JP5715305B2 - オートファジー誘導性ペプチド - Google Patents

Description

本発明はオートファジー誘導性ペプチドに関する。

本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）により授与された助成番号Ｕ５４ＡＩ０５７１５６に基づく米国政府の援助によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

本出願人は、２０１２年２月１１日付け出願のＵＳ Ｓｅｒ Ｎｏ．６１／５９７，７４１に基づく優先権を主張する。

オートファジーを調節し遂行する分子カスケードは多数の総説の主題になっている^１−４。オートファジーを調節するシグナルおよびオートファジーを遂行する遺伝子の特定はオートファジー経路の検出および操作を促進している^５。酵母Ａｔｇ８または哺乳類ＬＣ３のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）共役は、オートファゴソーム膜と安定に会合するＡｔｇ８またはＬＣ３の不溶性形態（それぞれＡｔｇ８−ＰＥまたはＬＣ３−ＩＩ）を与える。その結果、オートファジーは、生化学的に（Ａｔｇ８−ＰＥまたはＬＣ３−ＩＩの生成を評価することにより）または顕微鏡的に（例えば、蛍光標識Ａｔｇ８またはＬＣ３の局在化パターンを観察することにより）検出されうる。

本発明者らの研究室は、中心的必須オートファジー遺伝子の１つであるベクリン（ｂｅｃｌｉｎ）１を発見した^６。ベクリン１は酵母Ａｔｇ６／Ｖｐｓ３０の哺乳類オルソログである^７。それはクラスＩＩＩホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ），Ｖｐｓ３４と相互作用し、オートファゴソーム形成の第１段階、すなわち、小胞体における隔離膜（ファゴホアとしても公知である）の核形成（オートファジー小胞核形成と呼ばれる過程である）に関与する。遺伝子ノックアウト／ノックダウン研究は、植物、粘菌、線虫、ショウジョウバエ、マウスおよびヒト細胞におけるオートファジーにおけるＡＴＧ６／ベクリン１に関する保存された要件を示している^９。ベクリン１の発現および／または機能の低減は癌、アルツハイマー病、ハンチントン病およびデスミン関連心筋症に対する感受性の増加；微生物病原性の変化おける改変；アポトーシスコープスの消失および発生における欠損；ならびに老化に関連づけられている^９。

ベクリン１は、中心のコイルドコイルドメインを有する４５０アミノ酸のタンパク質をコードしている。そのＮ末端内に、それはＢＨ３のみのドメインを含有し、これはＢｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬのような抗アポトーシス分子への結合を媒介する^１０。進化的保存ドメイン（ＥＣＤ）と称される最も高度に保存された領域はアミノ酸２４４−３３７に伸長し、これはＶｐｓ３４とのその相互作用に重要である^１０。Ｖｐ３４およびＢｃｌ−２ファミリータンパク質のほかに、ベクリン１は、Ａｔｇ１４（もう１つの中心的オートファジータンパク質）、ＵＶＲＡＧ（オートファゴソーム成熟において機能するタンパク質）、ルビコン（Ｒｕｂｉｃｏｎ）（ベクリン１／Ｖｐｓ３４複合体の負の調節因子）およびアンブラ（Ａｍｂｒａ）１（ベクリン１／Ｖｐｓ３４複合体の正の調節因子）を含む多数の他の結合相手を有する^９。また、ベクリン１は、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ）、エストロゲン受容体、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦおよびｎＰＩＳＴを含む或る受容体および免疫シグナリングアダプタータンパク質、ならびにＨＳＶ−１ ＩＣＰ３４、ＫＳＨＶ ｖＢｃｌ−２、ＨＩＶ−１ ＮｅｆおよびインフルエンザＭ２のような或るウイルスビルレンスタンパク質と相互作用すると報告されている^９。ベクリン１の過剰発現は、オートファジーを誘導するのに十分であり^１１、本発明者らの研究室は、上皮増殖因子受容体およびＡｋｔを含む、ヒトの癌において活性化される２つの発癌性増殖シグナリング分子が共に、ベクリン１と相互作用し、そのオートファジー機能を抑制することを示している。

発明の概括
本発明は、オートファジーを誘導するための方法および組成物を提供する。

１つの態様においては、本発明は、（ａ）１２個以下の天然で隣接しているベクリン１残基に各末端において直接的に隣接しているベクリン１残基２６９−２８３（該残基２６９−２８３のうちの６個までは置換されていてもよい）を含むオートファジー誘導性ペプチドと、（ｂ）例えばその化合物の治療上の安定性または運搬を促進する第１異種部分とを含むオートファジー誘導性化合物または組成物を提供する。

活性なそのような化合物は、種々の代替的構造および式を伴って開発されており、種々の特定の実施形態においては、例えば、以下のとおりである：
−該ペプチドはＮ末端でＴ−Ｎに隣接しており、Ｃ末端でＴに隣接している；
−該ペプチドはＦ２７０、Ｆ２７４およびＷ２７７の少なくとも１つを含む；
−該ペプチドは少なくとも１つの置換、特にＨ２７５Ｅ、Ｓ２７９ＤまたはＱ２８１Ｅの置換を含む；
−該ペプチドはＮ末端で該第１部分に結合しており、Ｃ末端で第２異種部分に結合している；
−該ペプチドはリンカーまたはスペーサーを介して該第１部分に結合している；
−該第１部分は、タンパク質由来（例えば、ｔａｔ、ｓｍａｃ、ｐｅｎ、ｐＶＥＣ、ｂＰｒＰｐ、ＰＩｓ１、ＶＰ２２、Ｍ９１８、ｐｅｐ−３）、キメラ（例えば、ＴＰ、ＴＰ１０、ＭＰＧΔ）および合成（例えば、ＭＡＰ、Ｐｅｐ−１、オリゴ−Ａｒｇ）細胞透過性ペプチドを含むトランスダクションドメインを含む；
−該第１部分は、ホーミングペプチド、例えばＲＧＤ−４Ｃ、ＮＧＲ、ＣＲＥＫＡ、ＬｙＰ−１、Ｆ３、ＳＭＳ、ＩＦ７またはＨ２００９．１を含む；
−該第１部分は、安定化剤、例えばＰＥＧ、オリゴ−Ｎ−メトキシエチルグリシン（ＮＭＥＧ）、アルブミン、アルブミン結合タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメインを含む；
−該ペプチドは、１以上のＤ−アミノ酸、Ｌ−β−ホモアミノ酸、Ｄ−β−ホモアミノ酸またはＮ−メチル化アミノ酸を含む；
−該ペプチドは環化している；
−該ペプチドはアセチル化、アシル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、硫酸化またはグリコシル化されている；
−該化合物は、Ｎ末端アセチル、ホルミル、ミリストイル、パルミトイル、カルボキシルもしくは２−フロシル基および／またはＣ末端ヒドロキシル、アミド、エステルもしくはチオエステル基を含む；
−該化合物はアフィニティタグまたは検出可能な標識を含む；ならびに／または
−該ペプチドはＮ末端で該第１部分に結合しており、Ｃ末端で、検出可能な標識、例えば蛍光標識を含む第２異種部分に結合している。

特定の実施形態は、例えば以下のような、特定の実施形態の全ての組合せ及び部分的組合せを含む：
−該ペプチドはＮ末端でＴ−Ｎに隣接しており、Ｃ末端でＴに隣接しており、該第１部分は、ジグリシンリンカーを介して該ペプチドに連結されたｔａｔタンパク質トランスダクションドメインである；および
−該ペプチドはＮ末端でＴ−Ｎに隣接しており、Ｃ末端でＴに隣接しており、該第１部分は、マレイミド−ＰＥＧ（３）リンカーを介して該ペプチドに連結されたＨ２００９．１として公知の四量体インテグリンα（ｖ）β（６）結合性ペプチドである。

もう１つの態様においては、本発明は、オートファジーの誘導を要する者に本化合物の有効量を投与することを含む、オートファジーを誘導する方法を提供する。

本発明はまた、ベクリン１−ＧＡＰＲ１相互作用のモジュレーターを特定するための方法および組成物を提供する。

１つの態様においては、本発明は、予め決められた量の（ａ）請求項１記載の化合物、ベクリン１またはＧＡＰＲ１結合性ベクリン１ペプチド、および（ｂ）ＧＡＰＲ１またはＧＡＰＲ１結合性ベクリン１ペプチドを含む組成物を提供する。

