JP5623014B2

JP5623014B2 - 表面プラズモン共鳴（ｓｐｒ）検出用の新規チップ

Info

Publication number: JP5623014B2
Application number: JP2008532776A
Authority: JP
Inventors: ブケルーブ、ラバー; シュナーリッツ、サビーヌ
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2005-09-27
Filing date: 2006-09-27
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2026-09-27
Also published as: US20100149540A1; EP1937869A1; JP2009510423A; WO2007036544A1; FR2891279B1; FR2891279A1; US8279444B2

Description

本発明は、その上にプラズマ増強化学蒸着（ＰＥＣＶＤ）法により均一な厚みの安定なＳｉＯ_ｘ層が成膜（堆積）されている金属層で被覆された固体担体を製造する方法に関する。本発明はさらに、こうして得られた担体と、かかる担体を用いて、該担体の表面に存在する標的化合物に特異的に結合するか、吸着されることができる化合物の存在を決定するための、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた方法にも関する。本発明の別の目的は、かかる担体を含む分析用キットと、該担体を用いた対象化合物のスクリーニングおよび選択方法とを提供することである。

表面感受性分光法の１種である表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、近年では、界面現象の監視と薄膜の特性決定のための分析手法として十分に認められるようになってきた（非特許文献１〜９）。この方法の選択性は金属誘電体界面に生起した表面プラズモンの金属表面での電界および磁界励起から生ずる。表面プラズモンは、プリズムを通る内部全反射を経たｐ偏光が金／誘電体界面を照射する時に金表面で励起され、入射光をある角度で表面プラズモンモードに連結する。プラズモン共鳴はフォトダイオードにより測定される反射光の強い減少および共鳴角度に関係づけられる。この角度は隣接媒質の屈折率（ｎ）の変化および光学的厚さの変化に非常に敏感である。金および銀はスペクトルの可視領域で動作するＳＰＲチップの理想的な金属層の候補である。金に比べて銀はよりはっきりしたＳＰＲスペクトルとより良好な較正励起を与えるが、反応環境中で不安定となる傾向がある。従って、金薄膜が安定性および感受性に関してＳＰＲ用途のためのより良好な選択肢となる。

実際、ＳＰＲは、ラベルを使用しない検出、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応の研究ならびに分子およびバイオ分子事象のリアルタイム検出に広く使用されてきた。これを達成することができるのは、周囲媒質に比べて界面で結合された分子により誘導される光コントラスト変化に検出が基づいているためである。ＳＰＲチップの金表面に生物学的化合物を固定するために使用される化学反応は、主にチオール化化合物（非特許文献１０〜１５）または導電性ポリマー（非特許文献１、３、８）に基づく。バイアコアがＳＰＲに基づくバイオ分析システムを構築する（非特許文献９ａ）。かかるシステムは金表面に結合させた官能性化デキストラン層を用いて、該表面に各種の化学的および生物学的化合物種を結合させる。

しかし、多くのバイオセンサー用途において、ＤＮＡ、炭水化物またはタンパク質のようなバイオ分子の固定には、二酸化ケイ素基体上のシランカップリング化学が使用されており、それらの分子の相補的アナライト（分析物）との相互作用が蛍光手法を用いて検出されている。しかし、金チップ上で蛍光とＳＰＲとを組み合わせる（併用する）ことは、金基体上では蛍光シグナルが完全に消光するために実現することができなかった。

表面反応の監視のためのＳＰＲ分光法とＳｉＯ_ｘに対して開発されたカップリング化学とを利用するために、チップの貴金属をＳｉＯ_ｘ薄膜で被覆することができる。金層を二酸化ケイ素薄膜で被覆してなるＳＰＲチップを開発するための従来の試みは既に文献に報告されている。シリカ（ＳｉＯ_ｘ）薄膜は減圧またはゾル−ゲル法を用いて成膜されてきた（非特許文献１６）。この文献の著者は、蒸着シリカ層はＰＢＳのような水性緩衝液中では不安定であることを知見した。シリカ層は水溶液中では露出から数分以内に金属表面から剥がれる。しかし、ゾル−ゲル法を用いて安定なＡｕ／ＳｉＯ_ｘ界面をうまく作製することができた。この方法は、金属表面上での３−メルカプトプロピルトリメトキシシランの自己集合とその後のトリメチルシリル基の加水分解によってスピナー上で堆積させたテトラメトキシシランの縮合反応に必要な表面シラノール基を形成することに基づいていた。

