JP5660731B2 - 口腔の疾病を治療するためのシアノバクテリアからの糖脂質画分 - Google Patents
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Description
a)好ましくは等体積の水又は水性溶媒によるペレットの希釈;
b)(13)に記載される、好ましくは極性プロトン性有機溶媒、好ましくはフェノールと、Trireagent(登録商標)(Sigma cat.N T3934)又はTrizol(登録商標)(Invitrogen)等の類似試薬のようなカオトロピック剤(チオシアン酸グアニジン等)と、クロロホルム等の非プロトン性有機溶媒とに基づく試薬からなる適当な体積の抽出溶液(変性剤)との、シアノバクテリア水性懸濁液約1ボリューム、抽出溶液2〜4ボリューム、好ましくは約3ボリューム、クロロホルム約0.5〜1ボリュームの割合での混合;
c)室温にて少なくとも5分間、より好ましくは少なくとも10分間の混合物のインキュベーション;
d)好ましくは約2000xgでの遠心分離と、例えば電気泳動法及び銀染色法による生化学アッセイ又はLPS存在下における細胞毒性抑制アッセイによって測定できる糖脂質画分を含有する上澄み(水相)の収集
を含む。
e)塩、例えば酢酸ナトリウム(最終5〜20mM)と有機溶媒、好ましくはアセトンの約2ボリュームに等しい量での添加による沈澱、次いで、上記したものと同一の条件下での遠心分離;
f)遠心分離により得たペレットを、水で希釈したエタノール、例えば70%エタノールにより少なくとも1回、好ましくは2回洗浄すること、及び該ペレットを水溶液中、好ましくは緩衝水溶液中、例えばTRIS50mM中に再懸濁させること,
g)核酸混入物質のエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ(例えばDNAse及びRNAse)による酵素処理、次いでタンパク質混入物質のプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼKによる、好ましくは100μg/mlに等しい量にて、十分な時間(37℃で少なくとも1時間)の処理である。酵素消化の後、サンプルを再度遠心分離し、その上澄みを回収し、更に塩(例えば酢酸ナトリウム、最終約10mM)と適当な体積(好ましくは2ボリューム)のアセトン又は他の有機溶媒との添加により沈殿させる。そのサンプルを再度遠心分離し、そのペレットを水又は水溶液中に再懸濁させ、30キロダルトンのカットオフを備えたフィルター(又は他の適切な装置)の使用による分子ふるいを受けさせ、その結果、フィルターを通過するすべての物を除去し、水又は緩衝水溶液と一緒に、保持された脂質画分の回収をもたらす。
例1.オシラトリア・プランクトスリックスFP1培養物からの抽出物の調製
シアノバクテリアのオシラトリア・プランクトスリックスFP1(12)から、Yiらに説明されるように、これまでのところグラム陰性細菌からのLPS抽出についてのみ使用されていた、リポ多糖(LPS)の低温抽出法の現在のニーズへの適応によって、抽出物を調製した。詳細には、シアノバクテリア(CCAP 2 No.1459/45,2008年7月9日,スコットランド UK)を水中に1:1で希釈し、3ボリューム(ここで、ボリューム単位は、水中に希釈されたシアノバクテリアの全体積である)のTri−reagent(Sigma−Aldrich cat.N.T3934)及び1ボリュームのクロロホルムと共に混合し、室温にて10分間インキュベートした。
先の例に記載されるようにして調製されたオシラトリア・プランクトスリックスFP1からの糖脂質画分を、ヒト単球細胞株(THP1)における炎症促進性サイトカイン産生への影響をインビトロで研究するために用いた。そのモノサイトを0.5×106細胞/mlの濃度にし、24−ウェルプレートに播種し(1ml/ウェル)、シアノバクテリア抽出物の不在下又は様々な濃度(1〜20μg/ml)での存在下において1μg/mlの濃度でのP.ジンジバリスからのLPSと共にインキュベートさせた。また、10μg/mlの濃度のシアノバクテリア抽出物の存在下においてのみ培養物を作った。培養物を5%CO2の加湿インキュベーター中37℃にて18〜20時間インキュベートさせた。インキュベーション後、上澄みを集め、挟まれたDiaclone ELISA Kit(ヒトTNF−アルファ ELISA kit cat.N.950.090.096,ヒトIL−6 ELISA kit cat.N.950.030.096,ヒトIL−8 ELISA kit cat N.850.050.096,ヒトIL1−ベータ ELISA kit cat N.850.006.096)の使用により炎症促進性サイトカインを定量化した(5)。
毒性
オシラトリア・プランクトスリックスFP1抽出物は、異なる細胞株(THP1、RAW264.7、SKMEL−28、HEY4、SHSY−5Y)及び末梢血から得られた単核細胞(PBMC、末梢血単核細胞)の両方において、1〜100μg/ml間の濃度にてテストされ、最も高い濃度(100μg/ml)で使用された場合であっても毒性のないことが証明された。
例1に記載のように調製されたオシラトリア・プランクトスリックスFP1抽出物を、ジクルコン酸クロルヘキシジンと共に水中で室温にて30分間混合し;その後、クロルヘキシジンを除去するように精製した後、その単球細胞培養物への有効性を再テストした。その結果は、P.ジンジバリスからのLPSにより誘発されるTNF−アルファ産生を抑制する能力によって測定されるように、糖脂質抽出物がその活性を保つことを示す。抑制は、クロルヘキシジンがない場合に観察されたものから類推すると、1、2、4μg/mlの濃度の抽出物の存在下においてそれぞれ95%、96%及び99%であった。インキュベーション時間の終わりに、同一の培養物中の細胞の生存率をチェックし、全ての培養物で100%であることが証明された。
オシラトリア・プランクトスリックスFP1抽出物をヒドロキシエチルセルロースマトリックスに埋め込み、1月後、生物学的活性についてテストした。この場合の結果もまた、糖脂質抽出物は、細胞の生存率に影響せず、1、2、4μg/mlの濃度でそれぞれ90%、93%及び96%に等しい抑制度合いの生物学的活性を保つことを示した。
例1に記載のように調製し、水中に溶解したオシラトリア・プランクトスリックスFP1抽出物を5分間100℃にし、その後、生物学的活性についてテストした。この場合の結果でさえも、糖脂質抽出物は、細胞の生存率に影響せず、P.ジンジバリスLPSによって誘発されるTNF−アルファ産生への抑制活性を保つことを示した。
例1において調製されたオシラトリア・プランクトスリックスFP1抽出物を、例2に記載の実験でテストした最適濃度より最高で100倍高い各種濃度にて水中に溶解した。
