JP5715305B2 - オートファジー誘導性ペプチド - Google Patents
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Description
本発明は、オートファジーを誘導するための方法および組成物を提供する。
−該ペプチドはN末端でT−Nに隣接しており、C末端でTに隣接している;
−該ペプチドはF270、F274およびW277の少なくとも1つを含む;
−該ペプチドは少なくとも1つの置換、特にH275E、S279DまたはQ281Eの置換を含む;
−該ペプチドはN末端で該第1部分に結合しており、C末端で第2異種部分に結合している;
−該ペプチドはリンカーまたはスペーサーを介して該第1部分に結合している;
−該第1部分は、タンパク質由来(例えば、tat、smac、pen、pVEC、bPrPp、PIs1、VP22、M918、pep−3)、キメラ(例えば、TP、TP10、MPGΔ)および合成(例えば、MAP、Pep−1、オリゴ−Arg)細胞透過性ペプチドを含むトランスダクションドメインを含む;
−該第1部分は、ホーミングペプチド、例えばRGD−4C、NGR、CREKA、LyP−1、F3、SMS、IF7またはH2009.1を含む;
−該第1部分は、安定化剤、例えばPEG、オリゴ−N−メトキシエチルグリシン(NMEG)、アルブミン、アルブミン結合タンパク質または免疫グロブリンFcドメインを含む;
−該ペプチドは、1以上のD−アミノ酸、L−β−ホモアミノ酸、D−β−ホモアミノ酸またはN−メチル化アミノ酸を含む;
−該ペプチドは環化している;
−該ペプチドはアセチル化、アシル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、硫酸化またはグリコシル化されている;
−該化合物は、N末端アセチル、ホルミル、ミリストイル、パルミトイル、カルボキシルもしくは2−フロシル基および/またはC末端ヒドロキシル、アミド、エステルもしくはチオエステル基を含む;
−該化合物はアフィニティタグまたは検出可能な標識を含む;ならびに/または
−該ペプチドはN末端で該第1部分に結合しており、C末端で、検出可能な標識、例えば蛍光標識を含む第2異種部分に結合している。
−該ペプチドはN末端でT−Nに隣接しており、C末端でTに隣接しており、該第1部分は、ジグリシンリンカーを介して該ペプチドに連結されたtatタンパク質トランスダクションドメインである;および
−該ペプチドはN末端でT−Nに隣接しており、C末端でTに隣接しており、該第1部分は、マレイミド−PEG(3)リンカーを介して該ペプチドに連結されたH2009.1として公知の四量体インテグリンα(v)β(6)結合性ペプチドである。
1つの態様においては、本発明は、(a)12個以下(または6、3、2、1もしくは0個)の天然で隣接しているベクリン1残基に各末端において直接的に隣接しているベクリン1残基269−283[該残基269−283のうちの6個(または3、2、1もしくは0個)までは置換されていてもよい]を含むオートファジー誘導性ペプチドと、(b)例えばその化合物の治療上の安定性または運搬を促進する第1異種部分とを含むオートファジー誘導性化合物または組成物を提供する。
A.Tat−ベクリン1ペプチドはインビトロにおけるオートファジーの強力な誘導物質である
HIV−1ウイルスタンパク質Nefはオートファジータンパク質ベクリン1と相互作用することが示されている12。HIV−1 Nefとベクリン1の相互作用に不可欠である、ベクリン1のドメインを位置決定するために、本発明者らは種々のflagエピトープタグ付きベクリン1欠失突然変異体(アミノ酸1−377、141−450および257−450)をC末端HAエピトープタグ付きNefと共にコトランスフェクトした。全3個のflag−ベクリン1欠失突然変異体がNef−HAと共に免疫共沈降した。このことは、共通の重複領域であるベクリン1のアミノ酸244−377(進化的保存ドメイン(ECD)と称される)がHIV−1 Nefへの結合に関与しうることを示唆している。
次に、Tatタンパク質トランスダクションドメインに連結された18マー配列における最小生物活性領域を決定し、潜在的必須残基を特定するために、Tat−ベクリン1ペプチドの追加的な突然変異分析を行った。ベクリン1のアミノ酸277におけるトリプトファン残基からイソロイシンへの突然変異は、p62レベルおよびLC3−II変換のウエスタンブロット分析により測定された場合、Tat−ベクリン1の活性を低減し、270位におけるフェニルアラニンからセリンへの突然変異または274位におけるフェニルアラニンからセリンへの突然変異はTat−ベクリン1ペプチド媒介性オートファジー誘導を阻止した。しかし、F274およびW277における置換を有するペプチドは有意な活性を保有していた。
