JP2020059662A - 抗ウイルス性ペプチドおよびその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
該ペプチドは、以下の(1)および(2)に示すアミノ酸配列:
(1)水胞性口炎ウイルス(Vesicular stomatitis virus:VSV)のG遺伝子にコードされる糖タンパク質(Gタンパク質)のトランスメンブレン領域を構成するアミノ酸配列(TM配列)、または、該TM配列について1個、2個または3個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列;および
(2)細胞膜透過性ペプチド(CPP)として機能するアミノ酸配列(CPP配列);
をともに備えることを特徴とする。
あるいは、上記(1)に示すアミノ酸配列と(2)に示すアミノ酸配列とを合わせたアミノ酸残基数が、抗ウイルス性ペプチド全体のアミノ酸残基数の80%以上(より好ましくは90%以上、例えば100%)を占めるような合成ペプチドは、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドのうちの特に好適な一態様である。
また、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドの好適な他の一態様では、上記(2)のCPPとして機能するアミノ酸配列が、ポリアルギニン(特に限定しないが、典型的には、5個以上9個以下のアルギニン残基から構成される)、または、配列番号4〜21のいずれかに示すアミノ酸配列、または、該アミノ酸配列について1個、2個または3個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列であることを特徴とする。
かかる組成物は、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドを含むことにより、抗ウイルス剤としての利用、あるいは新たな抗ウイルス剤の開発のための研究材料として利用することができる。
かかる構成の方法では、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドを対象物に供給することによって、少なくとも1種のウイルス(例えばVSV)の増殖を阻止もしくは抑制することができる。
本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のN末端アミノ酸およびC末端アミノ酸を包含する用語である。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がN末端側であり右側がC末端側である。
したがって、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドの具体例には、後述する各配列番号のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列で構成される合成ペプチドに加え、各配列番号のアミノ酸配列において1個、2個または3個のアミノ酸残基が置換(典型的には同類置換)、欠失または付加された改変アミノ酸配列であって当該配列番号のアミノ酸配列と同様に抗ウイルス活性を示す改変アミノ酸配列からなる合成ペプチドが包含される。
(1)Gタンパク質のTM配列、または、上記のTM配列について1個、2個または3個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列;
(2)CPPとして機能するアミノ酸配列(CPP配列);
をともに備えることで特徴付けられるペプチドである。
Gタンパク質は、膜貫通型のI型糖タンパク質であり、近年では「レトロウイルスベクター」におけるエンベロープを構成する糖タンパク質として利用されている。しかしながら、Gタンパク質のTM領域が、抗ウイルス活性を有することは見出されておらず、かかるTM領域のアミノ酸配列を合成し、該配列にCPPを付加することにより、人為的に合成された抗ウイルス性ペプチドが得られることは、本願出願当時、全く想定されていないことであった。また、TM配列は、配列番号1から3に示すように、VSVの血清型により異なるが、いずれのTM配列を有する合成ペプチドにも優れた抗ウイルス性が見出されることも、本願出願当時において、全く想定されていなかった。
配列番号1は、単離された1種のVSV(Vesicular stomatitis Piry virus)のGタンパク質に含まれる計19アミノ酸残基からなるTM配列である(UniProtKB - Q85213)。
配列番号2は、単離された1種のVSV(Vesicular stomatitis Indiana virus)のGタンパク質に含まれる計21アミノ酸残基からなるTM配列である(UniProtKB - P05322)。
配列番号3は、単離された1種のVSV(Vesicular stomatitis New Jersey virus)のGタンパク質に含まれる計21アミノ酸残基からなるTM配列である(UniProtKB - P04882)。
配列番号4のアミノ酸配列は、FGF2(塩基性線維芽細胞増殖因子)由来の合計14アミノ酸残基から成るNoLS(核小体局在シグナル:Nucleolar localization signal)に対応する。