もう１つの態様においては、本発明は、（ａ）ある物質の非存在下ではベクリン１またはＧＡＰＲ１結合性ベクリン１ペプチドがＧＡＰＲ１またはＧＡＰＲ１結合性ベクリン１ペプチドを対照相互作用に関わらせる条件下、本組成物を該物質と一緒にし、（ｂ）該ベクリン１またはＧＡＰＲ１結合性ベクリン１ペプチドと該ＧＡＰＲ１またはＧＡＰＲ１結合性ベクリン１ペプチドとの間の試験相互作用を検出する工程を含む、ベクリン１−ＧＡＰＲ１相互作用のモジュレーターを特定する方法を提供し、ここで、該対照相互作用と試験相互作用との相違がベクリン１−ＧＡＰＲ１相互作用のモジュレーターとしての該物質を特定する。

本発明の特定の実施形態の説明
１つの態様においては、本発明は、（ａ）１２個以下（または６、３、２、１もしくは０個）の天然で隣接しているベクリン１残基に各末端において直接的に隣接しているベクリン１残基２６９−２８３［該残基２６９−２８３のうちの６個（または３、２、１もしくは０個）までは置換されていてもよい］を含むオートファジー誘導性ペプチドと、（ｂ）例えばその化合物の治療上の安定性または運搬を促進する第１異種部分とを含むオートファジー誘導性化合物または組成物を提供する。

該オートファジー誘導性ペプチドは、１２個以下（または６、３、２、１もしくは０個）の天然で隣接しているベクリン１残基に各末端において直接的に隣接しているベクリン１残基２６９−２８３（ＶＦＮＡＴＦＨＩＷＨＳＧＱＦＧ；配列番号１）［該残基２６９−２８３のうちの６個（または３、２、１もしくは０個）までは置換されていてもよい］を含む。本明細書に例示されているとおり、ペプチドおよび化合物の活性は、定められた境界内の種々の追加的部分、隣接残基および置換に対して抵抗性である。例えば、幾つかの実施形態においては、該ペプチドはＮ末端でＴ−Ｎに隣接しており、Ｃ末端でＴに隣接している（ＴＮＶＦＮＡＴＦＨＩＷＨＳＧＱＦＧＴ；配列番号２）。他の実施形態においては、該ペプチドは置換Ｈ２７５Ｅ、Ｓ２７９ＤおよびＱ２８１Ｅの少なくとも１つ（または２もしくは３つ）を含む（例えば、ＶＦＮＡＴＦＥＩＷＨＤＧＥＦＧ；配列番号３）。他の実施形態においては、該ペプチドはＦ２７０、Ｆ２７４およびＷ２７７の少なくとも１つ（例えば、２もしくは３つ）を含む。

ペプチドおよび化合物の活性は、バックボーンの修飾および置換、側鎖修飾、ならびにＮおよびＣ末端修飾（これらは全て、ペプチド化学の分野において一般的なものである）に対しても抵抗性である。

ペプチド結合の化学修飾は、酵素媒介性加水分解に対する代謝安定性の増強をもたらすために用いられることが可能であり、例えば、ペプチド結合置換（ペプチド同族体）、例えばトリフルオロエチルアミンは、より代謝的に安定で生物学的に活性なペプチド模倣体を与えうる。

ペプチドバックボーンを束縛するための修飾には、例えば、ＣおよびＮ末端が保護されているためにエキソペプチダーゼに対する代謝安定性の増強を示しうる環状ペプチド／ペプチド模倣体が含まれる。環化のための適当な技術には、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド架橋、ペプチドマクロラクタム、ペプチドチオエーテル、平行および逆平行環状二量体などが含まれる。

他の適当修飾には、ペプチドのバイオアベイラビリティおよび／または活性を改善するために用いられうるアセチル化、アシル化（例えば、リポペプチド）、ホルミル化、アミド化、リン酸化（Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび／またはＴｙｒ上のもの）など、グリコシル化、スルホン化、キレーター（例えば、ＤＯＴＡ、ＤＰＴＡ）の取り込みなどが含まれる。ＰＥＧ化は、ペプチドの安定性、バイオアベイラビリティ、インビボ安定性を増強し、および／または免疫原性を低減するために用いられることが可能であり、多種多様なＰＥＧ、例えばＨｉＰＥＧ、分枝および分岐ＰＥＧ、遊離可能なＰＥＧ；ヘテロ二官能性ＰＥＧ（末端基Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミンおよびカルボン酸を有するもの）などを含む。

適当な末端修飾には、Ｎ末端アセチル、ホルミル、ミリストイル、パルミトイル、カルボキシルおよび２−フロシル、ならびにＣ末端ヒドロキシル、アミド、エステルおよびチオエステル基が含まれ、これらは、該ペプチドが、その天然タンパク質の荷電状態をより厳密に模倣したものとなるようにし、および／または、それを、エキソペプチダーゼによる分解に対して、より安定なものにしうる。

該ペプチドは、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−β−ホモアミノ酸、Ｄ−β−ホモアミノ酸、Ｎ−メチル化アミノ酸などを含む非定型または非天然アミノ酸をも含有しうる。

該化合物は、ベクリン１ペプチドに対して異種（天然で隣接していない）である第１部分、典型的には、治療上の安定性または運搬を促進するもの、そして所望により、好ましくは同様にベクリン１ペプチドに対して異種である同じ又は異なる第２部分を含む。特定の実施形態においては、該ペプチドはＮ末端で該第１部分に結合しており、Ｃ末端で該第２部分に結合している。

多種多様なそのような部分、例えばアフィニティタグ、トランスダクションドメイン、ホーミングもしくは標的化部分、標識または他の官能基、例えば、バイオアベイラビリティおよび／もしくは活性を改善させ、ならびに／または追加的な特性を付与するものが使用されうる。

そのような部分の１つの有用なクラスには、細胞透過性または取り込みを促進するトランスダクションドメイン、例えば、タンパク質由来（例えば、ｔａｔ、ｓｍａｃ、ｐｅｎ、ｐＶＥＣ、ｂＰｒＰｐ、ＰＩｓ１、ＶＰ２２、Ｍ９１８、ｐｅｐ−３）；キメラ（例えば、ＴＰ、ＴＰ１０、ＭＰＧΔ）または合成（例えば、ＭＡＰ、Ｐｅｐ−１、オリゴＡｒｇ）細胞透過性ペプチドが含まれる。例えば、“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”，Ｂｅｒｎｄ Ｇｒｏｎｅｒ編，２００９ ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ，ＫＧａＡ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，特にＣｈａｐ ７：“Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｍａｔｓ Ｈａｎｓｅｎ，Ｅｌｏ ＥｒｉｓｔｅおよびＵｌｏ Ｌａｎｇｅｌ，ｐｐ．１２５−１４４を参照されたい。

もう１つのクラスはホーミング生体分子、例えばＲＧＤ−４Ｃ（ＣＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号４）、ＮＧＲ（ＣＣＮＧＲＣ；配列番号５）、ＣＲＥＫＡ、ＬｙＰ−１（ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ；配列番号６）、Ｆ３、ＳＭＳ（ＳＭＳＩＡＲＬ；配列番号７）、ＩＦ７およびＨ２００９．１（Ｌｉら，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１１ Ｓｅｐ １５；１９（１８）：５４８０−９）、特に、癌細胞ホーミングまたは標的化生体分子であり、この場合の適当な例は当技術分野で公知であり、例えば、Ｈｏｍｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅｓ，Ｐｉｒｊｏ Ｌａａｋｋｏｎｅｎ ａｎｄ Ｋｉｒｓｉ Ｖｕｏｒｉｎｅｎ，Ｉｎｔｅｇｒ．Ｂｉｏｌ．，２０１０，２，３２６−３３７；Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ ＺＩＰ Ｃｏｄｅｓ ｂｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｔｅｅｓａｌｕ Ｔ，Ｓｕｇａｈａｒａ ＫＮ，Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１２；５０３：３５−５６を参照されたい。

