JP5615184B2 - 皮膚病の治療におけるセリンプロテアーゼ阻害剤の使用 - Google Patents

Description

本発明は、セリンプロテアーゼ阻害剤として作用する治療化合物、その医薬組成物並びにヒト又は動物の体の治療におけるそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、投与を必要とする被投与者に治療有効量のセリンプロテアーゼ阻害剤を投与することを含む、皮膚病の治療、診断又は予後のための方法に関する。

プロテアーゼ（タンパク分解酵素）は、細菌やウイルス並びに哺乳動物を含む有機体に必須である。プロテアーゼは、ペプチド結合を加水分解することによってタンパク質を消化・分解する。セリンプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１）は、活性部位、主として活性セリン残基に共通な特徴を有する。触媒残基Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒの同一の空間配列を有するが、タンパク質骨格が全く異なる、キモトリプシン／トリプシン／エラスターゼ様セリンプロテアーゼ及びスブチリシン様セリンプロテアーゼという２種類の主要なセリンプロテアーゼが知られている。ただし，２０種類を超えるセリンプロテアーゼファミリー（Ｓ１〜Ｓ２７）が同定されており、それらは構造類似性及びその他の機能的証拠（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＥ、ＳＦ、ＳＧ）に基づいて６つの族（ｃｌａｎ）に分類される。キモトリプシン／トリプシン／エラスターゼ様セリンプロテアーゼファミリーは２種類に細分される。大型の種類（約２３０残基）は、通常はトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、トロンビン等の哺乳動物酵素を含む。小型の種類（約１９０残基）は細菌酵素を含む。

触媒残基Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒは、基質のＣ末側において基質アミノ酸側鎖残基結合ポケット（Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’等）に隣接し、基質のＣ末側においてＳ１、Ｓ２、Ｓ３等に隣接する。この命名法は、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｌｄｉｎｇ，Ａｌａｎ Ｆｅｒｓｈｔ，１９９９（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ），４０−４３頁及びＢｒｉｋ ｅｔ ａｌ，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，１，５−１４頁に記載されている。キモトリプシン／トリプシン／エラスターゼ様セリンプロテアーゼは、Ｓ１ポケットに存在する残基によってさらに細分することができる（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｃａｒｌ Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｔｏｏｚｅ，１９９１（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ）２３１−２４１頁）。すなわち、トリプシン様プロテアーゼ（ＳｌポケットにおけるＧｌｙ−２２６、Ｓｅｒ−１８９、Ｇｌｙ−２１６）、トリプシン様プロテアーゼ（ＳｌポケットにおけるＧｌｙ−２２６、Ａｓｐ−１８９、Ｇｌｙ−２１６）及びエラスターゼ様プロテアーゼ（Ｓ１ポケットにおけるＶａｌ−２２６及びＴｈｒ−２１６）に細分される（残基の付番は標準キモトリプシン付番に対応）。トリプシン様セリンプロテアーゼは、Ｌｙｓ又はＡｒｇをＳ１ポケットに有する基質を選択する。

セリンプロテアーゼは、キモトリプシン付番法において１９５位置に存在する反応性Ｓｅｒ残基を特徴とする共通の触媒メカニズムを有する。セリンプロテアーゼの例としては、トリプシン、トリプターゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、トロンビン、プラスミン、カリクレイン、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）Ｃｌ、先体プロテアーゼ（ａｃｒｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ）、リソゾームプロテアーゼ、コクナーゼ、α−溶菌プロテアーゼ、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、セリンカルボキシペプチダーゼπ、スブチリシン、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、Ｖｉｌａ因子、ＩＸａ因子、Ｘａ因子が挙げられる。セリンプロテアーゼは長年にわたって広範囲に研究されており、様々な生理学的過程の調整に関与するために薬物標的として盛んに研究が行われている。

セリンプロテアーゼが関与する過程としては、凝固、フィブリン溶解、受精、発育、悪性腫瘍、神経筋パターニング（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）、炎症が挙げられる。セリンプロテアーゼは、循環プロテアーゼ及び組織内で活性化又は放出されるプロテアーゼを阻害することが知られている。また、セリンプロテアーゼ阻害剤は、粘着、マイグレーション、遊離基生成及びアポプトーシス等の重要な細胞過程を阻害することも知られている。さらに、動物実験によって、静脈内投与したセリンプロテアーゼ阻害剤、変異体又はセリンプロテアーゼ阻害剤を発現する細胞は組織損傷を防止することが示されている。