配列番号5のアミノ酸配列は、核小体タンパク質の1種(ApLLP)由来の合計19アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号6のアミノ酸配列は、HSV−1(単純ヘルペスウイルス タイプ1)のタンパク質(γ(1)34.5)由来の合計16アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号7のアミノ酸配列は、HIC(human I-mfa domain-containing protein)のp40タンパク質由来の合計19アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号8のアミノ酸配列は、MDV(Marek病ウイルス)のMEQタンパク質由来の合計16アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号9のアミノ酸配列は、アポトーシスを抑制するタンパク質であるSurvivin- deltaEx3由来の合計17アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号10のアミノ酸配列は、血管増殖因子であるAngiogenin由来の合計7アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号11のアミノ酸配列は、核リンタンパク質であってp53腫瘍抑制タンパク質と複合体を形成するMDM2由来の合計8アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号12のアミノ酸配列は、ベータノダウイルスのタンパク質であるGGNNVα由来の合計9アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号13のアミノ酸配列は、NF−κB誘導性キナーゼ(NIK)由来の合計7アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号14のアミノ酸配列は、Nuclear VCP-like protein由来の合計15アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号15のアミノ酸配列は、核小体タンパク質であるp120由来の合計18アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号16のアミノ酸配列は、HVS(ヘルペスウイルスsaimiri)のORF57タンパク質由来の合計14アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号17のアミノ酸配列は、細胞内情報伝達に関与するプロテインキナーゼの1種であるヒト内皮細胞に存在するLIMキナーゼ2(LIM Kinase 2)の第491番目のアミノ酸残基から第503番目のアミノ酸残基までの合計13アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号18のアミノ酸配列は、IBV(トリ伝染性気管支炎ウイルス:avian infectious bronchitis virus)のNタンパク質(nucleocapsid protein)に含まれる合計8アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号19のアミノ酸配列は、HIV(ヒト免疫不全ウイルス:Human Immunodeficiency Virus)のTATに含まれるタンパク質導入ドメイン由来の合計9アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
配列番号20のアミノ酸配列は、上記TATを改変したタンパク質導入ドメイン(PTD4)の合計11アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
配列番号21のアミノ酸配列は、ショウジョウバエ(Drosophila)の変異体であるAntennapediaのANT由来の合計18アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
これらのうち、特にNoLSやTATに関連するアミノ酸配列(またはその改変アミノ酸配列)が好ましい。例えば、配列番号17や配列番号18に示すようなNoLS関連のCPP配列、あるいは配列番号19〜21のTATやANT関連のCPP配列は、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドを構築するために好適に用いることができる。
(1)抗ウイルス性TM配列と(2)CPP配列とが、直接的に配置されていることが好ましい。具体的な一態様では、(1)抗ウイルス性TM配列と(2)CPP配列との間に、両配列部分に包含されないアミノ酸残基が存在しないことが好ましい。あるいは他の一態様では、上記二つの配列が、10個以下(より好ましくは5個以下、例えば1個、2個または3個のアミノ酸残基)のアミノ酸残基からなるリンカーを介して配置されることが好ましい。
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が100以下が適当であり、80以下が好ましく、70以下、あるいは60以下(例えば25±2から50±2程度のペプチド鎖)が好ましい。このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、容易に抗ウイルス性ペプチドを提供することができる。特に限定されるものではないが、免疫原(抗原)になり難いという観点から直鎖状またはへリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。
ある一態様では、ここに開示される抗ウイルス性ペプチドのC末端部分をCPP配列が構成するとき、抗ウイルス性TM配列のC末端アミノ酸残基がアミド化される。一方、好適な他の一態様では、抗ウイルス性ペプチドのC末端部分をCPP配列が構成するとき、CPP配列のC末端アミノ酸残基をアミド化し、該抗ウイルス性ペプチドの安定化を図る。
