JP5674082B2

JP5674082B2 - Ｎｋｔ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の有効性の予測方法

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Publication number: JP5674082B2
Application number: JP2009200911A
Authority: JP
Inventors: 新一郎本橋; 俊憲中山; 幸祐沖田
Original assignee: KOSHIN. CO., LTD.; Chiba University NUC
Current assignee: KOSHIN. CO., LTD.; Chiba University NUC
Priority date: 2009-08-31
Filing date: 2009-08-31
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2029-08-31
Also published as: JP2011050285A

Description

本発明は、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の有効性を予測する方法、及びそれに使用するキットに関する。

非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、肺癌症例の８０％超を占め、患者の大部分が、局所進行性であるか、転移症例である。肺癌の予後は未だに暗澹たるものであり、５年生存率が１５％を下回る。プラチナベースの化学療法が進行したＮＳＣＬＣに対する標準的な第一選択治療（first-line therapy）である（非特許文献１）。第一選択治療後の不応答症例や再発症例は、治療をすることがより一層困難であると考えられている（非特許文献２〜４）。後期ＮＳＣＬＣの患者は、しばしば症候性であって、標準的な化学療法は好ましくない合併症を引き起こすので、免疫療法のような毒性の低い新たな治療法の確立が強く望まれている。

非多様性ナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞は、リンパ球のユニークな亜群であり、幅広い免疫反応を制御する（非特許文献５〜７）。ｉＮＫＴ細胞は非古典的ＭＨＣ分子であるＣＤ１ｄにより提示された糖脂質抗原を認識する。α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ；ＫＲＮ７０００）は、もともとは海綿から抽出されたものであり、ｉＮＫＴ細胞についての最初の糖脂質リガンドとして見出された（非特許文献８）。α−ＧａｌＣｅｒへの反応において、ｉＮＫＴ細胞は有効量のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）のようなサイトカインを産生し、樹状細胞（ＤＣｓ）、ＮＫ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む他のエフェクター細胞に対してアジュバント効果を発揮する。また、ｉＮＫＴ細胞はインビトロ及びインビボの双方において、悪性腫瘍に対する強力で直接的な抗腫瘍活性を有する（非特許文献９〜１３）。

ｉＮＫＴ細胞の強力な抗腫瘍活性を臨床分野に適用するため、最近、内在性のｉＮＫＴ細胞を活性化するようにデザインされたα−ＧａｌＣｅｒパルスＤＣの第１相臨床試験を、標準治療に不応答なＮＳＣＬＣの患者で行った（非特許文献１４）。この細胞療法は、注入細胞の最大用量で、３例全てにおいて明らかな免疫反応を誘導した。結果的に、進行性又は再発性のＮＳＣＬＣの患者１７名についてα−ＧａｌＣｅｒパルスＤＣ投与の第Ｉ〜ＩＩ相試験を行った。その結果、ＰＢＭＣにおける上昇したＩＦＮγ産生と、延長した生存期間の中央値との間の相関が認められ、即ち、ＩＦＮγ良好応答者群（１０例）の生存期間中央値（ＭＳＴ：１９．１月）は低応答者群（７例）のそれ（９．５月）よりも長かった（ｐ＝０．００４６）（非特許文献１５）。

ロイコトリエンＢ４１２−ヒドロキシデヒドロゲナーゼ（ＬＴＢ４ＤＨ）は、亜鉛非依存的な中鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＭＤＲ）ファミリーの一員であり、生物学的活性の高い３つの全てのエイコサノイドを除去するためのその非可逆的分解における鍵となる酵素である（非特許文献１６）。Schultzらは、腫瘍組織におけるＬＴＢ４ＤＨ発現が、早期段階の尿路上皮細胞カルシノーマにおける再発の予測マーカーとなり得ることを報告している（非特許文献１７）。

ジヒドロピリミジネース・ライク３（ＤＰＹＳＬ３）は、ＴＵＣ（TOAD-64/Ulip/CRMP）ファミリーの一員であり、コラプシン・レスポンス・メディエーター・プロテイン−４（ＣＲＭＰ−４）又はＴＵＣ−４としても知られており、神経の可塑性及び神経突起伸展や伸長に寄与している（非特許文献１８）。ＤＰＹＳＬ３はチュブリン、アクチン及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカン等の構造蛋白質と相互作用することから、このタンパク質は、細胞骨格系の組織化の制御において重要な役割を果たしていることが示唆されている。Ｋｎｕｄｅｎらは、抗ＤＰＹＳＬ３抗体が、胸腺腫及び亜急性の辺縁系脳炎と関連することを記載している（非特許文献１９）。

クロモソーム１３オープン・リーディング・フレーム１５（Ｃ１３ｏｒｆ１５）は、細胞周期進行を制御すると考えられており、ＤＮＡ損傷に応答してｐ５３により誘導され、あるいは溶解性を下回るレベルの補体系タンパク質により誘導される。レスポンス・ジーン・トゥ・コンプレメント３２（ＲＧＣ３２）は、Ｃ１３ｏｒｆ１５の別名であり、そのアライメントから、この遺伝子の機能として、サイクリン依存的キナーゼ２（ＣＤＣ２）のレギュレーターの基質ということが示唆されている。Ｃ１３ｏｒｆ１５を過剰発現させると、細胞周期進行を活性化するか抑制することが示されている（非特許文献２０及び２１）。ＲＧＣ−３２タンパク質の過剰発現が、結腸腫瘍、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、乳線腫瘍、肺腫瘍、他の消化管腫瘍及び皮膚性のＴ細胞リンパ腫において見出されている（非特許文献２２及び２３）。

近年、癌の検出、予後の予測又は治療の評価のための、多くの分子バイオマーカーが、開発されてきている（非特許文献２４及び２５）。過去の報告における知見によれば、ＣＥＡ、ＳＣＣ及びＣＹＦＲＡ等の通常の腫瘍マーカーに加えて、ＮＳＣＬＣの予後のバイオマーカーとして、１４−３−３ζ（非特許文献２６）、クラステリン（非特許文献２７）、及びＫＩＦ４Ａ（非特許文献２８）が、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析に基づき同定されている。Ｗａｎｇらは、Ｌ５２３Ｓタンパク質が、肺癌の治療標的であることを報告している（非特許文献２９）。

しかしながらα−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞療法の有効性を容易に予測する方法は未だ開発されていない。

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本発明の目的はＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の有効性を予測する方法を提供することである。