セリンプロテアーゼカリクレイン（ＫＬＫ）は、皮膚の通常の生理機能において重要な役割を果たす。ＫＬＫ５及びＫＬＫ７は角質層から分離・クローニングされ（Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｂｒａｔｔｓａｎｄ ａｎｄ Ｅｇｅｌｒｕｄ，１９９９）、角質デスモソーム（ＣＤＳＮ）、デスモグレイン１（ＤＳＧ１）及びデスモコリン１（ＤＳＣ１）の細胞外接着タンパク質のプロセッシングによる皮膚剥離に関与することが分かっている（Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｂｒａｔｔｓａｎｄ ａｎｄ Ｅｇｅｌｒｕｄ，１９９９）。ＫＬＫ５は３つの構成要素の全てを開裂させるが、ＫＬＫ７はＣＤＳＮ及びＤＳＣ１しか消化できない（Ｃａｕｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＩＨＣの研究も剥離におけるＫＬＫ７の役割を裏付けている（Ｓｏｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。生体外研究では、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４を含むタンパク質分解カスケードによるＫＬＫ７の潜在的活性化メカニズムが示されている（Ｂｒａｔｔｓａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００５）。また、異なる濃度のＫＬＫ１、６、８、１０、１１、１３がＳＣにおいて報告され（Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｂｏｒｇｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ＫＬＫ１、５、６、１４はＤＳＧ１プロセッシングによって皮膚剥離に関与すると考えられている（Ｂｏｒｇｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＫＬＫ１４はＳＣ層のトリプシン様タンパク分解活性の約半分に貢献するため、皮膚リモデリングに大きな役割を果たすと考えられている（Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＫＬＫ８は、皮膚剥離においてＤＳＧ１及びＣＤＳＮと重複する機能を有することが示唆されている（Ｋｉｓｈｉｂｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。カテリシジンペプチドの調節によるＫＬＫの皮膚抗菌作用も生体外及び生体内において明らかになっている（Ｙａｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

慢性皮膚炎、皮膚剥離症候群、乾癬、アトピー性皮膚炎、ネザートン症候群等の多くの皮膚病において、遺伝子過剰発現又は活性の調節不全によるＫＬＫのタンパク分解活性の不均衡が報告されている（Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００５ｂ；Ｄｅｓｃａｒｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｈａｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｅｋｈｏｌｍ ａｎｄ Ｅｇｅｌｒｕｄ，１９９９）。慢性皮膚炎、皮膚剥離症候群、乾癬、アトピー性皮膚炎、ネザートン症候群等の多くの皮膚病において、遺伝子過剰発現又は活性の調節不全によるＫＬＫのタンパク分解活性の不均衡が報告されている（Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００５ｂ；Ｄｅｓｃａｒｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｈａｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｅｋｈｏｌｍ ａｎｄ Ｅｇｅｌｒｕｄ，１９９９）。ネザートン症候群又は常染色体劣性皮膚病に罹患した患者は、ＬＥＫＴＩをコードするＳＰＩＮＫ５遺伝子のフレームシフト及びナンセンス突然変異を示し（Ｃｈａｖａｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｃｈａｖａｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓｐｒｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）、ＬＥＫＴＩはＫＬＫ５、６、７、１３、１４に対する活性を有するセリンプロテアーゼ阻害剤として作用する（Ｂｏｒｇｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｅｇｅｌｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｄｅｒａｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。そのような遺伝的欠損により、阻害ドメインのロスが生じる（Ｃｈａｖａｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓｐｒｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）。

また、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）の活性化を介した剥離型皮膚炎におけるカリクレインの関与も興味深い。ＰＡＲ１〜４は、カリクレインを含む様々なプロテアーゼによって活性化されるＧタンパク質結合レセプターである。ＰＡＲ２は特に興味深い。すなわち、ＰＡＲ２はトリプシン開裂によって活性化され、皮膚組織において組織カリクレインと共存するためである。アトピー性皮膚炎及びネザートン症候群の患者の皮膚病変では、ＰＡＲ２受容体は過剰表現され、ヒト組織カリクレインと共存することが分かっている（Ｄｅｓｃａｒｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）。これにより、ＫＬＫ−ＰＡＲ経路が疾患の病因論に関与し、ＫＬＫがＰＡＲ２活性化によって皮膚病の炎症を引き起こすという仮説が得られる。

