JP5624471B2 - 磁性金属酸化物で被覆されたポリマー性ナノ粒子及びその使用 - Google Patents
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Description
大きさが約5nmから100nmの範囲であり狭い粒度分布のゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子を、国際公開第99/062079号に詳細に記載のように、核形成、それに続くゼラチン/酸化鉄核上への磁性酸化鉄薄膜の制御された成長によって調製した。核形成ステップは、ゼラチンのキレート形成部位へのFe+2イオンの錯体形成、それに続くキレート化されたFe+2のFe+3への部分酸化(ほぼ50%まで)を基礎とし、その結果、水溶性ゼラチンはキレート化されたFe+2及びFe+3イオンの両方を含んでいた。次いで、NaOH又は代わりにアンモニア水溶液を約pH9.5となるまで添加することによってゼラチン/酸化鉄の核を形成した。ゼラチン核上への磁性膜の成長は、核形成ステップを数回繰り返すことによって完遂された。
蛍光染料を主として磁性複合ナノ粒子内に封じ込めた、蛍光染料で標識されたゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子を、図7に図示するように、ゼラチンを、蛍光染料に共有結合で結合しているゼラチンに代えて例1に記載のように調製した。例えば、200mgのゼラチンを含む20mL水溶液に、5mgのローダミンイソチオシアネート(RITC)を含む0.5mLのジメチルスルホキシド(DMSO)を徐々に添加することによって、ローダミンで標識されたナノ粒子を調製した。水溶液のpHをNaOH水溶液(1N)を添加して9.5まで上昇させ、溶液を60℃で1時間振盪した。この方法は、ゼラチンのヒドロキシル及びアミン基の一部とRITCのイソチオシアネートとの間のチオ尿素及び/又はチオウレタン結合を介する共有結合の形成を含む。次いで、過剰のRITCを、前者の水溶液の60℃でのH2Oに対する徹底的な透析(カットオフ:12〜14000)、又は磁気カラムを通す洗浄によって、ゼラチンと複合したローダミン鎖から除去した。溶液の容積を80mLに調整し、次いで例1に記載のように合成を継続した。
薬物を含むゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子を、ゼラチンを、薬物に共有結合で結合しているゼラチンに代えて、例1に記載のように調製した。例えば、アドリアマイシン(Aldrich社)を、Melamed及びMargel(2001年)が発表しているようなカルボジイミド活性化法によって共有結合でゼラチンに結合した。簡潔には、200mgのゼラチン及び5mgのアドリアマイシンを含む20mLのMES緩衝液(0.01M、pH5.0、Sigma社)に、123mgのNHS(N−ヒドロキシスクシンイミド、Sigma社)及び82mgのCDC(1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリノエチル)カルボジイミドメト−p−トルエンスルホン酸塩、Sigma社)を添加し、次いで、溶液を、60℃で2時間振盪した。溶液を、水に対する透析(カットオフ:12〜14000)によって洗浄して過剰な試薬を洗い流した。溶液の容積を80mLに調整し、次いで、例1に記載のように合成を継続した。
例1〜3に記載のように調製したゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子の表面に官能基を作り出すための各種方法は、(i)被覆形成ポリマー、例えば、デキストランのナノ粒子表面に対する高い親和性、(ii)マイケル付加反応による、ナノ粒子表面上の官能基と、所望の官能性リガンド(例えば、ナノ粒子表面上で活性化される二重結合を有するタンパク質などのアミノリガンド)との間での共有結合の形成、又はMelamed及びMargel(2001年)が発表しているようなカルボジイミド活性化法による、カルボキシレート基(ゼラチン被覆に属する)に対する共有結合の形成、及び(iii)ナノ粒子表面上での被覆形成ポリマー、例えば、ゼラチン又はアルブミンの沈殿などの様々な原理に基づいて開発されている。ナノ粒子表面の官能基を、次いで、様々な活性化法によって、各種薬物、例えば、TRAIL及びcRGDペプチドを共有又は物理的に結合するのに使用した。