本発明者らはα−ＧａｌＣｅｒパルス樹状細胞注入を行っている肺癌患者の末梢血ＮＫ細胞及びＴ細胞について、ｃＤＮＡマイクロアレイベースの遺伝子発現解析を行った。その結果、この免疫療法に対する応答性に、発現量が相関する遺伝子としてＬＴＢ４ＤＨ、ＤＰＹＳＬ３及びＣ１３ｏｒｆ１５を同定し、これらの遺伝子の発現量がα−ＧａｌＣｅｒパルスＤＣ療法の有効性についての良好な指標となり得ることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は以下に関する。
［１］ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の有効性を予測するための方法であって、
（１）対象患者へのＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の適用による、
（ａ）対象患者から単離されたＴ細胞におけるＬＴＢ４ＤＨの発現レベル、
（ｂ）対象患者から単離されたＮＫ細胞におけるＤＰＹＳＬ３の発現レベル、及び
（ｃ）対象患者から単離されたＮＫ細胞におけるＣ１３ｏｒｆ１５の発現レベル
からなる群から選択される少なくとも１つの発現レベルの変化を測定すること；並びに
（２）（１）において測定した発現レベルの変化と、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療の有効性とを相関付けること
を含む、方法。
［２］ＮＫＴ細胞リガンドがα−ガラクトシルセラミドである、［１］記載の方法。
［３］ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の有効性を予測するためのキットであって、
（ａ）ＬＴＢ４ＤＨをコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー或いはＬＴＢ４ＤＨを特異的に認識し得る抗体、及びＴ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体、
（ｂ）ＤＰＹＳＬ３をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー或いはＤＰＹＳＬ３を特異的に認識し得る抗体、及びＮＫ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体、並びに
（ｃ）Ｃ１３ｏｒｆ１５をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー或いはＣ１３ｏｒｆ１５を特異的に認識し得る抗体、及びＮＫ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体
からなる群から選択される少なくとも１つを含む、キット。
［４］以下の（Ａ）〜（Ｃ）を含むキット：
（Ａ）ＮＫＴ細胞リガンド、
（Ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ、及び
（Ｃ）（ａ）ＬＴＢ４ＤＨをコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー或いはＬＴＢ４ＤＨを特異的に認識し得る抗体、及びＴ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体、
（ｂ）ＤＰＹＳＬ３をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー或いはＤＰＹＳＬ３を特異的に認識し得る抗体、及びＮＫ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体、並びに
（ｃ）Ｃ１３ｏｒｆ１５をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー或いはＣ１３ｏｒｆ１５を特異的に認識し得る抗体、及びＮＫ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体
からなる群から選択される少なくとも１つ。

本発明によれば、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の有効性を容易に予測することが可能となる。本発明の方法を用いれば、治療の有効性を確認しながら、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法を実施することが可能となる。その結果、例えば、当該療法が有効な患者に対しては、その療法を続行し、有効性が認められない患者に対しては治療方針を変更する等、治療方針の選択判断が可能となる。

遺伝子発現解析の研究デザイン α−ＧａｌＣｅｒパルスＤＣ治療前及び該治療後の凍結保存したＰＢＭＣ試料を解凍した。ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞及びＣＤ５６⁻ＣＤ３^＋Ｔ細胞を磁性ビーズ及びＡｕｔｏ−ＭＡＣＳソーターを用いて精製した。ＮＫ細胞及びＴ細胞からメッセンジャーＲＮＡを抽出し、良好応答群からの３人の患者及び低応答群からの３人の患者を含む６人の患者についてマイクロアレイ解析を実施した。マイクロアレイデータから同定した候補遺伝子について、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により検証した。Ｔ細胞及びＮＫ細胞における、治療前と治療後との間での示差的遺伝子発現解析遺伝子発現レベルを標準化し、ｌｏｇ２変換をし、平均値を算出することにより、相対的な値を得た。各カラムは、３人の異なる患者（良好応答者群；#00, #10, #04、低応答者群；#01, #16, #24）から集められた試料を表す。いくつかの遺伝子は、多重のアフィメトリクスプローブセットを有する。上昇制御された遺伝子を赤字で、下方制御された遺伝子を青字で示す。色付きのバー（底辺）は遺伝子発現の差異の強度に関する。（Ａ）良好応答者群のＮＫ細胞及び（Ｃ）良好応答者群のＴ細胞で上方制御された遺伝子。（Ｂ）低応答者群のＮＫ細胞及び（Ｄ）低応答者群のＴ細胞において上方制御された遺伝子。３つの試料のうち２つにおいて他の群と比較して２倍を超えて変化しなかった遺伝子を除去することにより、四角で囲んだ遺伝子を抽出した。尚、本図面は本来カラー図面である。ＬＴＢ４ＤＨ、ＤＰＹＳＬ３及びＣ１３ｏｒｆ１５の発現レベルの変化治療前及び治療後の試料におけるＧＡＰＤＨ発現に相当する転写をｑＲＴ−ＰＣＲにより定量した。検証例（明るいグレイ）についてｑＲＴ−ＰＣＲを行った（ｎ＝８；５つの試料は良好応答者群の患者由来であり、３つの試料は、低応答者群の患者由来である）。検証例に加えて、マイクロアレイアッセイでＰＢＭＣ試料を調べた６つの症例についてもｑＲＴ−ＰＣＲにより解析した（ｎ＝１４）。*, p<0.05; ウィルコクソン検定。（Ａ）ＣＤ５６⁻ＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＬＴＢ４ＤＨが良好応答者群において上昇したが（p=0.0431；検証例、p=0.0251；全例）、低応答者群では上昇していなかった。（Ｂ）ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞、ＤＰＹＳＬ３が良好応答者において上昇制御されたが（p=0.0431；検証例、p=0.0117；全例）、低応答者群では上昇制御されていなかった。（Ｃ）ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞、Ｃ１３ｏｒｆ１５の発現レベルが、全ての低応答者群の試験した症例において上昇していた（p=0.0431）が、良好応答者群においては上昇していなかった。

１．ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の有効性を予測する方法
本発明は、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の有効性を予測する方法であって、
（１）対象患者へのＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の適用による、
（ａ）対象患者から単離されたＴ細胞におけるＬＴＢ４ＤＨの発現レベル、
（ｂ）対象患者から単離されたＮＫ細胞におけるＤＰＹＳＬ３の発現レベル、及び
（ｃ）対象患者から単離されたＮＫ細胞におけるＣ１３ｏｒｆ１５の発現レベル
からなる群から選択される少なくとも１つの発現レベルの変化を測定すること；並びに
（２）（１）において測定した発現レベルの変化と、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療の有効性とを相関付けること
を含む、方法を提供するものである。

ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＮＫ受容体の２つの抗原レセプターを発現しているリンパ球の一つである。ＮＫＴ細胞は、当該細胞上のＴ細胞受容体がＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）分子上に提示された下記の「ＮＫＴ細胞リガンド」を認識する。このような性質を有するＮＫＴ細胞を、特にＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）拘束性ＮＫＴ細胞という。通常のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体のレパートリーは非常に限られている。例えばマウスＮＫＴ細胞（Ｖα１４ＮＫＴ細胞という場合がある）上のＴ細胞受容体のα鎖は、非多型性のＶα１４及びＪα２８１遺伝子セグメントによりコードされており（Proc Natl Acad Sci USA, 83, p.8708-8712, 1986; Proc Natl Acad Sci USA, 88, p.7518-7522, 1991; J Exp Med, 180, p.1097-1106, 1994）、β鎖の９０％以上はＶβ８であり、他にＶβ７やＶβ２という限られたレパートリーが含まれ得る。また、ヒトＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体は、マウスのＶα１４と相同性の高い非多型性のＶα２４、及びＶβ８．２に近縁のＶβ１１の組み合わせであることが知られている。

本明細書中、「ＮＫＴ細胞リガンド」とは、ＣＤ１分子上に提示されたときに、ＮＫＴ細胞上のＴ細胞受容体により特異的に認識され、ＮＫＴ細胞を特異的に活性化させ得る化合物をいう。本発明において使用される「ＮＫＴ細胞リガンド」としては、例えば、α−グリコシルセラミド、イソグロボトリヘキソシルセラミド（Science, 306, p.1786-1789, 2004）、ＯＣＨ（Nature 413:531, 2001）等を挙げることができる。α−グリコシルセラミドは、ガラクトース、グルコースなどの糖類とセラミドとがα配位にて結合したスフィンゴ糖脂質であり、ＷＯ９３／０５０５５、ＷＯ９４／０２１６８、ＷＯ９４／０９０２０、ＷＯ９４／２４１４２、およびＷＯ９８／４４９２８、Science, 278, p.1626-1629, 1997 等に開示されているものを挙げることができる。中でも、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−ヘキサコサノイルアミノ−１，３，４−オクタデカントリオール（本明細書中、α−ガラクトシルセラミド又はα−ＧａｌＣｅｒと称する）が好ましい。

本明細書中、「ＮＫＴ細胞リガンド」は、その塩をも含む意味として用いられる。ＮＫＴ細胞リガンドの塩としては生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。

また、本明細書中、「ＮＫＴ細胞リガンド」は、その溶媒和物（水和物等）をも含む意味として用いられる。

抗原提示細胞とは、抗原をリンパ球に提示してリンパ球の活性化を促す細胞をいう。通常、抗原提示細胞は、Ｔ細胞やＮＫＴ細胞に抗原を提示し得る樹状細胞又はマクロファージである。特に、樹状細胞は、強力な抗原提示能力を有しており、細胞表面上に発現されたＭＨＣＣｌａｓｓＩ、ＭＨＣＣｌａｓｓＩ様分子（ＣＤ１等）、ＭＨＣＣｌａｓｓＩＩ等を介して抗原を提示し、Ｔ細胞又はＮＫＴ細胞を活性化させ得るので、好ましい。抗原提示細胞は、ＮＫＴ細胞リガンドをＮＫＴ細胞に確実に提示し得るように、ＣＤ１（例えばＣＤ１ｄ）発現細胞であることが好ましい。

本明細書中、抗原提示細胞は、任意の哺乳動物由来のものを意味する。哺乳動物としては、ヒト及びヒトを除く哺乳動物を挙げることが出来る。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。抗原提示細胞は、好ましくは、ヒト抗原提示細胞である。

抗原提示細胞は自体公知の方法によって、上述の哺乳動物の組織（例えばリンパ節、脾臓、末梢血等）から単離することが可能である。例えば抗原提示細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、セルソーター、パニング、抗体磁気ビーズ法等により樹状細胞を単離することができる。抗原提示細胞として樹状細胞を単離する場合には、樹状細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカーとして、例えば、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣＣｌａｓｓＩ、ＭＨＣＣｌａｓｓＩ様分子（ＣＤ１等）、ＭＨＣＣｌａｓｓＩＩ、ＣＤ８α、ＣＤ８５ｋ、ＣＤ８６、ＦＤＬ−Ｍ１、ＤＥＣ−２０５等を挙げることが出来る。

また、抗原提示細胞は、上述の哺乳動物の骨髄細胞や単核球等を適切な抗原提示細胞分化条件で培養することにより製造することもできる。例えば、骨髄細胞はＧＭ−ＣＳＦ（場合によっては更にＩＬ−４）の存在下で約６日間程度培養されることにより、樹状細胞（骨髄由来樹状細胞：ＢＭＤＣ）へと分化する（Nature, 408, p.740-745, 2000）。また、末梢血液中の単核球（特に単球、マクロファージ等）をＧＭ−ＣＳＦ（場合によっては更にＩＬ−２及び／又はＩＬ−４）の存在下で培養することにより、樹状細胞を得ることが出来る（文献名：Motohasi S, Kobayashi S, Ito T, Magara KK, Mikuni O, Kamada N, Iizasa T, Nakayama T, Fujisawa T, Taniguchi M., Preserved IFN-alpha production of circulating Valpha24 NKT cells in primary lung cancer patients., Int J Cancer, 2002, Nov.10; 102(2):159-165. Erratum in :Int J Cancer. 2003, May 10; 104(6):799）。

「抗原提示細胞へのＮＫＴ細胞リガンドのパルス」とは、ＮＫＴ細胞リガンドを抗原提示細胞表面に、該リガンドがＮＫＴ細胞へ提示され得るように、配置することをいう。より具体的には、ＮＫＴ細胞リガンドを、抗原提示細胞表面に発現されたＣＤ１分子上に提示させることを意味する。抗原提示細胞へのＮＫＴ細胞リガンドのパルスは、ＮＫＴ細胞リガンドを抗原提示細胞へ接触させることにより達成することが出来る。例えばＮＫＴ細胞リガンドを含有する生理的な培養液中で抗原提示細胞が培養される。この場合、培養液中のＮＫＴ細胞リガンドの濃度は、ＮＫＴ細胞リガンドの種類により適宜設定することが可能であるが、例えば、１〜１００００ｎｇ／ｍｌ好ましくは１０〜１０００ｎｇ／ｍｌである。また、培養液としては、例えば、適切な添加物（血清、アルブミン、緩衝剤、アミノ酸等）を含んでいてもよい基礎培地（最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地）などを挙げることが出来る。培養液のｐＨは通常約６〜８であり、培養温度は通常約３０〜４０℃であり、培養時間は通常４〜１４日間、好ましくは６〜１４日間である。更に、培養後に抗原提示細胞を、ＮＫＴ細胞リガンドを含まない培養液や生理的な水溶液で洗浄し、フリーのＮＫＴ細胞リガンドを除去することにより、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスされた抗原提示細胞が単離される。

ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による治療の対象となる腫瘍の種類としては、ＮＫＴ細胞リガンドが治療的に有効な腫瘍であれば特に限定されない。腫瘍としては、例えば、肺癌（小および／または非小細胞）、脳腫瘍、胃癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、精巣癌、皮膚癌、骨肉腫、結腸直腸癌、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性非リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ＡＣＴＨ生成腫瘍、副腎皮質癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、子宮内膜癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、メラノーマ、中皮腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、卵巣（胚細胞）癌、陰茎癌、前立腺癌、網膜芽腫、軟組織肉腫、扁平上皮細胞癌、甲状腺癌、栄養膜新生物、膣癌、外陰癌、ウィルムス腫瘍等を挙げることが出来る。腫瘍は、好ましくは肺癌であり、より好ましくは非小細胞肺癌である。

ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の対象患者は、通常、ヒト及び非ヒト哺乳動物であり、好ましくはヒトである。

ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の有効性とは、ＩＦＮγ産生を誘導し、生存期間を延長するという、該抗腫瘍療法の効果の程度又は有無をいう。

本発明の方法においては、対象患者へのＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の適用による、
（ａ）対象患者から単離されたＴ細胞におけるＬＴＢ４ＤＨの発現レベル、
（ｂ）対象患者から単離されたＮＫ細胞におけるＤＰＹＳＬ３の発現レベル、及び
（ｃ）対象患者から単離されたＮＫ細胞におけるＣ１３ｏｒｆ１５の発現レベル
からなる群から選択される少なくとも１つの発現レベルの変化を測定する。

ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の適用による各遺伝子の発現レベルの変化は、当該抗腫瘍療法を適用する前における遺伝子発現レベルと、当該抗腫瘍療法を適用した後における遺伝子発現レベルとを比較することにより測定することが出来る。発現レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。

ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法においては、少なくとも１回、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞を患者へ投与（注入）する。通常は、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞を、複数回（例えば３〜１０回）、５日〜５０日（好ましくは７日〜２８日）間隔で、患者へ注入する。ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の詳細については、例えば、Motohashi S et al., J Immunol 2009;182:2492-501を参照のこと。ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法を適用する前とは、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞の第１回目の投与より前を意味する。ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法を適用した後とは、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞を少なくとも１回投与した後を意味する。「ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法を適用した後」の時点は、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞を最後に投与してから、遅くとも３ヶ月以内、好ましくは２ヶ月以内、より好ましくは１ヶ月以内（例えば、最終投与から３〜４週間後）である。

ＬＴＢ４ＤＨ（ロイコトリエンＢ４１２−ヒドロキシデヒドロゲナーゼ）は、亜鉛非依存的な中鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＭＤＲ）ファミリーの一員であり、生物学的活性の高い３つの全てのエイコサノイドを除去するためのその非可逆的分解における鍵となる公知の酵素である（Hori T et al., J Biol Chem 2004;279:22615-23）。本発明において使用されるＬＴＢ４ＤＨは、通常ヒト及び非ヒト哺乳動物のＬＴＢ４ＤＨであり、好ましくはヒトＬＴＢ４ＤＨである。ヒトＬＴＢ４ＤＨのアミノ酸配列（配列番号２）及びｃＤＮＡ配列（配列番号１）も公知である（ｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号：NM_012212、バージョン：NM_012212.3）。

ＤＰＹＳＬ３（ジヒドロピリミジネース・ライク３）は、ＴＵＣ（TOAD-64/Ulip/CRMP）ファミリーの一員であり、コラプシン・レスポンス・メディエーター・プロテイン−４（ＣＲＭＰ−４）又はＴＵＣ−４としても知られており、神経の可塑性及び神経突起伸展や伸長に寄与する公知の遺伝子である（Kowara R et al., Neurosci Lett 2008;430:197-202）。本発明において使用されるＤＰＹＳＬ３は、通常ヒト及び非ヒト哺乳動物のＤＰＹＳＬ３であり、好ましくはヒトＤＰＹＳＬ３である。ヒトＤＰＹＳＬ３のアミノ酸配列（配列番号４）及びｃＤＮＡ配列（配列番号３）も公知である（ｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号：NM_001387、バージョン：NM_001387.2）。

Ｃ１３ｏｒｆ１５（クロモソーム１３オープン・リーディング・フレーム１５）は、ＤＮＡ損傷に応答してｐ５３により誘導され、あるいは溶解性を下回るレベルの補体系タンパク質により誘導される公知の遺伝子であり、細胞周期進行を制御すると考えられている。レスポンス・ジーン・トゥ・コンプレメント３２（ＲＧＣ３２）は、Ｃ１３ｏｒｆ１５の別名であり、そのアライメントから、この遺伝子の機能として、サイクリン依存的キナーゼ２（ＣＤＣ２）のレギュレーターの基質ということが示唆されている。Ｃ１３ｏｒｆ１５を過剰発現させると、細胞周期進行を活性化するか抑制することが示されている（Badea T et al., J Biol Chem 2002;277:502-8、Saigusa K et al., Oncogene 2007;26:1110-21）。本発明において使用されるＣ１３ｏｒｆ１５は、通常ヒト及び非ヒト哺乳動物のＣ１３ｏｒｆ１５であり、好ましくはヒトＣ１３ｏｒｆ１５である。ヒトＣ１３ｏｒｆ１５のアミノ酸配列（配列番号６）及びｃＤＮＡ配列（配列番号５）も公知である（ｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号：NM_014059、バージョン：NM_014059.2）。

「細胞の単離」とは、目的とする細胞以外の細胞を除去する操作がなされていることを意味する。「単離された細胞」における目的とする細胞の純度は通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは実質的に１００％である。Ｔ細胞は、例えば、末梢血から、Ｔ細胞マーカー（即ち、Ｔ細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカー）を特異的に認識する抗体を用いて、セルソーター、パニング、抗体磁気ビーズ法等により単離することができる。Ｔ細胞マーカーは当該技術分野において周知であり、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２、ＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｔｈｙ−１等を挙げることが出来る。同様に、ＮＫ細胞は、例えば、末梢血から、ＮＫ細胞マーカー（即ち、ＮＫ細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカー）を特異的に認識する抗体を用いて、セルソーター、パニング、抗体磁気ビーズ法等により単離することが出来る。ＮＫ細胞マーカーは、当該技術分野において周知であり、例えば、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＣＤ５７、ＣＤ９４、ＣＤ１５８ａ等を挙げることが出来る。ヒトＴ細胞は、通常、ＣＤ３^＋ＣＤ５６⁻である。ヒトＮＫ細胞は、通常、ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋である。なお、ヒトにおいてはＣＤ３^＋ＣＤ５６^＋細胞（即ちＮＫＴ細胞）のポピュレーションが非常に小さいので、ＣＤ５６^＋細胞をＮＫ細胞と近似して用いてもよい。

