JP5647300B2

JP5647300B2 - ホスファプラチン、ならびにシスプラチンおよびカルボプラチンに対し耐性を有する癌の治療におけるその使用

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Publication number: JP5647300B2
Application number: JP2013120309A
Authority: JP
Inventors: ボース，ラシンドラ，エヌ．
Original assignee: オハイオユニバーシティー
Priority date: 2007-08-06
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2028-08-06
Also published as: WO2009021081A2; SI2173337T1; US20110313182A1; EP2173337B1; HK1143551A1; CN101801369A; CY1115504T1; WO2009021081A3; WO2009021082A2; EP2668949A1; JP5385274B2; PL2173337T3; US20100233293A1; US20130237503A1; ES2495743T3; JP2013227218A; WO2009021082A3; HRP20140808T1; US8653132B2; US8445710B2

Description

関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．セクション１１９（ｅ）の下、２００７年８月６日出願の米国特許仮出願第６０／９５４，１２６号、および２００７年９月２０日出願の米国特許仮出願第６０／９７３，９２６号の優先権の利益を主張し、その両方の全内容が参照により本明細書に組み入れられる。

白金ジアミン錯体は、卵巣癌、精巣癌、頭頸部癌、およびその他の形態の癌の治療におけるシスジアミンジクロロ白金（ＩＩ）（シスプラチン）の驚異的な成功のために、当技術分野において周知である。さらに、シスプラチンは、放射線治療を含むその他の治療計画と併せて使用される。この白金化学療法剤は、特に高用量において、主に転写阻害および複製阻害プロセスによって細胞周期のＧ２期におけるアポトーシスを仲介する。鎖内および鎖間の両方の形態によるグアニンおよびアデニン塩基のＮ７位を介したＤＮＡとの共有結合が、一般に、アポトーシスにつながる一連の細胞応答の伝達における重要な分子事象であると考えられている。

シスプラチンは極めて効果的であるにもかかわらず、腎臓毒性、腎毒性、および神経毒性を示す。さらに、多くの患者はシスプラチン治療に対し経時的に耐性を持つようになり、したがってシスプラチン治療により治癒されない。他の２つのＦＤＡ認可白金薬、すなわちカルボプラチン（ジアミン−１，１−ジカルボキシラートシクロブタン−白金（ＩＩ））およびオキサリプラチン（ジアミン−オキサラト白金（ＩＩ））もまた、シスプラチンと同様の様式で機能すると考えられている。カルボプラチンは、シスプラチン耐性腫瘍細胞に対し特に効果的であるが、シスプラチンに耐性を持つ患者を効果的に治療するためには比較的高い用量が必要である。そのような高用量はまた、関連した毒性を有する。

多くの新しい白金アミン錯体が合成され、その抗癌活性に関して試験されてきた。しかしながら、有望な結果を示しているのは、これらの錯体（そのいくつかが図１４に列挙されている）のうち極僅かである。これらの新たな錯体は、様々な置換可能な非アミン配位子だけでなく、ＤＮＡ結合および細胞取込みにとって重要であると考えられている置換不可能なアミン配位子を含有する。一般に、これらおよび当技術分野において知られたその他の関連した白金アミン錯体は、シスプラチンの調製に使用されるプロセス、すなわち、テトラクロロ白金酸（ＰｔＣｌ_４ ^２−）がアミン配位子を受容してＰｔＣｌ_２（アミン／ジアミン）となるプロセスにより合成される。テトラクロロ錯体から開始すると、一般に、その他の生成物が提供されるため、ＰｔＩ_４ ^２−を使用してシス異性体の高収量および純度を確実とし、続いてＰｔＩ_４ ^２−をＰｔＩ_２（アミン／ジアミン）に変換した後、ＰｔＣｌ_２（アミン／ジアミン）に変換することもできる。ＰｔＩ_２（アミン／ジアミン）のＰｔＣｌ_２（アミン／ジアミン）への変換において、２当量の硝酸銀、またはその他の可溶性銀塩でジヨード錯体を低ｐＨで処理することにより、ジヨード錯体がジアクア錯体に変換される。得られるジアクア錯体は、容易に塩化カリウムまたは塩酸と反応して対象となるジクロロ錯体を生成する。一般に、比較的高いｐＨではジアクア錯体の二量体化または重合が急速に生じ、望ましくない生成物が生成されるため、対象となる白金錯体は、置換可能な配位子を導入するために低いｐＨにおいて対応するジアクア錯体から合成される。

置換可能な塩素配位子の代わりに、当技術分野における白金アミン錯体はまた、窒素、硫黄、カルボキシレート、およびホスホネートを置換可能な配位子として有する。しかしながら、癌の治療に最も有望であるそれらの錯体の１つの特徴は、白金（柔らかい酸）に配位した置換可能な硬い塩基の配位子である。優れた抗癌特性を示したそのような硬−柔の組合せの例は、カルボキシラト、カルボナト、ホスホナト白金錯体である。

シスプラチンをより効果的な化学療法剤と置換するための多大なる努力にもかかわらず、置換可能な配位子としてのホスフェートとの白金（ＩＩ）および白金（ＩＶ）錯体は、ほとんど開発されていなかった。これは、主として、白金（ＩＩ）ホスファト錯体に対する初期の研究では通常ホスフェート架橋複核錯体が得られたことに起因する。いくつかの複核ホスファト白金（ＩＩ）錯体の優れた抗癌特性の報告にもかかわらず、これらの錯体の水溶液における低い溶解度のために、その応用のさらなる探求は限られていた。ある種のモノマーピロホスフェートおよびトリホスフェート錯体が当技術分野において知られているが、そのような錯体は、中程度の酸性溶液中でリン酸加水分解し、不溶性の複核生成物が得られるため、医薬組成物には適していない（本明細書およびBose et al., Inorg. Chem. 1985, 24, 3989-3996に記載の、モノマー錯体二量体ａｍ−２を記載している、Odaniらに対する米国特許第７，３４２，１２２号を参照；さらに、潜在的抗癌薬としてのモノマーａｍ−２を記載している、Odaniらに対するＷＯ２００５／０００８５８号も参照）。

したがって、当技術分野において、癌の治療のためのシスプラチンおよびカルボプラチンに代わる安定で効果的な代替物の必要性が残されている。

本発明は、ホスファプラチン、すなわち図１に示される一般式（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３が、それぞれ、置換または非置換の脂肪族または芳香族アミンから独立して選択され、Ｒ^１およびＲ^２のうちの一方がＮＨ_３である場合には、Ｒ^１およびＲ^２のうちの他方がＮＨ_３ではなく、Ｓはないか、または水酸化物、酢酸、酪酸、およびアルファ−ヒドロキシ酸から選択される）を有する白金（ＩＩ）および（ＩＶ）の安定なモノマーホスファト錯体を提供する。また、ホスホプラチンを作製および単離する方法も提供する。

本発明は、単独で、または薬学的に許容される担体と組み合わせて、ホスファプラチンの有効量をそのような治療が必要な対象に投与することにより、シスプラチンおよび／またはカルボプラチン耐性癌を含む癌を治療するための方法も提供する。

