いる培養ガスを濃度を調整して供給する培養ガス供給部と、前記生体試料に前記チャンバの前記透明部を介して励起光を照射するｐＨ検出用光源と、前記励起光が照射され前記ｐＨ感受性物質が励起されることにより発生した蛍光を検出して蛍光情報を取得する蛍光情報取得部と、該蛍光情報取得部により取得された前記蛍光情報に基づきｐＨ値を演算する演算部とを備えるｐＨ検出部と、該ｐＨ検出部により検出されるｐＨ値に基づいて、前記培養ガス供給部の前記培養ガスの濃度を調整する培養ガス調整制御部とを備える顕微鏡観察用培養装置を提供する。

本発明によれば、培地および生体試料を収容する培養容器が収納されたチャンバ内に培養ガス供給部から培養ガスを供給することで、生体試料の育成に適した培養ガス濃度の環境下で生体試料を培養することができる。

本発明に係る顕微鏡観察用培養装置は、ｐＨ検出部により培地のｐＨ値を検出し、培養ガス調整制御部によりそのｐＨ値がほぼ一定の状態になるように培養ガス供給部から供給される培養ガスの濃度を調整することで、培地のｐＨ値が変動して生体試料の活性に異変が生じるのを防ぎ、生体試料を正常に活動させながら培養することができる。これにより、顕微鏡観察によりチャンバの透明部を介して培養容器内の生体試料の正常な生命活動を観察することが可能となる。なお、培養ガスとしては、例えば、ＣＯ_２混合ガスを用いることとし、培養ガス調整制御部により培養ガスのＣＯ_２濃度を調整することとしてもよい。

上記発明においては、前記ｐＨ検出部が、ｐＨ感受性物質が付与された前記培地に前記チャンバの前記透明部を介して励起光を照射するｐＨ検出用光源と、前記励起光が照射された前記培地の前記ｐＨ感受性物質が励起されることにより発生した蛍光を検出して蛍光情報を取得する蛍光情報取得部と、該蛍光情報取得部により取得された前記蛍光情報に基づき前記培地のｐＨ値を算出する演算部とを備える。

このように構成することで、ｐＨ検出部において、培地のｐＨ値を光学的に検出することができ、培地に非接触で迅速にｐＨ値を検出することができる。これにより、培養ガスの濃度をリアルタイムに調節し、培地のｐＨ値をより確実に一定の状態に維持することが可能となる。なお、蛍光情報としては、例えば、検出した蛍光の輝度等の測光情報であってもよいし、検出した蛍光から生成される画像情報であってもよい。

上記発明においては、前記蛍光情報取得部が複数配置され、複数の該蛍光情報取得部に入射される前記蛍光の波長を選択的に分割する光路選択部を備えることとしてもよい。

このように構成することで、各蛍光情報取得部により、光路選択部によって分割された波長が異なる蛍光の蛍光情報が取得される。したがって、演算部において、蛍光情報取得部ごとに取得された蛍光情報の比率、例えば、平均輝度の比率により、培地のｐＨ値を検出することができる。これにより、特定の波長の蛍光のみに基づいて培地のｐＨ値を検出する場合と比較して、ノイズ等を補正して精度よくｐＨ値を検出することができる。

本発明は、蛍光を発するｐＨ感受性物質が付与された生体試料を収容する培養容器を外気から遮断した状態で収納し、光を透過させる透明部を備えるチャンバと、前記チャンバ内に前記生体試料の培養に用いる培養ガスを濃度を調整して供給する培養ガス供給部と、前記生体試料に励起光が照射されることにより前記ｐＨ感受性物質から発生した蛍光を検出して蛍光情報を取得する蛍光情報取得部と、該蛍光情報取得部により取得された前記蛍光情報に基づきｐＨ値を算出する演算部とを備えるｐＨ検出部と、該ｐＨ検出部により検出されるｐＨ値に基づいて、前記培養ガス供給部の前記培養ガスの濃度を調整する培養ガス調整制御部と、前記チャンバを載置するステージと、前記チャンバの前記透明部を介して前記培養容器内の前記生体試料に照明光を照射する照明光源と、前記照明光が照射された前記生体試料からの戻り光を集光する対物レンズと、前記ステージと前記対物レンズとを相対的に光軸方向に移動させて該対物レンズの焦点位置を調整する照準機構と、前記対物レンズにより集光された前記戻り光を観察する観察部とを備える顕微鏡観察培養システムを提供する。

本発明によれば、照明光源により、ステージ上に載置された顕微鏡観察用培養装置のチャンバの透明部を介して培養容器内の生体試料に照明光が照射され、照準機構により、対物レンズの焦点位置が調整されて生体試料からの戻り光が集光される。そして、観察部により、対物レンズによって集光された戻り光を観察することで、顕微鏡観察用培養装置により正常な活動状態で培養される生体試料の顕微鏡観察を行うことができる。

本発明は、上記本発明の顕微鏡観察用培養装置と、該顕微鏡観察用培養装置を載置するステージと、前記チャンバの前記透明部を介して前記培養容器内の前記生体試料およびｐＨ感受性物質が付与された前記培地に照明光を照射する照明光源と、前記照明光が照射された前記生体試料からの戻り光を集光する対物レンズと、前記ステージと前記対物レンズとを相対的に光軸方向に移動させて該対物レンズの焦点位置を調整する照準機構と、前記対物レンズにより集光された前記戻り光を観察する観察部とを備え、前記ｐＨ検出部が、前記照明光が照射された前記培地の前記ｐＨ感受性物質が励起されることにより前記照明光の透過方向に向かって発生した蛍光を検出して蛍光情報を取得する蛍光情報取得部と、前記蛍光情報取得部により取得された前記蛍光情報に基づき前記培地のｐＨ値を算出する演算部とを備える顕微鏡培養観察システムを提供する。

