JP5636257B2 - 角層細胞の物性測定方法 - Google Patents
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直接的に皮膚の物性を定量的に示すためには、ヒトの皮膚、具体的には角層細胞を採取する必要がある。角層細胞を採取する方法としては、バイオプシー(生検)が採用されている。しかし、バイオプシーは皮膚を切り出すため、侵襲的で被験者の負担が大きいという問題がある。
さらに、テープストリッピングにより角層細胞を採取する方法も知られている(特許文献1〜2参照)。テープストリッピングは低侵襲的だが、採取時に角層細胞の表面に粘着性テープの粘着面を押し付けるので、角層細胞の表面の物性を測定する際、角層表面を露出させるため溶媒を用いて粘着性テープの粘着剤を除去しなければならない。溶媒を用いて粘着剤を除去すると、粘着剤だけではなく、粘着性テープに付着する角層細胞の物理的/化学的特性に影響を及ぼすため、角層細胞の物性を正確に測定することができない。さらに、溶媒中から角層細胞を回収しなければならず、採取した角層細胞は非常に薄いものであり採取した角層細胞の表面と裏面とを区別することは困難なため、回収した角層細胞を扱うのは非常に難しく、熟練度を要する。
さらに、本発明は、前記角層細胞の物性測定方法を用いた、皮膚性状の評価方法に関する。
本発明の角層細胞の表面の物性測定方法によれば、角層細胞表面の物理的/化学的特性に影響を与えずに、皮膚の物性を簡便、正確かつ客観的に評価することができる。従って、剤の使用前後の物性変化に基づく剤開発における処方設計指針の提案や、皮膚の物性の部位差や加齢の影響等の測定/評価が容易となる。
本発明に用いる支持体の材質に特に制限はないが、物性測定の際に採取した角層細胞を生体と同じ状態で再現/維持するために伸縮性が小さく、ヒトの皮膚表面の凹凸に適合を有するためのある程度の柔軟性を有し、使用する粘着剤と親和性が高い材質が好ましい。例えば、金、白金、ニッケル、アルミニウム、チタン、モリブデン、ステンレス、銅などが挙げられる。本発明では、銅、金、又はニッケルが好ましい。
本発明において、支持体1の厚さは特に制限はないが、採取した角層細胞を支持体上で固定し、SPM観察を行う観点から、1〜20μmが好ましく、3〜10μmがより好ましい。
支持体1の大きさは特に制限はないが、2〜25mm2が好ましく、5〜10mm2がより好ましい。
支持体1には透孔2が複数設けられていることが好ましい。
支持体1上に皮膚から角層細胞を採取するため、支持体1を皮膚4に貼着させた後、一定時間放置してもよいし、支持体1を皮膚4に押し付けてもよい。
そこで、本発明では、SPM観察を行う前に、上述のような粘着層の閉塞がなくSPM観察可能な透孔において、角層細胞に対して確実に測定を行うために支持体における接合採取した角層細胞の存在箇所を確認し、多数の透孔からSPM観察を行う透孔を選択することが好ましい。これにより、探針が汚染されることなく、角層細胞の物性を正確かつ迅速に測定することができる。確認方法としては特に制限はなく、目視で確認してもよいし、光学顕微鏡等を用いて確認してもよい。なお、図2に示すような、透孔の形状が他の部分とは異なる透孔を設けた支持体を用いると、当該部分が目印となり測定箇所の特定が容易となる。
本発明では、透孔2を設けた支持体1の粘着層3を皮膚4に貼着し、皮膚4から支持体1を剥がす。従って、支持体1の接合側の粘着層3とは反対側の非接合側に、接合採取した皮膚(角層細胞)の表面が露出している。よって、本発明の角層細胞の物性測定方法において、図1−4に示すように、支持体1の非接合側から透孔2内の角層細胞5に対してSPM観察を行うことで、正確に角層細胞表面の物性を測定することができる。
ヒトの皮膚の角層細胞の物性(弾性率)測定方法を図1−1〜図1−4に則して説明する。
粘着剤(コスメディ製薬社製、商品名:MASCOS08K)を酢酸エチルで30wt%に希釈した。図1−1に示す支持体1として、図2に示すような透孔の形状を有する透過型電子顕微鏡(TEM)観察用の銅グリッド(商品名:G600HH、日新EM製、直径3mmΦ、六角形の透孔2の大きさ30μm)を濾紙に置き、希釈した粘着剤を1滴滴下し、表面をシリコーン加工処理したシール台紙(KOKUYO社製タックタイトル(商品名))で上から強く押すことにより余剰な粘着剤を除去した。銅グリッドからシール台紙を剥がし、グリッドの透孔が粘着剤で閉塞していないことを光学顕微鏡(商品名:ECLIPSE E600 POL、Nikon社製)で確認し、支持体1の透孔2周辺に粘着剤を用いて図1−1(b)に示すような粘着層3を形成した(粘着層3の厚さ:数μm)。なお、支持体1には多数の透孔があるため、支持体1の透孔2の形状が他とは異なる中央部分(以下、「中央の目印」ともいう)付近の透孔が粘着層で閉塞されないように粘着層を形成させた支持体1を作製した。粘着層の溶剤を揮発させるために、減圧下で支持体1を一晩放置した。