本発明の白金（ＩＩ）および白金（ＩＶ）錯体の構造を示す図である。Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３は、それぞれ、置換または非置換の脂肪族または芳香族アミンから独立して選択され、Ｒ^１およびＲ^２のうちの一方がＮＨ_３である場合、Ｒ^１およびＲ^２の他方はＮＨ_３ではない。ある特定の実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２は、アミン、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、シクロヘキサンアミン、アニリン、ピリジン、および置換ピリジンから選択される。ある特定の実施形態において、Ｒ^３は、エチレンジアミンおよびシクロヘキサンジアミンから選択される。Ｓは、水酸化物、酢酸、酪酸、およびアルファ−ヒドロキシ酸から独立して選択される。ある特定の実施形態において、化合物の薬学的に許容される塩を特許請求の範囲に記載する。本発明のいくつかの単離された錯体、すなわち（Ａ）ａｍ−２としても知られるジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）、（Ｂ）ａｍ−４としても知られるシス−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）、（Ｃ）ｅｎ−２としても知られる１，２−エタンジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）、（Ｄ）ｅｎ−４としても知られる１，２−エタンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）、（Ｅ）ｄａｃｈ−２としても知られる（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）、および（Ｆ）ｄａｃｈ−４としても知られる（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）の構造を示す図である。ナトリウム対イオンを有するａｍ−４のＸ線結晶構造を示す図である。ピロホスフェート側から見た異なる立体構造のｅｎ−４のＸ線結晶構造を示す図である。ｐＨの関数として^３１Ｐ化学シフトにより測定される、図２に示される錯体のプロトン化の程度を示す図である。予測される酸性度定数を表１に示す。これらのデータから、酸性溶液と中性溶液との間の、これらの錯体の溶解度の差を把握することができる。２未満のｐＨ値における開示された条件下で、これらの錯体は完全にプロトン化され、したがって低下した溶解度を示すと予測される。（Ａ）ｐＨ４．２および（Ｂ）ｐＨ８におけるｄａｃｈ−２の示差的な安定性を示す図である。ｐＨ８では、白金（ＩＩ）に配位したピロホスフェートイオンの最長６日間の保持により明らかなように、ｄａｃｈ−２の分解は観察されなかった。対照的に、ｐＨ４．２では、遊離ピロホスフェートシグナルから、著しい分解が明らかである。スペクトルは、各パネルの一番下から始まって、２４時間間隔で記録されている。シスプラチンおよびカルボプラチン耐性ヒト卵巣細胞株（Ａ２７８０／Ｃ３０）におけるマイクロモル濃度の関数としての、ｄａｃｈ−２、シスプラチン、およびカルボプラチンの細胞傷害性効果を比較したプロットである。この細胞株は、３０マイクロモルのシスプラチンおよび１００マイクロモルのカルボプラチンに耐性を有する。ｄａｃｈ−２とＦＤＡ認可シスプラチンおよびカルボプラチン抗癌薬のヒト卵巣細胞株（Ａ２７８０）に対する細胞傷害性効果を比較したプロットである。（Ａ）シスプラチン感受性および（Ｂ）シスプラチン耐性頭頸部癌細胞株に対するｄａｃｈ−２の細胞傷害性を表す図である。シスプラチン感受性細胞に対しては、ｄａｃｈ−２のＩＣ５０値は１マイクロモル未満であり、シスプラチン耐性細胞に対しては、５マイクロモル未満である。所与の濃度において、ｄａｃｈ−２はシスプラチンと比較してより少ない量で細胞に取り込まれる（原子吸光分析により測定した場合）ことを示す図である。例えば、１０μＭ濃度では、Ａ２７８０細胞におけるシスプラチンの蓄積は３．０ｎｇＰｔ／１０^６細胞であったが、ｄａｃｈ−２は１．０ｎｇＰｔ／１０^６細胞を示した。他の濃度において、白金の蓄積について同様の傾向が当てはまる。２時間シスプラチンをインキュベートした後に原子吸光分析により測定されるヒト卵巣細胞株（Ａ２７８０）における濃度の関数としての、シスプラチンによるＤＮＡ結合の程度を示す図である。Ａ２７８０細胞が５０マイクロモル濃度までのｄａｃｈ−２で処理された場合、該細胞が２４時間処理されても、同じ技法を用いてＤＮＡに結合した白金は検出されなかった。プロトンＮＭＲ分光法による、シスプラチン（下）、ａｍ−２（中央）、およびｄａｃｈ−２（上）のグアニン塩基結合（シスプラチンの主要なＤＮＡ結合部位）の比較である。上のスペクトルは、８．０５ｐｐｍにおいてプリン環のＨ８水素に対応する遊離グアニン塩基のシグナルを示し、下のスペクトルは、８．４３ｐｐｍにおいてプリン環のＮ７位を介したグアニンのシスプラチンへの結合に起因したＨ８プロトンに対応する追加のシグナルを示し、中央のスペクトルは、非結合グアニンＨ８シグナルのみを示し、白金結合のシグナルを示していない。下のスペクトルは、４８時間後に記録された。中央および上のスペクトルは、それぞれ９６時間後および１０６時間後に記録された。本発明の錯体がグアニン塩基（シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチンのＤＮＡ結合部位）に共有結合しないということは、シスプラチンに対し提唱されているものとは異なるアポトーシス機序を示唆している。ｄａｃｈ−２によるヒト卵巣細胞におけるＤＮＡ結合の欠如を確証する^１ＨＮＭＲ分光法データである。関連した実験において、細胞用量の濃度より２５０倍程度高い濃度で、ｄａｃｈ−２を二本鎖ウシ胸腺ＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド（５^１−ATGATTTAGGTGACACTATAGCAGT−３’）、ジヌクレオチド（ｄＧｐＧ）、ならびにヌクレオチドモノホスフェート（５’−ｄＧＭＰおよび５’−ｄＡＭＰ）と反応させた。ＤＮＡ結合の程度は、^１ＨＮＭＲ分光法によりモニターした。並行して、シスプラチンを用いた同様の反応を、同一条件下で行った。２５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを使用した典型的なＮＭＲ実験からの結果が図に示されているが、これは、ｄａｃｈ−２は測定可能ないかなるＤＮＡ結合も示さず、一方シスプラチンは、８．４から８．９５ｐｐｍ域における新たなシグナルの形成により明らかなように、ＤＮＡとの共有結合付加体を容易に形成することを示している。しかしながら、シスプラチンは上記ヌクレオチドのすべてと容易に付加体を形成したが、一方、７日後であっても、ヌクレオチドと結合するｄａｃｈ−２の検出可能なＮＭＲシグナルは観察されなかった。薬物として使用されている、または可能性ある薬物として評価されている、または臨床試験中である、当技術分野で知られる有効な白金錯体のうちのいくつかの構造を示す図である。図１のホスファプラチン錯体を形成するために使用される錯体の構造を示す図であり、Ｘはハロゲンであり、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３はそれぞれ、置換または非置換の脂肪族または芳香族アミンから独立して選択される。

本明細書において、シスプラチンおよび／またはカルボプラチン耐性癌の治療を含む癌治療のための、安定なモノマー白金（ＩＩ）および（ＩＶ）ピロホスフェート錯体（ホスファプラチンと呼ばれる）が提供される。一般に、ホスファプラチンは容易に加水分解せず、中性ｐＨの水溶液に可溶であり、中性ｐＨの水溶液中で安定である。さらに、ホスファプラチンは、癌細胞株において全体的な細胞傷害性を示し、シスプラチンおよびカルボプラチンの一方または両方に対し耐性を有する細胞株において有効である。したがって、ホスファプラチンは有効であり、ある場合には、既知のプラチン系制癌剤と比較して、癌細胞死の誘引においてより効果的であり、患者への投与に好適な溶液における望ましい安定性および可溶性を示す。本明細書において本発明のホスファプラチンに関して使用される場合、安定とは、６〜８の範囲のｐＨの水溶液中で２日から６日間にわたり維持された場合の、加水分解に対する錯体の耐性を指す。