本発明によれば、蛍光情報取得部によって検出される、照明光源から発せられた照明光が照射された培地の透過方向に向かって発生する蛍光により、培地のｐＨ値が光学的に算出される。これにより、観察部による生体試料の観察と、蛍光情報取得部による培地のｐＨ値の検出とを同時に行うことができる。

上記発明においては、前記観察部が、前記対物レンズにより集光された前記戻り光を撮影し、画像情報を取得する画像情報取得部を備えることとしてもよい。
このように構成することで、画像情報取得部によって取得された画像情報に基づいて、生体試料をリアルタイムに観察したり、画像情報を保存して生体試料を事後的に観察したりすることができる。

本発明は、上記本発明の顕微鏡観察用培養装置と、該顕微鏡観察用培養装置を載置するステージと、前記チャンバの前記透明部を介して前記培養容器内の前記生体試料およびｐＨ感受性物質が付与された前記培地に照明光を照射する照明光源と、前記照明光が照射された前記生体試料からの戻り光および前記培地の前記ｐＨ感受性物質が励起されることにより発生した蛍光を集光する対物レンズと、前記ステージと前記対物レンズとを相対的に光軸方向に移動させて該対物レンズの焦点位置を調整する照準機構と、前記対物レンズにより集光された前記戻り光を撮影して画像情報を取得するとともに前記蛍光を検出して蛍光画像を取得する画像情報取得部とを備え、前記ｐＨ検出部が、前記画像情報取得部により取得された前記蛍光画像に基づき前記培地のｐＨ値を算出する顕微鏡観察培養システムを提供する。

本発明によれば、生体試料の顕微鏡観察を行う照明光源および画像取得部を用いて、培地のｐＨ値を光学的に検出することができる。これにより、培地のｐＨ値を検出するための光源や画像取得部を別途に設ける必要がなく、装置が大型化するのを防ぐことができる。

上記発明においては、前記画像情報取得部により取得された前記画像情報を記憶する記憶部を備え、前記画像情報取得部が一定の時間間隔をあけて前記画像情報を取得して前記記憶部に記憶し、前記画像情報取得部により前記画像情報が取得されない合間に、前記ｐＨ検出部が前記培地のｐＨ値を検出するとともに前記培養ガス調整部が前記培養ガスの濃度を制御することとしてもよい。

このように構成することで、画像情報取得部により生体試料の画像情報が取得される間は培地のｐＨ値の検出を行わず、生体試料の画像情報が取得されない合間に培地のｐＨ値を検出して培養ガスの濃度を調整することができる。これにより、培地のｐＨ値が一定の状態に維持しつつ生体試料の所望の画像情報を経時的に取得することができ、生体試料の正常な生命活動を効率的に観察することができる。

本発明によれば、培地のｐＨ値を一定に保ち、生体の正常な生命活動を精度よく観察することができるという効果を奏する。

本発明の参考実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置および顕微鏡観察培養システムの概略構成図である。図１の顕微鏡観察用培養装置による混合ガスの濃度調整工程を示すフローチャートである。本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置および顕微鏡観察培養システムの概略構成図である。図３の顕微鏡観察用培養装置による混合ガスの濃度調整工程を示すフローチャートである。図３の顕微鏡観察用培養装置による培養液のｐＨ値の算出工程を示すフローチャートである。本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置および顕微鏡観察培養システムの概略構成図である。本発明の第２の実施形態の変形例に係る顕微鏡観察用培養装置および顕微鏡観察培養システムの概略構成図である。本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置および顕微鏡観察培養システムの概略構成図である。図８の顕微鏡観察用培養装置による混合ガスの濃度調整工程を示すフローチャートである。本発明の第４の実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置および顕微鏡観察培養システムによる観察工程を示すフローチャートである。

〔参考実施形態〕
以下、本発明の参考実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置および顕微鏡観察培養システムについて、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察培養システム１００は、図１に示すように、細胞や菌等の生体試料６を培養しながら観察を行うものであり、生体試料６を培養する顕微鏡観察用培養装置２と、顕微鏡観察用培養装置２により培養されている生体試料６を観察する顕微鏡観察装置５０とを備えている。

顕微鏡観察用培養装置２は、培養液（培地）７および生体試料６が収容された培養容器８を収納するチャンバ１０と、チャンバ１０内に生体試料６の培養に用いるＣＯ_２混合ガス（培養ガス）を供給する混合ガス供給装置（培養ガス供給部）２０と、培養容器８内の培養液７に挿入され、培養液７のｐＨ値を検出するｐＨセンサ（ｐＨ検出部）３０と、ｐＨセンサ３０により検出される培養液７のｐＨ値がほぼ一定の状態になるように混合ガス供給装置２０のＣＯ_２混合ガスの濃度を調整する制御部（培養ガス調整制御部）４０とを備えている。なお、培養容器８としては、例えば、シャーレ等の透明な皿状のガラス容器が用いられる。

チャンバ１０は、開口部１４を有する筐体本体１２と、筐体本体１２の開口部１４を閉塞する開閉可能な蓋１６とを備えている。筐体本体１２は、培養容器８を収納して動かないように保持することができるようになっている。蓋１６は、開口部１４を閉塞して筐体本体１２内の培養容器８を外気から遮断することができるようになっている。