複合Ａｕ／ＳｉＯ_ｘ薄膜はLiaoらによりマルチターゲット（複数標的）マグネトロン・スパッタリングシステムにおいて作製され、この複合薄膜は透過ＳＰＲにより光学的に特性決定された（非特許文献１７）。さらに、γ−アミノプロピルエトキシシランを用いたＳＰＲチップの直接官能性化も文献に報告されている（非特許文献１８）。センサーチップをシラン蒸気に露出すると末端アミノ基が導入され、金表面に抗体が固定された。著者は、ＳＰＲ応答がシラン蒸気へのＳＰＲチップの露出時間に依存し、十分な応答レベルを達成するにはより長い露出時間が好ましいことを知見した。しかし、金表面とシラン多層との間の結合のタイプに関する記載は何もない（非特許文献１８）。Graneli及びKasemoは、金層と二酸化ケイ素層（ＳＰＲチップに対しては３０ｎｍ）との間に１ｎｍのチタン薄膜を形成することにより安定な層を得ることができることを報告した。彼らは、石英結晶の微量天秤とＳＰＲとを用いて担持リン脂質層の生成について検討した（非特許文献１９〜２２）。この場合、１ｎｍのチタン接着層が必要であり、二酸化ケイ素薄膜は電子線蒸着により成膜された。
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よって、上記からみて、科学分野に有益でシランカップリング化学とＳＰＲ分光法とを結びつけることができる、固体担体またはＳＰＲチップ上に安定なシリカ薄膜を成膜するための単純で大規模に実施可能な製作技術が求められている。

これがまさしく本発明の目的である。
本発明者らは、プラズマ増強化学蒸着（ＰＥＣＶＤ）法を用いて、ＳＰＲチップ上に制御された厚みでシリカ誘電体薄膜を再現可能に成膜できることを見出した。さらに、予想外なことに、本発明者らは、こうして得られシリカ被覆ＳＰＲチップは、約７ｎｍのシリカ膜厚で、裸の金表面から得られたシグナルに比べて、類似の反射率強度とやや強いピークとを示すことも見出した。本発明のシリカ層は有機溶液中と水性溶液中の両方で、また８０℃のピラニア溶液中でも非常に安定であり、ピラニア溶液はシランカップリング化学に適した表面シラノール基を生じさせるのに最終的に必要となる。

かくして、以下に説明する本発明の方法により製造された、均一厚みの安定なＳｉＯ_ｘ層で被覆された金属層の薄膜を有する固体担体は、ＳＰＲ検出に適合しているようであり、対象となる標的分子の共有結合による界面グラフト化を可能にし、或いは拘束リン脂質バイレイヤー用の担体として使用することができる。

よって、本発明は、厚みが均一で安定なＳｉＯ_ｘ層が上層として成膜されている金属層によって被覆された固体担体であって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による顕著な応答（反応）を示すか、および／または該担体の表面に存在する標的化合物に特異的に結合することができる化合物の存在のＳＰＲ判定を可能にする固体担体を製造する方法において、前記ＳｉＯ_ｘ層がプラズマ増強化学蒸着（ＰＥＣＶＤ）法により成膜されたものであることを特徴とする方法に関する。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による顕著な応答とは、ここでは、上層としてＳｉＯ_ｘ層が成膜されている金属層により被覆された本発明の固体担体がＳＰＲの研究においてセンサーとして使用可能であることを意味すると解される。

１好適態様において、本発明の製造方法に係る前記金属層は、金または銀の層から選ばれ、金の層が最も好ましい。
別の好適態様において、本発明に係る製造方法は、ＰＥＣＶＤ法により成膜された前記ＳｉＯ_ｘ層の厚みが５〜８０ｎｍ、好ましくは５ｎｍ以上、４０ｎｍ以下であるか、または５ｎｍ以上、２０ｎｍ以下であり、最も好ましくは７ｎｍ±１.５ｎｍであることを特徴とする。

さらに別の好適態様において、本発明に係る製造方法は、前記金属層の厚みが約５０ｎｍであることを特徴とする。
特定の１態様において、本発明に係る製造方法は、前記金属層が、ＰＥＣＶＤ法によるＳｉＯ_ｘ層の成膜の前に金または銀粒子により被覆されることを特徴とする。

さらに別の好適態様において、本発明に係る製造方法は、前記固体担体が、前記金属層で被覆される前に、好ましくは厚みが約５ｎｍ（５ｎｍ±１.５ｎｍ）であるチタン層によってまず被覆されることを特徴とする。

さらに別の好適態様において、本発明に係る製造方法は、ＰＥＣＶＤ法で使用されるガス混合物がＳｉＨ_４（好ましくはＮ₂中３％濃度）／Ｎ_２Ｏ混合物であり、好ましくはそれぞれの流量が２６０ｃｍ^３／ｍｉｎおよび７００ｃｍ^３／ｍｉｎであって、好ましくは基体温度が３００℃であることを特徴とする。

さらに別の好適態様において、本発明に係る製造方法は、担体上にＰＥＣＶＤ法により成膜された前記ＳｉＯ_ｘ層が約４１４Å／ｍｉｎの速度で成膜されることを特徴とする。
さらに別の好適態様において、本発明に係る製造方法は、担体上のＰＥＣＶＤ法によるＳｉＯ_ｘ層の成膜が反応器内の全圧が１トル（Torr）および１３.５６ＭＨｚで１０Ｗの電力で実施されることを特徴とする。

さらに別の好適態様において、本発明に係る製造方法は、ＰＥＣＶＤ法により成膜されたＳｉＯ_ｘ層の屈折率が、１.４５〜１.４８の間、好ましくは１.４５、１.４６５および１.４８の屈折率よりなる群から選ばれることを特徴とする。