ホスファプラチンは、シスプラチン、カルボプラチンおよび関連の白金系抗癌剤とは異なり、ＤＮＡに共有結合しないと考えられる。シスプラチン耐性は、核除去修復酵素を含む様々な酵素によるＤＮＡ損傷の効率的修復から生じると考えられているため、またホスファプラチンはＤＮＡに共有結合しないため、ＤＮＡ修復機序によるホスファプラチンに対する耐性は生じないと思われる。データは、ホスファプラチンが、ｆａｓおよびｆａｓ関連転写因子、ならびにＢａｋおよびＢａｘ等のいくつかのアポトーシス促進遺伝子の過剰発現を誘引することを示唆している。さらに、ホスファプラチンの細胞結合はシスプラチンよりずっと少ないが、ホスファプラチンは驚異的な細胞傷害性を示す。したがって、本発明は、当技術分野におけるものとは異なる分子標的を有する有効な白金抗癌剤を提供する。

いくつかの実施形態において、錯体は、図１に示される一般式（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３が、それぞれ、置換または非置換の脂肪族または芳香族アミンから独立して選択され、Ｒ^１およびＲ^２のうちの一方がＮＨ_３である場合、Ｒ^１およびＲ^２の他方がＮＨ_３ではない）を有する。ある特定の実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２は、アミン、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、シクロヘキサンアミン、アニリン、ピリジン、および置換ピリジンから選択される。ある特定の実施形態において、Ｒ^３は、エチレンジアミンおよびシクロヘキサンジアミンから選択される。Ｓは、水酸化物、酢酸、酪酸、およびアルファ−ヒドロキシ酸から独立して選択される。ある特定の実施形態において、化合物の薬学的に許容される塩が特許請求の範囲に記載される。したがって、本発明の抗癌剤は、ある特定の実施形態において、図２の錯体を含む。

また、本明細書において、安定なモノマー白金（ＩＩ）および（ＩＶ）ピロホスフェート錯体を合成および単離する方法が提供される。一実施例において、当該方法は、過剰のピロホスフェートと図１５に示される式の白金錯体（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３が、それぞれ、置換または非置換の脂肪族または芳香族アミンから独立して選択され、Ｒ^１およびＲ^２のうちの一方がＮＨ_３である場合、Ｒ^１およびＲ^２のうちの他方がＮＨ_３ではなく、Ｘは、ハロゲンから独立して選択される）とを含む水性反応混合物を、約７から約９のｐＨで、約１２時間から約１８時間にわたり、約３０℃から約６０℃の温度に維持することにより、図１（Ｉ）および（ＩＩＩ）の式を有する錯体を形成するステップを含む。

図１５に示される錯体は、任意の好適な方法で作製することができる。当技術分野において一般に説明されるように、いくつかの例では、シス−（アミン／ジアミン）ジクロロ白金（ＩＩ）錯体は、ヨウ化カリウムの添加によりＫ_２ＰｔＣｌ_４からＫ_２ＰｔＩ_４に変換することにより調製することができる。次いでこれを所望のアミン配位子と反応させる。次いで、得られるシス−（アミン／ジアミン）ジヨード白金（ＩＩ）錯体を、２当量の硝酸銀を添加することにより、対応するシス−（アミン／ジアミン）ジアクア白金（ＩＩ）錯体にｉｎｓｉｔｕで変換する。次いで、シス−ジアクア種［Ｐｔ（アミン／ジアミン）_２（Ｈ_２Ｏ）_２ ^２＋］を、塩化カリウムの添加によりシス−ジクロロ錯体に変換する。

その他の好適な反応条件を使用することができることが理解される。例えば、いくつかの実施形態において、温度は、約３５℃から約４５℃であってもよい。したがって、反応温度は、約３０〜３１、３１〜３２、３２〜３３、３３〜３４、３４〜３５、３５〜３６、３６〜３７、３７〜３８、３８〜３９、３９〜４０、４０〜４１、４１〜４２、４２〜４３、４３〜４４、４４〜４５、４５〜４６、４６〜４７、４７〜４８、４８〜４９、４９〜５０、５０〜５１、５１〜５２、５２〜５３、５３〜５４、５４〜５５、５５〜５６、５６〜５７、５７〜５８、５８〜５９、５９〜６０℃、およびその間の増分であってもよい。４０℃で良好な結果が得られている。いくつかの例では、約１３時間から約１６時間反応を進行させる。したがって、反応時間は、約１２〜１３、１３〜１４、１４〜１５、１５〜１６、１６〜１７、および１７〜１８時間、ならびにその間の増分であってもよい。１５時間の反応時間で良好な結果が得られている。いくつかの例では、ｐＨは、約６〜７、７〜８、および８〜９、ならびにその間の増分であってもよい。ｐＨ約８で良好な結果が得られている。

当該方法は、後に水性反応混合物を、ピロホスフェートの沈殿物が形成しないように濃縮するステップをさらに含む。水性反応混合物は任意の好適な方法で濃縮することができることが理解される。例えば、水性反応混合物は、回転蒸発により濃縮することができる。

当該方法は、好適な酸の添加により、反応混合物のｐＨを、約２未満のｐＨに急速に低下させるステップをさらに含む。いくつかの例では、硝酸を使用してｐＨを低下させることができる。いくつかの実施形態において、該ｐＨは、約１から約２の間の範囲である。ｐＨ１で良好な結果が得られている。

いくつかの例では、当該方法はまた、反応混合物を濃縮した後に、反応混合物を、５℃から周囲温度の間の温度にするステップをさらに含む。別の実施例において、当該方法はまた、反応混合物のｐＨを低下させた後に、反応混合物を、５℃から周囲温度の間の温度に冷却するステップをさらに含む。

別の実施形態において、図１（ＩＩ）および（ＩＶ）に係る錯体を形成する方法が提供される。当該方法は、上述した通りであるが、反応混合物を、約７から約９のｐＨで、約１２時間から約１８時間にわたり、約３０℃から約６０℃に維持した後で、過酸化水素、ならびに任意選択で、酢酸塩、酪酸塩およびアルファ−ヒドロキシ酸の塩とを、反応混合物に添加するステップをさらに含む。

いくつかの例では、反応混合物の濃縮前に過酸化水素とともに添加される任意選択の試薬は、酢酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、およびアルファ−ヒドロキシ酸のナトリウム塩から選択される。別の例において、反応混合物の濃縮前に過酸化水素とともに添加される任意選択の試薬は、酢酸カリウム、酪酸カリウム、およびアルファ−ヒドロキシ酸のカリウム塩から選択される。

新規な方法はダイマーまたはオリゴマーホスフェート化合物を生成しないため、本明細書に記載のモノマー錯体の合成および単離の方法は従来技術と区別することができる。例えば、Boseら、Inorg. Chem. 1985, 24, 3989-3996（「Bose 1985」）により報告された方法は、中性ｐＨでアニオン交換樹脂にアニオン性ピロホスフェート錯体を吸着させ、より低いｐＨの溶離液で溶離させることによる、反応混合物からのＰｔ（ＮＨ_３）_２（Ｈ_２Ｐ_２Ｏ_７）（ａｍ−２）の単離を含むが、これはａｍ−４、ｅｎ−２、ｅｎ−４、ｄａｃｈ−２、およびｄａｃｈ−４の合成および単離には有用ではなかった。Bose 1985の方法を使用する場合、より低いｐＨの電解液での溶離による分離を試みると、これらの錯体はイオン交換ベッド上で分解した。まず、錯体は黒褐色に変色し、次にイオン交換樹脂内に不溶性の黒色沈殿物が形成された。ａｍ−４、ｅｎ−２、ｅｎ−４、ｄａｃｈ−２、およびｄａｃｈ−４のそれぞれの反応混合物からの分離は、Bose 1985の方法が本明細書に記載のように修正されたときのみ可能であった。各反応混合物は、次のステップにおいてｐＨを低下したときに未反応のピロリン酸が沈殿しない程度に真空蒸発により濃縮された（ピロホスフェート配位子の溶解度は、ｐＨにより大きく変化する）。選択的な沈降を始めるために、最終濃度は０．０５Ｍから０．０８Ｍの間であったが、これは、体積のさらなる低下が、反応の間に過剰に存在しなければならない未反応ピロホスフェートの共沈殿を生じさせるからである。濃縮後、反応混合物を冷却し、錯体のプロトン化形態と脱プロトン化形態との間の溶解度の差を利用して沈降を誘引するために、ｐＨを１．０まで急速に低下した。