各遺伝子の発現レベルは、各遺伝子の翻訳産物（即ち、タンパク質）を特異的に認識する抗体を用いて、免疫学的手法により、該翻訳産物量を定量することにより測定することができる。免疫学的手法としては、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色等を挙げることができる。

抗体による抗原Ｘの「特異的な認識」とは、抗原抗体反応における、抗体の抗原Ｘに対するアフィニティが、抗原Ｘ以外の抗原に対するアフィニティよりも強いことを意味する。

各遺伝子の翻訳産物を特異的に認識する抗体は、該翻訳産物やその抗原性を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はこれらの結合性断片である。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF(ab')₂、Fab'、Fab、Fv、sFv、dsFv、sdAb等が挙げられる（Exp. Opin. Ther. Patents， Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）。抗体のクラスは、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgDあるいはIgE等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、IgG又はIgMであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはIgGである。

各遺伝子の発現レベルは、また、各遺伝子の転写産物（即ち、各遺伝子をコードするｍＲＮＡ）やｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマーを用いて、自体公知の方法により測定することが出来る。該測定方法としては、例えば、ｃＤＮＡアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション等を挙げることができる。

ＬＴＢ４ＤＨをコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブとしては、配列番号１で表されるヌクレオチド配列に含まれる、約15塩基以上、好ましくは約18〜約500塩基、より好ましくは約18〜約200塩基、いっそう好ましくは約18〜約50塩基の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。

ＬＴＢ４ＤＨをコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プライマーは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部又は全部の領域を特異的に増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。例えば、上記ヌクレオチド配列の相補配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約18〜約30塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、このハイブリダイゼーション部位より3’側の上記ヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約18〜約30塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの組み合わせであり、それらによって増幅される核酸の断片長が約50〜約1,000塩基、好ましくは約50〜約500塩基、より好ましくは約50〜約200塩基である、一対のポリヌクレオチドが挙げられる。

ＤＰＹＳＬ３をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブとしては、配列番号３で表されるヌクレオチド配列に含まれる、約15塩基以上、好ましくは約18〜約500塩基、より好ましくは約18〜約200塩基、いっそう好ましくは約18〜約50塩基の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。

ＤＰＹＳＬ３をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プライマーは、配列番号３で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部又は全部の領域を特異的に増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。例えば、上記ヌクレオチド配列の相補配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約18〜約30塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、このハイブリダイゼーション部位より3’側の上記ヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約18〜約30塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの組み合わせであり、それらによって増幅される核酸の断片長が約50〜約1,000塩基、好ましくは約50〜約500塩基、より好ましくは約50〜約200塩基である、一対のポリヌクレオチドが挙げられる。

Ｃ１３ｏｒｆ１５をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブとしては、配列番号５で表されるヌクレオチド配列に含まれる、約15塩基以上、好ましくは約18〜約500塩基、より好ましくは約18〜約200塩基、いっそう好ましくは約18〜約50塩基の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。

Ｃ１３ｏｒｆ１５をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プライマーは、配列番号５で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部又は全部の領域を特異的に増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。例えば、上記ヌクレオチド配列の相補配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約18〜約30塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、このハイブリダイゼーション部位より3’側の上記ヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約18〜約30塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの組み合わせであり、それらによって増幅される核酸の断片長が約50〜約1,000塩基、好ましくは約50〜約500塩基、より好ましくは約50〜約200塩基である、一対のポリヌクレオチドが挙げられる。

核酸プローブ及び核酸プライマーは、特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列（検出対象のポリヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド配列）を含んでいてもよい。

また、核酸プローブ及び核酸プライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³Ｈ、¹⁴Ｃ等）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。あるいは、蛍光物質（例：FAM、VIC等）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。

核酸プローブ及び核酸プライマーは、DNAであってもRNAであってもよく、また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は二本鎖DNA、二本鎖RNA、DNA／RNAハイブリッドのいずれであってもよい。従って、本明細書においてあるヌクレオチド配列を有する核酸について記載する場合、特に断らない限り、該ヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、該ヌクレオチド配列と相補的な配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、それらのハイブリッドである二本鎖ポリヌクレオチドをすべて包含する意味で用いられていると理解されるべきである。

上記核酸プローブ及び核酸プライマーは、例えば、本明細書に記載されたヌクレオチド配列の情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。

次に、工程（１）において測定した発現レベルの変化と、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療の有効性とが相関付けられる。

（ａ）Ｔ細胞におけるＬＴＢ４ＤＨの発現レベルを測定する場合
後述の実施例に示すように、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療に対する応答が良好な患者においては、Ｔ細胞におけるＬＴＢ４ＤＨの発現レベルが治療後において有意に上昇しているが、低応答者では発現レベルの上昇が認められない。即ち、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療の適用によるＴ細胞におけるＬＴＢ４ＤＨ発現レベルの上昇と、当該抗腫瘍治療の有効性との間の正の相関に基づき、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療の有効性が予測される。

例えば、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療により、Ｔ細胞におけるＬＴＢ４ＤＨの発現レベルが上昇した場合には、対象患者はＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療に対して応答が良好であり、当該治療が有効である可能性が高いと判定することが出来る。逆に、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療を施しても、Ｔ細胞におけるＬＴＢ４ＤＨの発現レベルの上昇が認められない場合には、対象患者はＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療に対する応答が弱く、当該治療が無効である可能性が高いと判定することが出来る。

（ｂ）ＮＫ細胞におけるＤＰＹＳＬ３の発現レベルを測定する場合
後述の実施例に示すように、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療に対する応答が良好な患者においては、ＮＫ細胞におけるＤＰＹＳＬ３の発現レベルが治療後において有意に上昇しているが、低応答者では発現レベルの上昇が認められない。即ち、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療の適用によるＮＫ細胞におけるＤＰＹＳＬ３発現レベルの上昇と、当該抗腫瘍治療の有効性との間の正の相関に基づき、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療の有効性が予測される。

例えば、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療により、ＮＫ細胞におけるＤＰＹＳＬ３の発現レベルが上昇した場合には、対象患者はＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療に対して応答が良好であり、当該治療が有効である可能性が高いと判定することが出来る。逆に、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療を施しても、ＮＫ細胞におけるＤＰＹＳＬ３の発現レベルの上昇が認められない場合には、対象患者はＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療に対する応答が弱く、当該治療が無効である可能性が高いと判定することが出来る。

（ｃ）ＮＫ細胞におけるＣ１３ｏｒｆ１５の発現レベルを測定する場合
後述の実施例に示すように、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療に対する応答が低い患者においては、ＮＫ細胞におけるＣ１３ｏｒｆ１５の発現レベルが治療後において有意に上昇しているが、良好応答者では発現レベルの上昇が認められない。即ち、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療の適用によるＮＫ細胞におけるＣ１３ｏｒｆ１５発現レベルの上昇と、当該抗腫瘍治療の有効性との間の負の相関に基づき、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療の有効性が予測される。