特定の１態様において、本発明に係る製造方法は、ＰＥＣＶＤ法により成膜された前記ＳｉＯ_ｘ層の上に、好ましくは金または銀からなる、第２の金属薄膜を成膜する追加工程を含み、この第２の金属薄膜は、ＳｉＯ_ｘ層に金属ナノ粒子の薄膜を形成するように蒸着されることを特徴とする。この第２の金属薄膜は、好ましくは５ｎｍより小さい厚みを有する（図４Ａおよび４Ｂを参照）。

特定の１態様において、本発明に係る製造方法は、ＰＥＣＶＤ法により成膜されたＳｉＯ_ｘ層が、該金属薄膜により被覆された担体表面の一部のみに、好ましくはＳＰＲ撮像に適した幾何学形状に従って成膜されていることを特徴とする。この特定の態様において、成膜は、例えば、予定した幾何学形状に適合したマスクを用いて実施される。図５はＳＰＲ撮像に適した幾何学形状の１例を示す。

本発明に係る製造方法において、前記担体は好ましくは透明固体担体、特にガラスである。
本発明の別の側面によると、本発明は、本発明に係る方法により得ることができるＳｉＯ_ｘ層被覆担体に関し、この担体は、該担体上に成膜されたＳｉＯ_ｘ層の厚みが均一であり、かつ成膜されたＳｉＯ_ｘ層の厚みおよび／またはＳＰＲ応答が８０℃でのピラニア溶液（硫酸／３０％過酸化水素水の３／１の比率での混合液）による担体の処理後も著しく変化しないことを特徴とする。

本発明はまた、前記担体の屈折率が約１.４８（１.４８±０.４）、好ましくは１.４５〜１.４８の間、好ましくは１.４５、１.４６５および１.４８から選ばれ、１.４８が最も好ましい屈折率値であることを特徴とする、本発明に係る担体または本発明に係る方法により得られた担体に関する。

１好適態様において、本発明に係る担体は、ＳｉＯ_ｘ層が成膜された後に、対象の標的分子との結合（共有結合または非共有結合、好ましくは共有結合）を形成することができる反応性の基を担体上に生ずるように処理されていることを特徴とする。

非共有結合とは、ここでは、イオン結合、水素結合、ファンデルファールス力または疎水性結合を意味すると解される。
好ましくは、前記の予定される反応性の基は、特にピラニア溶液で処理することにより生ずるＳｉ−ＯＨ基である。

本発明はまた、ＳｉＯ_ｘ層が有機シラン化合物の結合を可能にするように処理されていることを特徴とする、本発明に係る担体または本発明に係る方法により得られた担体に関する。

本発明はまた、その上にＳｉＯ_ｘ層が成膜された担体の表面が、有機シラン型の官能基、好ましくは３−アミノプロピルトリメトキシシランおよびＮ−(２−アミノエチル)−３−アミノプロピルトリメトキシシランのようなアミノシラン型またはチオシラン型、好ましくは(３−メルカプトプロピル)トリメトキシシランのようなメルカプトシラン型の官能基を有することを特徴とする、本発明に係る担体または本発明に係る方法により得られた担体に関する。

このようなシラノールＳｉ−ＯＨ基によりガラススライドを官能性化するプロトコルを説明する文献として、２００３年８月２１日に発行された国際特許出願公開ＷＯ０３／０６８７１２を挙げることができる。

本発明はまた、前記標的化合物が前記担体に共有結合により結合されていることを特徴とする、本発明に係る担体または本発明に係る方法により得られた担体に関する。
好ましくは、この標的化合物はポリペプチド、核酸または炭水化物である。

本発明において、ポリペプチドとは、天然または非天然、Ｌ型またはＤ型のアミノ酸配列からなるペプチドを含む任意の化合物を意味すると解され、このペプチド化合物は特に、ペプチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、リポペプチドまたはグリコペプチドから選択される。

本発明において、ポリペプチドはタンパク質またはペプチド（これらは区別されずに使用される）を意味すると解される。
核酸は、非天然ヌクレオチドを含んでいても含んでいなくてもよい核酸断片または領域の定義を可能にする、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのような該ＤＮＡの転写産物に対応する、修飾されていてもされていなくてもよい特定のヌクレオチド鎖を意味すると解される。

本発明の別の側面によると、本発明は、２種類の化合物間の結合をＳＰＲおよび／または蛍光を用いて判定または分析するための本発明に係る担体または本発明に係る方法により得られた担体の使用に関する。

本発明に係るシリカ被覆担体またはＳＰＲチップは、裸の金表面の担体で得られるシグナルに匹敵する顕著なＳＰＲ応答を示す。さらに、シリカ層によって、裸の金表面では観察される蛍光の消光が効果的に減少するようになる。従って、前記担体を用いると、蛍光とＳＰＲ分光とを組み合わせることができる。

本発明の別の側面によると、本発明は、少なくとも２種類の化合物間の反応をＳＰＲを用いて判定または監視するための本発明に係る担体または本発明に係る方法により得られた担体の使用に関する。