中性ｐＨでは、本発明の単離されたモノマーＰｔ（ＩＩ）およびＰｔ（ＩＶ）錯体は安定である。^３１ＰＮＭＲスペクトルにより示されるように、ｐＨ６〜８の範囲では、該錯体は、水溶液中での中性ｐＨにおける６日間の時間間隔において、アミンまたはピロホスフェート配位子の損失に起因するいかなる脱配位も受けなかった。しかしながら、ｐＨ４．２では、同じ時間間隔において、ピロホスフェート配位子の放出に起因する緩やかな脱配位が、−１０．３ｐｐｍにおける遊離ピロホスフェートのシグナルの出現により明らかであった。同時に、不溶性のピロホスファト架橋複核白金（ＩＩ）生成物が形成された。データはまた、酸分解が酸性度に大きく依存する、つまり酸性度がより高いほど分解がより速いことを示している（図５、表１、および表２を参照）。

本発明の錯体は、様々な癌の治療に有用である。ヒト卵巣細胞株（Ａ２７８０）およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）における細胞傷害性アッセイは、これらの錯体が１回目の治療法として有効であることを示しており、シスプラチンおよびカルボプラチン耐性卵巣細胞（Ｃ３０）（表３を参照）を用いたアッセイは、これらの錯体が耐性癌の好適な２回目の治療法であることを示している。本発明の錯体は、ｉｎｖｉｖｏで毒性を低減する可能性があるため特に望ましい。これらの錯体は、シスプラチンと比較して、低減された量が細胞に取り込まれ、シスプラチンおよびその他の白金癌治療薬の用量と比較して、必要とされる用量がより低くなる可能性がある。例えば、１０μＭ濃度では、Ａ２７８０細胞におけるシスプラチン蓄積は３．０ｎｇＰｔ／１０^６細胞であり、一方ｄａｃｈ−２は１．０ｎｇＰｔ／１０^６細胞を示し、耐性細胞株においては、ｄａｃｈ−２はそのＩＣ５０値において１．４ｎｇＰｔ／１０^６細胞を示し、一方シスプラチンは＞５ｎｇＰｔ／１０^６細胞を示したが、前者の錯体のＩＣ_５０値は、後者の錯体の半分未満である（図１０および表４を参照）。

当該データは、本発明の錯体が、シスプラチンおよびその他の白金薬とは異なる分子機序および細胞機序によりアポトーシスを誘引し得ることを示唆している。第１に、共有結合がないこと（図１２および実施例１３を参照）は、本発明の錯体がＤＮＡ結合経路を介して機能しないことを示している。当業者には、一般に、獲得されるシスプラチン耐性は、ヌクレオチド除去修復プロセスによるＤＮＡからの白金の効果的除去に起因すると考えられている。ＤＮＡ結合が明らかに存在しないために、ひいてはＤＮＡ修復機序が本発明の錯体では行われない可能性のために、この錯体に対する細胞耐性を排除することができる。この結論は、ｄａｃｈ−２がシスプラチンおよびカルボプラチン耐性細胞株の両方において有効であることを示す細胞傷害性データから裏付けられる（表３を参照）。

第２に、本発明の錯体が、シスプラチンおよびその他の白金薬とは異なる分子機序および細胞機序によりアポトーシスを誘引する証拠は、ｄａｃｈ−２をシステインおよびグルタチオン（データは示されていない）と反応させた実験から得られる。ｄａｃｈ−２のピロホスフェート配位子は、チオールによる同時連結により容易に置換されたが、これはシステインまたはメチオニン残基を介した細胞表面タンパク質の可能性あるタンパク質アンカー部位を示している。

第３に、本発明の錯体が、シスプラチンおよびその他の白金薬とは異なる分子機序および細胞機序によりアポトーシスを誘引する証拠は、ｆａｓおよびそれと関連したメンバーの過剰発現を含む実験から得られる（実施例１１参照）。本発明の錯体に応答したそのような過剰発現は、ＤＮＡを損傷する経路以外のシグナル伝達経路が本発明の錯体の細胞傷害性活性の発現に最も関与すると考えられることを暗示している。平均的に、細胞が本発明の錯体で処理された場合にｆａｓは６倍過剰発現し、シスプラチンで処理された細胞においては有意な過剰発現は観察されなかった。

本明細書に記載のように、本発明の錯体は、一般に使用されるシスプラチンおよびカルボプラチンと同程度有効であるか、またはそれよりも有効であり、したがって、以前はシスプラチンおよびカルボプラチン治療に代わる有効な代替物のなかった患者の癌治療の方法を提供する。しかしながら、患者は、本明細書に記載の錯体および方法で治療するために、以前にシスプラチンまたはカルボプラチンで治療されている必要はない。治療の施行は、病院またはその他の医療施設において医療関係者により行うことができる。

本発明の錯体は、個々の患者の病態、投与する部位および方法、投与スケジュール、患者の年齢、性別、体重ならびに医者に知られているその他の因子を考慮して、適切な医療行為に従い投与および服用される。したがって、本明細書の目的において、薬学的に「有効な量」は、当技術分野において知られるようなそのような考慮点により決定される。該量は、改善された生存率もしくはより急速な回復、または症状および当業者により適切な目安として選択されるその他の指標の改善もしくは排除を含むがこれらに限定されない改善を達成するよう有効でなければならない。本発明の錯体は、哺乳動物を含む動物に投与することができる。

本発明の治療方法において、本発明の錯体は、様々な方法で投与することができる。それらは錯体として投与することができ、またこれらの錯体の優れた溶解度を利用して水溶液として単独で、または、有効成分として薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントおよびビヒクルと組み合わせて投与することができる。該錯体は、経口、皮下、または、非経口、例えば静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、気管内および鼻腔内投与ならびに髄腔内および注入技法などで投与することができる。該錯体の埋込みもまた有用である。治療対象の患者は、温血動物、特にヒトを含む哺乳動物である。薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントおよびビヒクル、ならびに埋込み用担体は、一般に、本発明の有効成分と反応しない、不活性かつ非毒性の固体または液体の充填剤または希釈剤または封入材料を指す。

用量は、単回投与または数日間にわたる複数回投与であってもよい。治療期間は、一般に、疾病過程の長さ、薬の有効性および治療対象の患者の種に比例した長さを有する。

本発明の錯体を非経口投与する場合、それらは一般に単位用量の注射剤型（溶液、懸濁液、エマルジョン）として製剤化される。注射に好適な医薬製剤は、滅菌水溶液または分散液、および注射用無菌溶液または分散液にもどすための無菌粉末を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。

例えばレシチン等のコーティングを使用することにより、分散の場合は必要な粒径を維持することにより、および界面活性剤の使用により、適正な流動性を維持することができる。綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、コーン油、ヒマワリ油、ピーナツ油、およびミリスチン酸イソプロピル等のエステル等の非水性媒体もまた、組成物の溶媒系として使用することができる。さらに、抗菌性保存剤、酸化防止剤、キレート剤、および緩衝剤を含む、組成物の安定性、無菌性、および等張性を高める様々な添加剤を添加することができる。微生物の活動の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等により確実とすることができる。多くの場合において、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を含めることが望ましい。注射用医薬剤型の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらすことができる。しかしながら、本発明においては、使用されるいかなる媒体、または希釈剤、または添加剤も、当該錯体と適合性がなければならない。