筐体本体１２の底面および蓋１６には、それぞれ顕微鏡観察装置５０による観察用の光を透過させる筐体透明部１３および蓋透明部１７（以下、単に「透明部１３，１７」という。）が形成されている。
また、チャンバ１０には、収納した培養容器８内を所定の温度に保つヒータ１８と、培養容器８内を所定の湿度に保つための水が蓄えられた水槽１９とが設けられている。

混合ガス供給装置２０は、ボンベ（図示略）から１００％濃度のＣＯ_２ガスを導入するＣＯ_２ガス導入管２２と、送風機（図示略）から空気を導入する空気導入管２４と、ＣＯ_２ガス導入管２２および空気導入管２４が接続され、ＣＯ_２ガスと空気とを混合する混合装置２６と、混合装置２６により混合されたＣＯ_２混合ガスをチャンバ１０内に供給する混合ガス供給管２８とを備えている。

ＣＯ_２ガス導入管２２および空気導入管２４には、それぞれ図示しないバルブが設けられており、バルブの開閉により混合装置２６に導入されるＣＯ_２ガスの量および空気の量が調整されるようになっている。
符号２９は、ＣＯ_２混合ガスのＣＯ_２濃度を計測する濃度計である。

制御部４０は、ｐＨセンサ３０と混合装置２６のＣＯ_２ガス導入管２２のバルブおよび空気導入管２４のバルブに接続されている。この制御部４０は、ｐＨセンサ３０により検出された培養液７のｐＨ値に基づき、ＣＯ_２ガス導入管２２および空気導入管２４の各バルブの開閉度を制御して、チャンバ１０に供給するＣＯ_２混合ガスのＣＯ_２濃度を調節するようになっている。

顕微鏡観察装置５０は、前記チャンバ１０が載置されるステージ５２と、チャンバ１０の透明部１３，１７を介して培養容器８内の生体試料６に照明光を照射する照明光源５４と、照明光が照射された生体試料６からの戻り光を集光する対物レンズ５６と、ステージ５２と対物レンズ５６とを相対的に光軸方向に移動させて対物レンズ５６の焦点位置を調整する照準機構５８と、対物レンズ５６により集光された戻り光を集めて像を結像させる結像レンズ６２と、結像レンズ６２により結像された像を観察するための接眼レンズ（観察部）６４とを備えている。

また、顕微鏡観察装置５０には、照明光源５４から発せられた照明光から所定の波長帯域の励起光を切り出す励起フィルタ７２と、励起フィルタ７２により切り出された励起光を反射して対物レンズ５６に入射させるとともに、対物レンズ５６により集光された戻り光を透過させるＤＭ（ダイクロイックミラー）７４と、ＤＭ７４を透過した戻り光のうち励起光を遮断して蛍光のみを透過させる励起光カットフィルタ７６とにより構成されるミラーキューブ７０が設けられている。
なお、符号６６は、半導体レーザ等の透過照明用光源であり、例えば、所定の波長帯域の励起光を発するようになっている。

ステージ５２には、チャンバ１０の筐体透明部１３が位置する箇所に、観察用の光を透過させるステージ透明部５３が形成されている。
照明光源５４としては、例えば、キセノンランプ等が用いられる。

対物レンズ５６は、ミラーキューブ７０により切り出された励起光をステージ透明部５３および筐体透明部１３を介して培養容器８内の生体試料６に照射するとともに、生体試料６の励起光の照射位置において発生した蛍光を含む戻り光を集光してミラーキューブ７０に入射させるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置２および顕微鏡観察培養システム１００の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察培養システム１００を用いて、生体試料６を培養しながらその生命活動を観察するには、培養液７とともに生体試料６を収容した培養容器８をチャンバ１０の筐体本体１２に保持させ、蓋１６を閉めて培養容器８を外気から遮断した状態に設定する。そして、チャンバ１０を顕微鏡観察装置５０のステージ５２上に載置する。

また、ヒータ１８の作動により培養容器８内を所定の温度に保つとともに、水槽１９に蓄えられた水により培養容器８内を所定の湿度に保ち、混合ガス供給装置２０においてＣＯ_２ガスと空気とが所定の混合比率で混合されたＣＯ_２混合ガス（例えば、５％濃度）をチャンバ１０内に供給する。これにより、生体試料６の育成に適した培養条件下で生体試料６の培養が行われる。

この場合に、図２のフローチャートに示されるように、ｐＨセンサ３０により培養容器８内の培養液７のｐＨ値が検出され（ステップＳＡ１）、検出されたｐＨ値が制御部４０に送られる（ステップＳＡ２）。なお、培養液７のｐＨは中性（例えば、ｐＨ７．０〜７．２程度。）であることが望ましい。

制御部４０においては、ｐＨセンサ３０から送られる培養液７のｐＨ値が一定か否かが判断される。培養液７のｐＨ値が一定の場合には、混合ガス供給装置２０のＣＯ_２混合ガスのＣＯ_２ガスと空気の混合比率が維持される。一方、培養液７のｐＨ値が変動した場合には、制御部４０により、混合ガス供給装置２０のＣＯ_２ガス導入管２２のバルブあるいは空気導入管２４のバルブの開閉度が制御され、ＣＯ_２ガスと空気の混合比率が調整される。