本発明の別の側面によると、本発明は、サンプル中の核酸、ポリペプチド、炭水化物、リポソーム、小胞または細胞の検出のための、好ましくはサンプル中の核酸、ポリペプチドまたは炭水化物の検出のための、本発明に係る担体または本発明に係る方法により得られた担体の使用に関する。

本発明の使用方法は有利には、その上で検出すべき核酸が該担体の表面上に存在しているプローブ（標的化合物）に特異的にハイブリダイズするか、検出すべきポリペプチドまたは炭水化物が該担体の表面上に存在している標的化合物に特異的に結合するか、または吸着される本発明に係る担体を用いて行われ、核酸、ポリペプチドまたは炭水化物の存在は、ＳＰＲ（例えば、Biacoreシステムを参照）によって判定される。同じ方法が、本発明に係る前記担体の表面に存在する標的化合物に対する特異的な親和性を示す対象化合物の存在の判定にも使用することができる。

ポリペプチド型の標的化合物の場合、例えば、特異的にこのポリペプチドを認識することができるか、および／またはそれに結合するか、吸着されることができる（例えば、抗体−抗原型結合、リガンド−レセプター型結合または酵素−基質型結合などにより）サンプル中の対象化合物の存在を判定しようと試みることができよう。当業者であれば、実施しようとする特定の相互作用の種類に対する周知の標準的な条件およびプロトコルの使用方法について承知していよう。

本発明の別の側面によると、本発明は、下記工程を含むことを特徴とする、標的化合物に特異的に結合するか、または吸着されることができる化合物のサンプル中の存在または量を決定する方法に関する：
ａ）その上に標的化合物が好ましくは共有結合により結合されている、本発明に係る担体または本発明に係る方法により得られた担体を調製する工程；
ｂ）工程ａ）で得られた前記担体を、前記標的化合物に特異的に結合するか、吸着されることができる化合物を含有すると予測される前記サンプルと、前記標的化合物とサンプル中のその存在またはその量を決定しようとしている化合物との間の特異的複合体の生成に適した条件下で接触させる工程；
ｃ）必要であれば、前記標的化合物に特異的に結合または吸着されなかった化合物を除去するための少なくとも１回の洗浄工程；および
ｄ）表面プラズモン共鳴と呼ばれる方法を用いてサンプル中の前記化合物の存在または量を決定する工程。

本発明の別の側面によると、本発明は、本発明に係る担体または本発明に係る方法により得られた担体を含んでいることを特徴とする、表面プラズモン共鳴および／または蛍光を用いてサンプル中の化合物の存在または量を決定するためのキットに関する。

本発明の別の側面によると、本発明は、下記工程を含むことを特徴とする、所定の標的化合物に特異的に結合するか、吸着されることができる化合物のスクリーニング方法にも関する：
ａ）前記被試験化合物と、本発明に係る担体または本発明に係る方法により得られた担体とを、その上に標的化合物が好ましくは共有結合によって結合されている担体に前記被試験化合物が特異的に結合するか、吸着されるのに適した条件下で接触させる工程；
ｂ）前記標的化合物に特異的に結合または吸着しなかった被試験化合物を適当な条件下で少なくとも１回の洗浄工程により除去する工程；および
ｃ）担体上で表面プラズモン共鳴による前記化合物の存在の検出の有無により被試験化合物を選択する工程。

最後に、本発明は、その上にＳｉＯ_ｘ層がＰＥＣＶＤ法により、特に上述し、もしくは以下の実施例に述べるような厚みおよび／もしくは均一性および／もしくは安定性および／もしくは屈折率特性を持って成膜されている本発明に係る担体を含む、診断または分析機器または装置、或いは本発明に係る方法により得られた担体を含む診断または分析機器または装置に関する。

以下の添付図面の説明および実施例は、本発明を例示する意図であり、いかなる意味でも本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１：材料と方法
１）材料
清浄化（洗浄）および酸洗用試薬はすべて半導体用品質のものである。全ての化学薬品は試薬級以上の品質のものであり、特に言及しない限り、受け入れ時のまま使用した。

−Ｃ₁₀Ｈ₄Ｆ₁₇Ｃｌ₃Ｓｉ：供給元：Gelest Inc.（米国ペンシルベニア州、モリスビル、イー・スチール・ロード11）;
−イソプロパノール、アセトン：供給元：Aldrich（他の精製を何もせずに使用）；
−過酸化水素水および硫酸：半導体品質のもの。

２）金スライドの調製
金スライドは、グルノーブルのＣＥＡ社からのPROMESSプラットフォーム上で、清浄化したガラススライド（７６×２６×１ｍｍ³、λ＝６３３ｎｍでのｎ＝１.５８、仏国、ＣＭＬ社製）の上に５ｎｍのチタンと５０ｎｍの金を蒸着することにより調製した。