例1〜3に記載のように調製されたゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子にジビニルスルホン(DVS)を、当初の[DVS]/[ナノ粒子]の重量比を4/1として添加し、次いで、トリエチルアミンを10.5のpHに到達するように添加し、続いて60℃で一夜インキュベートした。形成された官能化ゼラチン/酸化鉄−DVSナノ粒子、又は蛍光染料標識化ゼラチン/酸化鉄−DVSナノ粒子を、次いで、磁気勾配カラムを用い0.1M重炭酸塩緩衝液(pH=8.3)で洗浄し、4℃で貯蔵した。
例1〜3に記載のように調製されたゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子の水性分散液に2%(w/v)デキストラン(MW48,000、Sigma社)を添加し、デキストランを溶解した後、水性分散液を85℃で3時間振盪した。デキストランで被覆されたナノ粒子を、磁気カラムを使用し、水で洗浄して過剰なデキストランを洗い流した。物理的に吸着されたデキストランの水性連続相中への漏れを防止するために、及び表面で活性化される二重結合を生じさせるために、デキストラン被覆の架橋を、DVSを用いて前記の4(i)に記載のように実施した。
例1〜3に記載のように調製されたゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子の水性分散液に0.2%(w/v)ゼラチンを添加し、次いで、水性分散液を85℃で3時間振盪した。水性分散液を室温まで冷却し、次いで、ゼラチンで被覆されたナノ粒子を、磁気カラムを用いて洗浄した。必要なら、前記の4(i)に記載のようにDVS誘導体化を実施した。
5(i)ゼラチン/酸化鉄−DVS磁性複合ナノ粒子上へのヒトTRAIL又はIL12の固定化
例4に記載のように調製された1mgのゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子を含む1mLの重炭酸塩緩衝分散液(0.1M、pH=8.3)に、20μgのヒトTRAIL(hTRAIL、CytoLab社、イスラエル)を添加し、次いで、分散液を室温で60分間混合した。この方法は、ナノ粒子の残留二重結合とTRAILの第一級アミノ基とのマイケル付加による結合形成を含む。次いで、活性化される残留二重結合の封鎖を、グリシンを用い、グリシン(1%w/v)を添加すること及び分散液の混合を室温でさらに60分間継続することによって実施した。過剰な未結合のhTRAIL及びグリシンを、磁気勾配カラムを使用してPBS(pH=7.4)で除去した。結合したhTRAILの濃度は、ELISA Development Kit(900−K141、ロット番号11041410、CytoLab社、イスラエル)で測定して、約2000ng/mgナノ粒子であることが見出された。
上記5(i)に記載の実験を、20μgのhTRAILを配列シクロ(Arg−Gly−Asp−D−Phe−Lys)(配列番号1)を有する3mgのcRGDペプチド(Peptides International社、Louisville、ケンタッキー州40224、米国)に代えて繰り返した。ネガティブ対照として、cRGDペプチドを配列シクロ(Arg−Ala−Asp−D−Phe−Lys)を有するcRADペプチド(Peptides International社)に代えて類似の方法を実施した。
前記5(i)に記載の実験を、グリシンを3mgのcRGDペプチドに代えて繰り返し、結果として、残っているDVSの活性化される残留二重結合をcRGDペプチドに複合した。
ヒトTRAIL及び/又はcRGDペプチドを、例1〜3及び例4(iii)により調製されたゼラチン/酸化鉄複合ナノ粒子に、Melamed及びMargel(2001年)に記載のようなカルボジイミド活性化法により共有結合で結合した。簡潔には、200mgのナノ粒子を含む20mLのMES緩衝液(0.01M、pH5.0、Sigma社)に、123mgのNHS及び82mgのCDCを添加し、次いで、ナノ粒子分散液を室温で3時間振盪した。活性化されたナノ粒子を、磁気勾配カラムを使用してPBSで徹底的に洗浄し、次いで、20mLの洗浄された活性化ナノ粒子分散液に、8mgのhTRAIL又は50mgのcRGDペプチドを含む5mLのPBS溶液を添加した。懸濁液を、室温で約8時間振盪し、次いで、残留活性化基の封鎖を、グリシン(200mg)又はcRGDペプチド(50mg)のどちらかを用いて、それぞれ5(i)又は5(iii)に記載のように実施した。
例4に記載のように調製された1mgのゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子を含む1mLの重炭酸塩緩衝分散液(0.1M、pH=8.3)に、20μgのモノクローナル抗体、アバスチン(Bevacizumab、Genentech社)又はレミケード(Infliximab)を添加し、次いで、分散液を室温で60分間混合する。この方法は、ナノ粒子の残留二重結合とアバスチン又はレミケードの第一級アミノ基とのマイケル付加による結合形成を含む。次いで、残留活性化二重結合の封鎖を、グリシンを用い、グリシン(1%w/v)を添加すること及び分散液の混合を室温でさらに60分間継続することによって実施する。過剰の未結合アバスチン又はレミケード及びグリシンを、磁気勾配カラムを使用してPBS(pH=7.4)で除去する。
