JP5706617B2 - ケラタン硫酸の測定方法および測定用キット、これらを用いる関節疾患の検知方法等 - Google Patents
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Description
GPC法での分析値: 13kDa〜15kDa
KS-II: 二糖分析の分析値: (Gal6S-GN6S) /total = 95〜100 %
GPC法での分析値: 12kDa〜14kDa
上記の分析値は下記(1)および(2)の方法で得ることができる。測定結果の具体例と合わせて下記に示す。
KS-IおよびKS-IIの二糖構成単位である、
2-acetamido-2-deoxy-4-O-(b-D-glucopyranosyl)-6-O-sulfo-D-gulcose (Gal-GN6S)
および
2-acetamido-2-deoxy-4-O-(6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-6-O-sulfo-D-gulcose (Gal6S-GN6S)
の組成比を、Analytical method to determine keratan sulfate in the serum using HPLC. Kurahashi Y, Masuda H, Miyazaki K. Rinsho Byori (2008) 56(5), 373-378に記載の方法に基づきHPLC法で分析した。その結果を、表1に示した。結果は、2種類の二糖単位の総和に占める各成分の割合で示した。
KS-IおよびKS-IIの分子量を、Identification and functions of chondroitinsulfate in the milieu of neural stem cells. Ida M, ShuoT, Hirano K, Tokita Y, Nakanishi K, Matsui F, Aono S, Fujita H, Fujiwara Y, KajiT, Oohira A. J. Biol. Chem. (2006) 281(9), 5982-5991に記載の方法に基づきGPC法で分析した。分析の標準品としては、Evaluation of Molecular Weights of Hyaluronate Prfeparations by Multi-Angle Laser Light Scattering. Chikako Yomota Bull. Natl. Health Sci. (2003) 121, 030-033に記載の方法で分子量を定めた5種のコンドロイチン硫酸を使用した。その結果を、表2に示した。結果は、ピーク分子量で示した。
[工程1]ケラタン硫酸−Iとケラタン硫酸−IIとに対する相対的反応特異性が、IC50KS−I/KS−IIとして0.4〜5である抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体を固着させた固相、および、標識された当該抗体を、一緒に若しくは先後別々に生体試料に接触させ、当該抗体と生体試料中のケラタン硫酸の免疫複合体を当該固相上に形成させる工程。
[工程2]当該免疫複合体における標識のシグナルにより得られる検出値により、生体試料中のケラタン硫酸を測定する工程。
[工程1]本発明の測定法によって、被検体中のケラタン硫酸を測定する工程。
[工程2]工程1により測定される被検体中のケラタン硫酸量と、正常検体中のケラタン硫酸量、および/または、時間をおいて複数回にわたり測定される被検体中のケラタン硫酸量とを比較する工程。
[工程3]工程2における比較に基づいて、被検体中のケラタン硫酸量が、正常検体中のケラタン硫酸量よりも増加している場合を、関節疾患について陽性であると判定し、あるいは、複数回の測定により検出された被検体中のケラタン硫酸量が、前の回の測定値よりも増加している場合を関節疾患は進行傾向にあると判定する工程。
[工程1]本発明の測定法によって、関節疾患治療薬またはその候補物質(以下、治療薬等ともいう)の投与前の検体と、投与後の検体中のケラタン硫酸を測定する工程。
[工程2]工程1により得られた治療薬等の投与前の被検体中のケラタン硫酸量と、投与後の被検体中のケラタン硫酸量を比較する工程。
[工程3]工程2における比較に基づいて、治療薬等の投与前のケラタン硫酸量から、投与後のケラタン硫酸量への正常方向への変化の度合いを検出し、これを指標として上記治療薬等の効果を判定する工程。