３）金−ＳｉＯ_ｘ複合スライドの調製
シリコン皮膜を成膜する前に、金サンプルはいずれも室温の超音波浴中にてイソプロパノールおよびアセトンで脱脂した後、十分な量のMilli-Q水（Milli-Q装置で精製した純水）ですすぎ、Ｎフラックス（窒素気流）下で乾燥した。金スライドを次いで０.００５トルの圧力で３００℃のプラズマ・チャンバー内で１時間乾燥した。ＳｉＯ_ｘ層は、ＰＥＣＶＤ用装置Plasmalab 800Plus (Oxford Instruments社)内でプラズマにより刺激された気相中での蒸着により合成した。

使用した成膜条件は次の通りであった：
基体温度＝３００℃、
ガス混合物＝ＳｉＨ₄（Ｎ₂中３％）およびＮ₂Ｏ（ガス流量はＳｉＨ₄およびＮ₂Ｏについてそれぞれ２６０ｓｃｃｍおよび７００ｓｃｃｍ）、
反応器内の全圧＝１トル、
電力＝１３.５６ＭＨｚに対して１０Ｗ。

実験条件下で、成膜速度は４１４Å／分であり、シリコン皮膜の屈折率は１.４８であった。シリコン皮膜の厚みは成膜時間の変動により調整した。
４）安定性試験
シリコン層で被覆された金サンプルを、まず順にイソプロパノール、アセトンおよび脱イオン水中での超音波処理により室温で洗浄した後、濃硫酸／３０％過酸化水素水の３：１（ｖ／ｖ）混合液中に１５分間浸漬し、その後Milli-Q水で十分にすすいだ。得られたサンプルを窒素気流下で乾燥した。

ピラニア溶液は上記有機物と激しく反応する。従って、その取り扱いは極めて慎重にすべきであり、事後に脱イオン水による十分なすすぎを行う。
５）ＳＰＲ測定
表面プラズモン共鳴用装置は、電気化学的測定とＳＰＲとの同時測定が可能な、ESPRIT Autolab (オランダ国、ユトレヒト、Autolab社製)であった。本実験ではＳＰＲ部分のみを使用した。

６）ＡＦＭ測定
ナノスコープIVコントローラ（ディジタル装置）を備えたDimension 3100システムAFMモデル（米国カリフォルニア州サンタバーバラ、Veeco社製）を用いて、サンプルを室温条件下で室温にて映像化した。単一ビーム・シリコン・カンチレバー（片持ち梁）（AFM-TM Arrow、Nanoworld社製）を約４２Ｎ／ｍのばね定数および約２５０ｋＨｚの共鳴周波数で使用した。すべてのＡＦＭ（原子間力顕微鏡、Atomic Force Microscopy）画像は５〜５０ｐＮの一定の原子間力での動作モードで撮像された。

７）エリプソメトリー（楕円偏光法）
デルタプシー２データ解析ソフトウェアを備えたJobin Yvon Horiba分光エリプソメータ（膜厚計）UVISELを用いて、分光エリプソメトリーデータを可視範囲で得た。このシステムは、２〜４.５ｅＶ（３００〜７５０ｎｍに相当）のスペクトルを０.０５ｅＶ（即ち、７.５ｎｍ）の間隔で獲得した。データは、入射角度７０°を用いて取得し、補償板は４５.０°にセットした。データは、その厚みと複屈折率により既述されるある基体上でのモデル薄膜についての回帰分析を用いて適合化（順応）させた。表１および２に示す得られた値は、表面の異なる地点で求めた５回の測定値の平均である。

８）接触角の測定
水の接触角を脱イオン水を用いて測定した。遠隔コンピュータにより制御される角度測定システム（DIGIDROP、仏国ＧＢＸ社製）を用いて接触角を測定した。精度は±２°である。すべての測定を室温の周囲条件下で行った。

実施例２：結果
ここで検討したシリコン薄膜は、３００℃のプラズマ反応器内でＳｉＨ₄とＮ₂Ｏとのガス混合物の化学分解を利用してＳＰＲチップ表面に成膜されたものである。実験条件下で、成膜された薄膜の屈折率は１.４８であり、成膜速度は４１４Å／分であった。薄膜の厚みは反応時間により制御した。１０、３０、６０、７５および１２０秒後に成膜された薄膜のエリプソメトリー測定の結果、それぞれ７.５、２０、４４、５１および６３ｎｍの膜厚値が得られた（表１を参照）。

厚みが４４ｎｍより大きなＳｉＯ_ｘ層は顕著なＳＰＲ応答を示さないのでここでは検討しなかった。次いで、ＳＰＲチップのシリコン被覆前および被覆後のトポグラフィー（立体形状）を検査した。図１Ａは清浄化された金表面のタッピングモードでのＡＦＭを示す。この表面は平均粒度が４０ｎｍの結晶粒からなり、表面粗さは１.８ｎｍ未満であることが判明した。この表面上へのシリコン薄膜の化学的蒸着は表面の立体形状の変化を生じなかった。ＳｉＯ_ｘ薄膜（厚み７.５ｎｍ）で被覆された表面のＡＦＭ画像は、元の表面に類似の特性と同じ粗さを示す（図１Ｂ）。

