JP5693973B2

JP5693973B2 - 高分解能分類

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Publication number: JP5693973B2
Application number: JP2010549014A
Authority: JP
Inventors: ウルリク・ダーリンク・ラーセン
Original assignee: Koninklijke Philips NV; Koninklijke Philips Electronics NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 2008-03-03
Filing date: 2009-03-02
Publication date: 2015-04-01
Anticipated expiration: 2029-03-02
Also published as: US20110027825A1; EP2252872B1; AU2009221393B2; JP2011513739A; WO2009109190A1; EP2252872A1; AU2009221393A1; CA2714495A1

Description

本発明は、サンプル中の細胞の粒径分布を求める方法に関する。サンプルは、好ましくは液体と細胞との混合物を含む。サンプルは血液サンプルでよい。

例えば血液サンプルであるサンプルを試験するとき、そのようなサンプル中の細胞の計数および粒径測定の高分解能の方法が必要である。

細胞の計数または特徴づけのやり方の1つに、液体に懸濁された粒子が、例えばコールター計数による粒子の特徴づけを可能にするように原則として1つずつオリフィスを通過する粒子特徴づけ装置を使用するものがある。

コールターサイジング(非特許文献1を参照されたい)として広く知られている電気インピーダンス技法を用いることにより、粒径(size)、濃度および導電率に関して小オリフィスを通って進む粒子を特徴づけることができることは周知である。

コールターの原理による粒子の計数および分粒(sizing)は、大抵の血液分析器および粒子計数機器に用いられている国際的に評価の高い方法である。この方法は、電解質中の非導電性粒子によってもたらされる、電気インピーダンスの測定可能な変化に基づく。「開口」または「オリフィス」と称される小開口が、電解質と接触するように電極が設けられている2つの電気的に絶縁されたチャンバを連結する。オリフィスが電気路に絞りを与え、これによって粒子が通って吸引される検知ゾーンが確立される。検知ゾーンでは、各粒子が周囲の電解質の変位を引き起こし、したがって電流経路の一部を遮断し、電圧パルスを引き起こす。この方法により、1秒当り数千の粒子を高精度で特徴づけることができる。

粒子によって発生された電圧パルスのピーク振幅は、粒径に非常によく相関されることも周知であり、したがって、電圧パルスのピーク振幅を、簡単かつ確実なやり方で、しかも低コストで求めることができるのが望ましい。

しかし、高分解能が望まれる場合、より高分解能を達成する従来のやり方は、パルスを測定して分類するためにより多くのチャネルを有するハードウェアを実装することであり、ハードウェアコストおよび複雑さが増加する。コストを下げ、より簡単なハードウェアを提供する、波高分布を求めるための新規の方法が必要とされている。

V. Kachel、「Electrical Resistance Pulse Sizing: Coulter Sizing」、Flow Cytometry and Sorting、Second Edition、45〜80頁、1990年、Wiley-Liss

本発明は、マイクロコントローラを使用して、パルスをアナログ閾値電圧と比較し、各パルス波高カテゴリの範囲内の各イベントを計数するアナログ-デジタルパルス波高分類ユニットを備える装置を使用することによって波高分布を求める方法に関し、この方法は、
1)閾値電圧の第1の組を選択するステップと、
2)閾値電圧の第1の組を用いて第1の測定を実行するステップと、
3)閾値電圧の第1の組と異なる閾値電圧の新規の組を選択するステップと、
4)閾値電圧の新規の組を用いて新規の測定を実行するステップと、
5)第1の測定および新規の測定に基づいて細胞の粒径分布を求めるステップとを含む。

選択された閾値電圧は、測定を実行する前にアナログ-デジタルパルス波高分類ユニットに与えられる。閾値電圧は、閾値電流または単に閾値でもよい。

驚くべきことに、異なる閾値電圧、シフトされた閾値電圧または移動された閾値電圧を用いて上記で定義された方法による細胞計数の方法を実行すると、精度が大幅に改善することが判明した。