そのような部分の他の有用なクラスには、安定化剤、例えばＰＥＧ、オリゴ−Ｎ−メトキシエチルグリシン（ＮＭＥＧ）、アルブミン、アルブミン結合性タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン；アフィニティタグ、例えば免疫タグ、ビオチン、レクチン、キレーターなど；標識、例えば光学的タグ（例えば、Ａｕ粒子、ナノドット）、キレート化ランタニド、蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ローダミン）、ＦＲＥＴアクセプター／ドナーなどが含まれる。

該部分、タグおよび官能基は、当技術分野で公知のリンカーまたはスペーサー、例えばポリグリシン、ε−アミノカプロン酸などを介して該ペプチドに連結されうる。

該化合物および／またはペプチドはまた、潜在的または活性化可能な形態、例えば、活性ペプチドが代謝により遊離［例えば、アシルオキシアルコキシ プロ部分（プロドラッグ１）または３−（２’−ヒドロキシ−４’，６’−ジメチルフェニル）−３，３−ジメチルプロピオン酸 プロ部分（プロドラッグ２）を伴って製造された環状プロドラッグからの直鎖状ペプチドの遊離］されるプロドラッグとして提供されうる。

特定の実施形態は、それぞれが別々に記載されている個々の実施形態の全組合せを含み、例えば、該ペプチドはＮ末端でＴ−Ｎに隣接しており、Ｃ末端でＴに隣接しており、該第１部分は、ジグリシンリンカーを介して該ペプチドに連結されたｔａｔタンパク質トランスダクションドメインであり、該ペプチドはＮ末端でＴ−Ｎに隣接しており、Ｃ末端でＴに隣接しており、該第１部分は、マレイミド−ＰＥＧ（３）リンカーを介して該ペプチドに連結された、Ｈ２００９．１としての公知の四量体インテグリンα（ｖ）β（６）結合性ペプチドである。

もう１つの態様においては、本発明は、オートファジーの誘導を要する者に本化合物または組成物の有効量を投与することを含む、オートファジーを誘導する方法を提供する。本出願は、オートファジーの増強を要する者を広く包含し、オートファジーのアップレギュレーションが治療上有益な疾患および病状、例えば、細胞内病原体による感染、神経変性疾患、癌、心筋症および老化を含む。

オートファジーは、生化学的（Ａｔｇ８−ＰＥもしくはＬＣ３−ＩＩの生成またはｐ６２の分解を評価することによる）または顕微鏡的（例えば、蛍光標識Ａｔｇ８またはＬＣ３の局在化パターンを観察することによる）アッセイを含む、本明細書に開示および／または例示されているような通常のアッセイにより、直接的に、間接的に、または推論により検出されうる。

本発明はまた、ベクリン１−ＧＡＰＲ１相互作用のモジュレーターを特定するための方法および組成物を提供する。

１つの態様においては、本発明は、予め決められた量の（ａ）請求項１記載の化合物、ベクリン１またはＧＡＰＲ１結合性ベクリン１ペプチド、および（ｂ）ＧＡＰＲ１またはＧＡＰＲ１結合性ベクリン１ペプチドを含む組成物を提供する。

もう１つの態様においては、本発明は、（ａ）ある物質の非存在下ではベクリン１またはＧＡＰＲ１結合性ベクリン１ペプチドがＧＡＰＲ１またはＧＡＰＲ１結合性ベクリン１ペプチドを対照相互作用に関わらせる条件下、本組成物を該物質と一緒にし、（ｂ）該ベクリン１またはＧＡＰＲ１結合性ベクリン１ペプチドと該ＧＡＰＲ１またはＧＡＰＲ１結合性ベクリン１ペプチドとの間の試験相互作用を検出する工程を含む、ベクリン１−ＧＡＰＲ１相互作用のモジュレーターを特定する方法を提供し、ここで、該対照相互作用と試験相互作用との相違がベクリン１−ＧＡＰＲ１相互作用のモジュレーターとしての該物質を特定する。このアッセイは、蛍光偏光、プル−ダウン、固相結合などを含む種々の形態で実施されうる。

本明細書に記載されている実施例および実施形態は例示のためのものであるに過ぎず、それを考慮して、種々の修飾または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであると理解される。本明細書中で引用されている全ての刊行物、特許および特許出願（それらにおける引用を含む）の全体を、全ての目的のために、参照により本明細書に組み入れることとする。

実施例
Ａ．Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドはインビトロにおけるオートファジーの強力な誘導物質である
ＨＩＶ−１ウイルスタンパク質Ｎｅｆはオートファジータンパク質ベクリン１と相互作用することが示されている^１２。ＨＩＶ−１ Ｎｅｆとベクリン１の相互作用に不可欠である、ベクリン１のドメインを位置決定するために、本発明者らは種々のｆｌａｇエピトープタグ付きベクリン１欠失突然変異体（アミノ酸１−３７７、１４１−４５０および２５７−４５０）をＣ末端ＨＡエピトープタグ付きＮｅｆと共にコトランスフェクトした。全３個のｆｌａｇ−ベクリン１欠失突然変異体がＮｅｆ−ＨＡと共に免疫共沈降した。このことは、共通の重複領域であるベクリン１のアミノ酸２４４−３７７（進化的保存ドメイン（ＥＣＤ）と称される）がＨＩＶ−１ Ｎｅｆへの結合に関与しうることを示唆している。

この仮定を試験するために、ＥＣＤ内に種々の欠失を含有する幾つかのベクリン１突然変異体を構築した。免疫共沈降実験は、ベクリン１のアミノ酸２６７−２９９が、ベクリン１がＮｅｆに結合するのに必須であることを示した。２６７−２９９の領域内のベクリン１のどのアミノ酸がＨＩＶ−１ Ｎｅｆへの結合に必要なのかを更に位置決定するために、２つの追加的な欠失突然変異体を構築した。アミノ酸２８５−２９９を欠くベクリン１欠失突然変異体と比較して、アミノ酸２６７−２８４を欠く欠失突然変異体は、ＨＩＶ−１ Ｎｅｆへの、より弱い結合を示した。これは、該ＥＣＤ内のベクリン１のアミノ酸２６７−２８４がＨＩＶ−１ Ｎｅｆとのベクリン１の相互作用に決定的に重要であることを示している。

次に、ベクリン１のアミノ酸２６７−２８４がベクリン１のオートファジー機能に必要かどうかを調べた。これを行うために、低レベルの内因性ベクリン１を発現し、外因性ベクリン１発現の非存在下で飢餓誘導性オートファジーを欠くＭＣＦ−７細胞^７，１１を使用した。ＭＣＦ−７細胞を、オートファゴソームの緑色標識マーカー（ＧＦＰ−ＬＣ３^１３）、およびアミノ酸２６７−２８４の欠失を含有するＦｌａｇ−ベクリン１または完全長Ｆｌａｇ−ベクリン１のいずれかをコードするプラスミドでコトランスフェクトした。正常または飢餓培地内の培養の後、オートファゴソーム（ＧＦＰ−ＬＣ３ドット）の数を定量した。正常培地においては、空ベクター、ならびにＷＴ Ｆｌａｇ−ベクリン１およびＦｌａｇ−ベクリン１Δ２６７−２８４を発現するプラスミドでトランスフェクトされた細胞において、オートファジーレベルは類似していた。ＷＴ Ｆｌａｇ−ベクリン１でトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞においては、飢餓はオートファジーを増強したが、空ベクターまたはＦｌａｇ−ベクリン１Δ２６７−２８４でトランスフェクトされた細胞においてはそうではなかった。このことは、ベクリン１のアミノ酸２６７−２８４がベクリン１のオートファジー機能に決定的に重要であることを示している。