注射用無菌溶液は、本発明の実施に利用される錯体を、必要な場合は様々なその他の成分とともに、必要量の適切な溶媒中に組み込むことにより調製することができる。

本発明の薬理学的な製剤は、様々な媒体、アジュバント、添加剤および希釈剤等の任意の適合性の担体を含有する注射製剤として患者に投与することができ、あるいは、本発明において利用される錯体は、徐放性皮下埋込み物の形態で、または、モノクローナル抗体、ベクター送達、イオントフォレシス、ポリマーマトリックス、リポソーム、およびミクロスフェア等の標的送達系の形態で、患者に非経口投与することができる。その他多くのそのような埋込み物、送達系およびモジュールが、当業者に周知である。

本発明は、以下の実験的実施例を参照して、より詳細に説明される。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されるものであり、限定を意図しない。したがって、本発明は、本明細書に記載される教示の結果明らかとなるあらゆる変形を包含するものと解釈されたい。

上記の説明および続く実施例は、以前に開示された合成方法とは異なる様式でのピロホスファト白金錯体の合成を示す。これらの錯体は、シスプラチンおよびカルボプラチン耐性癌などにおいて、抗癌活性を有することが示されている。予期せぬことに、示された抗癌活性は、現在投与されているいくつかの白金錯体と同等であり、それよりも比較的低い用量で活性である。また、予期せぬことに、データは、本発明の錯体が、現在投与されている白金錯体とは異なる作用機序を有する、つまり治療の間それらはＤＮＡに結合しないことを示唆している。したがって本発明の錯体は、これまで効果的な治療を得ることが困難であったシスプラチンおよびカルボプラチン耐性癌を含む癌の治療に有用な、新規なクラスの白金治療薬を提示する。

本発明は本明細書において例示的に説明されており、使用されている用語は、限定のための用語ではなく本質的に説明のための用語であることが意図されることを理解されたい。明らかに、本明細書の教示に照らして本発明の多くの修正および変形が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲内において、本発明は具体的に記載されているものとは異なって実施され得ることを理解されたい。

実施例１：ジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）（ａｍ−２）
ピロリン酸ナトリウム十水和物（０．４ｇ）およびシスプラチン０．１ｇを、ｐＨ８の蒸留水２５０ｍＬに溶解させ、４０℃で１５時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、溶液を回転蒸発により５〜１０ｍＬまで濃縮し、濾過していかなる未反応出発材料も除去した。１ＮＨＮＯ_３の添加により約１．０までｐＨを急速に低下させると、生成物が淡黄色粉末として沈殿した。氷上で冷却することにより沈降を終了させ、真空濾過により生成物を単離し、冷水およびアセトンで洗浄した。収量Ｐｔ（ＮＨ_３）_２（Ｈ_２Ｐ_２Ｏ_７）：０．０４ｇ（３０％）。^３１ＰＮＭＲスペクトルは、外部標準としての８５％リン酸と比較して、ｐＨ７．９９で２．１２ｐｐｍに単一ピークを示している。^１９５ＰｔＮＭＲ共鳴が、−１５０３ｐｐｍに検出される。

実施例２：シス−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金
（ＩＶ）
（ａｍ−４）
ピロリン酸ナトリウム十水和物（０．４ｇ）およびシスプラチン０．１ｇを、ｐＨ８の蒸留水２５０ｍＬに溶解させ、４０℃で１５時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、反応混合物に１ｍＬの３０％Ｈ_２Ｏ_２を添加し、さらに３時間反応させた。次いで溶液を回転蒸発により５〜１０ｍＬまで濃縮し、濾過していかなる未反応出発材料も除去した。１ＮＨＮＯ_３の添加により約１．０までｐＨを急速に低下させると、生成物が淡黄色粉末として沈殿した。氷上で冷却することにより沈降を終了させ、真空濾過により生成物を単離し、冷水およびアセトンで洗浄した。収量シス，トランス−Ｐｔ（ＮＨ_３）_２（ＯＨ）_２（Ｈ_２Ｐ_２Ｏ_７）：０．０５ｇ（３４％）。^３１ＰＮＭＲスペクトルは、ｐＨ８．１１で２．３２ｐｐｍに単一ピークを示しており、^１９５Ｐｔ−^３１Ｐ結合定数は１５．４Ｈｚである。^１９５ＰｔＮＭＲスペクトルは、１７３３ｐｐｍに五重項を示しており、^１９５Ｐｔ−^１４Ｎ結合定数は２３２Ｈｚである。

実施例３：１，２−エタンジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）（ｅｎ−２）
ピロリン酸ナトリウム十水和物（０．４ｇ）およびジクロロ（エチレンジアミン）白金（ＩＩ）０．１ｇを、ｐＨ８の蒸留水２５０ｍＬに溶解させ、４０℃で１５時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、溶液を回転蒸発により５〜１０ｍＬまで濃縮し、濾過していかなる未反応出発材料も除去した。１ＮＨＮＯ_３の添加により約１．０までｐＨを急速に低下させても、生成物は沈殿しなかった。^３１ＰＮＭＲによりｉｎｓｉｔｕで生成物の特性を決定した。^３１ＰＮＭＲスペクトルにおいて１．９３ｐｐｍに単一ピークが観察され、^１９５Ｐｔ−^３１Ｐ定数は２９．７３Ｈｚである。

実施例４：１，２−エタンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）（ｅｎ−４）
ピロリン酸ナトリウム十水和物（０．４ｇ）およびジクロロ（エチレンジアミン）白金（ＩＩ）０．１ｇを、ｐＨ８の蒸留水２５０ｍＬに溶解させ、４０℃で１５時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、反応混合物に１ｍＬの３０％Ｈ_２Ｏ_２を添加し、さらに３時間反応させた。次いで溶液を回転蒸発により５〜１０ｍＬまで濃縮し、濾過していかなる未反応出発材料も除去した。１ＮＨＮＯ_３の添加により約１．０までｐＨを急速に低下させると、生成物が淡黄色粉末として沈殿した。氷上で冷却することにより沈降を終了させ、真空濾過により生成物を単離し、冷水およびアセトンで洗浄した。収量トランス−Ｐｔ（ＯＨ）_２（Ｃ_２Ｈ_８Ｎ_２）（Ｈ_２Ｐ_２Ｏ_７）：０．０７ｇ（４９％）。^３１ＰＮＭＲスペクトルは、ｐＨ８．１３で２．３０ｐｐｍに単一ピークを示しており、^１９５Ｐｔ−^３１Ｐ結合定数は２５．９Ｈｚである。^１９５ＰｔＮＭＲスペクトルは、１５８２ｐｐｍに広いピークを示した。

実施例５：（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）
（ｄａｃｈ−２）
ピロリン酸ナトリウム十水和物（０．４ｇ）およびジクロロ（トランス−１，２−ジアミノシクロヘキシル）白金（ＩＩ）０．１ｇを、ｐＨ８の蒸留水２５０ｍＬに溶解させ、４０℃で１５時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、溶液を回転蒸発により５〜１０ｍＬまで濃縮し、濾過していかなる未反応出発材料も除去した。１ＮＨＮＯ_３の添加により約１．０までｐＨを急速に低下させると、生成物が淡黄色粉末として沈殿した。氷上で冷却することにより沈降を終了させ、真空濾過により生成物を単離し、冷水およびアセトンで洗浄した。収量トランス−Ｐｔ（Ｃ_６Ｈ_１４Ｎ_２）（Ｈ_２Ｐ_２Ｏ_７）：０．０５ｇ（３８％）。^３１ＰＮＭＲスペクトルは、ｐＨ７．９３で１．７８ｐｐｍに単一ピークを示しており、^１９５Ｐｔ−^３１Ｐ結合定数は２５．０３Ｈｚである。^１９５ＰｔＮＭＲシグナルが、−１７２９ｐｐｍに記録されている。