本発明の測定法は、ケラタン硫酸−I(以下、「KS−I」ともいう)およびケラタン硫酸−II(以下、「KS−II」ともいう)の2種類のケラタン硫酸への反応性を十分に有し、かつ、KS−IとKS−IIとの反応特異性の差が少ない抗ケラタン硫酸抗体、すなわち、KS−IとKS−IIとに対する相対的反応特異性が、IC50KS−I/KS−IIとして0.4〜5、好ましくは、0.4〜3.8である抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体を用いることを特徴とするものである。なお、上述したように、「IC50KS−I」は、競合的免疫測定法、(例えば、競合ELISA法)を用いて測定した際に、抗ケラタン硫酸抗体のビオチン標識KS−Iに対する反応がKS−Iによって50%阻害される濃度であり、「IC50KS−II」は、同抗ケラタン硫酸抗体のビオチン標識KS−Iに対する反応がKS−IIによって50%阻害される濃度を意味するものである。
使用する免疫原は、軟骨、プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、アグリカン、また、これらのコンドロイチナーゼAまたはABCの消化物あるいは未消化物が好ましい。免疫原の由来する動物種は、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ブタ、ウサギ、サル、ハト、ニワトリなどいずれであっても良く、特にヒト、ウシ、ブタなどの比較的大型の動物の使用が好都合である。免疫原を調製する材料は、前述の動物の角膜、関節軟骨など免疫原を含む組織から免疫原を調製するのが好ましい。
免疫を獲得した動物からの脾細胞、リンパ節細胞、末梢血リンパ球などの抗体産生細胞を常法により取得する。取得する抗体産生細胞としては脾細胞、リンパ節細胞が好ましい。
抗体産生細胞(本項目では、免疫後に取得した脾細胞、リンパ節細胞を示す)と融合させるミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ヒトなどの種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。通常、8−アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株はヒポキサンチン−グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ(Hypoxanthine guaninephosphoribosyl transferase)を欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン(HAT)培地で生育できない。また細胞の性質として免疫グロブリンを分泌しない、いわゆる非分泌型の細胞株であることが好ましい。
ケラタン硫酸を認識する抗体を産生するハイブリドーマの検索は、酵素免疫測定法(EIA、ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)などによって行うことができる。たとえば、ケラタン硫酸あるいはケラタン硫酸誘導体を固相に固定化させた96ウェルELISA用マイクロプレートにモノクローナル抗体を含む培養上清を添加し、ハイブリドーマが産生した抗体とケラタン硫酸とを反応させ、次いで結合した特異抗体に酵素標識抗免疫グロブリン抗体を反応させるか、あるいはビオチン標識抗免疫グロブリン抗体を反応させたのちアビジンあるいはストレプトアビジン−酵素標識体を反応させ、次いでいずれの場合とも各ウェルに酵素基質を加えて発色させる。ケラタン硫酸を固定化したウェルのみで発色する培養上清を選別することにより、ケラタン硫酸と特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択(スクリーニング)することができる。
このようにして取得したハイブリドーマを増殖させ、抗体を生産させる方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法などが採用されうる。
抗体を含有する培養上清、腹水などから抗体の精製が必要である場合には、硫安塩析法、DEAEセルロースなどの陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、プロテインA−セファロースなどを用いるアフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択し、組み合わせることにより、培養上清、腹水などからそれらに含まれる抗体を精製することができる。
免疫原:コンドロイチナーゼABCで消化したヒト関節軟骨プロテオグリカン
免疫動物:マウス
抗体クラス:IgG2b
交差する動物種:ヒト、マウス、ウシ、犬、豚、羊