Ｏｉｋｏｎｏｍｏｐｏｕｌｏｕら（２００６）の生体内外における研究は、ＰＡＲ活性はＫＬＫ５、６及び１４の標的となることを示している。ＫＬＫ５及びＫＬＫ６はＰＡＲ２を活性化するが、ＫＬＫ１４はＰＡＲ１を不活化し、ＰＡＲ２及びＰＡＲ４を活性化することが報告されている。また、異なる細胞におけるＫＬＫ１、２、４、５、６、１４によるＰＡＲ１又はＰＡＲ２の活性化が報告されている（Ｍｉｚｅ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｖａｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

ＰＡＲ２受容体は皮膚炎、細胞増殖、癌抑制、皮膚色素沈着、皮膚水分に関与することが示されており、皮膚科及び化粧品分野において研究が行われている。ＰＡＲ２受容体であるカリクレインの活性剤は、上述した皮膚過程の研究者から益々注目を浴びている。皮膚色素沈着、ＵＶ曝露及び皮膚水分に関する化粧品の成分として、天然の非変性大豆由来トリプシン阻害剤が使用されている。大豆種子及び豆乳は、ダイズトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）及びＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤（ＢＢＩ）をそれぞれ含む（Ｐａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。所期の効果は、ＰＡＲ２活性化を阻害するトリプシン阻害によって得られる。ＫＬＫ５及びＫＬＫ７は、ＵＶＢ照射下においてＬＥＫＴＩ発現の減少に付随して過剰表現することが分かっており、これらの皮膚カリクレインがＵＶＢストレス下において角質層剥離に作用することを示唆している（Ｎｉｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

ＳＴＩの局所投与によってＵＶＢに暴露されたマウスの癌の進行が停止しており、ＳＴＩはＵＶ光誘発皮膚癌を減少させることを示唆している（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）。カリクレイン阻害によって、天然大豆抽出物を含む製品がＰＡＲ２の活性化をブロックすることが示唆されている。ＳＴＩは、トリプシン様ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４を高い効率で阻害することが証明されている（Ｐａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。乾燥皮膚の上部ＳＣにおいてＫＬＫ５及びＫＬＫ７の発現が減少し、ＵＶ放射後にＫＬＫ活性が上昇することが報告されている（Ｖｏｅｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

セリンプロテアーゼ阻害剤は、腫瘍、神経、血液、肺、免疫、炎症、感染等の様々な疾患の分野における疾患の治療に有益に使用することができると予測されている。また、セリンプロテアーゼ阻害剤は、血栓症、喘息、肺気腫、肝臓硬変症、炎症性関節腫脹、癌、黒色腫、再狭窄、粉瘤、外傷、ショック、再潅流損傷の治療においても有用である可能性がある。Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ（２００２），１２（８）に有益な報告が記載されている。セリンプロテアーゼ阻害剤は、米国特許出願第２００３／０１０００８９号、米国特許出願第２００４／０１８０３７１号、米国特許第６，７８４，１８２号、米国特許第６，６５６，９１１号、米国特許第６，６５６，９１０号、米国特許第６，６０８，１７５号、米国特許第６，５３４，４９５号、米国特許第６，４７２，３９３号に開示されている。

接触過敏、アトピー性皮膚炎、希な遺伝子皮膚病（例えば、ネザートン症候群）、乾癬等の皮膚病は、超増殖性及び炎症性皮膚反応を特徴とする。これらの疾患には多くの人々が罹患している。例えば、米国では、約８００万人の成人と子供が皮膚の遺伝慢性病であるアトピー性皮膚炎に罹患している。遺伝子、環境、免疫要因等の複数の因子の組み合わせによって皮膚病が発生すると考えられている。ほとんどの皮膚病は致命的ではないが、患者のクオリティオブライフを大きく損なう。

皮膚病を治療するために通常使用されているステロイド含有軟膏又は抗ヒスタミン剤を使用した場合には、かなりの副作用が生じる。例えば、外用又は経口によるステロイドの長期投与によって皮膚層は薄くなり、骨粗鬆症が発生し、子供の成長が阻害される。また、ステロイドの服用を停止すると、病変が再発する場合が多い。

従って、皮膚病の治療、予防又は診断のための改良された非ステロイド物質を開発することが求められている。本発明は、投与を必要とする被投与者に治療有効量のセリンプロテアーゼ阻害剤を投与することを含む、皮膚病の治療、診断又は予後のための改良された方法を提供する。

上記及びその他の目的は上述した記載から明らかであろう。

本発明は、組換え型セリンプロテアーゼ阻害剤を含む医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、皮膚病を予防又は治療する方法に関する。