図1−4に示すように、支持体1の非接合側から選択した透孔2内に探針6を侵入させ、角層細胞5の表面をトレースし、AFM測定を行い、角層細胞の表面の形状像及び弾性率を測定した(Scan rate:形状測定時:0.5Hz、弾性率像測定時:3.26Hz)。なお、AFM測定における解像度は、512×512ピクセルとした。さらに、Force Volumeモードでナノインデンテーション・マッピング(弾性率イメージング)を行った。解像度は、64×64ピクセルとした。
弾性率測定の結果、前腕部の弾性率は0.59±0.16GPaであった。
図6の結果から、前腕の方が頬に比べて弾性率の平均値が高い傾向が得られた。さらに、角層細胞の弾性率に部位差があることもわかった。
実施例1と同様にして、片面に粘着層3を有する、透孔2を設けた支持体1を作製し、被験者(29才男性)の皮膚4(前腕)から角層細胞5(厚さ:約500nm)を接合採取した。光学顕微鏡で観察したところ、接合採取した角層細胞5はフィルム状であり、支持体1上でしっかり固定されていて、たるみがなく、生体における皮膚の状態を再現/維持されていた。
図1−4に示すように、支持体1の非接合側から選択した透孔2内に探針6(商品名D-NP-S(Si3N4lever)、NANOSENSOR社製、バネ定数0.12N/m)を侵入させ、探針6の先端部を角層細胞5に当接させ、FFM測定を行い、角層細胞の表面の形状像及び摩擦力を測定した(Scan rate:1.0Hz(2μm四方)、Scan angle:90°)。なお、FFM測定における解像度は、512×512ピクセルとした。
なお、FFM測定後の探針6の先端部の走査型電子顕微鏡写真を図8に示す。図8の結果から、上述の通り角層採取前に粘着層による閉塞がない透孔の位置を確認し、粘着剤で覆われなかった透孔に採取された角層を測定したので、FFM測定後の探針6の先端部には粘着剤は全く付着していなかった。
実施例2で用いたものと同じ探針を用いて、FFM測定の前に、両面粘着物7を走査した。その後、探針6の先端部の走査型電子顕微鏡で観察した。結果を図9に示す。図9からわかるように、探針6の先端部には粘着剤が付着していた。
その後、実施例2においてFFM測定を行った部位と同じ部位について、前記の先端部に粘着剤が付着した探針6を用いて、実施例2と同様にFFM測定を行った。その結果を図10に示す。図10から明らかなように、先端部に粘着剤が付着した探針を用いたため、摩擦力像が全体的にぼやけて観察された。
さらに、図7(b)及び図10(b)の画像において、同位置の50ピクセル×50ピクセルの画像5枚について摩擦力の平均値を算出し、有意差検定を行った。その結果、図7(b)及び図10(b)の画像から算出した摩擦力の平均値には有意差があり(P<0.05)、探針6の先端部の汚染が皮膚表面の物性の測定結果に影響を及ぼすことは明らかであった。
従って、SPM測定前に支持体における接合採取した角層細胞の存在箇所を確認したうえで、支持体の透孔内の角層細胞に対してSPM測定を行うことで、探針先端部への粘着剤の付着を防止できるため角層細胞の物性を正確に測定することができ、さらに、角層細胞の物性測定に要する時間も短縮することができる。
2 透孔
3 粘着層
4 皮膚
5 角層細胞
6 探針
7 両面粘着物
8 試料台
Claims (5)
- 透孔を有し、かつ片面に粘着層を有する支持体の粘着層側を、ヒトの肌の皮膚上に貼着し、その後前記支持体を肌の皮膚から剥離して、粘着層の粘着作用によって支持体上にヒトの肌から剥離させた皮膚を接合採取して、接合した皮膚で透孔の粘着層側の中央付近の一定面積以上を覆った支持体を得、透孔の皮膚非接合側から走査型プローブ顕微鏡観察を行って、前記支持体に接合した角層細胞の表面の物性を測定する、角層細胞の物性測定方法。
- 角層細胞の接合採取前に、粘着層による閉塞がない透孔の位置を確認する、請求項1に記載の角層細胞の物性測定方法。
- 支持体における接合採取した角層細胞の存在箇所を確認し、多数の透孔から走査型プローブ顕微鏡観察を行う透孔を選択する、請求項1又は2に記載の角層細胞の物性測定方法。
- 走査型プローブ顕微鏡観察を行って角層細胞の表面の弾性率又は摩擦力を測定する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の角層細胞の物性測定方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の角層細胞の物性測定方法を用いた、皮膚性状の評価方法。
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