次に、ベクリン１のアミノ酸２６７−２８４はオートファジーの誘導に十分であるかどうかを調べた。これを評価するために、ＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質トランスダクションドメイン（ＰＴＤ）、ジグリシンリンカーおよびアミノ酸２６７−２８４に伸長するベクリン１の領域に由来する１８アミノ酸から構成される細胞透過性ペプチドを設計した。該ペプチドの疎水性を増強し、溶解度を最適化するために、この領域内に、Ｈ２７５Ｅ、Ｓ２７９ＤおよびＱ２８１Ｅを含む３つの置換を施した。これらの置換がベクリン１発現にもベクリン１／Ｎｅｆ相互作用にも影響を及ぼさないことを確認するために、該突然変異Ｆｌａｇ−ベクリン１ Ｈ２６７Ｅ／Ｓ２７９Ｄ／Ｑ２８１Ｅを発現するプラスミドを構築した。Ｆｌａｇ−ベクリン１ Ｈ２６７Ｅ／Ｓ２７９Ｄ／Ｑ２８１Ｅは、ＷＴ Ｆｌａｇ−ベクリン１の場合と同様に効率的に、Ｎｅｆ−２ＨＡと免疫共沈降した。このことは、ベクリン１における置換Ｈ２６７Ｅ、Ｓ２７９ＤおよびＱ２８１ＥがＨＩＶ−１ Ｎｅｆへのその結合を変化させないことを示している。更なる研究は、このベクリン１活性が追加的置換に対して抵抗性であることを証明した。

したがって、Ｔａｔタンパク質トランスダクションドメインと、ジグリシンリンカーと、置換Ｈ２６７Ｅ、Ｓ２７９ＤおよびＱ２８１Ｅを含む、ベクリンのアミノ酸２６７−２８４からの１８アミノ酸とから構成される、Ｔａｔ−ベクリン１（Ｔ−Ｂ）と称される３１アミノ酸長のペプチドを合成した。対照ペプチドとして、Ｔａｔ−ベクリン１におけるベクリン１の１８アミノ酸をランダムにシャッフルして、Ｔａｔ−スクランブル（Ｔ−Ｓ）と称されるペプチドを得た。Ｔａｔ−ベクリン１およびＴａｔ−スクランブルの円二色性スペクトルは非常に類似したパターンを示した。このことは、これらの２つのペプチドが類似した三次元構造を有すること、およびＴａｔ−スクランブルがＴａｔ−ベクリン１ペプチドに関する適当な対照ペプチドであることを示している。

次に、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドがオートファジーを誘導するかどうかを調べるために、ｐ６２およびＬＣ３のタンパク質レベルを分析した^５．ｐ６２はオートファジー装置により選択的に分解され、そのタンパク質レベルはオートファジーフラックス（ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｆｌｕｘ）（すなわち、完全オートファジー応答）の量を表す。脂質化ＬＣ３（ＬＣ３−ＩＩ）はオートファゴソームに結合するが、非脂質化ＬＣ３（ＬＣ３−Ｉ）は結合せず、ＬＣ３脂質化はオートファゴソーム形成と相関する。ウエスタンブロット分析は、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−７、ＭＥＦｓ、Ａ５４９、ＨＢＥＣ３０−ＫＴ、ＴＨＰ１およびＨＣＣ８２７細胞を含む複数の細胞系において、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチド処理の後、ｐ６２タンパク質レベルが減少し、ＬＣ３−ＩＩタンパク質レベルが増加したことを示した。ｐ６２分解およびＬＣ３−ＩＩ変換により測定された場合の、オートファジーを誘導するのに必要な厳密な用量は、細胞型によって若干変動する。Ｔａｔ−ベクリン１での結果とは対照的に、Ｔａｔ−スクランブル対照ペプチドで処理された細胞においては、ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩ発現のレベルはいずれの試験用量においても変化しなかった。

本発明者らは、４つの追加的なアッセイを用いて、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドのオートファジー誘導効果を確認した。第１に、ＧＦＰ−ＬＣ３を安定に発現するＨｅＬａ細胞^１４において、Ｔａｔ−ベクリン１がオートファゴソーム数を増加させるかどうかを評価した。Ｔａｔ−ベクリン１で処理された細胞は、Ｔａｔ−スクランブル対照ペプチドで処理された細胞と比較してＧＦＰ−ＬＣ３ドット（オートファゴソーム）の数における２７倍の増加を示した。この誘導の大きさは、最も強力な公知の生理的なオートファジー誘導因子である飢餓で見られるものより大きい。第２に、Ｔａｔ−ベクリン１で処理されたＨｅＬａ細胞におけるオートファジー構造体の存在を確認するための電子顕微鏡検査を行った。Ｔａｔ−ベクリン１で処理された細胞においては多数のオートファゴソームおよびオートリソソームが観察されたが、Ｔａｔ−スクランブルで処理された細胞においては非常に少数のオートファジー構造体が観察されたに過ぎなかった。第３に、オートファゴソーム／リソソーム融合を阻止することによりオートファジー分解を抑制する液胞型Ｈ^＋−ＡＴＰアーゼインヒビターであるバフィロマイシンＡ１の存在下および非存在下でｐ６２およびＬＣ３−ＩＩのレベルを測定することにより、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチド処理がオートファジーフラックスを増加させることを証明した。前記のとおり、バフィロマイシンＡ１の非存在下、ＨｅＬａおよびＣＯＳ７細胞において、Ｔａｔ−ベクリン１はＬＣ３−ＩＩのレベルを増加させ、ｐ６２のレベルを減少させた。Ｔａｔ−ベクリン１で処理されたＨｅＬａおよびＣＯＳ−７細胞において、バフィロマイシンＡ１は、バフィロマイシンＡ１の非存在下のＴａｔ−ベクリン１処理細胞において観察されたものと比較して、ＬＣ３−ＩＩレベルの更なる顕著な増加およびｐ６２タンパク質レベルの軽度な増加を引き起こした。これは、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチド処理がオートファジーフラックスを増強することを示している。第４に、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドにより誘導されたオートファジーフラックスを更に分析するために、細胞からのＴＣＡ−可溶性［^３Ｈ］ロイシンの遊離を測定することにより、長寿命タンパク質の大量分解を評価した。Ｔａｔベクリン１処理細胞においては、Ｔａｔ−スクランブル処理細胞の場合と比較して、長寿命タンパク質分解が有意に増加した。この増加は、オートファゴソーム形成を阻止するホスファチジルイノシトール−３−キナーゼのインヒビターである３−メチルアデニン（３−ＭＡ）^１５により部分的に阻止された。総合すると、これらの結果は、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドがオートファゴソーム形成を誘導し、リソソームによるオートファジー分解を増強することを示している。

２つの必須オートファジー遺伝子であるＡＴＧ７およびベクリン１をノックダウンするためにｓｉＲＮＡを用いることにより、Ｔａｔ−ベクリン１媒介性オートファジーが正規オートファジー経路を必要とするかどうかを調べた。ＡＴＧ７およびベクリン１標的化ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は、それぞれ、Ａｔｇ７およびベクリン１のタンパク質発現を低減し、オートファゴソームの数を有意に減少させた。これらのデータは、クラスＩＩＩ／ＰＩ３Ｋ複合体（すなわち、ベクリン１）およびタンパク質共役系（すなわち、Ａｔｇ７）の両メンバーが関わる正規オートファジーがＴａｔ−ベクリン１ペプチド媒介性オートファジーに関与していることを示している。

Ｂ．Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドの突然変異分析
次に、Ｔａｔタンパク質トランスダクションドメインに連結された１８マー配列における最小生物活性領域を決定し、潜在的必須残基を特定するために、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドの追加的な突然変異分析を行った。ベクリン１のアミノ酸２７７におけるトリプトファン残基からイソロイシンへの突然変異は、ｐ６２レベルおよびＬＣ３−ＩＩ変換のウエスタンブロット分析により測定された場合、Ｔａｔ−ベクリン１の活性を低減し、２７０位におけるフェニルアラニンからセリンへの突然変異または２７４位におけるフェニルアラニンからセリンへの突然変異はＴａｔ−ベクリン１ペプチド媒介性オートファジー誘導を阻止した。しかし、Ｆ２７４およびＷ２７７における置換を有するペプチドは有意な活性を保有していた。