また、皮膚病を治療するための薬剤の調製におけるセリンプロテアーゼ阻害剤の使用を開示する。

本発明の別の目的は、組換え型セリンプロテアーゼ阻害剤の医薬組成物を含む、皮膚病を治療するためのキットを提供することにある。

その他の目的及び利点は、図面及び添付の特許請求の範囲を参照して説明する以下の詳細な説明から当業者に明らかになるだろう。

ｈＫ２プロテアーゼ阻害剤ＭＤ８２０のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ２プロテアーゼ阻害剤ＭＤ６２のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ２プロテアーゼ阻害剤ＭＤ８３のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ２プロテアーゼ阻害剤ＭＤ６７のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ２プロテアーゼ阻害剤ＭＤ６１のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ２プロテアーゼ阻害剤ＭＤ５１８のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ２プロテアーゼ阻害剤ＭＤＣＩのＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 野生型ＡＣＴのＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＣＴ−Ｇ１のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＣＴ−Ｇ１ＧのＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＣＴ−Ｃ１１のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＣＴ−Ｃ１１ＧのＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＣＴ−Ｅ５のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＣＴ−Ｅ８のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＣＴ−Ｆ１１のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＣＴ−Ｆ３のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＣＴ−Ｇ９のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 野生型ＡＡＴのＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＡＴ−Ｇ１のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＡＴ−Ｇ１ＧのＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＡＴ−Ｃ１１のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＡＴ−Ｃ１１ＧのＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＡＴ−Ｅ５のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＡＴ−Ｅ８のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＡＴ−Ｆ１１のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＡＴ−Ｆ３のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＡＴ−Ｇ９のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＡＴ−Ｇ１ＶのＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 ｈＫ１４プロテアーゼ阻害剤ＡＡＴ−Ｃ１１ＤのＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。 遺伝子変異ｈＫＬＫ５マウスネザートンモデルにおける皮膚病変の採点システムを示す。 ネザートン症候群マウスモデルにおける皮膚病変サイズを示す。病変サイズ及び病変重症度は、２％ナトロソル（第１群、対照）又は２％ナトロソルに添加したＭＤＰＫ６７ｂ（第２群）の局所投与の１、１５及び２８日後に監視した。

本発明は、皮膚病を治療するための薬剤の調製におけるセリンプロテアーゼ阻害剤の使用に関する。セリンプロテアーゼ阻害剤の生物学的に活性なフラグメントも前記薬剤の調製に有用である。

キモトリプシンスーパーファミリー（ｔ−ＰＡ、プラスミン、ｕ−ＰＡ等）のセリンプロテアーゼ及び血液凝固カスケードのプロテアーゼのいくつかは、セリンプロテアーゼ触媒ドメインに加え、それらの活性の調節に部分的に関与する他の構造ドメインを含む巨大分子である（Ｂａｒｒｅｔｔ，１９８６；Ｇｅｒａｒｄ ｅｔ ａｌ，１９８６；Ｂｌａｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。重要なセリンプロテアーゼは、トリプシン、トリプターゼ、トロンビン、カリクレイン、Ｘａ因子等のトリプシン様酵素である。セリンプロテアーゼターゲットは、血液凝固、補体媒介溶菌、免疫反応、腎炎、疼痛、炎症、膵臓炎、癌、受胎抑制、細菌感染、ウイルス成熟等に関連付けられる。特定のターゲットに対して高い特異性を有するセリンプロテアーゼを阻害することにより、宿主に対して大きな影響を与え得る生体内の多くの生物学的過程を阻害することができる。

セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）は、ウイルス、植物及びヒトを含む様々な有機体に由来する１００を超えるタンパク質からなるスーパーファミリーを構成する様々なタンパク質グループを含む。セルピンは５億年以上前に発生し、阻害機能を有するタンパク質及び非阻害機能を有するタンパク質に系統発生学的に分かれた（Ｈｕｎｔ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，１９８０）。オボアルブミン等の非阻害性セルピンは、プロテアーゼ阻害活性を有していない（Ｒｅｍｏｌｄ−Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，１９９３）。セルピンファミリーの主要な機能は、過剰発現したセリンプロテイナーゼ活性を無効化することであると思われる（Ｐｏｔｅｍｐａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。セルピンは、細胞外マトリックスのリモデリング、炎症反応の調節及び細胞移動に関与する（Ｐｏｔｅｍｐａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。