ＳＰＲには、界面相互作用の評価方式が２種類ある。走査モードでは、光ビームの入射角度に基づく反射光の強度変化が検出される。臨界角度および共鳴角度は試験される系に固有であり、誘電性環境の屈折率の変化が共鳴角度のより高い角度へのシフトを生ずる。

図２は、金で被覆されたガラススライド上に異なる膜厚（７.５ｎｍ，２０ｎｍ，４４ｎｍ）の二酸化ケイ素の層が成膜された後の共鳴角度のシフトを実証している。すべての実験において水を溶媒として使用する場合には臨界角度は変化しない（実験データを示さず）のに対し、最小表面プラズモンが介在すると、ＳｉＯ_ｘ厚みの増大に伴ってそれがより大きな角度にシフトする：６６.０３（０ｎｍ）、６６.１９°（７.５ｎｍ）、６６.４５（２０ｎｍ）、６６.９６（４４ｎｍ）。ＳｉＯ_ｘ厚みが６０ｎｍより大きい二酸化ケイ素−金の界面は、検出可能な角度が検出限界の外側にあるため、Autolab社製のＳＰＲ装置ESPRITを用いた場合には屈折率１.５８のガラスプリズム上に最小ＳＰＲ信号を示さなかった。共鳴角度の変化に加えて、最小共鳴強度も０.０４８（０ｎｍ）からそれぞれ０.０５３（７.５ｎｍ）、０.０５９（２０ｎｍ）、および０.０８０（４４ｎｍ）に低減した。これらはそれぞれ強度線量（intensity dose）０.５％、１.１％、３.２％に相当する。

実験曲線は理論ＳＰＲ曲線に適合化（順応）させた。また、対応する厚みを、下記パラメータを用いて求めた：ｎ（プリズム）＝１.５８、ｎ（金）＝０.１９７＋ｉ３.４４２（ｄ＝５３０ｎｍで）、ｎ（チタン）＝２.３６＋ｉ３.１１２（ｄ＝６０ｎｍで）、ｎ（ＳｉＯ_ｘ）＝１.４８。

ＳＰＲ実験の結果は、空気中でのエリプソメトリーによる測定から得られた値（７.５、２０、４４.２ｎｍ）（表１）に匹敵している。Ａｕ／ＳｉＯ_ｘ界面で多くの地点を測定したところ、それぞれｄ＝７.５１；２０.００；４４.２；６２.９５の平均値が得られた。

金上の二酸化ケイ素薄膜の安定性：
ＳＰＲチップと表面官能化に適合性のある基体（プラットフォーム）を提供することに加えて、シリコン薄膜は長期研究に有用ないくつかの化学処理の担体となるべきである。従って、シリコン薄膜で被覆された金スライドをイソプロパノール（室温で５分間）、アセトン（室温で５分間）、および脱イオン水（室温で５分間）超音波洗浄した。得られた表面のエリプソメトリー分析は、シリコン薄膜の厚みの顕著な変化を示さなかった。表面の厚みの４％の減少が認められただけであった（表１を参照）。この分析はエリプソメトリーおよびＳＰＲにより測定された厚みを実証し、薄膜安定性を確認する。これは、界面が清浄化された場合にもあてはまる。

また、ＳｉＯ_ｘで被覆されたＳＰＲチップは、ピラニア溶液（Ｈ₂ＳＯ₄/Ｈ₂Ｏ₂＝３／１（ｖ／ｖ））中で１５分間処理後も安定であることが実証された。この場合も、表面の厚みの減少は４％未満しか認められなかった（表１および２を参照）。これは、表面上の吸着質または汚染物が除去されるためであるかもしれない。ピラニア溶液は表面上の有機吸着質を分解することが知られている。エリプソメトリー法の結果はＳＰＲ分光法により確認された。

表面官能化：
ＳｉＯ_ｘ薄膜で被覆されたＳＰＲチップの化学反応性を検査した。厚み７ｎｍのシリコン薄膜で被覆された表面をまずピラニア溶液で清浄化し、得られた表面を１０−２Ｍパーフルオロアルキルシランの溶液中に室温で２時間浸漬処理した。この反応の後に接触角の測定を行った。

最初のガラス製ＳＰＲチップ上の金層は、水の接触角が７４°の疎水性を示した。シリコンを成膜しピラニア溶液で処理すると、表面の湿潤性は疎水性から親水性に変化した。この酸化表面は水の接触角が１５°未満（ガラスに似ている）を示した。オルガノシラン（有機シラン）を化学結合させると、接触角は１１４°に増大した。これは、表面でのシラン分子の化学的固定と符号する。この処理は、厚みまたはＳＰＲ応答における変化を引き起こさないことがわかった。処理によってトリクロロパーフルオロシランの結合に使用されたＳｉ−ＯＨ基がかなりの量に達したためである。我々が知る限り、これは、熱的に調製された金層上のシリコン薄膜におけるこのような安定性を実証した最初の例である。

ピラニア溶液処理によって、オルガノシランの化学結合に必要な試薬である表面シラノール基が生成した。この特性によって、複雑な構造を作り上げ、周知のオルガノシラン類の表面化学を利用して表面に官能基を導入するために表面化学を有効利用することが可能となる。