Tat−ベクリン1ペプチドがマウスにおいてオートファジーを誘導するかどうかを調べるために、オートファゴソームに関するマーカータンパク質であるGFP−LC3をトランスジェニック発現するマウス16を使用した。Tat−ベクリン1またはTat−スクランブルペプチドを6〜8週齢のマウスに20mg/kgの用量で腹腔内注射し、注射の6時間後、肺および骨格筋(外側広筋)の2つの組織を回収した。Tat−ベクリン1で処理されたマウスの筋肉組織および肺マクロファージにおいては、Tat−スクランブルで処理されたものと比較して有意に大きな数のオートファゴソームが観察された。5日齢の乳飲みマウスにおいて、Tat−スクランブル対照、Tat−ベクリン1ペプチド、またはTat−ベクリン1の逆(retro−inverso)D−アミノ酸形態で処理されたマウスの脳におけるp62タンパク質発現のレベルを測定することにより、オートファジー誘導を評価した。Tat−スクランブルペプチド対照で処理されたマウスと比較して、Tat−ベクリン1ペプチドのL−またはD−形態で処理されたマウスの脳におけるp62レベルの有意な減少が見出された。複数の反復実験に基づけば、全体として、Tat−ベクリン1のD−形態は、脳内のオートファジーの誘導において、より活性であるらしい。また、Tat−ベクリン1のL−およびD−形態での処理の後、骨格筋、心筋および外分泌膵臓におけるオートファジー誘導のレベルを比較した。これらの組織の3つ全てにおいて、Tat−ベクリン1のD−形態での処理はTat−ベクリン1のL−形態での処理より有意に高いレベルのオートファゴソームを示し、更なる研究は、この活性がベクリン1ペプチドにおける追加的置換に対して抵抗性であること証明している。
オートファジーの誘導は、ハンチントン病(HD)を引き起こす凝集性突然変異ハンチンチン(Htt)タンパク質の消失を招く17,18。Tat−ベクリン1媒介性オートファジーがHtt凝集およびHttタンパク質のレベルを減少させるかどうかを調べるために、本発明者らは、103残基のポリQ拡張(Htt103Q)をコードするhttのエキソン1を発現するHeLa細胞系であるHeLa/Htt103Q細胞19をTat−ベクリン1ペプチドで処理した。該細胞系は、蛍光顕微鏡検査によりHttの消失を評価することを可能にするCFPに融合したドキシサイクリン(dox)抑制性Htt103Qを発現する19。オートファジーは大きなタンパク質凝集物を消失させないという従前報告に合致して、Tat−ベクリン1ペプチド処理は大きな(>1μm)Htt103Q凝集物の数に影響を及ぼさなかった。しかし、Tat−ベクリン1処理(1日当たり4時間で2日間)は小さな(<1μm)Htt103Q凝集物の数を、Htt103Qの発現を抑制するドキシサイクリン(100ng/ml)での処理と同様に効率的に減少させた。これらの知見は、大きなタンパク質凝集物、小さなタンパク質凝集物および可溶性タンパク質を分離するためのフィルタートラップアッセイを用いて生化学的に証明された。本発明者らの顕微鏡分析に類似して、Tat−ベクリン1ペプチドは、Htt103Qタンパク質合成のドキシサイクリン抑制に類似した度合で、小さな凝集物におけるHtt103Qタンパク質の量を減少させた。更に、Tat−ベクリン1ペプチドはまた、可溶性Htt103Qタンパク質の発現のレベルの顕著な減少をもたらした。これらの知見は、Tat−ベクリン1ペプチドが突然変異Httタンパク質の前凝集および小凝集形態を消失させる可能性があり、ハンチントン病および他の神経変性疾患の治療におけるこの物質の前臨床試験に関する論理的根拠を与えうることを示している。
これまでに、本発明者らは、ベクリン1の過剰発現がマウス脳におけるシンドビスウイルス複製を低減することを示した6。より最近になって、本発明者らは、ニューロンにおけるオートファジー遺伝子Atg5を欠くマウスが、中枢神経系の致死性シンドビスウイルス感染に、より感受性であることを示し14、本発明者らの共同研究者は、Atg16L1オートファジー遺伝子の低次形態対立遺伝子を有するマウスが、致死性チクングニヤウイルス感染に、より感受性であることを示している20。また、他の研究は、ベクリン1および他のオートファジー遺伝子の遺伝的ノックアウトまたはノックダウンが、植物におけるタバコモザイクウイルス21およびドロゾフィラ(drosophila)における水疱性口炎ウイルス22を含む種々のウイルスの複製を増強することを示している。総合すると、これらの研究は多種多様なウイルスの制御におけるオートファジーの重要な役割を示している。