実施例６：（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）（ｄａｃｈ−４）
ピロリン酸ナトリウム十水和物（０．４ｇ）およびジクロロ（トランス−１，２−ジアミノシクロヘキシル）白金（ＩＩ）０．１ｇを、ｐＨ８の蒸留水２５０ｍＬに溶解させ、４０℃で１５時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、反応混合物に１ｍＬの３０％Ｈ_２Ｏ_２を添加し、さらに３時間反応させた。次いで溶液を回転蒸発により５〜１０ｍＬまで濃縮し、濾過していかなる未反応出発材料も除去した。１ＮＨＮＯ_３の添加により約１．０までｐＨを急速に低下させると、生成物が淡黄色粉末として沈殿した。氷上で冷却することにより沈降を終了させ、真空濾過により生成物を単離し、冷水およびアセトンで洗浄した。収量トランス−Ｐｔ（ＯＨ）_２（Ｃ_６Ｈ_１４Ｎ_２）（Ｈ_２Ｐ_２Ｏ_７）：０．０７ｇ（５２％）。^３１ＰＮＭＲスペクトルは、ｐＨ７．９５で２．４１ｐｐｍに単一ピークを示しており、^１９５Ｐｔ−^３１Ｐ結合定数は２５．９Ｈｚである。^１９５ＰｔＮＭＲスペクトルは、１６１３ｐｐｍに広いピークを示した。

実施例７
^３１ＰＮＭＲ分光法を使用して、図２に示され実施例１〜６に記載のジアミン（ピロホスファト）白金（ＩＩ）およびジアミン（ジヒドロキソ）ピロホスファト）白金（ＩＶ）錯体がそれぞれ本明細書に記載の新規な方法により合成および単離されたことを確認することができる。

該錯体のそれぞれが、単一の^３１ＰＮＭＲ共鳴を示し、化学シフトは１．７８〜２．１２ｐｐｍの範囲であった。これらの化学シフトは、遊離ピロホスフェート配位子と比較して９〜１１ｐｐｍ下側であり、当技術分野において報告されているホスフェートキレートで観察される配位化学シフトと一致している。予測される２組の二重項の欠落により明らかなように、単座ピロホスファト錯体は最終生成物では検出されなかった。^３１ＰＮＭＲデータはまた、それぞれの場合における単一のピロホスファト白金（ＩＶ）錯体の形成により明らかなように、Ｈ_２Ｏ_２によるＰｔ（ＩＩ）錯体からＰｔ（ＩＶ）錯体への酸化が選択的であることを示した。

実施例８
ヒト卵巣癌細胞Ａ２７８０を、Dr. Thomas Hamilton（Fox Chase Cancer Center、Philadelphia、PA）から入手した。５％ＣＯ_２気体を連続的に導入しながら、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、０．２５単位／ｍＬインスリンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０を使用して、３７℃のインキュベータ内で細胞を単層で培養した。細胞の指数増殖を維持するために、ＨＢＳＳ中０．０６２５％トリプシンを使用して細胞を継代培養した。

ＩＣ５０値は、クローン原性アッセイを使用して決定した。簡潔に説明すると、細胞接着させるために、薬物処理の２４時間前に単一細胞懸濁液からの５００個のＡ２７８０細胞を６０ｍｍペトリ皿に播種した。薬物処理の日に、培地を傾斜して除き薬物と置換し、これらの処理後の細胞を３７℃のインキュベータに１時間戻した。各薬物濃度に対し３つのペトリ皿を用意した。１時間の薬物処理後、薬物を含有する培地を移して新鮮な培地と置換した。これらのペトリ皿を３７℃のインキュベータに戻し、１週間かけてコロニーを形成させた。コロニーを固定し、無水メタノール中２％クリスタルバイオレットを使用して染色した。５０を超える細胞を含有するコロニーを評点した。３つのペトリ皿からの評点したコロニーの数を平均し、この数を播種した細胞の数で割り、コロニー形成細胞の割合の値を得た。次いで、これらのコロニー形成細胞の割合の値を、薬物で処理しなかったペトリ皿中のコロニー形成細胞の数で割ることにより、播種効率に関して補正した。

表３は、シスプラチンおよびカルボプラチンと比較した、ＩＣ５０値として表される本明細書に記載の錯体の抗癌活性を示す。データから分かるように、ｄａｃｈ−２は、耐性細胞株において、シスプラチンおよびカルボプラチンの両方よりも良好な性能を示す。さらに、ｄａｃｈ−４は、カルボプラチンよりもはるかに優れた活性を示す。データはまた、ｄａｃｈ−４がシスプラチン／カルボプラチン耐性癌細胞およびシスプラチン感受性細胞に対し同程度またはより効果的であることを示し、これはホスファプラチンが耐性を発現しない可能性をさらに示唆している。

シスプラチンおよびカルボプラチンとは異なり、本発明のホスファト錯体は、これらの錯体を細胞に効率的に輸送するのを補助し得るホスファト配位子の存在に起因して、より低い毒性を示すと予測される。さらに、シスプラチンとは異なり、これらのホスファト錯体は、図１２に示されるように、７２時間以内に、測定可能ないかなるＤＮＡに対する結合も示さなかった。シスプラチンは、ゲノムＤＮＡへの結合機能を有すると考えられている。したがって、本発明のホスファト錯体は、異なる細胞標的を有する。

実施例９
Dr. Thomas Hamilton（Fox Chase Cancer Center、Philadelphia、PA）から得たシスプラチン耐性卵巣細胞株（Ｃ３０）（Hamaguchi, et al., 1993）を、本発明のモノマー白金錯体（図２に示される）で処理した。この細胞株はカルボプラチンに対する交差耐性も有する。１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、０．２５単位／ｍＬインスリンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０を使用して、５％ＣＯ_２気体を連続的に導入しながら、３７℃のインキュベータ内で細胞を単層で培養した。細胞の指数増殖を維持するために、ＨＢＳＳ中０．０２５％トリプシンを使用して細胞を継代培養した。

ＩＣ５０値は、クローン原性アッセイを使用して決定した。簡潔に説明すると、細胞接着させるために、薬物処理の２４時間前に単一細胞懸濁液からの５００個のＣ３０細胞を６０ｍｍペトリ皿に播種した。薬物処理の日に、培地を傾斜して除き薬物と置換し、これらの処理後の細胞を３７℃のインキュベータに１時間戻した。各薬物濃度に対し３つのペトリ皿を用意した。１時間の薬物処理後、培地を傾斜して除き薬物を移して新鮮な培地と置換した。これらのペトリ皿を３７℃のインキュベータに戻し、１週間かけてコロニー形成させた。コロニーを固定し、無水メタノール中２％クリスタルバイオレットを使用して染色した。５０を超える細胞を含有するコロニーを評点した。３つのペトリ皿からの評点したコロニーの数を平均し、この数を播種した細胞の数で割り、コロニー形成細胞の割合の値を得た。次いで、これらのコロニー形成細胞の割合の値を、薬物で処理しなかったペトリ皿中のコロニー形成細胞の数で割ることにより、播種効率に関して補正した。

実施例１０
ヒト頭頸部扁平上皮細胞癌から誘導されたＵＭＳＣＣ１０ｂ（シスプラチン感受性）およびＵＭＳＣＣ１０ｂ／１５ｓ（シスプラチン耐性）細胞株を、カリフォルニア大学（Dan Diego）のDr. Stephen B. Howellから得た。１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えた１６４０ＲＰＭＩ中で細胞を培養した。２４ウェルプレートに、各ウェルプレートにつき約２０，０００細胞／５００μｌ培地を播種した。１．１２μＭから最大７２μＭの範囲の可変濃度のｄａｃｈ−２に細胞を曝露した。ｄａｃｈ−２錯体の原液を調製し、これらの溶液の一定量を添加してそれらの有効濃度を作製した。次いで細胞を７２時間にわたり増殖させた。この試験では、１２の異なる濃度を使用した。各濃度に対し１つの対照、全体で１２対照が存在した。