例3に記載のように調製された1mgの非官能化ゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子、又は例4(iii)に記載のように調製されたアルブミン被覆化ゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子を含む1mLの重炭酸塩又はPBS緩衝分散液(0.1M、pH=8.3)に、20μgのヒトTRAIL(hTRAIL、CytoLab社、イスラエル)を添加した。次いで、分散液を室温で120分間混合し、結果として、hTRAILを、非被覆又はアルブミン被覆化ナノ粒子に非共有結合で結合した。この物理的な結合形成は、TRAILとナノ粒子との間の非共有結合性相互作用、例えば、疎水性結合、イオン性相互作用及び水素結合に基づく。過剰の未結合hTRAILを、磁気勾配カラムを使用してPBS(pH=7.4)で除去した。
ヒトsTRAILを、Melamed及びMargel(2001年)が発表しているようなカルボジイミド活性化法により、ゼラチン/酸化鉄ナノ粒子に直接結合した。典型的な実験において、10mgのナノ粒子を含む15mLのMES緩衝液(0.1M、pH5.0)に、123mgのNHS及び82mgのCDCを添加した。次いで、ナノ粒子混合物を、室温で約3時間振盪した。活性化されたナノ粒子を、磁気勾配カラムを使用して洗浄した。次いで、8mLの洗浄された活性化ナノ粒子のPBS分散液に、0.5mgのsTRAILを含むPBS溶液(2mL)を添加した。次いで、分散液を室温で約2時間振盪した。次いで、残留活性化二重結合の封鎖を、グリシン又は第一級アミノポリエチレングリコールを用いて、グリシン(1%w/v)(又は第一級アミノポリエチレングリコール、5mg)を添加すること、及び分散液の混合を室温でさらに60分間継続することによって実施した。過剰の未結合hTRAIL及びグリシン(又はアミノポリエチレングリコール)を、磁気勾配カラムを使用して、PBS(pH=7.4)で除去した。
材料及び方法
細胞系:次の実験で使用されるすべての細胞は、American Tissue Culture Collection(ATCC)又はHermelin Brain Tumor Center(Henry Ford Hospital、Detroit、ミシガン州)から入手した。すべての細胞は、10%FBS(Hyclone社、Logan、ユタ州)、2mMのL−グルタミン及び100μg/mLのストレプトマイシン−ペニシリンで補足されたDMEM(Invitrogen社)中、5%CO2下に37℃で培養した。
分解に対する遊離及び複合型TRAILの安定性を調べるために、遊離TRAIL(100ng)又はTRAIL複合型ゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子(NP−TRAIL、100ng TRAIL)のどちらかを含む1mLのPBSを10℃でインキュベートし、TRAILの濃度を35日間測定した。図8は、ナノ粒子へのTRAILの複合化が、TRAILを安定化し、その結果、複合型TRAILの初期濃度を10℃で35日目まで維持したことを示している。対照的に、遊離TRAILは、これらの条件下で有意に分解した。
ヒト神経膠腫細胞A172を、TRAIL(100ng/mL)又はNP−TRAIL(10ng TRAIL/mL)のどちらかと5時間インキュベートした。細胞アポトーシスを、プロピジウムヨージド染色で判定し、フローサイトメトリー(FACS)及び細胞の形態学的外観の両方によって分析した。図9Aは、遊離TRAILが、細胞の約48%のアポトーシスを誘導し、一方、NP−TRAILは、細胞の約57%のアポトーシスを誘導し、ナノ粒子単独は、有意な細胞アポトーシスを誘導しなかったことを示している。換言すれば、複合型TRAILによって誘導されるアポトーシス活性は、遊離のそれによって誘導されるものに比べて少なくとも10倍高かった。
神経膠腫細胞U87、A172及びU251、並びに神経膠腫細胞HF1308、HF1254及びHF1316の一次培養物を、TRAIL(100ng/mL)、NP−TRAIL(10ng TRAIL/mL)又はゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子(NP)単独と共に24時間インキュベートした。次いで、細胞を、捕集し、プロピジウムヨージドで染色し、FACS分析でsub−G0集団(アポトーシス細胞)について分析した。図11は、すべての場合に、NP単独の細胞毒性効果は、PBSによって引き起こされる効果と相違なかったこと、及びNP−TRAILは、遊離TRAILのそれに比べて有意により高い細胞毒性活性を呈示したことを示している。