幾つかの研究は、結核の原因因子であるエム・ツベルクローシス(M.tuberculosis)に対する宿主防御においてオートファジーが決定的に重要な役割を果たすことを示している23,24,25。エム・ツベルクローシス(M.tuberculosis)は最も重要な世界的病原体であり、全世界の人口の約3分の1が結核を有し、毎年200万〜300万人が結核で死亡している。結核を治療し根絶させるために、より良好な治療が必要とされている。
Tat−ベクリン1ペプチドがチクングニヤウイルス複製をインビトロで抑制することを確認した後、本発明者らはマウス新生児感染モデルにおける死亡率およびウイルス複製に対するその効果を評価した。チクングニヤは、幾つかの致命的症例を含む急性熱病を引き起こし、東南アジアで重大な問題となっている新興病原体である26。また、それはNational Institute of Allergy and Infectious Diseasesにより潜在的生物脅威因子とみなされている。現在、チクングニヤに対する特異的治療法は存在せず、この疾患に対するワクチンは利用可能でない。
西ナイルウイルスは重要な世界的新興病原体であり、1999年に北米にそれが侵入して以来、北米における流行性髄膜脳炎の最も頻繁な原因となっている27。神経侵襲性疾患(無菌性髄膜炎、脳炎、髄膜炎)は稀な感染症状であるが(感染個体の約1%)、神経疾患を有する者においては罹病率および致死率が非常に高い。他のアルボウイルスの場合と同様に、現在、利用可能な抗ウイルス治療は存在しない。また、利用可能なワクチンも存在しない。
リケッチアは、発疹チフスおよびロッキー山紅斑熱を含む重篤なヒト感染症を引き起こしうる節足動物媒介性細菌の一群である31,32。リケッチアは、オートファジーの細胞経路が宿主防御メカニズムを代表するものであることが仮定された最初の細胞内細菌病原体である32。したがって、リケッチア症の専門家であるUTMBのGustavo Valbuena博士との共同研究において、本発明者らはリケッチア・コノリイ(Rickettsia conorii)感染のマウスモデルにおいてTat−ベクリン1処理の効果を評価した。Tat−ベクリン1ペプチド処理は肺における細菌負荷の有意な低減(接種後第6日に測定された)ならびに肝臓および脳における低減の傾向をもたらすことを見出した。これらの結果はTat−ベクリン1のL−アミノ酸形態で得られた。現在、Tat−ベクリン1のD−アミノ酸形態での追加的な研究が繰り返されている。
前記研究において、本発明者らは、ハンチンチン凝集物を含有する又はウイルスもしくは細胞内細菌に感染した細胞に対するオートファジーの防御効果を記載している。しかし、高レベルのオートファジーは細胞死を誘導することが可能であり、これは、癌細胞を殺すための治療手段として潜在的に有用でありうるであろう。したがって、細胞死を誘導するTat−ベクリン1の能力を調べた。
Tat−ベクリン1ペプチドがどのようにしてオートファジーを誘導するのかを調べるために、本発明者らは、Tat−ベクリン1ペプチドの結合タンパク質を特定するための生化学的分析を行った。注目すべきことに、アミノ酸267−284はベクリン1 ECDの公知結合相手(例えば、Vps34)に要求されなかった。このことは、ベクリン1のこの領域は現在未特定のベクリン1の結合相手とのその相互作用に要求されることを示唆している。Tat−ベクリン1に結合するタンパク質を単離するために、本発明者らは細胞透過性ビオチン共役Tat−ベクリン1ペプチドを使用し、該ペプチド(または対照ビオチン共役Tat−スクランブルペプチド)と共にHeLa細胞を3時間処理し、ライセートをストレプトアビジンビーズと混合した。ビオチン共役Tat−ベクリン1に結合したタンパク質をビオチン共役Tat−スクランブルの場合と比較して、15〜20kDaのビオチン共役Tat−ベクリン1に結合したタンパク質のサンプルにおける特異的バンドを観察した。このバンドは、LC−MS/LC分析により、ホスファチジルイノシトールを含む負荷電脂質を含有するリポソームに結合することがこれまでに報告されているタンパク質であるGAPR−133と特定された。LC−MS/MS分析に用いたのと同じ方法により調製されたサンプルの免疫ブロット分析を行うために抗GAPR−1抗体を使用することにより、ビオチン−Tat−ベクリン1とGAPR−1との相互作用を確認した。また、ベクリン1のアミノ酸267−284(Tat−ベクリン1ペプチド内に含有されている領域)が、完全長ベクリン1タンパク質がGAPR−1と相互作用するのに必要かどうかを調べた。野生型ベクリン1はGAPR−1と免疫共沈降するが、アミノ酸267−284を欠くベクリン1欠失突然変異体は、非特異的結合のバックグラウンドレベルを超えるレベルでGAPR−1と相互作用しないことを、本発明者らの結果は示している。総合すると、これらのデータは、ベクリン1のアミノ酸267−284が、ベクリン1がGAPR−1と相互作用するのに必要かつ十分であることを示している。