閾値電圧の第1の組は、ユーザによって入力されたもの、既知の粒径分布に基づいて計算または決定されたもの、他の方法または上記の任意の組合せを用いて求めたものであるルックアップテーブルから選択することができる。

測定結果は、本発明による方法を実行するのに用いられる装置の内蔵メモリユニットまたは装置に電気的に接続されたメモリユニットに記録される。メモリユニットは、バッファなどの一時的なものでよい。

また、測定から記録されたデータは、ハードディスク、光ドライブなど他のデータ記憶装置に記憶または伝達され得る。

ステップ3向けに閾値電圧の新規の組が選択される。閾値電圧の新規の組は、少なくとも1つの新規の閾値電圧、すなわち第1の組の閾値電圧のうちいかなるものとも異なる少なくとも1つの新規の閾値電圧を含む。新規の測定は、第1の測定と実質的に同じやり方で実行することができる。

細胞の粒径分布の決定は、第1の測定および新規の測定に基づくものである。決定は、例えば、好ましくは上記の例では2回測定した測定の組に対して行なわれる数値演算手順である後退代入を用いて実行され得るが、一般に、後退代入は測定の組の全体に対して実行することができる。一般に、この決定は、測定の組に基づいて元の細胞分布を再構成する適応アルゴリズムによって実行される逆算でよい。

前述の装置は、集積回路、フィールドプログラマブルゲートアレイまたは特定用途向け集積回路、あるいはそれらの組合せを使用して実現されたパルス波高を得るための構成要素を有することができる。

本発明の一実施形態では、パルス波高決定ユニットは、電子パルスをアナログ-デジタル変換するための共通入力を有する第1の複数のコンパレータと、パルスの立ち上がりエッジによる対応する閾値電圧の通過を記録するためのそれぞれのコンパレータの出力に入力が接続されている第1の複数のラッチと、それぞれの閾値電圧によって定義されたパルス波高間隔の範囲内のパルス波高を有するパルスから成るパルス波高カテゴリを決定するためにラッチ出力に接続されたプライオリティエンコーダと、各パルス波高カテゴリの範囲内のパルスの数を計数するように適合されたマイクロコントローラとを備えることができる。

閾値電圧が、必要に応じて個々に調節され得ることは、本発明の利点である。例えば、閾値電圧が等間隔である必要はない。粒子のあり得る粒径分布が既知の場合、粒子の実際の粒径分布の最適な決定または検出のために調節される複数の閾値電圧を選択することが可能である。例えば、全血の分析では、赤血球、白血球および血小板の3つのタイプの血球の数を計数するのが望ましい。相当直径または等体積として示されるそれらの粒径は、最小の血小板の約1.2μmまたは1fl(1fl=10^-15l)から最大の白血球の約9μmまたは400flまでの範囲に及ぶ。

白血球の含有量、それらの部分母集団および血小板についての情報は、様々な疾病を診断し、かつ医療を監視するための医師用の重要なツールである。さらに、血液サンプルにおいて赤血球数と直接関係するヘモグロビンの濃度も非常に重要である。

したがって、赤血球、白血球および血小板の数は、赤血球、白血球および血小板の既知の粒径に従って選択されかつ調節された閾値電圧を用いて、例えば個々の粒径分布の対応する平均値の中間に閾値電圧を配置することにより、前述のパルス波高分析器を利用して計数することができる。

閾値電圧の第1の組が第1の閾値電圧範囲を定義することができ、新規の閾値電圧が新規の閾値電圧範囲を定義することができる。第1の閾値電圧範囲と新規の閾値電圧範囲とはオーバラップしてもしなくてもよく、あるいは、第1の閾値電圧範囲と新規の閾値電圧範囲とが1つの共有点を有してもよい。第1の閾値電圧範囲と新規の閾値電圧範囲とが、複数の共有点をさらに有してよい。範囲は、好ましくは所与の組の最高の閾値電圧および最低の閾値電圧によって定義される。