例えば、培養液７のｐＨ値が上昇した場合には、ＣＯ_２ガス導入管２２からのＣＯ_２ガスの量を増加し空気導入管２４からの空気の量を減少させることで、ＣＯ_２混合ガスのＣＯ_２濃度を高くする。一方、培養液７のｐＨ値が低下した場合には、ＣＯ_２ガスの量を減少させ空気の量を増加することでＣＯ_２混合ガスのＣＯ_２濃度を低くする。

そして、培養液７のｐＨ値がほぼ一定の状態を維持するようにＣＯ_２混合ガスのＣＯ_２濃度が設定される（ステップＳＡ３）。これにより、培養液７のｐＨ値が変動するのを防ぎ、生体試料６を正常に活動させながら培養することができる。

次に、顕微鏡観察装置５０による生体試料６の観察では、照明光源５４から照明光を発し、ミラーキューブ７０の励起フィルタ７２により所定の波長帯域の励起光を切り出して、対物レンズ５６によりステージ透明部５３および筐体透明部１３を介して生体試料６に励起光を照射する。

励起光が照射されることにより生体試料６において蛍光が発生すると、対物レンズ５６により蛍光を含む戻り光が集光される。そして、ミラーキューブ７０のＤＭ７４および励起光カットフィルタ７６により励起光が除去され蛍光のみとなって結像レンズ６２により集光され、像が結像される。これにより、接眼レンズ６４を介して、顕微鏡観察用培養装置２によって培養されている生体試料６の生命活動を観察することができる。

以上説明したように、顕微鏡観察用培養装置２および顕微鏡観察培養システム１００によれば、顕微鏡観察用培養装置２において、制御部４０により、培養液７のｐＨ値が一定の状態になるようにＣＯ_２混合ガスの濃度を調整することで、培養液７のｐＨ値が変動して生体試料６の活性に異変が生じるのを防ぎ、生体試料６を正常に活動させながら培養することができる。これにより、顕微鏡観察装置５０を用いて培養容器８内の生体試料６の正常な生命活動を観察することができる。
なお、本実施形態においては、例えば、透過照明用光源６６から生体試料６に励起光を照射して蛍光観察を行うこととしてもよい。

〔第１の実施形態〕
次に、本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置および顕微鏡観察培養システムについて説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察培養システム２００は、図３に示すように、顕微鏡観察用培養装置２が、ｐＨセンサ３０に代えて、培養液７のｐＨ値を光学的に検出する光学検出装置１３０を備える点で、参考実施形態と異なる。なお、培養液７には、予めｐＨ感受性物質を付与することとする。ｐＨ感受性物質としては、例えば、ＢＣＥＣＦ等の色素を用いることとしてもよい。
以下、参考実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置２および顕微鏡観察培養システム１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

光学検出装置１３０は、ｐＨ感受性物質が付与された培養液７に励起光を照射するｐＨ検出用光源１３２と、励起光が照射された培養液７のｐＨ感受性物質が励起されることにより発生した蛍光を検出して蛍光画像（画像情報）を取得するｐＨ検出用画像取得部（蛍光情報取得部）１３４と、ｐＨ検出用画像取得部１３４により取得された蛍光画像に基づき培養液７のｐＨ値を算出する演算部１３８とを備えている。なお、符号１３６はｐＨ検出用ミラーキューブを示している。

ｐＨ検出用光源１３２としては、例えば、半導体レーザ等を採用することとしてもよい。
ｐＨ検出用画像取得部１３４としては、例えば、ＣＣＤやＣＭＯＳ等の撮像素子を採用することとしてもよい。

ｐＨ検出用ミラーキューブ１３６は、励起フィルタ７２と、ＤＭ７４と、励起光カットフィルタ７６とを備え、ｐＨ検出用光源１３２から発せられた励起光のうち所定の波長帯域の光を選択して培養液７に向けて照射するとともに、培養液７のｐＨ感受性物質からの蛍光のうち所定の波長帯域の光を選択してｐＨ検出用画像取得部１３４に入射させるように構成されている。

演算部１３８は、ｐＨ感受性物質の各波長帯域の励起光に対する蛍光画像の輝度を測定して得られる輝度曲線のグラフを有している。また、演算部１３８は、異なる波長帯域の励起光により得られる２枚の蛍光画像の比率により、具体的には、蛍光画像ごとの平均輝度の比率を輝度曲線のグラフと比較することにより、培養液７のｐＨ値を算出するようになっている。なお、演算部１３８により算出された培養液７のｐＨ値は制御部４０に入力されるようになっている。

この光学検出装置１３０はステージ５２上のチャンバ１０の側方に配置されている。また、チャンバ１０の側壁部１０ａには、光学検出装置１３０からのｐＨ値検出用の光を透過させる側壁透明部（透明部）１１が形成されている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置２の作用について、図４のフローチャートを参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置２を用いて生体試料６を培養するには、まず、培養容器８内の培養液７に予めｐＨ感受性物質を付与する。また、光学検出装置１３０のｐＨ検出用ミラーキューブ１３６を、例えば、培養液７に向けて照射する励起光の波長が４５０ｎｍ（ｅｘ４５０）で、ｐＨ検出用画像取得部１３４に入射される蛍光の波長が５３５ｎｍ（ｅｍ５３５）となるように設定する（ステップＳＢ１）。

次に、ｐＨ検出用光源１３２から励起光を発し、ｐＨ検出用ミラーキューブ１３６により波長４５０ｎｍの光を選択的に透過させる。そして、チャンバ１０の側壁透明部１１を介して培養容器８の培養液７に励起光を照射する（ステップＳＢ２）。