1.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基267−284
2.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基267−284,H275E
3.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基267−284,S279D
4.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基267−284,Q281E
5.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基267−284,H275E,S279D,Q281E
6.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基267−284,H275E,S279D,Q281E,V269I,A272G,G283A
7.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基267−284,F274およびW277
8.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基268−284
9.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基267−283
10.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基269−284
11.HIV−l Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基268−283
12.HIV−l Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基269−283
13.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基257−283
14.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基269−283
15.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基257−295
16.H2009.1−マレイミド−PEG(3)−ベクリン1残基267−284
17.FLAAG−マレイミド−PEG(3)−ベクリン1残基267−284
18.ビオチン−マレイミド−PEG(3)−ベクリン1残基267−284
19.pVec−ε−アミノカプロン酸−PEG(3)−ベクリン1残基267−284
20.RGD−4C−ε−アミノカプロン酸−PEG(3)−ベクリン1残基267−284
21.マレイミド−PEG(3)−ベクリン1残基267−284
22.アルブミン−ε−アミノカプロン酸−PEG(3)−ベクリン1残基267−284
23.FITC−Ser−PEG(3)−ベクリン1残基267−284−ポリHis
24.GFP−PA−ベクリン1残基267−284−TAP
25.PEG−ベクリン1残基267−284−Cys−AuNP
26.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基(D)269−284
27.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基(D)269−284
28.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基267−284,N−271 N結合N−アセチルグルコサミン
29.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基267−284,N−271 N結合N−アセチルグルコサミン,S279 O結合N−アセチル−ガラクトサミン
30.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基(N−メチル)269−284