ＵＭＳＣＣ１０ｂ（シスプラチン感受性）のＩＣ５０は、１．０μＭ未満であると推定することができる。それと比較して、シスプラチンのＩＣ５０値は同じ細胞株において１７μＭである（Zheng et al., Clinical Cancer Research, 1997, 3, 1157-1165を参照）。ＵＭＳＣＣ１０ｂ／１５ｓ（シスプラチン耐性）のＩＣ５０は、５μＭと決定された。図９は、シスプラチン感受性およびシスプラチン耐性細胞株の細胞生存曲線を示す。

実施例１１
シスプラチンと比較した本発明の錯体に関する遺伝子発現予備実験（データは示されていない）を、ＢＣＬ２スーパーファミリー、アポトーシス促進および抗アポトーシスの両方、カスパーゼ、ＢＩＲファミリー、ＴＮＦ受容体活性化因子、ｐ５３およびその同族体、ならびにｆａｓ関連メンバーを含む、８４遺伝子を含有するアポトーシスアレイを用いて、リアルタイムＰＣＲにより行った。２組の遺伝子発現をより詳細に見てみると、発現パターンにいくつかの差が明確に示されていることが分かった。例えば、ｆａｓおよびｆａｓスーパーファミリー遺伝子のメンバーは、ｄａｃｈ−２で処理された細胞において過剰発現しており、一方シスプラチンは、これらの遺伝子の発現に僅かな変化しか与えていない。具体的には、ｆａｓは対照と比較して６倍過剰発現し、ＴＮＦＲＳＦ−１０Ｂ等のＴＮＦＲＳ遺伝子は、対照より２〜３倍過剰発現した。これらの後者の受容体因子は、ｆａｓスーパーファミリーに属する。ＢＡＫ１およびＢＡＸ等のアポトーシス促進ＢＣＬ２メンバーがｄａｃｈ−２により約２〜３倍過剰発現し、一方シスプラチンはその発現に有意な変化をもたらさなかったことが分かるのは興味深い。

実施例１２：白金の細胞蓄積およびＤＮＡに結合した白金の推定
黒鉛炉原子吸光分析器（Perkin Elmer AA-600）で、水中のシスプラチンまたはピロｄａｃｈ−２を使用して確立された較正曲線から、白金含有量を定量的に推定した。細胞（５×１０^６）を、Ｔ７５ｃｍ^２フラスコに播種した。２４時間後、次いでこれらの細胞を種々の濃度（０、１０、２０、３０および５０μＭ）のシスプラチンおよびピロｄａｃｈ−２で処理した。白金錯体による１時間の曝露後、薬物含有培地を除去して細胞を氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで細胞をトリプシン処理し、ペレット状に遠心分離した。McGahanの方法に従い、分析前に細胞ペレットを濃ＨＮＯ_３およびＨ_２Ｏ_２中で分解させた。表４に報告されたデータは、それぞれ２回ずつ行われた３つの独立した実験から収集された。シスプラチン蓄積に対しては、所与の濃度における単一試料から、３回の実験によりデータを得た。

ＤＮＡ−Ｐｔ測定では、Ｔ７５ｃｍ^２フラスコに１．０×１０^７細胞を播種した。２４時間後、白金錯体を、０、１０、２０、３０および５０μＭの異なる濃度で添加した。白金錯体で細胞を２４時間処理した。処理後、培地を除去して細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞をトリプシン処理し、ペレット状に遠心分離した。Wizard(登録商標)SV DNA精製キット（Promega）を使用してＤＮＡを抽出した。NanoDrop UV-Vis装置を使用して、２６０ｎｍの吸収からＤＮＡを定量的に推定した。