特異性:骨格由来(Type I)および角膜由来(Type II)のケラタン硫酸鎖(単独またはプロテオグリカン結合体のどちらか)の2−3の二糖単位を認識
免疫原:ウシ角膜由来ケラタン硫酸プロテオグリカン
免疫動物:マウス
交差する動物種:ヒト、ウシ
抗体クラス:IgG1
特異性:ヒトおよびウシの角膜由来ケラタン硫酸プロテオグリカンと高密度軟骨プロテオグリカンに存在する蛋白質関連エピトープと反応
免疫原:ウシ角膜由来ケラタン硫酸プロテオグリカン
免疫動物:マウス
交差する動物種:ヒト、ウシ
抗体クラス:IgG3
特異性:様々な動物種の軟骨および角膜プロテオグリカンのO−結合オリゴ糖と結合する蛋白質関連エピトープと反応
免疫原:コンドロイチナーゼA消化胎児性ヒト関節軟骨
免疫動物:マウス
交差する動物種:ヒト、ウシ、犬
抗体クラス:IgG3
特異性:異なる種の高密軟骨プロテオグリカンのコンドロイチン硫酸鎖の結合領域と結合する蛋白質関連エピトープを認識
免疫原:コンドロイチナーゼA消化胎児性ヒト関節軟骨
免疫動物:マウス
抗体クラス:IgG1
特異性:異なる種の高密軟骨プロテオグリカンのコンドロイチン硫酸鎖の結合領域と結合する蛋白質関連エピトープを認識
免疫原:ヒト関節プロテオグリカンA1D1フラクションおよび/またはコンドロイチナーゼABC消化したヒトプロテオグリカン
免疫動物:マウス
抗体クラス:IgG1
特異性:プロテオグリカンモノマーのケラタン硫酸あるいはケラタン硫酸様構造が結合しているペプチド部分を認識
免疫原:ヒト関節プロテオグリカンA1D1フラクションおよび/またはコンドロイチナーゼABC消化したヒトプロテオグリカン
免疫動物:マウス
抗体クラス:IgG1
特異性:プロナーゼ、パパイン、アルカリ処理による切断に敏感で、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、オリゴ糖を含まない部分を認識
上述のように、本発明の測定法では、検体におけるケラタン硫酸を、簡便且つ鋭敏に定量的または定性的に検出することができるが、当該測定法を、ヒトを含む動物の検体に対して用いて、主にはその定量値を指標とすることにより関節疾患の検知を行うことが可能である。
1)本発明の測定方法によって、被検体中のケラタン硫酸を測定する工程(第一工程)。
2)第一工程により測定される被検体中のケラタン硫酸量と、正常検体中のケラタン硫酸量、および/または、時間をおいて複数回にわたり測定される被検体中のケラタン硫酸量とを比較する工程(第二工程)。
3)第二工程における比較に基づいて、被検体中のケラタン硫酸量が、正常検体中のケラタン硫酸量よりも増加している場合を、関節疾患について陽性であると判定し、あるいは、複数回の測定により検出された被検体中のケラタン硫酸量が、前の回の測定値よりも増加している場合を関節疾患は進行傾向にあると判定する工程(第三工程)。
の3工程を含む関節疾患の検知方法である。
2)固相化抗ケラタン硫酸抗体:BCD−7、標識抗ケラタン硫酸抗体:EFG−11
3)固相化抗ケラタン硫酸抗体:EFG−11、標識抗ケラタン硫酸抗体:BCD−7
4)固相化抗ケラタン硫酸抗体:EFG−11、標識抗ケラタン硫酸抗体:EFG−11
5)固相化抗ケラタン硫酸抗体:BCD−4、標識抗ケラタン硫酸抗体:MK−172
6)固相化抗ケラタン硫酸抗体:MK−172、標識抗ケラタン硫酸抗体:BCD−4
本発明の測定法において、検体中のケラタン硫酸を高感度で測定することが可能であることから、これを、投薬した関節疾患の治療薬の効果の判定や、関節疾患の治療薬の候補物質のスクリーニングに用いることが可能である。
1)本発明の測定法によって、治療薬またはその候補物質(治療薬等)の投与前の検体と、投与後の検体中のケラタン硫酸を測定する工程(第1工程)
2)1)により得られた治療薬等の投与前の検体中のケラタン硫酸量と、投与後の検体中のケラタン硫酸量を比較する工程(第2工程)
3)2)における比較に基づいて、治療薬等の投与前のケラタン硫酸量から、投与後のケラタン硫酸量への正常方向への変化の度合いを検出し、これを指標として上記関節疾患治療薬等の効果を判定する工程(第3工程)
GAG:グリコサミノグリカン
KS:ケラタン硫酸
KSPG:ケラタン硫酸プロテオグリカン
HA:ヒアルロン酸
Ch:コンドロイチン
CS−AまたはCSA:コンドロイチン硫酸A
CS−A(S)またはCSA(S):サメ由来コンドロイチン硫酸A
CS−A(W)またはCSA(W):クジラ由来コンドロイチン硫酸A
CS−BまたはCSB:コンドロイチン硫酸B
CS−CまたはCSC:コンドロイチン硫酸C
CS−DまたはCSD:コンドロイチン硫酸D
CS−EまたはCSE:コンドロイチン硫酸E
EDC:1−メチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