ついで、ペプチドＴａｔ−ベクリン１内のベクリン１の１８マー配列のＮ’末端および／またはＣ’末端におけるアミノ酸を欠く一連のトランケート化突然変異体を構築した。Ｃ’末端の１アミノ酸の欠失（ΔＣ−１）、Ｎ’末端の１アミノ酸の欠失（ΔＮ−１）、Ｎ’末端の２アミノ酸の欠失（ΔＮ−２）、Ｎ’末端の３アミノ酸の欠失（ΔＮ−３）、またはＮ’末端の２アミノ酸の欠失およびＣ’末端アミノ酸の欠失の両方（ΔＮ−２／ΔＣ−１）は、ｐ６２レベルの低減およびＬＣ３−ＩＩ変換の増加の大きさにより測定された場合、完全長Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドに類似した活性、またはより一層大きな活性（ΔＮ−２の場合）を有するペプチドを与えた。Ｃ’末端の２アミノ酸の欠失（ΔＣ−２）またはＮ’末端の４アミノ酸の欠失（ΔＮ−４）を含有するペプチドはＴａｔ−ベクリン１より低い活性を示した。Ｎ’末端の３アミノ酸およびＣ’末端アミノ酸を欠くペプチド（ΔＮ−３／ΔＣ−１）を合成したが、このペプチドはＰＢＳに溶解性でなかった。これらの突然変異分析に基づいて、本発明者らは、Ｔａｔ−ΔＮ−２／ΔＣ−１がＴａｔ−ベクリン１ペプチドの最短活性形態であり、Ｔａｔ−ΔＮ２が、本発明者らが試験したもののなかで最も活性な形態でありうると結論づけた。

Ｃ．Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドはインビボで複数の組織においてオートファジーを誘導する
Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドがマウスにおいてオートファジーを誘導するかどうかを調べるために、オートファゴソームに関するマーカータンパク質であるＧＦＰ−ＬＣ３をトランスジェニック発現するマウス^１６を使用した。Ｔａｔ−ベクリン１またはＴａｔ−スクランブルペプチドを６〜８週齢のマウスに２０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射し、注射の６時間後、肺および骨格筋（外側広筋）の２つの組織を回収した。Ｔａｔ−ベクリン１で処理されたマウスの筋肉組織および肺マクロファージにおいては、Ｔａｔ−スクランブルで処理されたものと比較して有意に大きな数のオートファゴソームが観察された。５日齢の乳飲みマウスにおいて、Ｔａｔ−スクランブル対照、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチド、またはＴａｔ−ベクリン１の逆（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）Ｄ−アミノ酸形態で処理されたマウスの脳におけるｐ６２タンパク質発現のレベルを測定することにより、オートファジー誘導を評価した。Ｔａｔ−スクランブルペプチド対照で処理されたマウスと比較して、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドのＬ−またはＤ−形態で処理されたマウスの脳におけるｐ６２レベルの有意な減少が見出された。複数の反復実験に基づけば、全体として、Ｔａｔ−ベクリン１のＤ−形態は、脳内のオートファジーの誘導において、より活性であるらしい。また、Ｔａｔ−ベクリン１のＬ−およびＤ−形態での処理の後、骨格筋、心筋および外分泌膵臓におけるオートファジー誘導のレベルを比較した。これらの組織の３つ全てにおいて、Ｔａｔ−ベクリン１のＤ−形態での処理はＴａｔ−ベクリン１のＬ−形態での処理より有意に高いレベルのオートファゴソームを示し、更なる研究は、この活性がベクリン１ペプチドにおける追加的置換に対して抵抗性であること証明している。

Ｄ．Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドは、突然変異ヒトハンチンチンタンパク質を発現する細胞における凝集物の蓄積を減少させる
オートファジーの誘導は、ハンチントン病（ＨＤ）を引き起こす凝集性突然変異ハンチンチン（Ｈｔｔ）タンパク質の消失を招く^{１７，１８}。Ｔａｔ−ベクリン１媒介性オートファジーがＨｔｔ凝集およびＨｔｔタンパク質のレベルを減少させるかどうかを調べるために、本発明者らは、１０３残基のポリＱ拡張（Ｈｔｔ１０３Ｑ）をコードするｈｔｔのエキソン１を発現するＨｅＬａ細胞系であるＨｅＬａ／Ｈｔｔ１０３Ｑ細胞^１９をＴａｔ−ベクリン１ペプチドで処理した。該細胞系は、蛍光顕微鏡検査によりＨｔｔの消失を評価することを可能にするＣＦＰに融合したドキシサイクリン（ｄｏｘ）抑制性Ｈｔｔ１０３Ｑを発現する^１９。オートファジーは大きなタンパク質凝集物を消失させないという従前報告に合致して、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチド処理は大きな（＞１μｍ）Ｈｔｔ１０３Ｑ凝集物の数に影響を及ぼさなかった。しかし、Ｔａｔ−ベクリン１処理（１日当たり４時間で２日間）は小さな（＜１μｍ）Ｈｔｔ１０３Ｑ凝集物の数を、Ｈｔｔ１０３Ｑの発現を抑制するドキシサイクリン（１００ｎｇ／ｍｌ）での処理と同様に効率的に減少させた。これらの知見は、大きなタンパク質凝集物、小さなタンパク質凝集物および可溶性タンパク質を分離するためのフィルタートラップアッセイを用いて生化学的に証明された。本発明者らの顕微鏡分析に類似して、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドは、Ｈｔｔ１０３Ｑタンパク質合成のドキシサイクリン抑制に類似した度合で、小さな凝集物におけるＨｔｔ１０３Ｑタンパク質の量を減少させた。更に、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドはまた、可溶性Ｈｔｔ１０３Ｑタンパク質の発現のレベルの顕著な減少をもたらした。これらの知見は、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドが突然変異Ｈｔｔタンパク質の前凝集および小凝集形態を消失させる可能性があり、ハンチントン病および他の神経変性疾患の治療におけるこの物質の前臨床試験に関する論理的根拠を与えうることを示している。

Ｅ．Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドはシンドビスウイルス、西ナイルウイルス、チクングニヤウイルス、マウス適応エボラウイルス、エル・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）およびＨＩＶ１に対する活性を有する
これまでに、本発明者らは、ベクリン１の過剰発現がマウス脳におけるシンドビスウイルス複製を低減することを示した^６。より最近になって、本発明者らは、ニューロンにおけるオートファジー遺伝子Ａｔｇ５を欠くマウスが、中枢神経系の致死性シンドビスウイルス感染に、より感受性であることを示し^１４、本発明者らの共同研究者は、Ａｔｇ１６Ｌ１オートファジー遺伝子の低次形態対立遺伝子を有するマウスが、致死性チクングニヤウイルス感染に、より感受性であることを示している^２０。また、他の研究は、ベクリン１および他のオートファジー遺伝子の遺伝的ノックアウトまたはノックダウンが、植物におけるタバコモザイクウイルス^２１およびドロゾフィラ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）における水疱性口炎ウイルス^２２を含む種々のウイルスの複製を増強することを示している。総合すると、これらの研究は多種多様なウイルスの制御におけるオートファジーの重要な役割を示している。

したがって、本発明者らは、２つのアルファウイルス、すなわち、シンドビスウイルスおよびチクングニヤウイルス、ならびに１つのフラビウイルス、すなわち、西ナイルウイルスに感染したＨｅＬａ細胞を使用して、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドがウイルス複製を抑制するという仮定を検証した。全ての実験において、トリパンブルー排除およびＭＴＴアッセイにより測定された場合に細胞毒性を有さない用量（３０μｍで４時間）のＴａｔ−ベクリン１ペプチドを使用した。シンドビスウイルス、チクングニヤウイルスまたは西ナイルウイルスを０．１プラーク形成単位／細胞の感染多重度でＨｅＬａ細胞に感染させ、感染の４時間後、４時間にわたって該細胞をＴａｔ−スクランブルまたはＴａｔ−ベクリン１ペプチドで処理し、ついで、感染の１８時間後（シンドビスウイルスの場合）または感染の２４時間後（チクングニヤウイルスおよび西ナイルウイルスの場合）、ウイルス力価を測定した。Ｔａｔ−スクランブル対照で処理されたものと比較して、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドで処理された全３種のウイルスに感染した細胞におけるウイルス力価の有意な減少（＞２ ｌｏｇ）を見出した。Ｔａｔ−ベクリン１ペプチド処理が、感染後のより後の時点で投与された場合（ウイルス感染を有する患者においてこのペプチドが治療用物質として使用される状況を模擬しているもの）、ウイルス複製の低減において有効でありうるかどうかを判定するために、チクングニヤウイルス感染の毎日のペプチド処理を、感染の２４時間後から開始した。これは感染の４８時間後および７２時間後にウイルス力価の有意な減少をもたらし、これは、有意により低いウイルス誘導性細胞変性効果に関連づけられた。これらのデータは、感染の開始後に開始されたＴａｔ−ベクリン１ペプチド処理が幾つかの異なる包膜プラス鎖ＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性を有することを示している。