ヒト神経膠腫細胞A172細胞を、非蛍光ナノ粒子(NP−Control)、NP−TRAIL(10ng TRAIL/mL)、ローダミン標識化ゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子(NPR)及びTRAIL複合型ローダミン標識化ゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子(NPR−TRAIL、10ng TRAIL/mL)と共に5時間インキュベートした。アポトーシスを、プロピジウムヨージド染色を使用して判定し、FACSで分析した。図12に示すように、NPR−TRAILによって誘導されるアポトーシス(51%)は、NP−TRAILによって誘導されるもの(45%)に類似していた。同様の結果が、他の神経膠腫細胞、例えば、U251及びU87についても観察された。これらの結果は、蛍光性TRAIL複合型ナノ粒子が、それらの非蛍光性対応物に類似し、遊離TRAILのそれに比べて約10倍多い神経膠腫細胞のアポトーシスを誘導することを示している。
正常星状細胞に比較した神経膠腫細胞に対するNP−TRAILの特異性を、NPR−TRAILを用いて調べた。詳細には、ヒト神経膠腫細胞A172及び正常ヒト星状細胞を、NPR−TRAIL(10ng TRAIL/mL)と共に30分間インキュベートし、細胞を、共焦点顕微鏡を使用して観察し、写真撮影した。図13に示すように、NPR−TRAILは、処理の30分以内にA172細胞に入り込み、ER/ゴルジ領域に蓄積し、一方、正常星状細胞では極めて弱い蛍光が観察された。同様に、TRAILと複合されていないNPRは、両方の細胞型において細胞に入り込まなかった(データは示さない)。これらの結果は、NPR−TRAILが、おそらく、TRAIL受容体への結合形成に続く内部移入によって神経膠腫細胞に入り込み、且つそれらは、細胞中に薬物を送達するTRAIL複合型ナノ粒子の能力に対して重要な関連を有する可能性があることを示している。
NP−TRAILは、多くの神経膠腫細胞系においてアポトーシスを誘導したが、この処理に抵抗性のあるいくつかの神経膠腫細胞が存在した。かくして、γ線は、TRAIL受容体の発現を高めることによって腫瘍細胞のTRAILに対する感度を高めることが報告されているので、神経膠腫細胞のアポトーシスに対するNP−TRAILとγ線との併用処理の効果を調べた。詳細には、TRAILに対して敏感であったA172及びU251細胞、並びにTRAILに対して低い応答を示したU87細胞、及びTRAIL処理に抵抗性であったLN−18細胞を採用し、最適状態に及ばない濃度のNP−TRAIL(5ng TRAIL/mL)及びγ線(10Gy)を使用した。細胞をNP単独、NP−TRAIL(5ng TRAIL/ml)、γ線(10Gy)、又はNP−TRAIL(5ng TRAIL/ml)とγ線(10Gy)の組合せで処理した。併用処理では、細胞を、最初に照射し、2時間後に、NP単独で又はNP−TRAILで処理した。24時間後に、細胞アポトーシスを判定した。図14は、併用処理によって誘導されるアポトーシスが、有意に高められたこと、及び低線量のγ−照射を付加することが、NP−TRAILに対するいくつかの神経膠腫細胞の抵抗性を克服したことを示している。
神経膠腫細胞中で誘導される別のタイプの細胞死は、Gozuacik及びKimchi(2004年)の文献に記載のようなII型細胞死又は自己貪食である。自己貪食を特徴付けるために、細胞を、LC3−GFPプラスミドでトランスフェクトし、自己貪食性空胞形成の蓄積を調べた。見出されたように、対照細胞では、IC3−GFPが細胞中のいたるところに出現したが、自己貪食細胞では、断続染色が観察された。それを考慮して、NP単独で処理された対照細胞中及びcRGDペプチド複合型ゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子(NP−cRGD)で処理された細胞中のLC3−GFPのパターンを調べた。この目的のために、U251細胞を、LC3−GFPで24時間トランスフェクトし、細胞を、cRGDペプチド(10μg/mL)、NP単独又はNP−cRGD(約4μg cRGD/mL)でさらに24時間処理し、次いで、断続GFP染色を有する細胞の割合を計算した。図15に示すように、約24時間で、cRGDで処理された細胞の約30%及びNP−cRGDで処理された細胞の約18%が、LC3−GFPの高められた断続パターンを示した。それとは対照的に、対照又はNPで処理された細胞のほんの2〜3%が、断続染色を示した。