前述の後退代入は、閾値電圧の個々の組の閾値電圧の相互関係に応じて選択されてよい。

閾値電圧の組の閾値電圧の数は、前述の第1の複数の中の要素数次第であり得る。閾値の数は、5から15、8から12、2から5、5から8、8から10、10から12、12から15、15から18、18から20、8など、2から20でよい。閾値の実際の数は、本発明による方法を実行するのに使用される装置次第であり得る。この方法が、既存のハードウェアまたは代替形態で特別に開発されたハードウェア上で実行されるソフトウェアプログラムとして実施され得ることは、本発明の利点である。

ステップ3)および4)が、5から15回、8から12回、2から5回、5から8回、8から10回、10から12回、12から15回、15から18回、18から20回、10回など、1から20回さらに実行され得るのは本発明の利点である。測定が繰り返される回数は、所望の精度および/または試験液の量次第であり得る。試験液をオリフィスに通そうとするとき、利用可能な流体の量が限られていることがあり、代替として流体を再循環させてもよい。流体が、実質的に均質な粒子すなわち血球などの分布を含むことはさらに有利であり得る。

本発明の特定の実施形態では、各繰返しにおける閾値電圧の新規の組は、以前に選択されたいかなる閾値電圧の組とも異なるものであり得る。1組の閾値電圧は、少なくとも1つの閾値電圧が、閾値電圧の組の他の以前の閾値電圧と異なるとき、いかなる他の組とも異なると考えることができる。あるいは、各組の閾値電圧が、いかなる閾値電圧の他の組のいかなる他の閾値電圧とも異なることがあり、すなわち、いかなる所与の測定の組においても同一の閾値電圧が再使用されないことがある。

閾値電圧の新規の組が、次式を使用して計算され得ることは特に有利である。
T_i,j+1=α_i,j+1T_i,j+β_i,j+1
ここで、閾値電圧の各組はN個の閾値電圧を含み、T_iはi番目の閾値であり、iは0からN-1まで変化し、jはj番目の閾値電圧の組であり、jは1からステップ3)および4)の繰返し数まで変化する。

本発明のいくつかの実施形態では、上式は次のように変更することができる。
T_i,j+1=α_i,j+1T_x,j+β_i,j+1
ここで、T_x,jはx番目の組の諸閾値電圧である。いくつかの実施形態では、閾値は、閾値電圧の第1の組、すなわち上式のx=1に基づいて計算することができる。他の実施形態では、閾値は、以前の閾値の組に対して計算することができる。

閾値は、上記の式のうち任意のものを用いて前もって計算することができ、続いてルックアップテーブル、データベースまたは他の適切な記憶装置に記憶される。あるいは、1組の閾値電圧を、上記の各測定ステップの繰返しの期間中、または短期間先立って計算することができ、すなわち実行中または測定期間中に計算される。あるいは、閾値電圧がユーザによって入力され、測定を実行するとき用いるために記憶されてもよい。

計数される細胞の実際の粒径分布に応じて、第1の閾値の分配は、等間隔でも不等間隔でもよい。続く閾値が、第1の閾値と同一の特性を有する必要はない。一実施例として、上式は、閾値の第1の組は等間隔に分配されるが、第1の組に基づいて計算される第2の組は等間隔に分配されない一連の閾値電圧をもたらすことができる。

それに続く閾値の組は、前述のように、前述の式のうち任意のものを用いて計算することができる。式では、αは任意の正の実数値を有し、またはゼロになることができ、βは任意の実数値、すなわち負、正、またはゼロの値を有することができる。αの値がすべて1または0である一実施形態では、閾値の範囲は、βの値により、βの符号に応じてプラス側またはマイナス側のいずれかへシフトされることになる。

ほとんどの実施形態では、閾値電圧の第1の組は、特徴づけるべき粒子の粒径が、生成される電圧に影響を及ぼし、またこれらの電圧が通常はゼロと異なるので、ゼロからいくらかの間隔を置いて始まる。