セリンプロテアーゼ阻害剤は、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（クニッツ）ファミリー（基本プロテアーゼ阻害剤）（Ｋｅｔｃｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７８）；Ｋａｚａｌファミリー；ストレプトミセススブチリシン阻害剤ファミリー；セルピンファミリー；ダイズトリプシン阻害剤（クニッツ）ファミリー；ジャガイモ阻害剤ファミリー；Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋファミリーに分類される（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８０；Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。セルピンファミリーに属するセリンプロテアーゼ阻害剤には、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、ＰＡＩ−３、Ｃｌエステラーゼ阻害剤、α−２−抗プラスミン、コントラプシン、α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテアーゼネキシンＩ、α１−アンチキモトリプシン、プロテインＣ阻害剤、ヘパリンコファクターＩＩ及び成長ホルモン調節タンパク質が含まれる（Ｃａｒｒｅｌｌｅｔａｌ．，１９８７；Ｓｏｍｍｅｒｅｔａｌ．，１９８７；Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｓｔｕｍｐ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。

セリンプロテアーゼ阻害剤の多くは広い特異性を有し、血液凝固セリンプロテアーゼ等のプロテアーゼのキモトリプシンスーパーファミリー及びセリンプロテアーゼのストレプトミセススブチリシンスーパーファミリーを阻害することができる（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。セルピンによるセリンプロテアーゼの阻害は、Ｔｒａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８３）、 Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）、Ｓｐｒｅｎｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）に報告されている。ＢＰＴＩ、Ｋａｚａｌ、ＳＳＩ、ダイズトリプシン、ジャガイモ阻害剤ファミリーの完全な阻害剤及びセルピンα１−アンチトリプシンの切断型の結晶学的データが得られている（Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。これらのセリンプロテアーゼ阻害剤は様々なサイズと配列を有するタンパク質だが、これまでに研究された完全な阻害剤は、同族のセリンプロテアーゼの活性部位の認識配列を含む分子の表面から延びる特有のループ（反応性部位ループと呼ばれる）を有する点で共通している（Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。異なるセリンプロテアーゼ阻害剤におけるループの構造類似性は顕著である（Ｐａｐａｍｏｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。各阻害剤の特異性は、セリンプロテアーゼによる阻害剤の潜在的開裂部位に近いアミノ末端であるアミノ酸の相同性によって主として決定されると考えられる。このアミノ酸（Ｐｉ部位残基）は、セリンプロテアーゼの活性部位におけるセリンとアシル結合を形成すると考えられている（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。セルピンが阻害機能を有するか否かは、コドン領域のカルボキシ末端近傍の反応性部位ループのヒンジ領域に位置するコンセンサス配列に強く依存する。反応性部位ループの外では、異なるファミリーに属するセリンプロテアーゼ阻害剤は構造的な関連性を有していない。ただし、Ｋａｚａｌファミリー及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓスブチリシンファミリーの阻害剤は多少の構造及び配列類似性を示す。

本発明の理解を容易にするために、以下に用語の定義を示す。

「１」又は「複数」と明記していない場合には、「少なくとも１」又は「１以上」を意味する。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、通常は内包する（ｉｎｃｌｕｄｅ）と同義で使用し、１又は複数の特性（特徴）又は成分（要素）が存在することを意味する。

本願明細書において使用する「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｉｃ）」、「ペプチド」、「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｉｃ）」、「ペプチド鎖」という用語は、一方のアミノ酸残基のα−アミノ基と隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基との間のペプチド結合によって結合した連続するアミノ酸残基を意味する。

好ましくは、セリンプロテアーゼ阻害剤は組換え型セリンプロテアーゼ阻害剤であり、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、４、６、８、１０、１２、１４及びセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有するそれらの生物学的に活性なフラグメントからなる群から選択される。

好ましくは、セリンプロテアーゼ阻害剤は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９〜５９及びセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有するそれらの生物学的に活性なフラグメントからなる群から選択される。

「アミノ酸残基」という用語は、当業者に公知の任意のアミノ酸残基を意味する。「アミノ酸残基」という用語は、天然アミノ酸（Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ等）並びに稀アミノ酸及び／又は合成アミノ酸及びそれらの誘導体（Ａａｄ、Ａｂｕ、Ａｃｐ、Ａｈｅ、Ａｉｂ、Ａｐｍ、Ｄｂｕ、Ｄｅｓ、Ｄｐｍ、Ｈｙｌ、ＭｃＬｙｓ、ＭｃＶａｌ、Ｎｖａ等）を含む。

アミノ酸残基又はその誘導体は、異性体（特にキラル異性体、例えばＬ又はＤ−アイソフォーム）であってもよい。

「アミノ酸誘導体」という用語は、当業者に公知の任意のアミノ酸誘導体を意味する。例えば、「アミノ酸誘導体」という用語は、付加された側鎖（アルキル側鎖等）及び／又はヘテロ原子置換を有する天然アミノ酸から誘導される残基を含む。