HEP:ヘパリン
HRP:ホースラディッシュペルオキシダーゼ
HS:ヘパラン硫酸
Tris:2−アミノ−2−ハイドロキシメチル−1,3−プロパンジオールPBS:リン酸緩衝生理食塩水
EDC:N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
BSA:ウシ血清アルブミン
TMB:3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン
Bi:ビオチン
MES:2−モルホリノエタンスルホン酸
ELISA法:酵素免疫測定法(EnzymeLinked Immunosorbent Assay法;ELISA法)
競合ELISA法:競合法を利用した酵素免疫測定法
各種GAG(HS、HA、HEP、Ch、CS−A(S)、CS−A(W)、CS−B、CS−C、CS−D、CS−E、KS)を0.1M MES緩衝液(pH5.5)に溶解して、10mg/mL のGAG溶液を調製した。1mLの各GAG溶液に、ジメチルスルホキシド(和光純薬工業社製)で20mMに調製したビオチン-LC-ヒドラジド(PIERCE社製)を25μL 添加した。続いて、0.1M MES緩衝液(pH5.5)で100mg/mLに調製したEDC(PIERCE社製)溶液を12.5μL添加した。よく撹拌した後、常温(15℃〜25℃)で16〜24時間撹拌反応を行った。
ストレプトアビジン(VECTOR社製)をPBS(−)で20μg/mLに希釈し、マキシソープ(登録商標)96ウェルマイクロプレート(ナルジェヌンク社製)の各ウェルに50μLずつストレプトアビジン溶液を加え、4℃で14〜18時間保存することにより、均一にコーティングした。このプレートをPBS(−)で2回洗浄し、ウェルのストレプトアビジンでコーティングされていない部分をブロッキングするため、ブロッキング剤として、ApplieDuo(登録商標)(使用希釈率5倍、生化学工業株式会社製)および防腐剤として0.05%プロクリン(登録商標)950(SUPELCO社製)を含むリン酸緩衝液(上記PBS(−)のうち、塩化ナトリウム、塩化カリウム不含、pH7.2〜7.5:以下、「PB」という)を加え、常温で2時間静置した。静置後、ブロッキング溶液を十分に除去し、37℃で2時間乾燥させることにより、所望する固相化ストレプトアビジンプレートを得た。プレートは乾燥剤とともにアルミラミネート袋に封入し、冷蔵保存した。
参考例1で調製したBi−GAGを、添加剤としてApplieDuo(登録商標)(使用希釈率20倍、生化学工業株式会社製)、0.05%のTween(登録商標)20(0.05%ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート(ICI社 Tween20相当品、和光純薬工業社製)および防腐剤として0.05%のプロクリン(登録商標)950とを含むTBS(50mM Tris塩酸塩、pH7.3〜7.8)(以下、「反応液A」ともいう)に溶解し、1μg/mL溶液を調製した。参考例2で作製した固相化ストレプトアビジンプレートを0.05%のTween20および防腐剤として0.05%のプロクリン(登録商標)950を含む50mM Tris塩酸塩(pH7.3〜7.8)(T−TBS、以下、「洗浄液」ともいう)300μLで4回洗浄し、各ウェルにBi−GAG溶液を100μLずつ加え、常温で30分静置して、固相化ストレプトアビジンにBi−GAGを固定化した(以下、「Bi−GAG」固相化プレート」といい、各GAGを固相化したものを個々に示すときは「Bi−GAG」の「GAG」を各GAG名に代えた略称を使用する)。
表4に示した各KS抗体を含む各腹水(入手先:Rush University Medical Center)から、プロテインAを用いたアフィニティークロマトグラフィーで、常法に従って精製した。
参考例4で得られた8種の精製抗体0.2mgをQuick labeler Pro−PO NH2(生化学工業株式会社販売)を用い、その操作方法に従って、ペルオキシダーゼ標識抗体を調製した。
ストレプトアビジンの代わりに参考例4で精製した各抗KS抗体を用いること以外は参考例2記載の方法と同じ方法で各抗KS抗体固相化プレートを作製した。
病院施設の倫理委員会の承認を受けた上で、被験者からのインフォームドコンセントのもとに、変形性膝関節症(OA)患者29名、膝関節にスポーツや事故などによる外傷を受け来院し、関節内視鏡検査または手術時に直視で関節軟骨の変性または損傷が認められた外傷性膝関節症(TA)患者17名および健常者18名から血液を採取した。血液は市販の血清分離用採血管で採取し、血清を分離した後、血清を−20℃で保管した。