前述のように、本発明による方法はソフトウェアプログラムとして実施することができ、したがって、本発明は、本発明による方法のコンピュータソフトウェア実装形態を備える装置にさらに関する。本発明は、本発明による方法のコンピュータソフトウェア実装形態を備えるデータ担持媒体にも関する。データ担持媒体は、ハードディスク、フラッシュドライブ、コンパクトディスク(CD)またはデジタル多用途ディスク(DVD)などの光学式記憶ディスク、あるいは他の適切なデータ担持媒体でよい。

以下で、添付図面を参照しながら、本発明がさらに説明され、かつ示される。

2つの細胞集団に関する第1の測定結果の概略図である。図1の2つの細胞集団に関する第2の測定結果の概略図である。本発明による方法を用いて実行された第1の測定結果の概略図である。本発明による方法を用いて実行された第2の測定結果の概略図である。第2の細胞集団に対して既知の方法を用いて実行された測定結果の概略図である。本発明による不等間隔の閾値を用いる方法で第2の細胞集団に対して実行された測定結果の概略図である。図6の測定の計算された後退代入の概略図である。 1つの閾値を用いて測定を実施する1つのやり方の概略図である。 1つの閾値を用いて測定を実施する1つのやり方の概略図である。 1つの閾値を用いて測定を実施する1つのやり方の概略図である。 8つの閾値を用いて測定を実施する1つのやり方の概略図である。 8つの閾値を用いて測定を実施する1つのやり方の概略図である。 8つの閾値を用いて測定を実施する1つのやり方の概略図である。不等間隔の閾値を用いて測定を実施する1つのやり方の概略図である。不等間隔の閾値を用いて測定を実施する1つのやり方の概略図である。不等間隔の閾値を用いて測定を実施する1つのやり方の概略図である。不等間隔の閾値を用いて測定を実施する1つのやり方の概略図である。

図1は、細胞計数の既知の方法を用いて実行された測定結果を示す概略図である。2つのオーバラップする細胞集団の混合物を用いた。

測定に対して非常に高い分解能が適用された。テスト装置は、800の離散的通信路を特徴とするものであった。既知の細胞集団の計数方法は、複雑なハードウェアおよびソフトウェアを必要とする高コストの方法である。

図1のX軸はチャネル番号を表す。図1のY軸は、所与のチャネルにおける計数を表す。

図1の調査における2つの細胞集団は、2つの異なる粒径の細胞を含むことが2つのピーク10、12から明らかである。2つの細胞集団間の分割を求めるのは比較的簡単である。

図2は、図1で調査されたのと同一の細胞集団の第2の測定の概略図である。ここでは、8つのチャネルの低分解能が用いられている。チャネル数が少ないとハードウェアの複雑さおよびコストが低下するが、分解能が犠牲になる。2つのピーク14、16がまだ見えるが、図1のものと同程度ではない。

低分解能のために、2つの母集団間で正確な分割を18に求めるのは困難である。

図3は、上記と同一の細胞集団の測定の概略図である。この測定は、本発明による方法を用いて実行されている。

図2の測定の場合と同じ8つのチャネルを有するシステムが使用されている。

システムまたは装置は、電子パルスのアナログ-デジタル変換のための共通の入力を有する8つのコンパレータと、パルスの立ち上がりエッジによる対応する閾値電圧または閾値の通過を記録するためのそれぞれのコンパレータの出力に入力が接続されている8つのラッチと、それぞれの閾値電圧によって定義されたパルス波高間隔の範囲内のパルス波高を有するパルスから成るパルス波高カテゴリを決定するためにラッチ出力に接続されたプライオリティエンコーダと、各パルス波高カテゴリの範囲内のパルスの数を計数するように適合されたマイクロコントローラとを備える。