実施例１３：ＮＭＲによる白金−ＤＮＡ結合
Bruker 500MHz NMR装置で、９９％（原子）Ｄ_２Ｏ中、水抑制パルスシーケンスによりプロトンＮＭＲ分光実験を行った。試料は、リン酸および炭酸緩衝液（１０〜２０ｍＭ）により維持されたｐＨ７．０で、シスプラチン（２．０ｍＭ）またはピロｄａｃｈ−２（２．０ｍＭ）およびヌクレオチド（５’−ｄＧＭＰ、５’−ｄＡＭＰ、ｄＧｐＧ（５．０ｍＭ））、ならびに一本鎖および二本鎖ＤＮＡ（ウシ胸腺、５．０ｍＭ）を含有した。シスプラチン（０．２５ｍＭ）およびピロｄａｃｈ−２（０．２５ｍＭ）と合成２５−ｍｅｒ：５’−ATGATTTAGGTGACACTATAGCAGT−３’（０．２５ｍＭ）との反応もまた、同一条件下で行った。反応は最高７日間行い、^１Ｈおよび^３１ＰＮＭＲスペクトルを一定の時間間隔で記録した。通常、５μｓのパルス幅、１．０ｓの反復遅延を測定に使用した。典型的には、１０，０００Ｈｚの掃引幅および３２Ｋデータ点を選択して自由誘導減衰を収集した。１Ｈｚの線幅拡大因子をフーリエ変換に適用した。Ｈ−Ｏ−Ｄピークを参照すると、化学シフトは４．６７ｐｐｍに見られた。
本発明は、下記の実施形態を含む。
［１］
癌を治療するための組成物であって、
図１に記載の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの１もしくは複数の単離されたモノマー白金錯体
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３が、それぞれ、置換または非置換の脂肪族または芳香族アミンから独立して選択され、
Ｒ^１およびＲ^２のうちの一方がＮＨ_３である場合、Ｒ^１およびＲ^２のうちの他方がＮＨ_３ではなく、
Ｓが、水酸化物、酢酸、酪酸、およびアルファ−ヒドロキシ酸から独立して選択される）、または
その薬学的に許容される塩
を含む組成物。
［２］
Ｒ^１およびＲ^２が、それぞれ、アミン、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、シクロヘキサンアミン、アニリン、ピリジン、および置換ピリジンから独立して選択される、［１］に記載の組成物。
［３］
Ｒ^３が、エチレンジアミンおよびシクロヘキサンジアミンから選択される、請求項１に記載の組成物。
［４］
前記単離されたモノマー白金錯体が、１，２−エタンジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）である、［１］に記載の組成物。
［５］
前記単離されたモノマー白金錯体が、（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）である、［１］に記載の組成物。
［６］
前記単離されたモノマー白金錯体が、シス−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である、［１］に記載の組成物。
［７］
前記単離されたモノマー白金錯体が、１，２−エタンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である、［１］に記載の組成物。
［８］
前記単離されたモノマー白金錯体が、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である、［１］に記載の組成物。
［９］
癌を治療するための組成物であって、
（ｉ）シス−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）；
（ｉｉ）１，２−エタンジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）；
（ｉｉｉ）１，２−エタンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）；
（ｉｖ）（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）；
（ｖ）トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）；および
（ｖｉ）その薬学的に許容される塩
から選択される１もしくは複数の単離されたモノマー白金錯体を含む組成物。
［１０］
前記単離されたモノマー白金錯体が、約６から約８のｐＨの水溶液中で安定である、［９］に記載の組成物。
［１１］
前記単離されたモノマー白金錯体が、ＤＮＡに結合しない、［９］に記載の組成物。
［１２］
前記単離されたモノマー白金錯体が、ｆａｓおよびｆａｓ関連転写因子の過剰発現を誘引する、［１１］に記載の組成物。
［１３］
前記単離されたモノマー白金錯体が、アポトーシス促進遺伝子の過剰発現を誘引する、［１１］に記載の組成物。
［１４］
前記アポトーシス促進遺伝子が、ＢａｋおよびＢａｘである、［１３］に記載の組成物。
［１５］
単離されたモノマー白金（ＩＩ）錯体を調製する方法であって、
（ｉ）過剰のピロホスフェートと、図１５に記載の式ＶおよびＶＩの白金錯体
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３が、それぞれ、置換または非置換の脂肪族または芳香族アミンから独立して選択され、Ｘが、ハロゲンから独立して選択される）
とを含む水性反応混合物を、約７から約９のｐＨで、約１２時間から約１８時間にわたり、約３０℃から約６０℃の温度に維持するステップと、
（ｉｉ）続いて前記水性反応混合物を、ピロホスフェートの沈殿物が形成しないように濃縮するステップと、
（ｉｉｉ）酸の添加により、前記反応混合物のｐＨを２未満のｐＨに急速に低下させるステップとを含み、
前記単離されたモノマー白金錯体は、図１に記載の式ＩまたはＩＩＩ
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３が、それぞれ、置換または非置換の脂肪族または芳香族アミンから独立して選択される）を有し、
前記単離されたモノマー白金錯体が、約６から約９の間のｐＨの水溶液中で安定である、前記方法。
［１６］
調製される前記単離されたモノマー白金錯体が、（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）である、［１５］に記載の方法。
［１７］
前記温度が４０℃であり、前記反応時間が１５時間であり、前記ｐＨが７から８の間である、［１５］に記載の方法。
［１８］
前記反応混合物を濃縮した後に、前記反応混合物を、約５℃から周囲温度の間の温度に冷却するステップをさらに含む、［１５］に記載の方法。
［１９］
前記反応混合物のｐＨを低下させた後に、前記反応混合物を、約５℃から周囲温度の間の温度に冷却するステップをさらに含む、［１５］に記載の方法。
［２０］
単離されたモノマー白金（ＩＶ）錯体を調製する方法であって、
（ｉ）過剰のピロホスフェートと、図１５に記載の式ＶおよびＶＩの白金錯体
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３が、それぞれ、置換または非置換の脂肪族または芳香族アミンから独立して選択され、Ｘが、ハロゲンから独立して選択される）
とを含む水性反応混合物を、約７から約９のｐＨで、約１２時間から約１８時間にわたり、約３０℃から約６０℃に維持するステップと、
（ｉｉ）過酸化水素と、任意選択で酢酸塩、酪酸塩およびアルファ−ヒドロキシ酸の塩、ならびにそれらの組合せの群から選択される試薬とを、前記反応混合物に添加するステップと、
（ｉｉｉ）続いて前記水性反応混合物を、ピロホスフェートの沈殿物が形成しないように濃縮するステップと、
（ｉｖ）硝酸の添加により、前記反応混合物のｐＨを２未満のｐＨに急速に低下させるステップとを含み、
前記単離されたモノマー白金錯体が、図１に記載の式ＩＩまたはＩＶ
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３が、それぞれ、置換または非置換の脂肪族または芳香族アミンから独立して選択され、
Ｓが、水酸化物、酢酸、酪酸、およびアルファ−ヒドロキシ酸から独立して選択される）を有し、
前記単離されたモノマー白金錯体が、約６から約９の間のｐＨの水溶液中で安定である、前記方法。
［２１］
前記温度が４０℃であり、前記反応時間が１５時間であり、前記ｐＨが７から８の間である、［２０］に記載の方法。
［２２］
前記反応混合物を濃縮した後に、前記反応混合物を、５℃から周囲温度の間の温度に冷却するステップをさらに含む、［２０］に記載の方法。
［２３］
前記反応混合物のｐＨを低下させた後に、前記反応混合物を、５℃から周囲温度の間の温度に冷却するステップをさらに含む、［２０］に記載の方法。
［２４］
前記反応混合物の濃縮前に過酸化水素とともに添加される任意選択の前記試薬が、酢酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、およびアルファ−ヒドロキシ酸のナトリウム塩から選択される、［２０］に記載の方法。
［２５］
前記反応混合物の濃縮前に過酸化水素とともに添加される任意選択の前記試薬が、酢酸カリウム、酪酸カリウム、およびアルファ−ヒドロキシ酸のカリウム塩から選択される、［２０］に記載の方法。
［２６］
前記過酸化水素が、３０％の初期ｖｏｌ／ｖｏｌ濃度である、［２０］に記載の方法。
［２７］
調製される前記単離されたモノマー白金錯体が、シス−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である、［２０］に記載の方法。
［２８］
調製される前記単離されたモノマー白金錯体が、１，２−エタンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である、［２０］に記載の方法。
［２９］
調製される前記単離されたモノマー白金錯体が、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である、［２０］に記載の方法。
［３０］
癌を治療する方法であって、請求項１の錯体から選択される少なくとも１つの単離されたモノマー白金錯体の治療上有効な量と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤またはアジュバントまたは媒体とを投与するステップを含む方法。
［３１］
前記癌が、卵巣癌、精巣癌、小細胞肺癌、および頭頸部癌から選択される、［３０］に記載の方法。
［３２］
シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンから選択される１もしくは複数の抗癌剤に耐性を有する癌を治療する方法であって、ジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）および請求項１の錯体から選択される少なくとも１つの単離されたモノマー白金錯体の治療上有効な量と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤またはアジュバントまたは媒体とを投与するステップを含む方法。
［３３］
前記癌は、卵巣癌、精巣癌、小細胞肺癌、および頭頸部癌から選択される、［３２］に記載の方法。

Claims

Ｐｔ（ＩＩ）およびＰｔ（ＩＶ）から選択される白金中心を有し、下記式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ：

（式中、Ｒ^１、およびＲ^２は、それぞれ、ＮＨ_３、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、シクロヘキサンアミン、アニリン、ピリジン、および置換ピリジンから独立して選択され、
式Ｉにおいて、Ｒ^１およびＲ^２が両方ともＮＨ_３であることはなく、
Ｒ^３は、置換または非置換の脂肪族または芳香族ジアミンから選択され、
Ｓは、それぞれ、水酸化物、酢酸、酪酸、およびアルファ−ヒドロキシ酸から独立して選択される）
から選択される式で表される、少なくとも１種の単離されたモノマーピロホスフェート−白金錯体、またはその薬学的に許容される塩を含む組成物。
式Ｉ：

で表される単離されたモノマー白金錯体またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１に記載の組成物。
式ＩＩ：

で表される単離されたモノマー白金錯体またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１に記載の組成物。
シス−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）を含む、請求項３に記載の組成物。
式ＩＩＩ：

で表される単離されたモノマー白金錯体またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１に記載の組成物。
Ｒ^３が、エチレンジアミンおよびシクロヘキサンジアミンから選択される、請求項５に記載の組成物。
Ｒ^３が、シクロヘキサンジアミンである、請求項６に記載の組成物。
（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）を含む、請求項７に記載の組成物。
式ＩＶ：

で表される単離されたモノマー白金錯体またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１に記載の組成物。
Ｒ^３が、エチレンジアミンおよびシクロヘキサンジアミンから選択される、請求項９に記載の組成物。
１，２−エタンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）を含む、請求項１０に記載の組成物。
（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）を含む、請求項１０に記載の組成物。
（ｉ）シス−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）；
（ｉｉ）（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）；
（ｉｉｉ）（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）
（ｉｖ）１，２−エタンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）および
（ｖ）その薬学的に許容される塩
から選択される1種または複数種の単離されたモノマー白金錯体を含み、各単離されたモノマー白金錯体またはその塩が、約６から約８のｐＨの水溶液中で安定である、請求項１〜１２のいずれか1項に記載の組成物。
医薬組成物である、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の組成物。
哺乳動物に投与された場合に、単離されたモノマーピロホスフェート−白金錯体がＤＮＡに結合しない、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の組成物。
単離されたモノマーピロホスフェート−白金錯体が、システインまたはメチオニン残基のチオール基による同時連結によるそのピロホスフェート配位子の置換によって細胞表面タンパク質に結合する、請求項１５に記載の組成物。