各種抗KS抗体におけるKS−IとKS−IIとの反応性を、抗KS抗体とビオチン標識KS−I(以下、「Bi−KS」という)との結合をKS−IあるいはKS−IIを存在させて阻害させる、いわゆる競合ELISA法を用いて評価した。
5D4を用いたサンドイッチELISA法は、市販のケラタン硫酸測定キット(生化学工業販売)を用い、その操作方法に従ってアッセイした。
2)固相化:BCD―4 検出:MK−172
3)固相化:MK−172 検出:MK−172
4)固相化:MK−172 検出:BCD−4
5)固相化:EFG−11 検出:EFG−11
6)固相化:BCD−7 検出:BCD−7
7)固相化:EFG−11 検出:BCD−7
8)固相化:MK−202 検出:MK−202
9)固相化:BCD−7 検出:EFG−11
10)固相化:BC−261 検出:BC−261
11)固相化:BC−703 検出:BC−703
プロナーゼで血清中たんぱく質を消化した検体と、プロナーゼ処理を行わなかった検体を生体試料として、BCD−4/MK172の測定系とEFG11/EFG11の測定系で、血清中のKS濃度を測定し、HPLCで測定したKS濃度との相関を比較した。検体は参考例7で採取したサンプルの一部で、健常者15名、および、OA患者20名の血清である。プロナーゼ処理検体は、血清20μLに、精製水180μLおよび2.0%アクチナーゼE溶液(科研製薬株式会社)を加え、55℃で一夜、酵素処理を行った。反応液を精製水で8mLに希釈した後、100℃で10分加熱することにより酵素反応を止めた試料を測定試料とした。また、プロナーゼ無処理検体は、血清を精製水で希釈したものを測定試料とした。ELISA測定は実施例2と同様に行った。
動物には7週齢Wistar系雄ラット(日本チャールスリバー、SPF)を用いた。
Sham群、半月板切除群での術後28日目における肉眼所見による関節の状態(肉眼スコア)を図5に示す。半月板切除群の肉眼スコアはSham群に比べて有意に高く、関節の状態が悪化していることが確認された。
ラット半月板切除モデルにおける各群の関節液KSは、既存KS測定キットでは検出不能であったが、本発明KS測定系では検出可能であった。本発明KS測定系での結果のみを図6に示す。半月板切除群の関節液KSはSham群より有意に高レベルであった。このように、本発明KS測定系では既存KS測定キットで検出不能である試料を検出可能であることが確認できた。また、ラット半月板切除モデルでも術後28日目における関節液KSレベルが増加していることが新たに判明した。さらに、本発明KS測定系でラット半月板切除モデルにおける関節液KSレベルを測定することにより、関節の状態を把握しうる可能性が示された。
動物には6週齢Lewis系雄ラット(日本チャールスリバー、SPF)を用いた。アジュバントとしてMycobacterium butyricumの乾燥菌体(DIFCO)をメノウ乳鉢でよく研磨後、6mg/mLの濃度に流動パラフィン(和光純薬工業)に懸濁したものを用いた。非麻酔下にラットの右後肢足蹠皮下にアジュバント(0.3mg/paw)を投与し、その14日後に群分けした。無処置正常群のラットには流動パラフィンのみを同様に投与した。Incadronate(ビスフォナール(登録商標)注射液10mg、アステラス製薬)は群分け時より1mg/kgの用量で、剖検日前日まで1日1回連日皮下投与した。無処置正常群とAIA対照群のラットには、PBSを剖検日前日まで1日1回静脈内投与した。左後肢足蹠浮腫容積は浮腫測定装置(TK−101CMP、UNICOM)により測定した。アジュバント感作後35日にエーテル麻酔下に腹部大静脈より採血(ヘパリン加)した後、ラットは安楽的に放血致死させた。血液は3,000回転で10分間遠心分離し、無処置正常群、AIA対照群、Incadronate投与群でのアジュバント投与後35日目における血漿中KSレベルを既存KS測定キット(5D4測定系)および本発明KS測定系で測定した。本発明KS測定系には、「固相化:BCD−4、検出:HRP標識MK−172」の系を用い、実施例2と同様の方法により測定した。ラット血漿の希釈率は、既存KS測定キットでは5倍(×5)、本発明KS測定系では120倍(×120)であった。
無処置正常群、AIA対照群、Incadronate(ビスフォスフォネート製剤)投与群(アジュバント投与+インカドロネート投与)でのアジュバント投与後35日目における左足浮腫容積(Left Paw volume)の結果を図7に示す。AIA対照群の左足浮腫容積は無処置正常群に比べて有意に高く、関節状態の悪化が確認された。Incadronate投与群ではAIA対照群と比較して浮腫容積が低下し、治療薬の効果(浮腫改善効果)が認められた。