図3のグラフのX軸は、8つのチャネルを表す。図3のグラフのY軸は、それぞれのチャネルにおける計数を表す。

この方法は、最初に閾値電圧の第1の組を選択し、続いて、閾値電圧の第1の組を用いて第1の測定を行なうことにより実行される。次いで、閾値電圧の第1の組と異なる閾値電圧の新規の組を選択し、閾値電圧の新規の組を用いて新規の測定を実行する。

測定は、5つのバー26、28、30、32および34によって示される5回を繰り返す。測定の各繰返しでは、閾値電圧は、次の一般的な式に従って移動またはシフトされる。
T_i,j+1=α_i,j+1T_i,j+β_i,j+1
ここで、閾値電圧の各組はN個の閾値電圧を含み、T_iはi番目の閾値であり、iは0からN-1まで変化し、jはj番目の閾値電圧の組であり、jは1から繰返し数まで変化する。図3の実施例では、Nは5であり、すべてのαは1である。

X軸の各位置はチャネルを表す。各チャネルは測定の繰返し数に相当するバーを備え、ここでは5回の繰返しが実行される。この実施例では、閾値は等間隔でシフトまたは移動される。

上記の式を用いて計算された異なる閾値を用いて測定を繰り返すと、図2に関して説明された方法と比べて驚くほど著しく改善された結果を得る。

本発明による方法は、所望の分解能に応じてスケーリングするのが比較的簡単である。図1および図2に関して説明されたように、既知の方法を用いると、分解能を向上させるスケーリングには、追加のハードウェアまたは適応したハードウェアが必要となり、結果的にハードウェアのコストおよび複雑さが増す。

図3の結果を図2の結果と比較すると、図3の結果では細胞集団間の分割の決定が改善されている。分割は、2つのピーク20と22との間のライン24によって示されている。

曲線33は、図3のバーによって示された結果に基づいて計算した粒径分布を示す。

図4は、対応する8回の閾値シフトを伴う8つの測定を実行するのに本発明による方法を用いたグラフを概略的に示す。各シフトは、バー42、44、46、48、50、52、54および56によって表されている。8つのチャネルのそれぞれが8つのバーを含む。図4の棒グラフを図3の棒グラフと比較すると、図4のグラフは、細胞タイプ間の分割を求めるためのさらに改善された基準を示す、母集団についてのより詳細な視野を提供する。また、チャネルで表された各カテゴリにおける細胞の数の決定も改善され、すなわち、棒グラフを詳しく調べることにより、所与の粒径カテゴリに何個の細胞があるか求める、または推測することができる。

図5は、8つのチャネルを有するデバイスを用いて実行された測定の概略的棒グラフである。測定は1回実行した。この測定は、閾値の不等間隔および/または不等間隔の閾値を含むものであった。母集団中の細胞の正確な粒径分布は、この結果からは明白でない。

図6は、図5の測定に用いられたのと同一の細胞集団の測定を示す概略的棒グラフである。不等間隔の閾値の分布のために、閾値の移動またはシフトによって、異なる繰返しの間隔がオーバラップしている。このオーバラップは結果にも見ることができる。第1のチャネルに相当するX軸上の位置では、7本のバーの高さが増加している。第2のチャネルに相当する隣接した位置では、最初のバーが、位置1の最後のバーより低く、また、最後のバーに次ぐものである。これは、閾値間隔のオーバラップによるものである。例えば図3の棒グラフと比較すると、図3のバーは、粒径分布を表す曲線をうまく定義している。

図6の棒グラフ以前に、粒径分布をより正確に示す何らかのデータ処理が必要である。得られた結果に対して適切な後退代入ルーチンを用いると、図7に示された曲線が得られる。

図1〜図7に示されたすべての実施例では、X軸はチャネル番号を表し、各チャネルは粒径間隔に関係する。粒径間隔は、ハードウェアの実装形態によって与えられる。

前述のように、より固定された閾値を分粒(size classification)に用いる代わりに、例えば一定期間のシーケンスで、試験または測定を通じて、閾値を進めるのに電流閾値または電圧閾値の調節を用いることができる。各ボックスにおける変化が、ステップと一致する分解能を有する分粒の分解能を反映することになる。したがって、それは、分解能を決定するステップの大きさである。