31.HIV−1 Tat PTD−ジグリシン−ベクリン1残基N−アセチル−269−284−C−アミド
32.HIV−1 Tat PTD−Cys−ベクリン1残基269−284−Cys(ジスルフィド環状)
略語:H2009.1:四量体インテグリンα(v)β(6)結合性ペプチド;PTD:タンパク質トランスダクションドメイン;PA:ブドウ球菌タンパク質Aのα−ヘリックス束状ドメインA;GFP:グリーン蛍光タンパク質;AuNP:金ナノ粒子。
Claims (18)
- オートファジー誘導性化合物であって、
(a)12個以下の天然で隣接しているベクリン1残基に各末端において直接的に隣接しているベクリン1残基269−283(配列番号1)を含むオートファジー誘導性ペプチド(該ペプチドは、置換H275E、S279D及びQ281Eの少なくとも1つを含んでいてもよい)と、(b)その化合物の治療上の安定性または運搬を促進する、前記オートファジー誘導性ペプチドと連結した第1異種部分とを有するオートファジー誘導性化合物。 - 該ベクリン1残基269−283がN末端でT−Nに隣接しており、C末端でTに隣接している、請求項1記載の化合物。
- 該ベクリン1残基269−283が置換H275E、S279DまたはQ281Eの少なくとも1つを含む、請求項1記載の化合物。
- 該オートファジー誘導性ペプチドがN末端で該第1異種部分に結合しており、C末端で第2異種部分に結合している、請求項1記載の化合物。
- 該オートファジー誘導性ペプチドがリンカーを介して該第1異種部分に結合している、請求項1記載の化合物。
- 該第1異種部分がトランスダクションドメインを含む、請求項1記載の化合物。
- 該第1異種部分がホーミングペプチドを含む、請求項1記載の化合物。
- 該第1異種部分が血清安定化剤を含む、請求項1記載の化合物。
- 該オートファジー誘導性ペプチドが1以上のD−アミノ酸、L−β−ホモアミノ酸、D−β−ホモアミノ酸またはN−メチル化アミノ酸を含む、請求項1記載の化合物。
- 該オートファジー誘導性ペプチドが環化している、請求項1記載の化合物。
- N末端アセチル、ホルミル、ミリストイル、パルミトイル、カルボキシルもしくは2−フロシル基および/またはC末端ヒドロキシル、アミド、エステルもしくはチオエステル基を含む、請求項1記載の化合物。
- 該オートファジー誘導性ペプチドがアセチル化、アシル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、硫酸化またはグリコシル化されている、請求項1記載の化合物。
- アフィニティタグまたは検出可能な標識を含む、請求項1記載の化合物。
- 該オートファジー誘導性ペプチドがN末端で該第1異種部分に結合しており、C末端で、蛍光標識を含む第2異種部分に結合している、請求項1記載の化合物。
- 該ベクリン1残基269−283がN末端でT−Nに隣接しており、C末端でTに隣接しており、該第1異種部分が、ジグリシンリンカーを介して該オートファジー誘導性ペプチドに連結されたtatタンパク質トランスダクションドメインである、請求項1記載の化合物。
- 該ベクリン1残基269−283がN末端でT−Nに隣接しており、C末端でTに隣接しており、該第1異種部分が、マレイミド−PEG(3)リンカーを介して該オートファジー誘導性ペプチドに連結されたH2009.1として公知の四量体インテグリンα(v)β(6)結合性ペプチドである、請求項1記載の化合物。
- ベクリン1−GAPR1相互作用のモジュレーターを特定するための組成物であって、予め決められた量の(a)ベクリン1残基267−284(配列番号2)から成るペプチド、ベクリン1または残基267−284(配列番号2)を含むGAPR1結合性ベクリン1ペプチド、および(b)GAPR1を含む前記組成物。
- (a)ある物質の非存在下ではベクリン1残基267−284(配列番号2)から成るペプチド、ベクリン1または残基267−284(配列番号2)を含むGAPR1結合性ベクリン1ペプチドがGAPR1を対照相互作用に関わらせる条件下、請求項17記載の組成物を該物質と一緒にし、
(b)該ベクリン1残基267−284から成るペプチド、ベクリン1または残基267−284を含むGAPR1結合性ベクリン1ペプチドと該GAPR1との間の試験相互作用を検出する工程を含む、ベクリン1−GAPR1相互作用のモジュレーターを特定する方法であって、
該対照相互作用と試験相互作用との相違がベクリン1−GAPR1相互作用のモジュレーターとしての該物質を特定する、方法。
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