例えば、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療により、ＮＫ細胞におけるＣ１３ｏｒｆ１５の発現レベルが上昇した場合には、対象患者はＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療に対する応答が弱く、当該治療が無効である可能性が高いと判定することが出来る。逆に、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療を施しても、ＮＫ細胞におけるＣ１３ｏｒｆ１５の発現レベルの上昇が認められない場合には、対象患者はＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療に対して応答が良好であり、当該治療が有効である可能性が高いと判定することが出来る。

尚、本発明の方法においては、（ａ）Ｔ細胞におけるＬＴＢ４ＤＨの発現レベル、（ｂ）ＮＫ細胞におけるＤＰＹＳＬ３の発現レベル、及び（ｃ）ＮＫ細胞におけるＣ１３ｏｒｆ１５の発現レベルからなる群から選択される少なくとも１つの発現レベルの変化を測定すれば足りるが、これらのうちの２つ（（ａ）及び（ｂ）、（ａ）及び（ｃ）、又は（ｂ）及び（ｃ））、又は３つ全ての発現レベルの変化を測定し、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療の有効性と相関付けることにより、より精度の高い予測が可能となる。

例えば、３つ全ての遺伝子の発現レベルの変化を測定する場合、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療により、Ｔ細胞におけるＬＴＢ４ＤＨの発現レベルが上昇し、ＮＫ細胞におけるＤＰＹＳＬ３の発現レベルが上昇し、且つＮＫ細胞におけるＣ１３ｏｒｆ１５の発現レベルの上昇が認められない場合には、対象患者はＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療に対して応答が良好であり、当該治療が有効である可能性が高いと判定することが出来る。逆に、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療を施しても、Ｔ細胞におけるＬＴＢ４ＤＨの発現レベルの上昇が認められず、ＮＫ細胞におけるＤＰＹＳＬ３の発現レベルの上昇が認められず、且つＮＫ細胞におけるＣ１３ｏｒｆ１５の発現レベルが上昇した場合には、対象患者はＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍治療に対する応答が弱く、当該治療が無効である可能性が高いと判定することが出来る。

２．キット
本発明は、
（ａ）ＬＴＢ４ＤＨをコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー或いはＬＴＢ４ＤＨを特異的に認識し得る抗体、及びＴ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体、
（ｂ）ＤＰＹＳＬ３をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー或いはＤＰＹＳＬ３を特異的に認識し得る抗体、及びＮＫ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体、並びに
（ｃ）Ｃ１３ｏｒｆ１５をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー或いはＣ１３ｏｒｆ１５を特異的に認識し得る抗体、及びＮＫ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体
からなる群から選択される少なくとも１つを含む、キット（即ち、組み合わせ物）を提供するものである。本発明のキットは、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の有効性を予測するためのものであり得る。本発明のキットを用いれば、上記本発明の方法により、容易にＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の有効性を予測することが可能となる。

本発明のキットは、（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される２つ（（ａ）及び（ｂ）、（ａ）及び（ｃ）、又は（ｂ）及び（ｃ））を含んでいてもよく、３つ全てを含んでいてもよい。

（ａ）には、Ｔ細胞へのＮＫ細胞の混入を除去するために、ＮＫ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体が更に含まれていてもよい。（ｂ）には、ＮＫ細胞へのＴ細胞の混入を除去するために、Ｔ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体が更に含まれていてもよい。（ｃ）には、ＮＫ細胞へのＴ細胞の混入を除去するために、Ｔ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体が更に含まれていてもよい。

本発明のキットに含まれる各構成要素は、各々別個に（あるいは可能であれば混合した状態で）水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファー、PBSなど）中に適当な濃度となるように溶解されるか、あるいは凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容される。

本発明のキットは、ＬＴＢ４ＤＨ、ＤＰＹＳＬ３又はＣ１３ｏｒｆ１５の発現レベルの測定方法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。
例えば、本発明のキットが、各遺伝子の翻訳産物を特異的に認識する抗体を含むものであれば、免疫学的手法により各遺伝子の発現レベルを測定することにより、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の有効性を予測することができる。この場合、本発明のキットは、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液、ELISAプレート、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。

本発明のキットが、各遺伝子をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマーを含むものであれば、RT-PCR、ノザンブロッティング、in situ ハイブリダイゼーション、cDNAアレイ等により各遺伝子の発現レベルを測定することにより、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の有効性を予測することができる。RT-PCRを測定に用いる場合には、本発明のキットは、10×PCR反応緩衝液、10×MgCl₂水溶液、10×dNTPs水溶液、Taq DNAポリメラーゼ（5U/μL）、逆転写酵素等をさらに含むことができる。ノザンブロッティングやcDNAアレイを測定に用いる場合には、本発明のキットは、ブロッティング緩衝液、標識化試薬、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。in situ ハイブリダイゼーションを測定に用いる場合には、本発明のキットは、標識化試薬、発色基質等をさらに含むことができる。

本発明のキットには、更に、ＮＫＴ細胞リガンド、及び抗原提示細胞を取得するための試薬（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ（場合によっては更にＩＬ−２及び／又はＩＬ−４））を含めることができる。当該キットは、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による腫瘍治療用キットであり得る。当該キットを使用することにより、治療の有効性を上記本発明の方法に従いモニターしながら、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による腫瘍治療を実施することが可能となる。

当該キットには、更に、樹状細胞マーカーを特異的に認識する抗体、抗原提示細胞を培養するための培養液等を更に加えることが出来る。

本発明のキットに係る各用語の定義は、「１．ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法の有効性を予測する方法」の項で述べた通りである。

本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。

［実施例１］
（材料及び方法）
臨床プロトコール及び患者試料
以前記載したように（Motohashi S et al., J Immunol 2009;182:2492-501）、全部で１７人の非小細胞肺癌患者が、４回のα−ＧａｌＣｅｒパルスＤＣの静脈内投与を受けた。即ち、末梢単核球をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−２の存在下で培養することにより製造した樹状細胞へα−ＧａｌＣｅｒをパルスし、これを患者へ４回静脈内投与した（１×１０^９／ｍ^２）。投与は、患者からアフェレシスによりＰＢＭＣを採取した時点を０週として、１週、２週、７週及び８週に行った。免疫モニタリングのために、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を週に１回、３ヶ月の観察期間に亘り採取した。治療前（pre-treatment）及び第１回のＤＣ注入から３ヵ月後（post-treatment）の２回の時点の試料を、マイクロアレイ解析に使用した。α−ＧａｌＣｅｒパルスＤＣ治療後のインターフェロン産生能が、全生存期間と有意に相関するので、良好応答者群は、ＩＦＮ−γ産生能力が２倍以上上昇した患者として定義し、１７人中１０人の患者がこれに該当した。逆に、ＩＦＮ−γ産生能力の上昇が２倍を下回った患者を低応答者群に分類し、７人の患者がこれに該当した。
このプロトコールは、千葉大学の治験倫理委員会（Ｎｏ．１８１）により承認されたものであり、全ての患者及びその家族からインフォームドコンセントを取得している。