簡単な1つの実施例は、1つの閾値によって定義された1つの分類だけの場合である。図8に示されたものなど、所与の、一定で限定されたパルス波高の分布を用いて、閾値を、各ステップ間にt秒の一定期間を置いてN回のステップで分布の全体にわたってスイープさせてよい。各ステップの計数C(i)が記憶され、図9に示されている。ここで、次式でクラス内容P(i)を計算することにより、パルス波高の分布をNクラスの分解能として見いだすことができる。
P(i)=C(i)-C(I+1)、I=1からN-1
結果は図10に示されている。

パルス波高を分類するのに8つのクラスが用いられる一実施形態では、等間隔の閾値を用いるのが有利であり得る。このようにして、用いるステップ数で分割した分類の幅と一致するようにステップを選択することができる。

さらに、全波高分布が常に含まれるように閾値を一致させることが有利であり得る。このように、各時間フレームの中のパルスの計数の合計は同一のままのはずであり、これは容易に確認される。図11に示されるような波高分布であると、5ステップを有する8クラスの分解能の計数はC(j:i)で表すことができ、ここでjはj番目のクラスを示し、iはi番目のステップを示す。図12を参照されたい。40クラスの分布は、クラス内容P(i)を次式で計算することにより見いだすことができる。
P(i+5×(j-1))=C(j:i)/5、j=1から8、i=1から5
測定に基づく計算の結果が、図13に示されている。

いくつかの実施形態では、不等間隔の閾値を用いることができる。後退代入は、より複雑になることがあり、間隔の変動に左右される。この問題を克服する最も簡単なやり方は、最小間隔と同じ閾値間隔の分類の中に各分粒を分割することであり、これは、好ましくは整数にするべきである。分割された分類の合計された内容は、元の分粒の内容に等しいが、隣の分粒を用いた補間によって不均一に分布することがある。

図14は、5クラスの不等間隔の閾値化が9つの新規のサブクラスに分割される様子を概略的に示す。図14の分布が、不等間隔の分類を用いて測定される(図15)。その分布は、9つの新規のサブクラスに分割され(図16を参照されたい)、この後、新規のサブクラスに対して補間が用いられる(図17)。図11〜図13に示された実施例で説明されるように、次にステッピングを用いることができる。

さらに、計数プロセスの期間を通じて、測定時間中に計数が変動することがある。例えば、開口を通る流れが変化するとき、計数がわずかに減少または増加することがある。そのような状況では、スイープを繰り返す方法を用いるのが有利なことがある。この方法は、ステップ時間を計数時間の合計の1/5または1/10へ減少させることを含んでよい。全計数時間に達するまでは、スイープの最後のステップが完了した後、新規のスイープで全体のプロシージャが開始される。それによって、一連のスイープが実行され、計数におけるゆっくりした変化は計数ステップのすべてに分配される。

一実施例では、5ステップおよび10回のスイープを有する8クラスの分解能の波高分布では、計数はC(j:i:k)で表すことができ、ここでjはj番目のクラスを示し、iはi番目のステップを示し、kはk番目のスイープを示す。40クラスの分布は、クラス内容P(i)を次式で計算することにより見いだすことができる。

ここで、jは1から8まで変化し、iは1から5まで変化する。

計数が流れに基づくものである場合、特定のボリューム中の細胞の計数に用いられる合計時間が、わずかに変動することがある。上記の実施例では、計数が停止されたときスイープが終了していなければ、粒径分布を表すデータに欠陥(hole)が生じる恐れがある。計数の合計と一致させるために、最後の不完全なスイープを用いるのでなく先のスイープの内容の補正を利用することにより、これが補正または補償され得ることが企図される。最後の不完全なスイープを含むすべての粒径クラスの計数の合計がPtotで示されるとき、補正は次式で表すことができる。