この実験では、TRAIL処理に抵抗性であったLN−18細胞を、NP−TRAIL、TRAIL及びcRGDペプチド複合型ナノ粒子(例5(iii)に記載のように調製された)又はアドリアマイシンを含むTRAIL及びcRGDペプチド複合型ナノ粒子(例3及び5(iii)に記載のように調製された)と共に24時間インキュベートした。付加的薬物(cRGDペプチド及びアドリアマイシン)の相乗効果が、NP−TRAILでは約8%、TRAIL及びcRGDペプチド複合型ナノ粒子では約25%、及びアドリアマイシンを含むTRAIL及びcRGDペプチド複合型ナノ粒子では45%であった、アポトーシスパーセントの有意な増加によって立証された。
この実験では、神経膠腫以外の腫瘍細胞に対するNP−TRAILの効果を、子宮頸癌細胞系HeLa、乳癌細胞系MCF−7及び肺癌細胞A549を使用して調べた。図16は、5時間のインキュベーション後のTRAIL(100ng/mL)、NP−TRAIL(50ng TRAIL/mL)、NP単独又はPBS(対照)のアポトーシス効果を示している。示したように、PBS及びNPは、両方とも、微々たるアポトーシス効果を有したのに、NP−TRAILは、TRAILによって誘導されるものの少なくとも2倍である有意なアポトーシスを誘導し、ナノ粒子へのTRAILの複合化は、そのアポトーシス効果を維持し、さらには各種癌細胞に対するその効果を増大させたことを示した。細胞アポトーシスは、プロピジウムヨージド(PI)染色を使用して判断し、フローサイトメトリーで分析した。
神経膠腫幹細胞を、腫瘍標本2355及び2303から確立し、球状体として増殖させ、培養組織中に2ヶ月間維持した。神経膠腫幹細胞は、自己複製を示し、ポリ−L−リシン上で星状細胞、ニューロン及びオリゴデンドロサイトに分化した。細胞に対するNP及びNP−TRAILの効果を調べるために、球状体を、6穴プレートに播種し、TRAIL(100ng/mL)、NP単独又はNP−TRAIL(50ng TRAIL/mL)で24時間処理した。次いで、上清液を捕集し、LDH分析を実施した。
卵巣癌細胞を、培地単独、IL−12(50ng/mL)、NP(50μg/mL)又はIL−12複合型ゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子(NP−IL−12、50ng IL−12/mL)で処理し、24時間インキュベートし、次いで、LDHアッセイを使用して細胞死について分析した。図18に示すように、IL−12及びNP−IL−12は、両方とも、さらに細胞形態に反映されたように、培養細胞中で細胞死を誘導した。
材料及び方法
細胞系及び動物:U251細胞を、ATCC(Manassas、バージニア州)又はHermelin Brain Tumor Center(Henry Ford Hospital、Detroit、ミシガン州)から得た。すべての細胞を、10%FBS(Hyclone社、Logan、ユタ州)、2mMのL−グルタミン及び100μg/mLストレプトマイシン−ペニシリンで補足されたDMEM(Invitrogen社)中、5%CO2下に37℃で培養した。雌性Nu/Nuラットを、NCI Fredericks社(Fort Detricks、メリーランド州)から得た。すべてのラットが、腫瘍移植の時点で6〜8週齢であった。
TRAIL複合型ゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子(NP−TRAIL)のインビボでの効果を調べるために、2種の神経膠腫動物モデルを確立した。第1モデルでは、ヒトU87又はU251細胞を、ヌードマウス中に頭蓋内で移植した。第2モデルでは、新鮮な手術腫瘍検体からのヒト神経膠腫細胞を採用し、ヌードラット中に移植し、元々の腫瘍の初期特性を維持する腫瘍を作り出し、かくして様々な抗癌治療に対するこれらの腫瘍の応答を予測できる系を提供した。
NP−TRAILのインビボでの効果を調べるために、異種移植片としてヒトU251神経膠腫細胞を採用した。腫瘍を7日間発育させ、その時点で、NP−TRAIL、ゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子(NP)単独又はPBSを腫瘍部位に頭蓋内で注入した。治療の7日後に、細胞アポトーシスの程度を調べた。細胞アポトーシスは、アポトーシス細胞を特異的に検出するTUNEL染色(褐色染色)を使用して判定した。図19は、NP単独又はNP−TRAILのどちらかで処理されたラットからの腫瘍切片を示す。示したように、NP単独は、有意な程度の細胞アポトーシスを誘導しなかったが、NP−TRAILは、TUNEL(褐色染色)陽性細胞によって判定されるような大規模な細胞アポトーシスを誘導した。なお、PBSで処理されたラットでも、有意な細胞アポトーシスは、示されなかった(データは示さない)。