ＭＡＣＳ分離及びフローサイトメトリー解析
試験の手順を図１に簡潔に示す。保管した試料を解凍し、ＰＢＳにより３回洗浄し、１０％ＦＢＳ、０．０１ｍＭ２−ＭＥ及び５０Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＥ−１６４０中で３７℃にて６時間プレインキュベートした。次に、ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞及びＣＤ５６⁻ＣＤ３^＋Ｔ細胞を得るために、製造者のプロトコールに従って、ａｕｔｏＭＡＣＳ（Miltenyi Biotec Inc. CA, USA）を使用した。ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を、ＣＤ５６マイクロビーズ（20 μl/10⁷個； Miltenyi Biotec Inc. CA, USA）を用いてＰＯＳＳＥＬ＿ｓプロトコールによりトラップした。ＣＤ５６⁻細胞画分から、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ＣＤ３ｍＡｂ（BD-pharmingen; clone-UHCT1）及びＦＩＣＴマイクロビーズ（20 μl/10⁷個； Miltenyi Biotec Inc. CA, USA）を用いてＰＯＳＳＥＬ＿ｓプロトコールにより、ＣＤ５６⁻ＣＤ３^＋Ｔ細胞を獲得した。これらの細胞を分離した後、FACScaliber (BD biosciences)及びFlowjoソフトウェア (Tree Star, Inc)により純度を測定した。使用したモノクローナル抗体は、フィコエリスリン（ＰＥ）結合抗ＣＤ５６ｍＡｂ（BD-pharmingen; clone-B159）であり、アイソタイプコントロールとして、ＦＩＴＣ−及びＰＥ−結合マウスＩｇＧ１Ａｂ（BD-pharmingen）を使用した。

ｃＤＮＡマイクロアレイ
分離した細胞から、TRIzol試薬（Invitrogen Japan, Tokyo, Japan）を用いて、全ＲＮＡを単離した。オリゴ（ｄＴ）プライマー及びSuperscript II RT（Invitrogen）を用いてｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡマイクロアレイを、理研免疫・アレルギー科学総合研究センター（横浜、日本）において行った。ＲＮＡインテグリティーナンバーが７．０を上回る試料をマイクロアレイ解析によるｍＲＮＡプロファイリングに使用した。ｃＤＮＡ合成、ｃＲＮＡ増幅、ビオチン化及び断片化は、One-Cycle Target Labelling Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)により行った。２０μｇの標識化標的ＲＮＡをヒトゲノムU133 Plus 2.0 (HG-U133_Plus2) GeneChip発現アレイ（Affymetrix）と４５℃にて１６時間、製造者の指示書に従いハイブリダイズした。洗浄及びストレプトアビジン−フィコエリスリン染色をGeneChip Fluidics Station (Affymetrix)を用いて行った。次に、チップをGeneChip Scanner 3000 (Affymetrix)を用いてスキャンした。アレイデータを、ＭＡＳ５（非特許文献１６）又はｇｃＲＭＡ（非特許文献１７）のいずれかのアルゴリズムを用いて標準化した。

定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
定量的ＲＴ−ＰＣＲをABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて行った。Universal ProbeLibrary (Roche Diagnostics K.K., Tokyo, Japan) （Kruhoffer M et al., Br J Cancer 2005;92:2240-8）による定量をTaqMan Universal PCR Master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)及びABI Prism 7000 sequence Detection Systemにより行った。本試験において使用したプライマー及びプローブを表１に列挙している。

*ユニバーサル・プローブライブラリー（Roche applied Science）からの適切なプローブ（#1-#165）を使用した。ｂｐ：ベース・ペア。

ＧＡＰＤＨのプライマーを作成し、データ標準化の目的で、この遺伝子を全てのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析に含めた。各試料のコピー数を閾値サイクル（Ｃｔ）及び標準曲線から推量した。

統計学的解析
試料中の各遺伝子及びＧＡＰＤＨｍＲＮＡの発現は、プラスミド標準曲線を用いて算出した。濃度は、ｍＲＮＡコピー数で表現し、平均値±ＳＤとして記載した。相対的な遺伝子発現量を標的遺伝子（コピー）／ＧＡＰＤＨ（コピー）の比として表現し、２つの異なる時点（治療前及び治療後）におけるｍＲＮＡ発現の差異を、ウィルコクソン検定を用いて解析した。０．０５を下回るＰ値を統計学的に有意であると解釈した。

（結果）
患者の特徴
全部で１４人の患者を本試験において解析した。８人の患者（#00, #03, #04, #05, #08, #10, #13 and #25）が良好応答者であり、６人の患者（#01, #12, #16, #22, #23 and #24）が低応答者であった。６人の患者（#00, #01, #04, #10, #16 and #24）からのＰＢＭＣをマイクロアレイで解析した。残りの８人の患者からのＰＢＭＣについては、マイクロアレイデータの結果を検証するためにｑＲＴ−ＰＣＲにより解析した。患者の特徴を表２に示す。

マイクロアレイ、マイクロアレイ解析を行った症例(n=6)；検証、定量的ＲＴ−ＰＣＲのみで解析した症例(n=8)；良好、良好応答者群；低い、低応答者群；Ｍ、男性；Ｆ、女性；rec、完全な外科的切除後に再発；IIIB、ｃ−ステージIIIB；IV、ｃ−ステージIV；Ad、腺癌；Sq、扁平上皮癌。

ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞及びＣＤ５６⁻ＣＤ３^＋Ｔ細胞
ＰＢＭＣからＣＤ５６^＋ＮＫ細胞及びＣＤ５６⁻ＣＤ３^＋Ｔ細胞を単離した。良好応答者と低応答者との間に当該純度に差異はなかった。

α−ＧａｌＣｅｒパルスＤＣ治療前及び治療後のＮＫ細胞及びＴ細胞についてのｃＤＮＡマイクロアレイ解析
α−ＧａｌＣｅｒパルスＤＣ治療の間のＮＫ細胞及びＴ細胞における遺伝子発現の有意な変化を同定するために、治療前試料の転写レベルを治療後試料のそれと比較した。５６０００超の遺伝子のなかから、ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞について１７５７２個の遺伝子を、ＣＤ５６⁻ＣＤ３^＋Ｔ細胞については１６８７３個の遺伝子をＨｉｊｉｋａｔａらの方法により抽出した（非特許文献１９）。次に、良好応答群及び低応答群の双方において、治療前と比較して発現量が閾値を超えて（４倍超）変化した候補遺伝子を選択した（図２Ａ〜Ｄ）。驚くべきことに、治療後において発現量が低下した遺伝子は見出されなかった（表３）。