「生物学的に活性なフラグメント」という用語は、基質の活性部位の各配列とアミノ酸の長さの少なくとも４０％を共有する配列を意味する。これらの配列は、当該配列が由来する配列と同一の特性を有する限り使用することができる。好ましくは、これらの配列は、基質の活性部位の各配列とアミノ酸の長さの７０％超、より好ましくは８０％超、特に好ましくは９０％超を共有する。

また、本発明は、セリンプロテアーゼ阻害剤配列の異形（ｖａｒｉａｎｔ）を含む。「異形」という用語は、本来の配列のポリペプチドと多少異なるアミノ酸配列（本来の配列と保存的アミノ酸置換において異なるアミノ酸配列）を有するポリペプチドを意味し、１以上のアミノ酸が同一の特性及び配座的役割を有する別のアミノ酸によって置換されている。アミノ酸配列の異形は、本来のアミノ酸配列内の所定の位置に置換、欠失及び／又は挿入を有する。保存的アミノ酸置換とは、以下の５つのグループの１つにおける置換と定義される。
Ｉ．非極性又はわずかに極性を有する低分子量の脂肪族残渣：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
ＩＩ．極性を有する正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
ＩＩＩ．極性を有する負に荷電した残基及びそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
ＩＶ．高分子量の芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
Ｖ．高分子量で非極性の脂肪族残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ

本発明において使用する「投与」という用語は、医薬組成物、治療組成物、診断用薬剤又は組成物の被投与者、好ましくはヒトへの接触を意味する。

「カリクレイン」という用語は、腺性又は組織カリクレインに関連する。腺性又は組織カリクレインは、高い基質特異性並びに様々な組織と体液中における発現性を有するセリンプロテアーゼのサブファミリーである。「カリクレイン」という用語は、大量のプロテアーゼ酵素が膵分離株において発見された１９３０年代に初めて文献において使用された（ギリシア語で膵は「ｋａｌｌｉｋｒｅａｓ」である）（Ｋｒａｕｔ ｅｔ ａｌ．，１９３０，Ｗｅｒｌｅ，１９３４）。現代では、カリクレイン酵素は、分子量、基質特異性、免疫学的特徴、遺伝子構造及び放出されるキニンの種類が著しく異なる血漿カリクレイン及び組織カリクレインに分類されている。

カリクレインは、１５種類の相同性を有する単鎖分泌セリンエンドペプチダーゼ（〜２５〜３０ｋＤａ）のファミリーを含み、少なくとも６つの哺乳類目の種に相同分子種が存在する。これらのカリクレインは、ｈＫ２、ｈＫ３、ｈＫ２、ｈＫ５、ｈＫ６、ｈＫ７、ｈＫ８、ｈＫ９、ｈＫ１０、ｈＫ１１、ｈＫ１２、ｈＫ１３、ｈＫ１４、ｈＫ１５である。好ましくは、阻害対象のカリクレインはｈＫ２、ｈＫ５、ｈＫ７、ｈＫ１４からなる群から選択される。

本願明細書において使用する「疾患」という用語は、感染、遺伝的欠損又は環境ストレス等の様々な原因によって生じる有機体の一部、臓器又は全身の病的状態を意味し、識別可能な一群の徴候又は症状によって特徴付けられる。

表皮は、カリクレイン、ウロキナーゼ、プラスミン、トリプターゼ様好中球エラスターゼ酵素等の、いくつかのセリンプロテアーゼを発現することが分かっている。これらのセリンプロテアーゼは、表皮性細胞増殖、細胞分化、皮膚及び脂質バリアホメオスタシス、組織リモデリング等の、皮膚における多くの活性に関与する。最も重要なことに、セリンプロテアーゼ及び他の酵素による角質層（ＳＣ）デスモソームのタンパク質分解は、剥離と呼ばれる皮膚最外層の脱落前に生じる重要な事象である。また、カリクレイン、プラスミン、ウロキナーゼ酵素を含むプロテアーゼ活性の上昇は、皮膚の炎症反応に関係がある。炎症性皮膚疾患のリストを表２０に示す。

また、プロテアーゼ活性の上昇は、紫外線暴露及び温度変化等の環境要因を含む様々な刺激に対するストレス反応又は様々な界面活性剤に対する反応としても観察されている。

数種類のカリクレイン（特にｈＫ５、ｈＫ７、ｈＫ１４）は、皮膚の剥離におけるタンパク質分解カスケードに関係があることが分かっている。このタンパク質分解過程は複雑な阻害及び活性化過程を介して制御され、調節不全によって重篤な皮膚障害を引き起こし得る。希な遺伝病（ネザートン症候群及び皮膚剥離症候群）及びアトピー性皮膚炎又は乾癬等の一般的な皮膚病は、少なくとも部分的にカリクレイン活性の上昇によって引き起こされる皮膚の剥離の増加によって特徴付けられる。