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、市販のペプチド合成機を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾(C末端アミド化等)部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞(例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞)に導入し、所定の条件で当該宿主細胞または該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞(分泌された場合は培地中)からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的の抗ウイルス性ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法および構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中でまたは無細胞タンパク質合成システムにて、抗ウイルス性ペプチド生産のための組換え遺伝子(発現カセット)を構築するための材料として使用することができる。
なお、抗ウイルス性組成物(抗ウイルス剤)に含有される抗ウイルス性ペプチドは、抗ウイルス活性を損なわない限りにおいて、塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸または有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。あるいは、抗ウイルス活性を有する限り、他の塩(例えば金属塩)であってもよい。したがって、本明細書および特許請求の範囲に記載の「ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。
ここで開示される抗ウイルス性組成物の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール(エタノール等)水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。あるいはリポソームであってもよい。また、抗ウイルス性組成物に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
抗ウイルス性組成物(抗ウイルス性剤)の典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水または適当な緩衝液(例えばPBS)等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、抗ウイルス性ペプチド(主成分)および種々の担体(副成分)を材料にして種々の形態の組成物(薬剤)を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修,Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、比較的高い濃度のカチオン、塩類(例えば塩化ナトリウム)あるいは血清のような有機物が存在する系においても抗ウイルス活性を維持し得る。したがって、ここで開示される抗ウイルス性組成物は、カチオン、塩類や血清等が存在する系(場)での使用に好適である。例えば、本発明によって提供される抗ウイルス性組成物は、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内もしくは腹腔内への注射あるいは灌腸によって患者に投与することができる。
あるいは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。また、衛生陶器表面の洗浄目的に使用する場合は、比較的多量(例えば1〜100mg/mL)の抗ウイルス性ペプチドを含有する液剤を対象物の表面に直接スプレーするか、あるいは、当該液剤で濡れた布や紙で対象物の表面を拭くとよい。これらは例示にすぎず、従来のペプチド系抗生物質やペプチドを構成成分とする農薬、医薬部外品等と同じ形態、使用方法を適用することができる。
さらに、家畜の飼養環境の管理、品質管理には、家畜の疾病予防や治療(例えばワクチンや抗ウイルス治療薬)が不可欠であるとともに、疾病を引き起こす病原体の正確な情報を把握する必要がある。ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、それ自体が抗VSV剤の有望なシーズとなり得るため、家畜のウイルス感染予防、家畜間の感染拡大防止、さらには家畜と濃厚接触し得る畜産関係者や獣医師などの感染予防や治療法の確立が期待できる。
表1に示す計3種のペプチドを市販のペプチド合成機を用いて製造した。具体的には次のとおりである。
サンプル1は、配列番号22に示され、(1)抗ウイルス性TM配列として配列番号1に示すアミノ酸配列(VSV Piry strainのG proteinのTM配列)を使用し、そのC末端側に(2)CPP配列として配列番号17のアミノ酸配列(LIMキナーゼ2のNoLS)を含む合成ペプチドである。
サンプル2は、配列番号23に示され、(1)抗ウイルス性TM配列として配列番号2に示すアミノ酸配列(VSV Indiana strainのG proteinのTM配列)を使用し、そのC末端側に(2)CPP配列として配列番号17のアミノ酸配列(LIMキナーゼ2のNoLS)を含む合成ペプチドである。