結論：
本発明により、ＰＥＣＶＤ法を利用して、金属、特に金の表面に厚みが７〜１００ｎｍの範囲内の安定なシリコン薄膜を成膜することができる。この薄膜は腐食性環境中、例えば、有機溶液および水溶液中での超音波処理、ならびに８０℃のピラニア溶液中、において安定である。ピラニア溶液による処理はシランへの化学結合に必要な表面Ｓｉ−ＯＨ基の生成を生じた。シリコン薄膜で被覆されたＳＰＲチップは、裸の金表面から得られたシグナルに匹敵しうる高いＳＰＲ応答を示すことが実証された。

このシリコン層は、裸の金基体上において認められる蛍光阻害の低減に効果的であることが判明している。この結果は、蛍光分光法とＳＰＲとの併用を可能にし、従って、微小流体およびバイオチップをはじめとする多様な領域における潜在的応用をもつ表面上の生物学的分子の事象の検出および画像化に対して新たな機会を切り開くものである。

上記実施例は、５ｎｍのチタンの接着層と５０ｎｍの金層とで被覆されたガラススライド上にプラズマ増強蒸着（ＰＥＣＶＤ）法を用いて成膜された、安定なナノメーター・オーダーの膜厚の非晶質シリコン（ＳｉＯ_ｘ）皮膜の製造と特性決定を実証した。得られた表面は、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、エリプソメトリー、接触角および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定を用いて特性決定された。ＡＦＭ分析は、金表面上に粗さの小さい均一なシリコン薄膜が生成したことを示した。成膜されたシリコン薄膜は異なる溶媒中およびピラニア溶液中で優れた安定性を示した。これらの過酷な処理後に膜厚およびＳＰＲシグナルの顕著な変化は認められなかった。少なくとも４０ｎｍまでの膜厚のシリコン薄膜は、表面プラズモン作用による可視化を可能にした。ＳＰＲ分析はまた、エリプソメトリーによる結果に匹敵するシリコン薄膜の膜厚測定を可能にした。疎水性の金表面および親水性のＡｕ／ＳｉＯ_ｘ薄膜とでは接触角が変化した。ピラニア溶液による化学処理によって、トリクロロシラン化合物に結合するシラノール基含有表面を生じた。

タッピングモードでの金表面のＡＦＭトポグラフ画像である。Ａｕ／ＳｉＯ_ｘ（ｄ＝７.５ｎｍ）表面のＡＦＭトポグラフ画像である。ガラス上の厚み５０ｎｍの金層上に５ｎｍのチタン接着層により異なる厚みで成膜したＳｉＯ_ｘへの入射角度に対する屈折率曲線。点線は実験結果であり、実線は順応曲線。０ｎｍ（■）、７.５ｎｍ（○）、２０ｎｍ（●）、４０ｎｍ（□）。ガラス上の厚み５０ｎｍの金層上に５ｎｍのチタン接着層によって７.５ｎｍのＳｉＯ_ｘを堆積させた時のＡｕ／ＳｉＯ_ｘ界面への入射角度に対する屈折率曲線。実線は金層上の７.５ｎｍのＳｉＯ_ｘに対して順応させた曲線である。■は成膜後の界面であり、○は８０℃のピラニア溶液で１５分間の処理を２回行った後の同じ表面である。ガラス上の厚み５０ｎｍの金層上に堆積させたＳｉＯ_ｘ薄膜の上に金または銀のナノ粒子を蒸着した担体を表す三次元図。ＰＥＣＶＤ法により厚さ１０ｎｍのＳｉＯ_ｘ層で被覆され、その上に金の薄層が蒸着された担体の表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）から得られた画像。ＳＰＲによる撮像に適合させた幾何学形状を有する、金層上に成膜されたＳｉＯ_ｘ薄膜により被覆された担体のモデル。