また、本発明者らの共同研究者であるＵＴＭＢのＲｏｂｅｒｔ Ｄａｖｅｙは、マウス適応エボラウイルスに感染したベロ細胞およびＨｅＬａ細胞において、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドの抗ウイルス活性を試験した。これらの実験においては、細胞をＴａｔ−スクランブル対照またはＴａｔ−ベクリン１ペプチドで１時間にわたって前処理し、細胞を０．１ｐｆｕのＭＯＩで感染させ、感染の２４時間後にウイルス感染細胞の比率を決定した。結果は、該Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドがベロ細胞およびＨｅＬａ細胞の両方においてマウス適応エボラウイルスの感染性の低減をもたらすことを示した。

Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドは初代マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）におけるエル・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の細胞内生存を低減した。本発明者らは、オートファジー回避タンパク質ＡｃｔＡを欠くエル・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の株、および未感染ＢＭＤＭに対して無毒性である用量（１０μＭで２時間）の該ペプチドを使用した。この抗細菌効果は、Ａｔｇ５発現の低減およびＴａｔ−ベクリン１誘導性オートファジーの低減を示したＡｔｇ５ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＬｙｓｏｚｙｍｅＭ−Ｃｒｅマウス由来のＢＭＤＭにおいて低減した。

Ｔａｔ−ベクリン１は初代ヒトＭＤＭにおけるＨＩＶ−１複製を顕著に抑制した。確立された前処理モデル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８６，１８８９０−９０２，２０１１；ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ８，ｅ１００２６８９，２０１２）を用いて、本発明者らは、無毒性濃度（０．５、１、２．５および５μＭ）のＴａｔ−ベクリン１の存在下で培養されたＭＤＭにおいて、ＨＩＶ ｐ２４抗原遊離の用量依存性抑制を観察した。この場合、５μＭ Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドで毎日処理された細胞においては、ほとんど検出不可能な抗原レベルが示された。ＨＩＶ−１複製の抑制の大きさは、同様にオートファジーを誘導するｍＴＯＲインヒビターであるラパマイシンで観察されたものに類似していた。ＨＩＶ−１複製のＴａｔ−ベクリン１ペプチド媒介性抑制は正規のオートファジー経路により生じるようであった。なぜなら、必須オートファジー遺伝子ＡＴＧ５のｓｈＲＮＡノックダウンはＴａｔ−ベクリン１誘導性オートファジーを低減し（ＬＣ３脂質化により評価された場合）、細胞生存の低下を何ら伴うことなくＴａｔ−ベクリン１処理の抗ウイルス効果を完全に阻止したからである。

Ｆ．Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドはヒトマクロファージ細胞系ＴＨＰ１細胞においてエム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対するインビトロ抗マイコバクテリア活性を有する
幾つかの研究は、結核の原因因子であるエム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対する宿主防御においてオートファジーが決定的に重要な役割を果たすことを示している^{２３，２４，２５}。エム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は最も重要な世界的病原体であり、全世界の人口の約３分の１が結核を有し、毎年２００万〜３００万人が結核で死亡している。結核を治療し根絶させるために、より良好な治療が必要とされている。

Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドが抗マイコバクテリア活性を有しうるかどうかを評価するために、本発明者らは、ホルボールエステル分化ＴＨＰ−１細胞（ヒトマクロファージのモデル）にエム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を感染させた。感染の１日後、細胞を種々の用量のＴａｔ−ベクリン１またはＴａｔ−スクランブルペプチドで処理し、６日後に細胞内細菌増殖を測定した。１０μｍ以上の用量のＴａｔ−ベクリン１ペプチドがエム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）細菌増殖の有意な低減をもたらすことを見出した。

Ｇ．Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドはマウスにおけるチクングニヤウイルス感染に対する有益な効果を有する
Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドがチクングニヤウイルス複製をインビトロで抑制することを確認した後、本発明者らはマウス新生児感染モデルにおける死亡率およびウイルス複製に対するその効果を評価した。チクングニヤは、幾つかの致命的症例を含む急性熱病を引き起こし、東南アジアで重大な問題となっている新興病原体である^２６。また、それはＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓにより潜在的生物脅威因子とみなされている。現在、チクングニヤに対する特異的治療法は存在せず、この疾患に対するワクチンは利用可能でない。

マウスにおけるＴａｔ−ベクリン１のチクングニヤウイルス病理発生の効果を評価するために、本発明者らは１０^６ ｐｆｕをＣ５７ＢＬ６マウスに皮下（ｓ．ｃ．）感染させ、感染後（ｐ．ｉ．）第１日から１３日間にわたって毎日、該マウスを１５ｍｇ／ｍｌのＴａｔ−ベクリン１ペプチドで腹腔内（ｉ．ｐ．）処理した。感染後第６日までに、調べた２つの筋群（外側広筋およびヒラメ筋）においてウイルス力価の有意な低減が認められることを見出した。オートファジーがチクングニヤウイルス感染筋肉において誘導されることを証明するために、ウイルスに感染したＧＦＰ−ＬＣ３トランスジェニックマウスの筋肉を調べ、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドで処理した。チクングニヤウイルスエンベロープタンパク質Ｅ２抗体に対する抗体での免疫染色により標識されたウイルス感染筋肉細胞において、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドで処理されたマウスにおいては、Ｔａｔ−スクランブル対照ペプチドで処理されたマウスと比較して有意に多いＧＦＰ−ＬＣ３陽性ドットが存在した。重要なことに、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドのインビボ抗ウイルス効果は動物致死性の有意な低減に関連づけられた。Ｔａｔ−スクランブルペプチドで処理された動物の１００％が致死性疾患のために死亡し、一方、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドで処理された動物の５８％が死亡した。

Ｈ．Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドはマウスにおける西ナイルウイルス感染に対する有益な効果を有する
西ナイルウイルスは重要な世界的新興病原体であり、１９９９年に北米にそれが侵入して以来、北米における流行性髄膜脳炎の最も頻繁な原因となっている^２７。神経侵襲性疾患（無菌性髄膜炎、脳炎、髄膜炎）は稀な感染症状であるが（感染個体の約１％）、神経疾患を有する者においては罹病率および致死率が非常に高い。他のアルボウイルスの場合と同様に、現在、利用可能な抗ウイルス治療は存在しない。また、利用可能なワクチンも存在しない。

Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドが、アルボウイルスにより引き起こされる神経感染症に対する防御活性をもたらしうるかどうかを判定するために、本発明者らは、新生児マウスへの西ナイルウイルスのエジプト株の直接脳内接種を伴う、西ナイルウイルス神経感染症のモデル^{２８，２９}を使用した。接種の１日後、Ｔａｔ−ベクリン１のＬ−アミノ酸形態またはＴａｔ−ベクリン１のＤ−アミノ酸形態でマウスを処理した。Ｔａｔ−ベクリン１のＬ−アミノ酸形態はチクングニヤウイルス感染に対する防御を誘導可能であったが、Ｄ−アミノ酸Ｔａｔタンパク質トランスダクションドメイン結合ペプチドは、血清および組織ペプチダーゼによる酵素的切断に対する抵抗性により増強された安定性を有し、優れたインビボ細胞内運搬を示している^３０。したがって、該ペプチドが脳内で活性であることを要するＣＮＳ感染モデルの本発明者らの使用を考慮して、本発明者らはＴａｔ−ベクリン１のＬ−アミノ酸形態およびＤ−アミノ酸形態の効力を比較した。Ｔａｔ−ベクリン１のＤ−アミノ酸形態は注射後第４日および第６日に脳内の西ナイルウイルス力価の有意な低減およびウイルス誘導性致死の有意な遅延をもたらしたが、Ｔａｔ−ベクリン１のＬ−アミノ酸形態はそうではなかったことを、本発明者らの結果は示している。