NP−TRAIL(100ng TRAIL)が生存上の利益を提供できるか否かを判定するために、PBS、NP単独又はNP−TRAILを、ヌードラット脳中の異種移植片ヒトU251腫瘍中に腫瘍内で直接的に送達した。次いで、動物を、罹患の徴候についてモニターし、任意の徴候の出現又は腫瘍移植後85日目の時点で安楽死させた。図20に示すように、NP−TRAILでの処理は、NP単独(p=0.0248)又はPBS(p=0.0288)のそれを超えて生存を有意に延長した。罹患時点での代表的腫瘍の顕微鏡写真を図21A〜21Cに示す。腫瘍罹患のために安楽死させた動物では大きな腫瘍が明らかであるが、打ち切った動物では腫瘍は明らかでない。しかし、これらの動物では若干の瘢痕形成が、明らかである(矢印)。各シリーズは、同一動物及び2mm離れた切片から撮影される。また、NP−TRAIL(100ng TRAIL)を含む10μLの注入されるPBSを100、200及び800ngのsTRAILに代えたsTRAILを用いて、類似の実験を完遂した。これらの実験は、PBSで観察されたものに類似の生存結果を示した。しかし、より高濃度のsTRAILでの実験は、オリゴデンドロサイトに対して若干の傷害を示した。
腫瘍量に対するNP−TRAILの効果を判定するために、PBS、NP単独又はNP−TRAILを、ヌードラットの脳中の異種移植片ヒトU251腫瘍中に腫瘍内で直接的に送達した。腫瘍移植の21日後に動物を安楽死させ、切片化及びH&E染色のために脳を摘出した。脳を、2mmのブロックに切断し、処理し、明確な腫瘍をもつブロックを、5μmの切片に切断し、15番目毎に切片を確保しH&Eで染色し、このスライドに関する腫瘍容積を判定した。15番目毎のスライドに関する腫瘍の最大の幅及び高さを測定し、明白な腫瘍を有する各スライドに関して最大のW×HX(5×15)を乗算することによって総腫瘍量を決定し、これらの数を加算した。統計的有意性を、FischerのPLSDを使用するStatviewを用いて決定した(有意水準5%)。図22に示すように、NP−TRAILの投与は、NP単独又はPBSと比較して腫瘍量を有意に低減した。NP単独とPBS投与の間で有意差は認められなかった。
NPが移植部位から腫瘍増殖部位に移動する能力は、特に脳腫瘍の療法に対する、NPの有用な治療潜在能力である。したがって、その能力を判定するために、0日目に、U251腫瘍細胞をヌードラットの脳の左半球中に移植し、7日後に、ローダミン標識化ゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子(NPR)を腫瘍移植と同方向ではあるが対側半球中に投与した。11日目(NPR投与の4日後)に、動物を安楽死させ、生理食塩水で灌流し、脳を取り出し、凍結切片化及び共焦点顕微鏡法での分析のために急速凍結した。図23に示すように、NPRは、脳梁に沿って追跡することが容易に認められる。若干のNPRは、むしろ腫瘍塊から遠い方に移動するが、大部分のNPRは、左半球中の腫瘍塊に向かって移動していることが認められた。類似の挙動が、ローダミン標識化TRAIL複合型ゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子(NPR−TRAIL)について観察された。
この実験では、腫瘍を破壊するNP−TRAILの能力を判定した。詳細には、0日目に、ヌードラットにU251n腫瘍を移植した。7日目に、NP−TRAIL、NP単独又はPBSを新生物内で投与し、14日目に、動物を安楽死させ、組織を摘出した。図24に示すように、NP−TRAILの投与は、NP単独又はPBSを投与された動物では認められなかった、腫瘍塊の底部における大きな腫瘍破壊領域の発生につながった。NP−TRAIL投与に続いて、多くの壊死及びアポトーシス細胞が、この領域内に認められたが(右パネル)、NP又はPBS投与の後では認められなかった。図25は、療法に続く腫瘍破壊領域の大きな拡大を示している。
U251nヒト神経膠腫細胞をヌードラットに移植し、11日後に、NP又はNP−TRAILを、腫瘍の対側側に頭蓋内で注入した。8日後に、MR画像を得た。図26A〜26Bに示すように、NP−TRAIL(26B)は、腫瘍の縁端及び内部の両方で、NP単独(26A)に比較してより低いシグナル強度を誘導した。低い強度は、ナノ粒子の存在を暗示する。