Claims

下記工程を含む担体の製造方法：
ａ）実質的に透明な固体担体を金属層で被覆する工程、
ｂ）前記金属層上に、厚み７ｎｍ±１．５ｎｍの均一で安定した厚みのＳｉＯ_ｘ層をプラズマ増強化学蒸着（ＰＥＣＶＤ）法により成膜する工程、および
ｃ）前記担体上のＳｉＯ_ｘ層に、有機シラン化合物への共有結合による界面グラフト化を可能にする処理を施し、得られた担体が、この担体の表面に存在する標的化合物に特異的に結合することができる化合物の存在を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により判定することを可能にする工程。
前記金属層が金または銀の層から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
前記金属層が金層であることを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。
前記金属層の厚みが約５０ｎｍであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
前記金属層が、ＰＥＣＶＤ法によるＳｉＯ_ｘ層の成膜の前に金または銀粒子により被覆されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
前記固体担体が、前記金属層で被覆される前に、チタン層によってまず被覆されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
ＰＥＣＶＤ法で使用されるガス混合物がＳｉＨ_４とＮ_２Ｏとの混合物であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
担体上にＰＥＣＶＤ法により成膜された前記ＳｉＯ_ｘ層が約４１４Å／ｍｉｎの速度で作製されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
担体上にＰＥＣＶＤ法により成膜された前記ＳｉＯ_ｘ層が、反応器内の全圧が１Ｔおよ
び電力が１３．５６ＭＨｚで１０Ｗの条件で作製されたものであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
ＰＥＣＶＤ法により成膜された前記ＳｉＯ_ｘ層の屈折率が１．４５〜１．４８の範囲内であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
前記ＳｉＯ_ｘ層（ＰＥＣＶＤ法により成膜された）の上に、第２の金属薄膜を成膜する追加工程を含み、この第２の金属薄膜は前記ＳｉＯ_ｘ層上に金属ナノ粒子を形成するように蒸着されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
前記第２の金属薄膜の膜厚が５ｎｍ未満であることを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
ＰＥＣＶＤ法により成膜された前記ＳｉＯ_ｘ層が、該金属層により被覆された担体表面の一部のみに成膜されていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
前記担体が固体透明担体であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の製造方法。
前記担体がガラス製であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の製造方法。
前記担体上に成膜されたＳｉＯ_ｘ層の厚みが均一であり、かつ成膜されたＳｉＯ_ｘ層の厚みおよび／またはＳＰＲ応答が８０℃でのピラニア溶液（硫酸／３０％過酸化水素水の３／１の比率での混合液）による担体の処理後も変化しないことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により得ることができるか、または該方法により得られた、ＳｉＯ_ｘ層で被覆された担体。
前記担体の屈折率が約１.４８であることを特徴とする、請求項１６に記載の担体。
成膜されたＳｉＯ_ｘ層がＳｉ−ＯＨ基を生成させるために成膜後に処理されていることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の担体。
成膜されたＳｉＯ_ｘ層がピラニア溶液により処理されていることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の担体。
その上にＳｉＯ_ｘ層が成膜される前記担体表面が有機シラン型の官能基を有することを特徴とする、請求項１６〜１９のいずれかに記載の担体または請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により得られた担体。
その上にＳｉＯ_ｘ層が成膜される前記担体表面が３−アミノプロピルトリメトキシシランおよびＮ−(２−アミノエチル)−３−アミノプロピルトリメトキシシランのようなアミノシラン型の官能基を有することを特徴とする、請求項２０に記載の担体。
その上にＳｉＯ_ｘ層が成膜される前記担体表面がチオシラン型の官能基を有することを特徴とする、請求項２０に記載の担体。
前記標的化合物が前記担体に共有結合により結合されていることを特徴とする、請求項１６〜２２のいずれかに記載の担体または請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により
得られた担体。
前記標的化合物がポリペプチド、核酸または炭水化物であることを特徴とする、請求項１６〜２３のいずれかに記載の担体または請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により得られた担体。
少なくとも２種類の化合物間の反応のＳＰＲおよび／または蛍光による判定または追跡のための請求項１６〜２４のいずれかに記載の担体または請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により得られた担体の使用。
少なくとも２種類の化合物間の反応のＳＰＲによる判定または追跡のための請求項１６〜２４のいずれかに記載の担体または請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により得られた担体の使用。
サンプル中の核酸、ポリペプチド、炭水化物、リポソーム、小胞または細胞の検出のための請求項１６〜２４のいずれかに記載の担体または請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により得られた担体の使用。
サンプル中の核酸またはポリペプチドの検出のための請求項１６〜２４のいずれかに記載の担体または請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により得られた担体の使用。
下記工程を含むことを特徴とする、請求項１６〜２４のいずれかに記載の担体または請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により得られた担体を使用する方法：
ａ）前記担体を、前記標的化合物に特異的に結合するか、吸着されることができる化合物を含有する可能性のあるサンプルと、前記標的化合物とサンプル中のその存在またはその量を決定しようとしている前記化合物との間の特異的複合体の生成に適した条件下で接触させる工程；
ｂ）適当であれば、前記標的化合物に特異的に結合または吸着されなかった化合物を除去するための少なくとも１回の洗浄工程；および
ｃ）表面プラズモン共鳴と呼ばれる方法によりサンプル中の前記化合物の存在または量を決定する工程。
請求項１６〜２４のいずれかに記載の担体または請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により得られた担体を含んでいることを特徴とする、表面プラズモン共鳴および／または蛍光を用いてサンプル中の化合物の存在または量を決定するためのキット。
下記段階を含むことを特徴とする、所定の標的化合物に特異的に結合するか、吸着されることができる化合物をスクリーニングする方法：
ａ）前記被試験化合物と、請求項１６〜２４のいずれかに記載の担体または請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により得られた担体とを、その上に標的化合物が結合されている該担体への前記被試験化合物の特異的結合を可能する条件下で接触させる；
ｂ）前記標的化合物に特異的に結合または吸着しなかった被試験化合物を適当な条件下での少なくとも１回の洗浄工程により除去する；および
ｃ）担体上の表面プラズモン共鳴による前記化合物の存在の検出の有無により試験化合物を選択する。
請求項１６〜２４のいずれかに記載の担体または請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により得られた担体を含む、診断または分析機器または装置。