励起光が照射されて培養液７内のｐＨ感受性物質が励起されることにより蛍光が発生すると、蛍光は側壁透明部１１を介してｐＨ検出用ミラーキューブ１３６に入射され、波長５３５ｎｍの光が選択的に透過させられる。ｐＨ検出用ミラーキューブ１３６を透過した蛍光はｐＨ検出用画像取得部１３４に入射され、ｐＨ検出用画像取得部１３４により蛍光画像Ａが取得される（ステップＳＢ３）。蛍光画像Ａは演算部１３８へと転送される（ステップＳＢ４）。

次に、光学検出装置１３０のｐＨ検出用ミラーキューブ１３６を、例えば、培養液７に向けて照射する励起光の波長が５００ｎｍ（ｅｘ５００）で、ｐＨ検出用画像取得部１３４に入射される蛍光の波長が５３５ｎｍ（ｅｍ５３５）となるように設定し直す（ステップＳＢ５）。そして、ｐＨ検出用光源１３２から励起光を発し、ｐＨ検出用ミラーキューブ１３６により波長５００ｎｍの光を選択的に透過させて、培養容器８の培養液７に照射する（ステップＳＢ６）。

励起光が照射されて培養液７内のｐＨ感受性物質が励起されることにより発生し、ｐＨ検出用ミラーキューブ１３６により選択的に透過させられた波長５３５ｎｍの蛍光は、ｐＨ検出用画像取得部１３４に入射され、ｐＨ検出用画像取得部１３４により蛍光画像Ｂが取得される（ステップＳＢ７）。

ｐＨ検出用画像取得部１３４により取得された蛍光画像Ｂは演算部１３８へ転送されてる（ステップＳＢ８）。演算部１３８においては、蛍光画像Ａおよび蛍光画像Ｂに基づいて培養液７のｐＨ値の算出処理が行われる（ステップＳＢ９）。

ここで、演算部１３８による培養液７のｐＨ値の算出方法について、図５のフローチャートを参照して詳細に説明する。
演算部１３８においては、蛍光画像Ａの培養液７部分および蛍光画像Ｂの培養液７部分がそれぞれ選択され（ステップＳＣ１）、各培養液７部分の平均輝度が計測される（ステップＳＣ２）。そして、蛍光画像Ａの培養液７部分の平均輝度と蛍光画像Ｂの培養液７部分の平均輝度との比率が計算され（ステップＳＣ３）、算出された輝度の比率が輝度曲線のグラフと比較される（ステップＳＣ４）。これにより、培養液７のｐＨ値が算出される（ステップＳＣ５）。

図４のフローチャートのステップＳＢ９に戻り、演算部１３８により算出されたｐＨ値は、制御部４０へ転送される（ステップＳＢ１０）。そして、制御部４０により、培養液７のｐＨ値に基づいて、混合ガス供給装置２０のＣＯ_２ガスと空気との混合比率が調整され、ＣＯ_２混合ガスの濃度が設定される（ステップＳＢ１１）。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置２および顕微鏡観察培養システム２００によれば、光学検出装置１３０により培養液７のｐＨ値を光学的に検出することで、培養液７に非接触で迅速にｐＨ値を検出することができる。この結果、ＣＯ_２混合ガスの濃度をリアルタイムに調節し、培養液７のｐＨ値をより確実に一定の状態に維持することが可能となる。また、演算部１３８により、異なる波長の励起光が照射されて得られる蛍光画像の平均輝度の比率に基づいて培養液７のｐＨ値を算出することで、蛍光に含まれるノイズ等による誤差を補正して精度よくｐＨ値を検出することができる。

〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置および顕微鏡観察培養システムについて説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察培養システム３００は、図６に示すように、観察カメラ（画像情報取得部）３６４を備える点で、参考実施形態および第１の実施形態と異なる。以下、参考実施形態および第１の実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置２および顕微鏡観察培養システム１００，２００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

照明光源５４は、培養容器８内の生体試料６に照明光を照射したり、ｐＨ感受性物質が付与された培養液７に照明光を照射したりするようになっている。
対物レンズ５６は、照明光が照射された生体試料６からの戻り光を集光したり、培養液７のｐＨ感受性物質が励起されることにより発生した蛍光を集光したりするようになっている。

観察カメラ３６４は、対物レンズ５６により集光された戻り光を撮影して画像情報を取得したり、蛍光を検出して蛍光画像を取得したりすることができるようになっている。
演算部（ｐＨ検出部）１３８は、観察カメラ３６４および制御部４０に接続され、観察カメラ３６４により取得された蛍光画像に基づいて、培養液７のｐＨ値を算出するようになっている。

符号３６３は、結像レンズ６２により集光された蛍光を含む戻り光の反射方向を切り替えて、接眼レンズ６４に入射させたり、あるいは、観察カメラ３６４に入射させたりすることができる切換えミラーである。

このように構成された顕微鏡観察用培養装置２および顕微鏡観察培養システム３００によれば、観察カメラ３６４により生体試料６の画像情報を取得することで、生体試料６をリアルタイムに観察したり、取得した画像情報を保存して生体試料６を事後的に観察したりすることができる。また、照明光源５４および観察カメラ３６４を用いて、培養液７のｐＨ値を光学的に検出することができる。これにより、培養液７のｐＨ値を検出するためのｐＨ検出用光源１３２やｐＨ検出用画像取得部１３４が不要となり、装置が大型化するのを防ぐことができる。