GFP−U251腫瘍細胞を移植して7日後に、腫瘍塊内にNPR単独又はNPR−TRAILを直接的に移植した。4日後に、動物を安楽死させ、脳を摘出し、切片化及び造影(赤色及び緑色は、それぞれNPR及びGFP−U251腫瘍細胞の存在を示している)のために急速凍結した。図27に示すように、NPR単独は、腫瘍細胞の周辺領域中に見出されたが、腫瘍細胞と共存せず(パネルD、E、F)、NPR−TRAILは、腫瘍細胞と共存して腫瘍破壊領域中に見出された(パネルG、H、I)。さらに、NPR−TRAILで処理された動物中で認められる腫瘍は、PBS又はNPRで処理された動物の両方中で認められる腫瘍に比較して退化していることを示しており、この切片中で明瞭に認められる腫瘍細胞は、ほんの少数であった。この実験は、例6(v)においてインビトロで示されたように、TRAILが、腫瘍細胞のNP取り込みにつながったことを示している。
GFP−U251腫瘍細胞を移植して7日後に、cRGDペプチド複合型ローダミン標識化ゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子(NPR−cRGD、約2μgのcRGDペプチドに複合された0.05mgのナノ粒子を含む10μL)を、脳の対側側に注入した。4日後に、動物を安楽死させ、脳を摘出し、切片化及び造影(赤色及び緑色は、それぞれNPR及びGFP−U251腫瘍細胞の存在を示している)のために急速凍結した。図28は、NPR−cRGDが、腫瘍部位に移動したことを示している。
損傷は、脳の左側でのPBSのニードル注入によって誘導した。4日後に、5μL(25μg)のNPR単独、NPR−TRAIL(50ng TRAIL)及びNPR−cRGDを、脳の対側側に注入した。4日後に、動物を屠殺し、蛍光顕微鏡下でNPRの蛍光を可視化した。図29に示すように、脳の反対側にNPRは殆ど存在しなかったが、それらの分布は豊富であった。NPR−TRAILは主として損傷部位に沿って局在した。対照的に、NPR−cRGDは、損傷脳の側の全体にわたって、さらに脳梁に沿って分布した。これらの結果は、ナノ粒子が、損傷部位を追跡する若干の能力を有すること、及びNPR−TRAILが、損傷部位での選択的蓄積を示すことを示唆している。NPR−cRGDは、追跡能力を有するが、それらの分布は、損傷部位に限定されず、それらは、やはりそこに蓄積する炎症細胞に結合する可能性がある。これらの結果は、薬物を脳損傷、脳卒中及び脳の炎症性疾患に送達するためにNP系を使用することに対して重要な関連を有する。
これらの実験では、TRAIL複合型ゼラチン/酸化鉄磁性複合ナノ粒子(NP−TRAIL)の神経膠腫細胞以外の各種癌細胞に対する細胞毒性効果を判定した。詳細には、使用する癌細胞系は、膀胱癌細胞TSU−PR1及び乳癌細胞MDA−MBとし、対照として正常乳腺細胞MCF10Aを使用した。加えて、プロテアソーム阻害薬(PS)、大部分の細胞内タンパク質分解の原因である多触媒性プロテイナーゼ複合体と組み合わせたNP−TRAILのこれらの細胞に対する効果を研究した。プロテアソームの薬理学的阻害薬は、インビトロ及びインビボで抗腫瘍活性を有する。前臨床研究は、プロテアソームの阻害が、TRAILなどのその他癌治療薬の活性を、部分的には化学療法抵抗性の経路を下向き調節することによって増強することを立証している。
Claims (34)
- 金属キレート形成ポリマー核、該金属キレート形成ポリマーを被覆する磁性金属酸化物、及び該ポリマーに共有結合で結合したTNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)を含む、ナノ粒子であって、該金属キレート形成ポリマーはアミノ基を含み、該結合が該ポリマー内のアミノ基とTRAILのアミノ基間のものである、上記ナノ粒子。
- 前記ポリマーが、金属イオンを結合することができる官能基を含む、請求項1に記載のナノ粒子。
- 前記ポリマーが、ゼラチン、ポリメチレンイミン、キトサン又はポリリシンを含む、請求項1に記載のナノ粒子。
- 前記磁性金属酸化物が、酸化鉄、又は酸化鉄由来のフェライトである、請求項1に記載のナノ粒子。
- 前記酸化鉄が、マグネタイト、マグヘマイト、又はこれらの混合物であり、且つ前記フェライトが、式(Fe,M)3O4の酸化物であり、ここで、Mが、遷移金属イオンを表す、請求項4に記載のナノ粒子。
- 少なくとも1種の付加的な薬剤を更に含む、請求項1に記載のナノ粒子。
- 前記ポリマーがゼラチンであり、及び、前記磁性金属酸化物が酸化鉄である、請求項1に記載のナノ粒子。
- 前記少なくとも1種の付加的な薬剤が、cRGDペプチド又はペプチド模倣体である、請求項6に記載のナノ粒子。
- 腫瘍細胞におけるアポトーシス、自己貪食又は両者を誘導するための、請求項1に記載のナノ粒子を含む薬剤。
- 該細胞にγ線を照射するための、請求項9に記載の薬剤。