ここで、jは1から8まで変化し、iは1から5まで変化し、lastは計数が停止したときの最後のスイープの番号である。

有利な実施形態では、一連のスイープが第1の時間間隔の範囲内に実行され得る。これは、例えばXX分の期間でよい。第1の時間間隔にわたって流速が変動することがあり、すなわち、測定期間中に流速がわずかに変化することがある。この方法は、一連のスイープの各スイープについて、1回のスイープにおける諸ステップに用いられる時間を短縮するステップをさらに含んでよい。これは、あるスイープに使われる時間が、それに続くスイープおよび/または諸スイープに使われる時間より長いことを意味する。

有利には、1回のスイープに用いられる時間が、各スイープについて期間が1/20から1/4の係数だけ短縮される。掃引に使われる時間は、各スイープについて特定の係数だけ短縮することができる。一実施例として、第1のスイープが10秒で実行され、その直後のスイープが8秒で実行され、それによってスイープ時間が1/5だけ短縮する。

別の有利な実施形態では、第1のボリュームを用いて一連の測定を実行することができ、すなわち特定のボリュームの調査が完了するまで測定が継続される。第1の時間間隔にわたって流速が変動することがあり、使われる合計時間が変動して、スイープの回数が完全なスイープの回数を構成しない恐れがあることを意味する。この方法は、次式を用いて最後のスイープを補正するステップをさらに含むことができる。

ここで、Ptotは最後の不完全なスイープを含むすべての粒径クラスの計数の合計であり、jはクラスの番号であり、iはステップの番号であり、max(i)は最大ステップ数であり、kはスイープの番号であり、lastは実行された最後のスイープの番号である。

10〜16、20、22 ピーク
18、24、38 ライン
26〜36、40〜56 バー
33 曲線

Claims

パルスを各チャネルにおいてアナログ閾値電圧と比較し、マイクロコントローラを使用して各パルス波高カテゴリの範囲内の各イベントを計数するアナログ-デジタルパルス波高分類ユニットを備える装置を使用することによって波高分布を求める方法であって、
1)前記アナログ閾値電圧の第1の組を選択するステップと、
2)前記アナログ閾値電圧の前記第1の組を用いて、各チャネルにおいて第1の前記比較及び計数を実行するステップと、
3)前記アナログ閾値電圧の前記第1の組と異なる前記アナログ閾値電圧の新規の組を選択するステップと、
4)前記アナログ閾値電圧の前記新規の組を用いて、各チャネルにおいて新規の前記比較及び計数を実行するステップと、
5)前記第1及び前記新規の比較及び計数に基づいて細胞の粒径分布を求めるステップと、
を含み、
前記アナログ閾値電圧の各組は、各チャネルで使用されるアナログ閾値電圧の１つを含み、前記第1の組の個々のアナログ閾値電圧は、前記ステップ2)において前記第1の比較及び計数のために個々の当該チャネルに入力され、前記新規の組の個々のアナログ閾値電圧は、前記ステップ4)において前記新規の比較及び計数のために個々の当該チャネルに入力され、各チャネルにおいて、前記アナログ閾値電圧の第１の組、次いで前記アナログ閾値電圧の新規の組からの当該アナログ閾値電圧を使用して前記比較及び計数が繰り返される結果として、個々のチャネルが、当該チャネルに対応付けられる所定の粒径間隔内の分布を提供することにより、前記細胞の粒径分布が求められ、
前記計数が、各チャネルで使用される各アナログ閾値電圧によって規定されるパルス波高カテゴリごとに実施される、方法。
前記アナログ閾値電圧の前記第1の組が第1の閾値電圧範囲を定義し、前記アナログ閾値電圧の前記新規の組が新規の閾値電圧範囲を定義して、前記第1の閾値電圧範囲と前記新規の閾値電圧範囲とがオーバラップする、請求項1に記載の方法。
前記ステップ3)および4)が、1から20回実行される請求項1または2に記載の方法。
各繰返しにおける前記アナログ閾値電圧の前記新規の組が、以前に選択された前記アナログ閾値電圧のいずれの組とも異なる請求項3に記載の方法。
前記アナログ閾値電圧の組の中のアナログ閾値電圧の数が、2から20である請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
前記アナログ閾値電圧の新規の組が次式を用いて計算され、
T_i,j+1=α_i,j+1T_i,j+β_i,j+1
ここで、
前記アナログ閾値電圧の各組がN個のアナログ閾値電圧を含み、T_iはi番目の閾値であり、iは0からN-1まで変化し、
jはj番目のアナログ閾値電圧の組であり、jが1からステップ3)および4)の繰返し数まで変化する請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
前記第1の組のアナログ閾値電圧が等間隔に分配される、または前記第1の組のアナログ閾値電圧が不等間隔に分配される請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
αが任意の正の実数値を有する、または零であることができる請求項6または7に記載の方法。
βが任意の実数値を有することができる請求項6から8のいずれか1項に記載の方法。
流速が第1の時間間隔にわたって変動し、
前記方法が、変動する計数が各ステップの中に均一に分配されるように、それぞれが合計の計数時間の数分の1持続する一連のスイープを繰り返すことによって流速変動の影響を低下させるステップを含む請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
1回のスイープに用いられる時間が、前記合計の計数時間の1/20から1/4である請求項10に記載の方法。
一連のスイープが第1の時間間隔の範囲内で実行され、
前記方法が、前記一連のスイープの各スイープについて、1回のスイープで諸ステップに用いられる時間を短縮するステップをさらに含む請求項10または11に記載の方法。
一連の前記比較及び計数が第1のボリュームを用いて実行され、流速が前記第1の時間間隔にわたって変動し、
前記方法が、次式を用いて最後のスイープを補正するステップをさらに含み、