なお、本実施形態は以下のように変形することができる。
例えば、図７に示すように、透過照明用光源６６に代えて、ｐＨ検出用カメラ（蛍光情報取得部）３３４を配置し、照明光源５４から発せられた照明光が照射された培養液７のｐＨ感受性物質が励起されることにより照明光の透過方向に向かって発生した蛍光をｐＨ検出用カメラ３３４で検出して蛍光画像を取得することとしてもよい。

この場合、ｐＨ検出用カメラ４３４は、対物レンズ５６の光軸上であって、対物レンズ５６に対してステージ５２上のチャンバ１０を介して対向するように配置し、演算部１３８に接続することとすればよい。このようにすることで、ｐＨ検出用カメラ３３４によって検出される蛍光により、培養液７のｐＨ値を光学的に算出することができる。したがって、観察カメラ３６４による生体試料６の観察と、ｐＨ検出用カメラ３３４による培養液７のｐＨ値の検出とを同時に行うことができる。

〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置および顕微鏡観察培養システムについて説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察培養システム４００は、図８に示すように、顕微鏡観察用培養装置２が、培養液７のｐＨ値を光学的に検出する光学検出装置（ｐＨ検出部）４３２を備え、また、顕微鏡観察装置５０が、対物レンズ５６により集光された戻り光を撮影して画像情報を取得する観察カメラ３６４を備える点で、参考実施形態および第１の実施形態と異なる。
以下、参考実施形態および第１の実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置２および顕微鏡観察培養システム１００，２００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

光学検出装置４３２は、ｐＨ検出用光源１３２、ｐＨ検出用ミラーキューブ１３４および演算部１３８に加えて、第１ｐＨ検出用画像取得部（蛍光情報取得部）１３４Ａおよび第２ｐＨ検出用画像取得部（蛍光情報取得部）１３４Ｂ（以下、単に「ｐＨ検出用画像取得部１３４Ａ，１３４Ｂ」という。）と、ｐＨ検出用ミラーキューブ１３４を透過してｐＨ検出用画像取得部１３４Ａ，１３４Ｂに入射される蛍光の波長を選択的に分割する光路選択ＤＭ（光路選択部）４３９とを備えている。

ｐＨ検出用画像取得部１３４Ａ，１３４Ｂは、それぞれ光路選択ＤＭ４３９により分割された波長が異なる蛍光を検出して蛍光画像を取得するようになっている。
なお、ｐＨ感受性物質としては、例えば、カルボキシＳＮＡＲＦ−１のような色素を用いることとしてもよい。

このように構成された顕微鏡観察用培養装置２の作用について、図９のフローチャートを参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置２を用いて生体試料６を培養するには、まず、培養容器８内の培養液７に予めｐＨ感受性物質としてカルボキシＳＮＡＲＦ−１を付与する。そして、光学検出装置４３２のｐＨ検出用ミラーキューブ１３４を、例えば、培養液７に向けて照射する励起光の波長が４８８ｎｍ（ｅｘ４８８）で、第１ｐＨ検出用画像取得部１３４Ａに入射される蛍光の波長が５８０ｎｍ（ｅｍ５８０）となるように設定する（ステップＳＤ１）。

次に、ｐＨ検出用光源１３２から励起光を発し、ｐＨ検出用ミラーキューブ１３４により波長４８８ｎｍの光を選択的に透過させ、チャンバ１０の側壁透明部１１を介して培養容器８の培養液７に励起光を照射する（ステップＳＤ２）。励起光が照射されて培養液７内のｐＨ感受性物質が励起されることにより発生した蛍光は、側壁透明部１１を介してｐＨ検出用ミラーキューブ１３４に入射される。そして、ｐＨ検出用ミラーキューブ１３４により波長５８５ｎｍの光が選択的に透過させられて、光路選択ＤＭ４３９により第１ｐＨ検出用画像取得部１３４Ａに蛍光が入射される。この第１ｐＨ検出用画像取得部１３４Ａにより蛍光画像Ｃが取得されて（ステップＳＤ３）、演算部１３８へ転送される（ステップＳＤ４）。

また、ｐＨ検出用ミラーキューブ１３４により選択的に透過させられた蛍光のうち、波長６４０の光が光路選択ＤＭ４３９により第２ｐＨ検出用画像取得部１３４Ｂに入射される。そして、第２ｐＨ検出用画像取得部１３４Ｂにより蛍光画像Ｄが取得されて（ステップＳＤ５）、演算部１３８へ転送される（ステップＳＤ６）。

演算部１３８においては、蛍光画像Ｃの培養液７部分の平均輝度と蛍光画像Ｄの培養液７部分の平均輝度との比率が計算され、算出された輝度の比率が輝度曲線のグラフと比較されて、培養液７のｐＨ値が算出される（ステップＳＤ７）。以下、第１の実施形態の図４のフローチャートのステップＳＢ１０およびステップＳＢ１１と同様であるので、説明を省略する。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置２および顕微鏡観察培養システム４００によれば、光学検出装置４３２により、光路選択ＤＭ４３９により分割された波長が異なる蛍光が入射されてｐＨ検出用画像取得部１３４Ａ，１３４Ｂごとに取得された蛍光画像の平均輝度の比率により培養液７のｐＨ値を検出することで、特定の波長の蛍光のみに基づいて培養液７のｐＨ値を検出する場合と比較して、ノイズを補正して精度よくｐＨ値を検出することができる。