- 前記腫瘍細胞は神経膠腫細胞、腫瘍幹細胞、癌腫細胞、乳癌細胞、又は肺癌細胞である、請求項9に記載の薬剤。
- 前記腫瘍細胞におけるアポトーシス、自己貪食又は両者の誘導が、癌に冒されている患者を治療するものである、請求項9に記載の薬剤。
- 前記癌が神経膠腫、癌腫、乳癌、肺癌である、請求項12に記載の薬剤。
- プロテアソーム阻害薬を更に同時に又は別々に含む、請求項9に記載の薬剤。
- 前記ナノ粒子が非癌細胞に対して非毒性である、請求項9に記載の薬剤。
- 神経膠腫に冒された対象を治療するための、請求項1に記載のナノ粒子を含む薬剤。
- プロテアソーム阻害薬を更に同時に又は別々に含む、請求項16に記載の薬剤。
- 前記ナノ粒子は、非癌細胞に非毒性である、請求項16に記載の薬剤。
- 前記神経膠腫にγ線を照射するための、請求項16に記載の薬剤。
- 非癌細胞に非毒性である、請求項1に記載のナノ粒子。
- 薬剤、染料標識、造影剤、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項1に記載のナノ粒子。
- 前記染料標識が蛍光染料である、請求項21に記載のナノ粒子。
- 前記TRAILが金属キレート形成ポリマーに直接的又は間接的に結合している、請求項1に記載のナノ粒子。
- 請求項1のナノ粒子と医薬として許容し得る担体を含む、組成物。
- 請求項1に記載のナノ粒子の調製方法であって、以下の連続した段階:
a)可溶性金属キレート形成ポリマーを含む水溶液と少なくとも1つの可溶性金属塩を混合する段階;
b)該溶液内に形成した金属イオンを酸化させる段階;
c)該溶液の酸性度を塩基性pHに調整することによって、該溶液内の前記ナノ粒子を形成させる段階;
d)該溶液に付加的な部分の金属塩を加える段階;
e)該溶液内に形成した金属イオンを酸化させる段階;
f)該溶液の酸性度を塩基性pHに調整する段階;
g)段階dからfまでを少なくとも1回繰り返す段階;
h)該ナノ粒子の金属キレート形成ポリマー中の第1級アミンに官能性を付与する段階;
i)該金属キレート形成ポリマー中の第1級アミンを有する官能性を付与したナノ粒子に少なくともTRAILを接触させて、該ポリマー中のアミノ基と該TRAIL中のアミノ基との間に共有結合を形成する段階;及び
j)該ナノ粒子の表面上に残った活性部位をブロックする段階、
を含む方法。 - 前記重合体金属キレート剤が官能基を含み、該官能基がアミノ、ヒドロキシル、カルボキシレート、−SH、エーテル、イミン、ホスフェート及びスルフィド基を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記重合体金属キレート剤がゼラチン、ポリメチレンイミン、デキストラン、キトサン、ポリリシン、ポリビニルピロリドン又はそれらの組み合わせを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記ナノ粒子の前記官能性付与は、該ナノ粒子を塩化アクリロイル、ジビニルスルホン(DVS)、ジカルボニルイミダゾール、エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシネート)、m−マレイミド安息香酸N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル又はそれらの任意の組み合わせに接触させることを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記官能性付与は前記ナノ粒子に被覆形成ポリマーを被覆させることを更に含む、請求項25に記載の方法。
- 前記官能性付与は前記被覆形成ポリマーに塩化アクリロイル、ジビニルスルホン(DVS)、ジカルボニルイミダゾール、エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシネート)、m−マレイミド安息香酸N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル又はそれらの任意の組み合わせに架橋させることを更に含む、請求項29に記載の方法。
- 前記水溶液は薬剤、染料標識、造影剤、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記可溶性金属キレート形成ポリマーが薬剤、染料標識、造影剤、又はそれらの任意の組み合わせに結合した、請求項25に記載の方法。
- 前記薬剤がTRAILである、請求項31又は32に記載の方法。
- 前記染料標識が蛍光染料である、請求項31又は32に記載の方法。
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