Ｉ．Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドはインビボ抗リケッチア活性を有する
リケッチアは、発疹チフスおよびロッキー山紅斑熱を含む重篤なヒト感染症を引き起こしうる節足動物媒介性細菌の一群である^{３１，３２}。リケッチアは、オートファジーの細胞経路が宿主防御メカニズムを代表するものであることが仮定された最初の細胞内細菌病原体である^３２。したがって、リケッチア症の専門家であるＵＴＭＢのＧｕｓｔａｖｏ Ｖａｌｂｕｅｎａ博士との共同研究において、本発明者らはリケッチア・コノリイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｃｏｎｏｒｉｉ）感染のマウスモデルにおいてＴａｔ−ベクリン１処理の効果を評価した。Ｔａｔ−ベクリン１ペプチド処理は肺における細菌負荷の有意な低減（接種後第６日に測定された）ならびに肝臓および脳における低減の傾向をもたらすことを見出した。これらの結果はＴａｔ−ベクリン１のＬ−アミノ酸形態で得られた。現在、Ｔａｔ−ベクリン１のＤ−アミノ酸形態での追加的な研究が繰り返されている。

Ｊ．Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドは、化学療法抵抗性癌細胞の場合を含む用量依存的細胞死を誘導する
前記研究において、本発明者らは、ハンチンチン凝集物を含有する又はウイルスもしくは細胞内細菌に感染した細胞に対するオートファジーの防御効果を記載している。しかし、高レベルのオートファジーは細胞死を誘導することが可能であり、これは、癌細胞を殺すための治療手段として潜在的に有用でありうるであろう。したがって、細胞死を誘導するＴａｔ−ベクリン１の能力を調べた。

本発明者らは、子宮頸癌上皮細胞系であるＨｅＬａ細胞を使用して、Ｔａｔ−ベクリン１処理後には細胞が細胞死の時間依存的増加を示すが、Ｔａｔ−スクランブル対照処理後にはそうでないことを見出した。用量依存的効果も認められる。Ｔａｔ−ベクリン１により引き起こされる死はアポトーシスまたは壊死アポトーシスではなく、オートファジー細胞死である。なぜなら、それは、アポトーシスのインヒビター（ｚ−ＶＡＤ）によっても壊死アポトーシスのインヒビター（Ｎｅｃ−１）によっても阻止されないが、オートファジーのインヒビター（３−ＭＡ）により阻止されるからである。また、それはオートファジー遺伝子ＡＴＧ７またはベクリン１に対するｓｉＲＮＡにより部分的に阻止される。腫瘍形成細胞および非腫瘍形成細胞の殺傷に関して該ペプチドのいずれかの特異性が存在するかどうかを調べるために、非腫瘍形成不死化ヒト乳上皮細胞（ＨＭＥＣ）のクローン原性生存を腫瘍形成ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞の場合と比較した。Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドは生存の用量依存性低減を誘導するが、ＭＣＦ７細胞はＴａｔ−ベクリン１ペプチド誘導性細胞死に対してＨＭＥＣより感受性であることが見出された。これらのデータは、腫瘍形成細胞が、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチド誘導細胞死に対して、より感受性でありうることを示している。

本発明者らは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）における活性化突然変異を有する非小細胞肺癌細胞系、例えばＨＣＣ８２７細胞が、ＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビター療法（一般名：エルロチニブ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）；商品名：タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ））に応答してオートファジー細胞死を受けることを見出した。このタイプの肺癌を有する患者におけるタルセバ療法に関する主な問題点の１つは、耐性突然変異が頻繁に発生することである。ＥＧＦＲにおける最も一般的な耐性突然変異Ｔ７９０Ｍを含有する肺癌細胞系（Ｈ１９７５細胞）においては、タルセバはオートファジーを誘導せず、該細胞を殺さない。したがって、本発明者らは、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドでの治療（処理）がオートファジー誘導および細胞死に対するこの耐性を克服しうるかどうかを疑問視した。Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドでの治療はＨ１９７５細胞におけるオートファジーの顕著な誘導およびクローン原性生存の低減をもたらすことが見出された。これらの知見は、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドが、それを使用しなければ化学療法誘導性オートファジー細胞死に対して耐性である癌細胞を殺す能力を有しうることを示している。また、ベクリン１ペプチド（Ｔａｔ以外）の細胞内運搬を癌細胞特異的に媒介するペプチドは、正常細胞における細胞死を誘導することなく、腫瘍細胞におけるオートファジー細胞死を選択的に誘導するのに有用でありうる。ＵＴ ＳｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎのＫａｔｈｌｙｎｎ Ｂｒｏｗｎとの共同研究において行っている本発明者らの現在進行中の研究は、Ｔａｔ−ベクリン１内に含有されるベクリン１の１８アミノ酸に結合した肺癌細胞特異的ペプチド運搬配列（例えば、Ｈ２００９．１）を使用している。

Ｋ．Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドは、オートファジー誘導性ベクリン１／Ｖｐｓ３４複合体の新規成分であるＧＡＰＲ−１に結合する
Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドがどのようにしてオートファジーを誘導するのかを調べるために、本発明者らは、Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドの結合タンパク質を特定するための生化学的分析を行った。注目すべきことに、アミノ酸２６７−２８４はベクリン１ ＥＣＤの公知結合相手（例えば、Ｖｐｓ３４）に要求されなかった。このことは、ベクリン１のこの領域は現在未特定のベクリン１の結合相手とのその相互作用に要求されることを示唆している。Ｔａｔ−ベクリン１に結合するタンパク質を単離するために、本発明者らは細胞透過性ビオチン共役Ｔａｔ−ベクリン１ペプチドを使用し、該ペプチド（または対照ビオチン共役Ｔａｔ−スクランブルペプチド）と共にＨｅＬａ細胞を３時間処理し、ライセートをストレプトアビジンビーズと混合した。ビオチン共役Ｔａｔ−ベクリン１に結合したタンパク質をビオチン共役Ｔａｔ−スクランブルの場合と比較して、１５〜２０ｋＤａのビオチン共役Ｔａｔ−ベクリン１に結合したタンパク質のサンプルにおける特異的バンドを観察した。このバンドは、ＬＣ−ＭＳ／ＬＣ分析により、ホスファチジルイノシトールを含む負荷電脂質を含有するリポソームに結合することがこれまでに報告されているタンパク質であるＧＡＰＲ−１^３３と特定された。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に用いたのと同じ方法により調製されたサンプルの免疫ブロット分析を行うために抗ＧＡＰＲ−１抗体を使用することにより、ビオチン−Ｔａｔ−ベクリン１とＧＡＰＲ−１との相互作用を確認した。また、ベクリン１のアミノ酸２６７−２８４（Ｔａｔ−ベクリン１ペプチド内に含有されている領域）が、完全長ベクリン１タンパク質がＧＡＰＲ−１と相互作用するのに必要かどうかを調べた。野生型ベクリン１はＧＡＰＲ−１と免疫共沈降するが、アミノ酸２６７−２８４を欠くベクリン１欠失突然変異体は、非特異的結合のバックグラウンドレベルを超えるレベルでＧＡＰＲ−１と相互作用しないことを、本発明者らの結果は示している。総合すると、これらのデータは、ベクリン１のアミノ酸２６７−２８４が、ベクリン１がＧＡＰＲ−１と相互作用するのに必要かつ十分であることを示している。

本発明者らは、オートファジーフラックスインヒビターを使用してオートファジーに対するＧＡＰＲ−１ ｓｉＲＮＡの効果を評価することにより、オートファジーにおけるＧＡＰＲ−１の機能を評価した。ＧＡＰＲ−１のｓｉＲＮＡノックダウンは、Ｔａｔ−スクランブル対照ペプチドで処理された細胞およびＴａｔ−ベクリン１ペプチドで処理された細胞の両方においてオートファジーを増強した。これらのデータは、ＧＡＰＲ−１が、オートファジーの負の調節因子として機能する新規ベクリン１相互作用性タンパク質であること、ならびにＧＡＰＲ−１およびベクリン１とのその相互作用がオートファジー促進性治療法のスクリーニングおよび設計のための新規標的となることを示している。