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2.Bodet C, Chandad F, Grenier D. 2006. Inflammatory responses of a macrophage/epithelial cell co-culture model to mono and mixed infections with Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia. Microbes Infection 8:27-35.
3.Bodet C, Chandad F, Grenier D. 2005. Porphyromonas gingivalis-induced inflammatory mediator profile in an ex vivo human whole blood model. Clin. Exp. Immunol. 143:50-57.
4.Wang P-L, Ohura K. 2002. Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide signaling in gingival fibroblasts-CD14 and toll-like receptors. Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 13:132:142.
5.Shapira L, Champagne C, Van Dyke TE, Amar S. 1998. Strain-dependent action of monocytes and inflammatory macrophages by lipopolysaccharide of Porphyromonas gingivalis. Infect. Immunity 66:2736-2742.
6.Saba JA, McComb ME, Potts DL, Costello CE, Amar S. 2007. Proteomic mapping of stimulus-specific signalling pathways involved in THP-1 cells exposed to Porphyromonas gingivalis or its purified components. J. Proteome Res. 6:2211-2221.
7.Werts C, et al. 2001. Leptospiral lipopolysaccharide activates cells through a TLR-2 dependent mechanism. Nature 2:346-352.
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10.Macagno A., et al. 2006. A cyanobacterial LPS antagonist prevents endotoxin shock and blocks sustained TLR4 stimulation required for cytokine expression. J. Exp. Med. 203:1481-92.
11.Yi EC, Hackett M. 2000. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. Analyst 125:651-656.
12.Pomati et al., 2000. The freshwater Cyanobacterium Planctothrix SP. FP1: Molecular Identification and Detection of Paralytic Shellfish Poisoning Toxins J. Phycol, 36:553-562 (2000).
13.Chomczynski P. and Mackey ''Modification of the tri-reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources'' 19: 924 (1995).
Claims (12)
- 細菌性病因の歯肉病態を治療及び/又は予防するための医薬組成物であって、オシラトリア・プランクトスリックスsp.からの糖脂質画分を含み、前記画分は、タンパク質混入度が2%以下であり、核酸混入度が5%以下であることを特徴とする医薬組成物。
- 病原因子は、アクチノバチラム・アクチノミセテムコンコミタンス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、タンネレラ・フォーサイシア、及びトレポネーマ・デンティコーラよりなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記病原因子が、ポルフィロモナス・ジンジバリスであることを特徴とする請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記歯肉病態が、歯肉炎及び歯周炎(歯槽膿漏)よりなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の医薬組成物。
- 賦形剤及び/又は希釈剤、安定剤及び/又は添加剤として、経口投与に適した化合物と、任意には一種以上の異なる有効成分とを更に含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記画分が、0.1から100μg/mlの量であることを特徴とする請求項5に記載の医薬組成物。
- 口腔洗浄剤、ゲル、歯科用ペースト、又は歯磨き粉としての請求項5又は6に記載の医薬組成物。
- キャンディ、錠剤、チューインガム、又は丸剤としての請求項5又は6に記載の医薬組成物。
- 前記画分が、1〜50μg/mlの量であることを特徴とする請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記画分が、4〜20μg/mlの量であることを特徴とする請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記画分が、1〜5μg/mlの量であることを特徴とする請求項5に記載の医薬組成物。
- 細菌性病因の歯肉病態を治療及び/又は予防するための口腔用組成物を調製するための、請求項1〜11のいずれかに規定される糖脂質画分の使用。
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