ラットAIAモデルにおける各群の血漿中KSは既存KS測定キットでは検出不能であったが、本発明KS測定系では検出可能であった。本発明KS測定系での結果のみを図8に示す。AIA群の血漿KSは無処置正常群より高レベルであり、浮腫の増加と同様の変動を示した。Incadronate群ではAIA対照群より低下し、浮腫の低下(改善)と同様の変動を示した。このように、本発明KS測定系により、ラットAIAモデルではアジュバント投与後35日目において血漿KSレベルが増加し、そのレベルはIncadronateによる治療により低下することが新たに判明した。このKSレベルの変動は浮腫の変動と一致することから、本発明KS測定系でラットAIAモデルにおける血漿KSレベルを測定することにより、関節の状態を把握し、治療による効果を評価しうることが示された。
ウサギ左後肢膝関節腔内に、生理食塩水で25mg/mlに溶解したパパイン溶液(パパイン:SIGMA社製)を関節あたり150μlで投与し、その1週間後に、同量のパパイン溶液を再投与した。対照群の左後肢膝関節腔内には生理食塩液を同様に投与した。初回パパイン投与後49日目に血清を採取し、血清中KSレベルを測定した。KS測定には、既存KS測定キットおよび本発明KS測定系で測定した。本発明KS測定系には、「固相化:BCD−4、検出:HRP標識MK−172」の系を用い、実施例2と同様の方法により測定した。既存KS測定キットによる測定系には、「固相化:5D4、検出:ビオチン標識5D4」の系を用いた。ウサギ血清の希釈率は、既存KS測定キットでは5倍(測定時:5倍希釈)、本発明KS測定系では20倍(測定時:120倍希釈)であった。結果を図9に示す。
変形性膝関節症(OA)患者血清(n=29)、外傷性膝関節症(TA)患者血清(n=17)および健康人血清(n=18)は参考例7で採取したサンプルを用いた。
Claims (14)
- 下記工程1および2を含むケラタン硫酸の免疫学的測定方法であって、下記工程1において用いる抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体はさらに下記(1)または(2)に従う、ケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
工程1:抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体を固着させた固相、および、標識された当該抗体を、一緒に若しくは先後別々に生体試料に接触させ、当該抗体と生体試料中のケラタン硫酸の免疫複合体を当該固相上に形成させる工程;
工程2:当該免疫複合体における標識のシグナルにより得られる検出値により、生体試料中のケラタン硫酸を測定する工程。
(1)固相に固着させる抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体は、受託番号FERM BP−11211であるハイブリドーマより産生されるMK-172、または、受託番号FERM BP−11210であるハイブリドーマより産生されるBCD-4であり、標識された抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体は、標識された、受託番号FERM BP−11210であるハイブリドーマより産生されるBCD-4、または、標識された、受託番号FERM BP−11211であるハイブリドーマより産生されるMK-172である。
(2)固相に固着させる抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体は、受託番号FERM BP−11213であるハイブリドーマより産生されるBCD-7、または、受託番号FERM BP−11212であるハイブリドーマより産生されるEFG-11であり、標識された抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体は、標識された、受託番号FERM BP−11213であるハイブリドーマより産生されるBCD-7、または、標識された、受託番号FERM BP−11212であるハイブリドーマより産生されるEFG-11である。 - 生体試料が動物由来の試料である、請求項1に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
- 動物が、ウサギ、モルモット、ラットまたはマウスである、請求項2に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
- 生体試料がヒト由来の試料である、請求項1に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