Ｌ．典型的な代替的オートファジー誘導性構築物
１．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２６７−２８４
２．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２６７−２８４，Ｈ２７５Ｅ
３．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２６７−２８４，Ｓ２７９Ｄ
４．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２６７−２８４，Ｑ２８１Ｅ
５．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２６７−２８４，Ｈ２７５Ｅ，Ｓ２７９Ｄ，Ｑ２８１Ｅ
６．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２６７−２８４，Ｈ２７５Ｅ，Ｓ２７９Ｄ，Ｑ２８１Ｅ，Ｖ２６９Ｉ，Ａ２７２Ｇ，Ｇ２８３Ａ
７．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２６７−２８４，Ｆ２７４およびＷ２７７
８．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２６８−２８４
９．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２６７−２８３
１０．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２６９−２８４
１１．ＨＩＶ−ｌ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２６８−２８３
１２．ＨＩＶ−ｌ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２６９−２８３
１３．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２５７−２８３
１４．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２６９−２８３
１５．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２５７−２９５
１６．Ｈ２００９．１−マレイミド−ＰＥＧ（３）−ベクリン１残基２６７−２８４
１７．ＦＬＡＡＧ−マレイミド−ＰＥＧ（３）−ベクリン１残基２６７−２８４
１８．ビオチン−マレイミド−ＰＥＧ（３）−ベクリン１残基２６７−２８４
１９．ｐＶｅｃ−ε−アミノカプロン酸−ＰＥＧ（３）−ベクリン１残基２６７−２８４
２０．ＲＧＤ−４Ｃ−ε−アミノカプロン酸−ＰＥＧ（３）−ベクリン１残基２６７−２８４
２１．マレイミド−ＰＥＧ（３）−ベクリン１残基２６７−２８４
２２．アルブミン−ε−アミノカプロン酸−ＰＥＧ（３）−ベクリン１残基２６７−２８４
２３．ＦＩＴＣ−Ｓｅｒ−ＰＥＧ（３）−ベクリン１残基２６７−２８４−ポリＨｉｓ
２４．ＧＦＰ−ＰＡ−ベクリン１残基２６７−２８４−ＴＡＰ
２５．ＰＥＧ−ベクリン１残基２６７−２８４−Ｃｙｓ−ＡｕＮＰ
２６．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基（Ｄ）２６９−２８４
２７．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基（Ｄ）２６９−２８４
２８．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２６７−２８４，Ｎ−２７１ Ｎ結合Ｎ−アセチルグルコサミン
２９．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基２６７−２８４，Ｎ−２７１ Ｎ結合Ｎ−アセチルグルコサミン，Ｓ２７９ Ｏ結合Ｎ−アセチル−ガラクトサミン
３０．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基（Ｎ−メチル）２６９−２８４
３１．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−ジグリシン−ベクリン１残基Ｎ−アセチル−２６９−２８４−Ｃ−アミド
３２．ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ＰＴＤ−Ｃｙｓ−ベクリン１残基２６９−２８４−Ｃｙｓ（ジスルフィド環状）
略語：Ｈ２００９．１：四量体インテグリンα（ｖ）β（６）結合性ペプチド；ＰＴＤ：タンパク質トランスダクションドメイン；ＰＡ：ブドウ球菌タンパク質Ａのα−ヘリックス束状ドメインＡ；ＧＦＰ：グリーン蛍光タンパク質；ＡｕＮＰ：金ナノ粒子。

参照文献

Claims (18)

1. オートファジー誘導性化合物であって、
   （ａ）１２個以下の天然で隣接しているベクリン１残基に各末端において直接的に隣接しているベクリン１残基２６９−２８３（配列番号１）を含むオートファジー誘導性ペプチド（該ペプチドは、置換Ｈ２７５Ｅ、Ｓ２７９Ｄ及びＱ２８１Ｅの少なくとも１つを含んでいてもよい）と、（ｂ）その化合物の治療上の安定性または運搬を促進する、前記オートファジー誘導性ペプチドと連結した第１異種部分とを有するオートファジー誘導性化合物。
2. 該ベクリン１残基２６９−２８３がＮ末端でＴ−Ｎに隣接しており、Ｃ末端でＴに隣接している、請求項１記載の化合物。
3. 該ベクリン１残基２６９−２８３が置換Ｈ２７５Ｅ、Ｓ２７９ＤまたはＱ２８１Ｅの少なくとも１つを含む、請求項１記載の化合物。
4. 該オートファジー誘導性ペプチドがＮ末端で該第１異種部分に結合しており、Ｃ末端で第２異種部分に結合している、請求項１記載の化合物。
5. 該オートファジー誘導性ペプチドがリンカーを介して該第１異種部分に結合している、請求項１記載の化合物。
6. 該第１異種部分がトランスダクションドメインを含む、請求項１記載の化合物。
7. 該第１異種部分がホーミングペプチドを含む、請求項１記載の化合物。
8. 該第１異種部分が血清安定化剤を含む、請求項１記載の化合物。
9. 該オートファジー誘導性ペプチドが１以上のＤ−アミノ酸、Ｌ−β−ホモアミノ酸、Ｄ−β−ホモアミノ酸またはＮ−メチル化アミノ酸を含む、請求項１記載の化合物。
10. 該オートファジー誘導性ペプチドが環化している、請求項１記載の化合物。
11. Ｎ末端アセチル、ホルミル、ミリストイル、パルミトイル、カルボキシルもしくは２−フロシル基および／またはＣ末端ヒドロキシル、アミド、エステルもしくはチオエステル基を含む、請求項１記載の化合物。
12. 該オートファジー誘導性ペプチドがアセチル化、アシル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、硫酸化またはグリコシル化されている、請求項１記載の化合物。
13. アフィニティタグまたは検出可能な標識を含む、請求項１記載の化合物。
14. 該オートファジー誘導性ペプチドがＮ末端で該第１異種部分に結合しており、Ｃ末端で、蛍光標識を含む第２異種部分に結合している、請求項１記載の化合物。
15. 該ベクリン１残基２６９−２８３がＮ末端でＴ−Ｎに隣接しており、Ｃ末端でＴに隣接しており、該第１異種部分が、ジグリシンリンカーを介して該オートファジー誘導性ペプチドに連結されたｔａｔタンパク質トランスダクションドメインである、請求項１記載の化合物。
16. 該ベクリン１残基２６９−２８３がＮ末端でＴ−Ｎに隣接しており、Ｃ末端でＴに隣接しており、該第１異種部分が、マレイミド−ＰＥＧ（３）リンカーを介して該オートファジー誘導性ペプチドに連結されたＨ２００９．１として公知の四量体インテグリンα（ｖ）β（６）結合性ペプチドである、請求項１記載の化合物。
17. ベクリン１−ＧＡＰＲ１相互作用のモジュレーターを特定するための組成物であって、予め決められた量の（ａ）ベクリン１残基２６７−２８４（配列番号２）から成るペプチド、ベクリン１または残基２６７−２８４（配列番号２）を含むＧＡＰＲ１結合性ベクリン１ペプチド、および（ｂ）ＧＡＰＲ１を含む前記組成物。
18. （ａ）ある物質の非存在下ではベクリン１残基２６７−２８４（配列番号２）から成るペプチド、ベクリン１または残基２６７−２８４（配列番号２）を含むＧＡＰＲ１結合性ベクリン１ペプチドがＧＡＰＲ１を対照相互作用に関わらせる条件下、請求項１７記載の組成物を該物質と一緒にし、
    （ｂ）該ベクリン１残基２６７−２８４から成るペプチド、ベクリン１または残基２６７−２８４を含むＧＡＰＲ１結合性ベクリン１ペプチドと該ＧＡＰＲ１との間の試験相互作用を検出する工程を含む、ベクリン１−ＧＡＰＲ１相互作用のモジュレーターを特定する方法であって、
    該対照相互作用と試験相互作用との相違がベクリン１−ＧＡＰＲ１相互作用のモジュレーターとしての該物質を特定する、方法。