〔第４の実施形態〕
次に、本発明の第４の実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置および顕微鏡観察培養システムについて説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察培養システム３００（図６参照）は、顕微鏡観察装置５０がカメラ（画像情報取得部）３６４により取得された画像情報を記憶する記憶部（図示略）を備え、観察カメラ３６４が一定の時間間隔をあけて画像情報を取得して記憶部に記憶し、観察カメラ３６４により画像情報が取得されない合間に、演算部１３８が培養液７のｐＨ値を検出するとともに制御部４０がＣＯ２混合ガスの濃度を調整するプログラムを有する点で、参考実施形態および第１の実施形態と異なる。
以下、参考実施形態、第１の実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置２および顕微鏡観察培養システム１００，２００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

この顕微鏡観察培養システム３００により生体試料６を観察するには、図１０のフローチャートに示されるように、観察条件として、観察カメラ３６４によって取得する画像情報の数と画像情報を取得する時間間隔（言い換えれば、画像情報を取得してから次の画像情報を取得するまでの間隔）を設定し（ステップＳＥ１）、顕微鏡観察装置５０により生体試料６の観察を開始する（ステップＳＥ２）。観察カメラ３６４により取得された画像情報は記憶部に記憶される（ステップＳＥ３）。

観察カメラ３６４により画像情報が取得されると、図示しない計測部により次に画像情報を取得するまで時間間隔（インタバル）の計測が開始される（ステップＳＥ４）。そして、照準機構５８により、対物レンズ５６の焦点位置がずらされ（デフォーカス、ステップＳＥ５）、この状態で観察カメラ３６４により蛍光画像が取得されて、演算部１３８により培養液７のｐＨ値が算出される（ステップＳＥ６）。なお、培養液７のｐＨ値を算出する方法としては、第１の実施形態および第２の実施形態の演算部１３８による方法と同様である。

計測部により設定された時間間隔が経過するまでの間、ステップＳＥ６の培養液７のｐＨ値の検出が行われる（ステップＳＥ７「ＮＯ」）。設定した時間間隔が経過すると（ステップＳＥ７「ＹＥＳ」）、照準機構５８により対物レンズ５６の焦点位置が合わされた状態に設定され（フォーカス調整、ステップＳＥ８）、予め設定した数の画像情報が取得されるまでステップＳＥ１〜ステップＳＥ８の動作が繰り返される（ステップＳＥ９「ＮＯ」）。設定した数の画像情報が取得されると観察が終了する（ステップＳＥ９「ＹＥＳ」）。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡観察用培養装置２および顕微鏡観察培養システム３００によれば、観察カメラ３６４により生体試料６の画像情報が取得される間は培養液７のｐＨ値の検出を行わず、画像情報が取得されない合間に培養液７のｐＨ値を検出してＣＯ_２混合ガスの濃度を調整することで、培養液７のｐＨ値を一定の状態に維持しつつ生体試料６の所望の画像情報を経時的に取得することができ、生体試料６の正常な生命活動を効率的に観察することができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
例えば、上記実施形態においては、蛍光情報取得部として、ｐＨ検出用画像取得部１３４、ｐＨ検出用カメラ３３４、ｐＨ検出用画像取得部１３４Ａ，１３４Ｂを例示して説明したが、これに代えて、培養液７のｐＨ感受性物質が励起されることにより発生した蛍光を検出して、その輝度等の測光情報を取得する蛍光測光部を用いることとしてもよい。この場合に、測光部位としては、観察視野の隅または観察視野の外等、観察の妨げにならない位置が望ましい。また、ｐＨ検出用画像取得部１３４、ｐＨ検出用カメラ３３４またはｐＨ検出用画像取得部１３４Ａ，１３４Ｂを用いた構成と同様に、複数波長の励起光を照射して同一の蛍光を検出したり、単一の励起光を照射して複数の異なる波長の蛍光を検出し、蛍光の波長特性変化を測定したりすることとしてもよい。

また、例えば、培養液７に付与するｐＨ感受性物質として、液体のものに代えて固体のものを用いることとし、固体のｐＨ感受性物質を生体試料６と重ならないように培養容器８の隅に配置してこのｐＨ感受性物質からの蛍光を検出することとしてもよい。このようにすることで、ノイズのない蛍光画像を取得してより正確にｐＨ値を検出することができる。なお、固体のｐＨ感受性物質としては、生体試料６の蛍光波長と重ならない波長の蛍光を発するものが望ましい。このような固体のｐＨ感受性物質を用いることで、仮に生体試料６の近くに固体のｐＨ感受性物質が配置されたとしても、生体試料６からの蛍光だけを分離して検出することができる。

また、第１の実施形態〜第４の実施形態においては、培養液７にｐＨ感受性物質を付与してその蛍光波長を観察することとしたが、これに代えて、例えば、天然に存在する生物由来の蛍光タンパク質であるＧＦＰ（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）からの蛍光波長特性を観察することとしてもよい。細胞（生体試料）自身に発現しているＧＦＰからの蛍光の波長特性は培養液７のｐＨ値に応じた変化をするので、例えば、培養液７のｐＨ値とＧＦＰの蛍光波長特性とを対応づけたリファレンスデータを予め保持しておき、ＧＦＰからの蛍光の波長特性の測定結果をリファレンスデータと比較することで、培養液７のｐＨ値を間接的に算出することができる。ＧＦＰの蛍光波長特性の測定やデータ処理の方法は、ｐＨ感受性色素を用いる場合と同様の方法を採用することとすればよい。

また、ＣＯ_２混合ガスのＣＯ_２濃度を所定の範囲で変動させたときのＧＦＰからの蛍光の波長特性を測定し、ＣＯ_２混合ガスの濃度を調整することとしてもよい。また、例えば、ＧＦＰのシグナルが一番強いことが細胞（生体試料）が活性している状態であるとして、ＧＦＰのシグナルが常に一番強い状態を保つようにＣＯ_２混合ガスの濃度を調整することとしてもよい。