また、本発明は、望ましくない皮膚状態の治療又は改善のための化粧料又は薬用化粧料の調製におけるセリンプロテアーゼの使用に関する。セリンプロテアーゼ阻害剤の生物学的に活性なフラグメントも前記化粧料又は薬用化粧料の調製に有用である。

本発明における「望ましくない皮膚状態」とは、必ずしも疾患であるとはみなされない皮膚又は皮膚の外観に影響を与える問題を意味する。

本願明細書において使用する「化粧料（化粧組成物）」という用語は、ヒトの皮膚の外観を向上又は保護するために使用される組成物を意味する。化粧料の例としては、スキンケアクリーム、ローション、パウダー、香水、口紅、手足用マニキュア液、眼及び顔用化粧品、パーマ液、ヘアカラー、ヘアスプレー及びジェル、デオドラント、ベビー製品、バスオイル、気泡剤、バスソルト、バター及びその他の多くの製品が挙げられる。

「薬用化粧料（薬用化粧組成物）」とは、薬剤のような効能を有すると思われる化粧品である。薬用化粧料に通常分類される製品の例としては、アンチエイジングクリーム及び保湿剤が挙げられる。薬用化粧料は、ビタミン、植物化学物質、酵素、酸化防止剤、精油等の活性成分を含むことができる。

本願明細書において使用する「皮膚病」という用語は、皮膚に影響を与える症状に関連する。通常、皮膚病は表２０から選択される。好ましくは、本発明は、アトピー性皮膚炎、（アレルギー性）接触皮膚炎、（刺激性）接触皮膚炎、湿疹、乾癬、にきび、表皮角化症、アカントーシス、表皮炎症、皮膚炎症又はそう痒、酒さ、ネザートン症候群、Ａ型及びＢ型皮膚剥離症候群、汗腺膿瘍及び紅皮症（全身性剥脱性皮膚炎）等の皮膚病の治療に適している。最も好ましくは、皮膚病は、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、乾癬、皮膚剥離症候群からなる群から選択される。

ネザートン症候群（ＮＳ）は、ＳＰＩＮＫ５（ＬＥＫＴＩ）（皮膚カリクレインカスケードの主要な阻害剤の１つ）の突然変異によって引き起こされる希な常染色体劣性遺伝性皮膚病である。

カリクレイン活性の上昇がネザートン症候群の臨床的症状の原因となることが判明している。

多系統魚鱗癬様症候群であるネザートン症候群は、魚鱗癬、紅皮症、毛幹欠陥及びアトピー性症状を特徴とする。皮膚の障壁機能の重篤な障害による多重感染が非常に一般的にみられる。

ネザートン症候群は非常に希だが、おそらくはネザートン症候群を特定することが困難であるために、頻度に関するデータはほとんどない。現在、１００万人に１０人未満の患者がネザートン症候群と診断されている。

治療の選択肢は非常に限られ、非治癒的である。治療では、各種皮膚感染の管理と痒感及び疼痛の減少（例えば、コルチコステロイド）に主に重点が置かれている。

過度のカリクレイン活性（ｈＫ５、ｈＫ７、ｈＫ１４）は、皮膚病の症状を引き起こすことが証明されている。カリクレイン阻害剤（ＬＥＫＴＩ）の活性低下は、代替のカリクレイン阻害剤によって元に戻すことができる。

予期せぬことに、本願発明者らは、例えば実施例４において、ＭＤ６７（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ８）マウスモデル（同所性ｈＫ５過剰発現）等のセリンプロテアーゼ阻害剤によって、症状の重症度が大きく減少することを見出した（未治療の皮膚病（例えば、ＮＳ）モデルにおいて観察）。症状は、角質デスモソーム及び角質層剥離をもたらす早期のデスモソームタンパク質分解による重症の皮膚剥離を特徴とする。これにより、皮膚障壁機能が大きく損なわれ、重症の脱水（ｄｅｈｙｄｒａｔａｔｉｏｎ）、紅斑及び激しい引っ掻き傷が生じる。

アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、原因が明らかになっていない通常は乳児期早期に始まる痒疹疾患であり、痒感、湿疹性病変及び乾燥した厚い皮膚を典型的な特徴とする。アトピー性皮膚炎は他のアトピー性疾患（例えば、約３０％の患者において喘息又はアレルギー反応）を伴い、皮膚感染が一般的である。