Good pre；良好応答群におけるαＧａｌＣｅｒパルスＤＣ治療前。
Good post；良好応答群におけるαＧａｌＣｅｒパルスＤＣ治療後。
Poor pre；低応答群におけるαＧａｌＣｅｒパルスＤＣ治療前。
Poor post；低応答群におけるαＧａｌＣｅｒパルスＤＣ治療後。
pre>post；治療後に遺伝子発現が低下（４分の１を下回る）。
post>pre；治療後に遺伝子発現が上昇（４倍超）。

次に、良好応答者又は低応答者に特異的な遺伝子を検出するために、良好応答者及び低応答者において同じように動いた遺伝子を選択した。このようにして１４個の遺伝子を抽出した（図２Ａ〜Ｄ）。３つの試料のうち、少なくとも２つにおいて同じパターンを示さなかった遺伝子は除外した。

選択された遺伝子のリアルタイムＰＣＲ定量
最後に、選択された１４個の遺伝子を検証するために、８個のマイクロアレイ非依存的検証ケース及び６個のマイクロアレイケースについてリアルタイムＰＣＲを実施した。全ての遺伝子の中で有意に発現が上昇した３つの遺伝子を図３に示す。他の１１個の遺伝子については、リアルタイムＰＣＲにおいて、治療前と治療後との間で有意な変化が認められなかった。ロイコトリエンＢ４１２−ヒドロキシデヒドロゲナーゼ（ＬＴＢ４ＤＨ）の遺伝子発現が、良好応答者の治療後のＴ細胞において有意に上昇しており（Ｐ＝０．０１１７）、低応答者では上昇していなかった（図３Ａ及び表４）。更に、ジヒドロピリミジネース・ライク３（ＤＰＹＳＬ３）は良好応答者の治療後ＮＫ細胞において上方制御されており（Ｐ＝０．０１１７）、これは低応答者では観察されなかった（図３Ｂ及び表４）。対照的に、クロモソーム１３オープン・リーディング・フレーム１５（Ｃ１３ｏｒｆ１５）の発現が、低応答者の治療後のＮＫ細胞において有意に上昇しており（ｐ＝０．０２７７）、良好応答者では有意な上昇は認められなかった（図３Ｃ及び表４）。

FC; 変化倍, FDR; フォールス・ディスカバリー・レート。

これらの遺伝子の予測精度を検証するために、１４人の患者からの試料について、定量的ＲＴ−ＰＣＲによるブラインドテストを行った。全ての試料をマスクし、盲検の仕様で、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ＬＴＢ４ＤＨ、ＤＰＹＳＬ３及びＣ１３ｏｒｆ１５の発現レベルを測定した。ＤＣ治療後に遺伝子発現が２倍を超えて上昇したことをポジティブとして評価した。３つの遺伝子を評価した後で、試料プロファイルを開示した。上記試験の結果及び対応する免疫学的データの比較分析を通じた、的中率（predictive value）を示す（表５）。

ＰＰＶ、ポジティブ的中率（positive predictive value）；ＮＰＶ、ネガティブ的中率（negative predictive value）。

ＬＴＢ４Ｄ、ＤＰＹＳＬ３（良好応答者において上昇制御された症例の数／全ての症例を通じて上昇制御された症例の数）及びＣ１３ｏｒｆ１５（低応答者において上昇制御された症例の数／全ての症例を通じて上昇制御された症例の数）を含む各遺伝子のポジティブ的中率は、それぞれ７７．８％、７５．０％及び７１．４％であった（表５）。ＬＴＢ４Ｄ及びＤＰＹＳＬ３の発現上昇を示し、Ｃ１３ｏｒｆ１５ではこれを示さない者を良好応答者と決定した場合には、良好応答者のポジティブ的中率は８５．７％（７症例のうちの６）であった。Ｃ１３ｏｒｆ１５の発現上昇を示し、ＬＴＢ４Ｄ及びＤＰＹＳＬ３でこれを示さない者を低応答者と決定した場合には、低応答者のポジティブ的中率は１００％（３症例のうちの３）であった。

以上の結果から、ＬＴＢ４ＤＨ、ＤＰＹＳＬ３及びＣ１３ｏｒｆ１５がα−ＧａｌＣｅｒパルスＤＣ療法の有効性と相関する有用なバイオマーカーであることが示唆された。

Claims

ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍療法の有効性を予測するための方法であって、
（１）該療法の適用の前後において、
（ａ）対象患者から単離されたＴ細胞におけるＬＴＢ４ＤＨの発現レベル、
（ｂ）対象患者から単離されたＮＫ細胞におけるＤＰＹＳＬ３の発現レベル、及び
（ｃ）対象患者から単離されたＮＫ細胞におけるＣ１３ｏｒｆ１５の発現レベル
からなる群から選択される少なくとも１つの発現レベルの変化を測定すること；並びに
（２）（１）において測定した発現レベルの変化と、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍治療の有効性とを相関付けること
を含む、方法。
ＮＫＴ細胞リガンドがα−ガラクトシルセラミドである、請求項１記載の方法。
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つを含む、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍療法の有効性を予測するためのキット；
（ａ）ＬＴＢ４ＤＨをコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー或いはＬＴＢ４ＤＨを特異的に認識し得る抗体、及びＴ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体、
（ｂ）ＤＰＹＳＬ３をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー或いはＤＰＹＳＬ３を特異的に認識し得る抗体、及びＮＫ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体、並びに
（ｃ）Ｃ１３ｏｒｆ１５をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー或いはＣ１３ｏｒｆ１５を特異的に認識し得る抗体、及びＮＫ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体。
以下の（Ａ）〜（Ｃ）を含む、ＮＫＴ細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による非小細胞肺癌に対する抗腫瘍療法の有効性をモニターしながら、該療法を実施するためのキット：
（Ａ）ＮＫＴ細胞リガンド、
（Ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ、及び
（Ｃ）以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つ；
（ａ）ＬＴＢ４ＤＨをコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー或いはＬＴＢ４ＤＨを特異的に認識し得る抗体、及びＴ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体、
（ｂ）ＤＰＹＳＬ３をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー或いはＤＰＹＳＬ３を特異的に認識し得る抗体、及びＮＫ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体、並びに
（ｃ）Ｃ１３ｏｒｆ１５をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー或いはＣ１３ｏｒｆ１５を特異的に認識し得る抗体、及びＮＫ細胞マーカーを特異的に認識し得る抗体。