サンプル3は、配列番号24に示され、(1)抗ウイルス性TM配列として配列番号3に示すアミノ酸配列(VSV New Jersey strainのG proteinのTM配列)を使用し、そのC末端側に(2)CPP配列として配列番号17のアミノ酸配列(LIMキナーゼ2のNoLS)を含む合成ペプチドである。
合成した各サンプルのペプチドは、DMSO(ジメチルスルホキシド)に溶かし、各サンプルペプチドのストック液(濃度2.5mM)を調製した。
本試験に使用した細胞とウイルスの詳細は、次の通りである。
アフリカミドリザル腎臓上皮Vero E6細胞の培養には、100U/mLのペニシリン、0.1mg/mLのストレプトマイシン、及び10%のFCSを含むL−グルタミン含有Dulbecco‘s Modified Eagle Medium(DMEM)を使用した。
対象ウイルスはVSVであり、そのウイルス力価(感染価)は、公知の一般的なプラークアッセイ法に基づいて測定した。
まず、あらかじめ用意しておいたVSVを適宜希釈し、感染価が102PFU/mLまたは103PFU/mLであるウイルス懸濁液を調製した。ウイルス液の希釈には、2%FCS含有DMEMを使用した。
あらかじめ市販の6ウェルプレートに培養したVero E6細胞に、各ウェル当たりPBS1mLで洗浄したのち、各ウェル1mLの上記感染価のウイルスを接種した。つまり、1ウェル当たりの接種ウイルス量は102PFUあるいは103PFUであった。ウイルスを接種して1時間ほど37℃にてインキュベートし、その後、各ウェルから接種したウイルス懸濁液を除去し、PBSとDMEMで各ウェルを1回ずつ洗浄した。
次いで、各ウェルに、上記調製したいずれかのサンプルペプチドを含有する、2%FCS含有DMEMを、各ウェル2mL供給し、37℃で培養した。サンプルペプチドの濃度は10μMであり、実験コントロールには、DMSOを、サンプルペプチド調製液に含有される溶媒と等量になるように添加した2%FCS含有DMEMを使用した。
図1,2は、103PFU/wellのVSV接種後培養1日目の細胞の顕微鏡観察像である。ここに示されるように、サンプルペプチド未処理のコントロール(図1,2)では、観察視野内の細胞がほとんど死細胞であった。一方、サンプルペプチド存在下の培養では、一部細胞の脱落は認められたが、観察視野の広範囲でVero E6細胞のモノレイヤー(生細胞)が観察された(図2)。
サンプルペプチドの濃度を50μMとし、培養上清の採取を、1,2,3日目に行った以外は試験例2と条件を同様にして、試験例3を行った。結果を図3〜8に示す。なお、50μMのサンプルペプチドは、3日間の培養においても、VSV非感染Vero E6細胞に対する細胞毒性は認められなかった。
図7,8はそれぞれ、103PFU/wellのVSV接種後培養2,3日後の顕微鏡観察像である。サンプルペプチド存在下の培養では、この時点においても観察視野の広範囲に生細胞のモノレイヤーが観察された。
例えば、本実施例では、(1)抗ウイルス性TM配列として配列番号1〜3に示すものを採用しているが、それらの改変配列を採用してもよい。また、本実施例では、(2)CPP配列として配列番号17に示すものを採用しているが、他の既知の(2)CPP配列(例えば配列番号4〜21に示すもの)、あるいはその改変配列を採用してもよい。
Claims (8)
- 少なくとも1種のウイルスの増殖を抑制する合成ペプチドであって、
以下の(1)および(2)に示すアミノ酸配列:
(1)水胞性口炎ウイルス(Vesicular stomatitis virus:VSV)のG遺伝子にコードされる糖タンパク質(Gタンパク質)のトランスメンブレン領域を構成するアミノ酸配列(TM配列)、または、該TM配列について1個、2個または3個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列;および
(2)細胞膜透過性ペプチド(CPP)として機能するアミノ酸配列(CPP配列);
をともに備え、
総アミノ酸残基数が100以下である、合成ペプチド。 - 前記VSVのGタンパク質のTM配列が、配列番号1〜3のいずれかに示すアミノ酸配列である、請求項1に記載の合成ペプチド。
- 前記CPP配列が、ポリアルギニン、または、配列番号4〜21のいずれかに示すアミノ酸配列、または、該アミノ酸配列について1個、2個または3個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列である、請求項1または2に記載の合成ペプチド。
- 前記CPP配列が、前記VSVのGタンパク質のTM配列の、N末端側あるいはC末端側に直接的に、もしくは1個、2個または3個のアミノ酸残基からなるリンカーを介して配置される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
- 配列番号22〜24のいずれかに示すアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の合成ペプチド。
- 少なくとも1種のウイルスの増殖を抑制する抗ウイルス性組成物であって、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の合成ペプチドと、
薬学上許容され得る少なくとも1種の担体と、
を備える、抗ウイルス性組成物。 - 少なくとも1種のウイルスの増殖を抑制する方法であって、
インビトロにおいて、対象物に対して請求項1〜5のいずれか一項に記載の合成ペプチドを少なくとも1回供給することを包含する、ウイルス増殖抑制方法。 - 前記ウイルスが、水疱性口炎ウイルス(VSV)である、請求項7に記載のウイルス増殖抑制方法。
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