２顕微鏡観察用培養装置
６生体試料
７培養液（培地）
８培養容器
１０チャンバ
１３，１７透明部（１３：蓋透明部、１７：筐体透明部）
２０混合ガス供給装置（培養ガス供給部）
３０ｐＨセンサ（ｐＨ検出部）
４０制御部（培養ガス調整制御部）
５２ステージ
５４照明光源
５６対物レンズ
５８照準機構
６４接眼レンズ（観察部）
１００，２００，３００，４００顕微鏡観察培養システム
１３０光学検出装置（ｐＨ検出部）
１３２ｐＨ検出用光源
１３４ｐＨ検出用画像取得部（蛍光情報取得部）
１３４ＡｐＨ検出用画像取得部（蛍光情報取得部）
１３４ＢｐＨ検出用画像取得部（蛍光情報取得部）
１３８演算部（ｐＨ検出部）
３３４ｐＨ検出用カメラ（蛍光情報取得部）
３６４観察カメラ（画像情報取得部）
４３９光路選択ＤＭ（光路選択部）

Claims

蛍光を発するｐＨ感受性物質が付与された生体試料を収容する培養容器を外気から遮断した状態で収納し、光を透過させる透明部を備えるチャンバと、
前記チャンバ内に前記生体試料の培養に用いる培養ガスを濃度を調整して供給する培養ガス供給部と、
前記生体試料に励起光が照射されることにより前記ｐＨ感受性物質から発生した蛍光を検出して蛍光情報を取得する蛍光情報取得部と、該蛍光情報取得部により取得された前記蛍光情報に基づきｐＨ値を算出する演算部とを備えるｐＨ検出部と、
該ｐＨ検出部により検出されるｐＨ値に基づいて、前記培養ガス供給部の前記培養ガスの濃度を調整する培養ガス調整制御部と、
前記チャンバを載置するステージと、
前記チャンバの前記透明部を介して前記培養容器内の前記生体試料に照明光を照射する照明光源と、
前記照明光が照射された前記生体試料からの戻り光を集光する対物レンズと、
前記ステージと前記対物レンズとを相対的に光軸方向に移動させて該対物レンズの焦点位置を調整する照準機構と、
前記対物レンズにより集光された前記戻り光を観察する観察部とを備える顕微鏡観察培養システム。
前記観察部が、前記対物レンズにより集光された前記戻り光を撮影し、画像情報を取得する画像情報取得部を備え、
前記画像情報取得部が、前記ｐＨ感受性物質から発生して前記対物レンズで集光される前記蛍光を検出して前記ｐＨ感受性物質の蛍光画像を取得することにより前記蛍光情報取得部として機能し、
前記演算部が、前記画像情報取得部により取得された前記ｐＨ感受性物質の前記蛍光画像に基づき前記ｐＨ値を算出する請求項１に記載の顕微鏡観察培養システム。
前記観察部が、前記対物レンズにより集光された前記戻り光を撮影し、画像情報を取得する画像情報取得部を備え、
前記蛍光情報取得部が前記ｐＨ感受性物質から前記照明光の透過方向に向かって発生した蛍光を検出して前記蛍光情報を取得し、この蛍光情報取得部により取得された前記蛍光情報に基づき前記演算部が前記ｐＨ値を算出する請求項１に記載の顕微鏡観察培養システム。
前記観察部が、前記対物レンズにより集光された前記戻り光を撮影し、画像情報を取得する画像情報取得部を備える請求項１に記載の顕微鏡観察培養システム。
前記画像情報取得部により取得された前記画像情報を記憶する記憶部を備え、
前記画像情報取得部が一定の時間間隔をあけて前記画像情報を取得して前記記憶部に記憶し、前記画像情報取得部により前記画像情報が取得されない合間に、前記ｐＨ検出部が前記ｐＨ値を検出するとともに前記培養ガス調整制御部が前記培養ガスの濃度を制御する請求項２から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡観察培養システム。
前記ｐＨ検出部が、前記培地に照射される前記励起光を発生するｐＨ検出用光源を備える請求項１に記載の顕微鏡観察培養システム。
前記蛍光情報取得部が複数配置され、複数の該蛍光情報取得部に入射される前記蛍光の波長を選択的に分割する光路選択部を備える請求項６に記載の顕微鏡観察培養システム。
蛍光を発するｐＨ感受性物質が付与された生体試料を収容する培養容器を外気から遮断した状態で収納し、光を透過させる透明部を備えるチャンバと、
前記チャンバ内に前記生体試料の培養に用いる培養ガスを濃度を調整して供給する培養ガス供給部と、
前記生体試料に前記チャンバの前記透明部を介して励起光を照射するｐＨ検出用光源と、前記励起光が照射され前記ｐＨ感受性物質が励起されることにより発生した蛍光を検出して蛍光情報を取得する蛍光情報取得部と、該蛍光情報取得部により取得された前記蛍光情報に基づきｐＨ値を演算する演算部とを備えるｐＨ検出部と、
該ｐＨ検出部により検出されるｐＨ値に基づいて、前記培養ガス供給部の前記培養ガスの濃度を調整する培養ガス調整制御部とを備える顕微鏡観察用培養装置。
前記蛍光情報取得部が複数配置され、複数の該蛍光情報取得部に入射される前記蛍光の波長を選択的に分割する光路選択部を備える請求項８に記載の顕微鏡観察用培養装置。