ここで、Ptotは、完全でない最後のスイープを含むすべての粒径クラスの計数の合計であり、jはクラスの番号であり、iはステップの番号であり、max(i)は最大ステップ数であり、kはスイープの番号であり、lastは実行された前記最後のスイープの番号である請求項10から12のいずれか1項に記載の方法。
パルスを各チャネルにおいてアナログ閾値電圧と比較するアナログ-デジタルパルス波高分類ユニットと、
各パルス波高カテゴリの範囲内の各イベントを計数するように構成されたマイクロコントローラと、
を含む装置であって、
前記マイクロコントローラが、
1)前記アナログ閾値電圧の第1の組を選択し、
2)前記アナログ閾値電圧の前記第1の組を用いて、各チャネルにおいて第1の前記比較及び計数を実行し、
3)前記アナログ閾値電圧の前記第1の組と異なる前記アナログ閾値電圧の新規の組を選択し、
4)前記アナログ閾値電圧の前記新規の組を用いて、各チャネルにおいて新規の前記比較及び計数を実行して、
5)前記第1及び前記新規の比較及び計数に基づいて細胞の粒径分布を求め、
前記アナログ閾値電圧の各組は、各チャネルで使用されるアナログ閾値電圧の１つを含み、前記第1の組の個々のアナログ閾値電圧は、前記ステップ2)において前記第1の比較及び計数のために個々の当該チャネルに入力され、前記新規の組の個々のアナログ閾値電圧は、前記ステップ4)において前記新規の比較及び計数のために個々の当該チャネルに入力され、各チャネルにおいて、前アナログ閾値電圧の第１の組、次いで前記アナログ閾値電圧の新規の組からの当該アナログ閾値電圧を使用して前記比較及び計数が繰り返される結果として、個々のチャネルが、当該チャネルに対応付けられる所定の粒径間隔内の分布を提供することにより、前記細胞の粒径分布が求められ、
前記計数が、各チャネルで使用される各アナログ閾値電圧によって規定されるパルス波高カテゴリごとに実施される、装置。
前記マイクロコントローラが、請求項1から13のいずれか1項に記載の方法をコンピュータソフトウェアにより実施することを含む請求項14に記載の装置。