- 生体試料が血液試料または関節液である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
- 前記生体試料は、プロテアーゼ処理が施されている生体試料である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
- 前記プロテアーゼは、プロナーゼ、ズブチリシン、パパイン、および、トリプシン、からなる群のプロテアーゼから選ばれる1種または2種以上のプロテアーゼである、請求項6に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法に使用するためのキットであって、抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体として、(1)受託番号FERM BP−11210であるハイブリドーマより産生されるBCD-4および受託番号FERM BP−11211であるハイブリドーマより産生されるMK-172、あるいは、(2)受託番号FERM BP−11213であるハイブリドーマより産生されるBCD-7および受託番号FERM BP−11212であるハイブリドーマより産生されるEFG-11、を含む、ケラタン硫酸測定用キット。
- 下記の工程を含む、関節疾患の検知方法。
工程1:請求項1〜7のいずれか1項に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法によって、被検体中のケラタン硫酸を測定する工程;
工程2:工程1により測定される被検体中のケラタン硫酸量と、正常検体中のケラタン硫酸量、および/または、時間をおいて複数回にわたり測定される被検体中のケラタン硫酸量とを比較する工程;
工程3:工程2における比較に基づいて、被検体中のケラタン硫酸量が、正常検体中のケラタン硫酸量よりも増加している場合を、関節疾患について陽性であると判定し、あるいは、複数回の測定により検出された被検体中のケラタン硫酸量が、前の回の測定値よりも増加している場合を関節疾患は進行傾向にあると判定する工程。 - 関節疾患が、変形性関節症または外傷性関節症である、請求項9に記載の関節疾患の検知方法。
- 関節疾患が、X線によっては検知できない変形性関節症である、請求項10に記載の関節疾患の検知方法。
- 請求項9〜11のいずれか1項に記載の関節疾患の検知方法に使用するためのキットであって、抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体として、(1)受託番号FERM BP−11210であるハイブリドーマより産生されるBCD-4および受託番号FERM BP−11211であるハイブリドーマより産生されるMK-172、あるいは、(2)受託番号FERM BP−11213であるハイブリドーマより産生されるBCD-7および受託番号FERM BP−11212であるハイブリドーマより産生されるEFG-11、を含む、関節疾患の検知用キット。
- 下記の工程を含むことを特徴とする関節疾患治療薬またはその候補物質の治療効果の判定方法。
工程1:請求項1〜7のいずれか1項に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法によって、関節疾患治療薬またはその候補物質の投与前の被検体と、投与後の被検体中のケラタン硫酸を測定する工程;
工程2:工程1により得られた関節疾患治療薬またはその候補物質の投与前の被検体中のケラタン硫酸量と、投与後の被検体中のケラタン硫酸量を比較する工程;
工程3:工程2における比較に基づいて、関節疾患治療薬またはその候補物質の投与前のケラタン硫酸量から、投与後のケラタン硫酸量への正常方向への変化の度合いを検出し、これを指標として上記治療薬またはその候補物質の効果を判定する工程。 - 請求項13に記載の関節疾患治療薬またはその候補物質の治療効果の判定方法に使用するためのキットであって、抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体として、(1)受託番号FERM BP−11210であるハイブリドーマより産生されるBCD-4および受託番号FERM BP−11211であるハイブリドーマより産生されるMK-172、あるいは、(2)受託番号FERM BP−11213であるハイブリドーマより産生されるBCD-7および受託番号FERM BP−11212であるハイブリドーマより産生されるEFG-11、を含む、治療効果の判定用キット。
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