アトピー性皮膚炎の病態生理学は十分に理解されていない。アトピー性皮膚炎には遺伝要素が関与しているように思われる。ＴＨ２細胞の異常を含む免疫欠如が示唆されており、プロテアーゼ活性の調節不全がアトピー性皮膚炎関連することが判明している。調節不全によって角質層における障壁機能欠陥が生じて抗原が侵入し、様々な炎症性サイトカインが産生すると考えられている。米国における有病率は、子供で１０〜１２％、成人で０．９％である。その他の先進国では有病率は１８％であり、上昇を続けている。アトピー性皮膚炎は慢性だが、患者の大部分は小児期から成人になるにつれて好転する。

現在のところ、治癒的な治療法はない。症状の重症度に応じて、局所ステロイド抗ヒスタミン剤及び免疫調節薬又は抗生物質、抗ウィルス剤又は抗真菌薬が通常は処方される。

乾癬は慢性疾患である。乾癬は非伝染性であり、通常は炎症性水腫状の皮膚病変として現れるが、口腔粘膜にも見られる。患者の１０％において関節（関節炎）が冒される。発赤は、ストレス事象又は感染等の様々な全身性及び環境要因に関連付けられる。乾癬には遺伝的素因があり、自己免疫異常の兆候を示す多くの証拠がある。通常の過度の皮膚剥離には、プロテアーゼ（カリクレイン等）活性の上昇が関与している。米国では人口の２〜３％が罹患しており，２０万人の新たな患者が毎年発生している。乾癬性関節炎に罹患した約１５０万人の患者が医者にかかっており、毎年４万人が乾癬に関連する原因によって死亡している。その他の国における乾癬の発生も同様であるが、気候及び遺伝要素に応じて異なる。乾癬は、熱帯の人々及び黒人ではそれほど一般的ではない。

現在のところ、治癒的な治療法はない。症状の重症度に応じて、局所コルチコステロイド、コールタール、角質溶解薬又はレチノイドが処方される。

治療対象となる「哺乳動物」とは、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、サル等の家畜及び動物園の動物、競技動物又はペット等の哺乳動物に分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

「治療（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、治療処置と予防又は再発防止の両方を意味する。治療を要する者には、既に疾患を有する者及び疾患を予防すべき者が含まれる。そのため、治療すべき哺乳動物は、疾患を有すると診断されたか、疾患にかかりやすい又は感染しやすい可能性がある。

「被投与者」という用語は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物の患者を意味し、本発明に係る方法を使用して検査又は治療することが望ましい個体を含む。ただし、「患者」とは、症状又は疾患が存在していることを必ずしも意味するものではない。

「製薬学的に許容し得る」とは、生理的に許容でき、ヒトに投与した際に異常高進や眩暈感等のアレルギー性又は同様な有害反応を通常は生じさせない分子及び組成物を意味する。

本願明細書において使用する「プロテアーゼ」という用語は、分子を認識し、分子中の活性化配列に開裂させる酵素を意味する。プロテアーゼは、内部ペプチド結合を開裂させるエンドペプチダーゼであってもよい。あるいは、プロテアーゼは、ポリペプチド又はタンパク質分子のＮ末端又はＣ末側からペプチド結合を加水分解するエキソペプチダーゼであってもよい。プロテアーゼは立体配座に折り畳まれ、活性化配列を受容し、開裂させる触媒部位を形成する。

「阻害剤」とは、好ましくはカリクレイン又はセリンプロテアーゼに結合することによって、カリクレイン又はセリンプロテアーゼの機能を阻害するポリペプチド又は化合物を意味する。

「反応性セルピンループ（ＲＳＬ）」又は「反応性部位ループ（ＲＳＬ）」とは、セルピンに見られ、推定ターゲットプロテアーゼとの相互作用に関係する、露出されたフレキシブルな反応性部位ループを意味する。切断性結合のアミノ酸側の残基から結合に離れるに従って、残基はＰ１、Ｐ２、Ｐ３等と呼ばれる。切断性結合に続く残基はＰ１’、Ｐ２’、Ｐ３’等と呼ばれる。通常、ＲＳＬは６〜１２個のアミノ酸残基で構成される。

本発明に係るセリンプロテアーゼ阻害剤又はセルピンは、α１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ）、α１−プロテイナーゼ阻害剤（ＡＡＴ）、ヒトα１−アンチトリプシン関連タンパク質前駆体（ＡＴＲ）、α２プラスミン阻害剤（ＡＡＰ）、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ前駆体（ＡＴＩＩＩ）、プロテアーゼ阻害剤１０（ＰＩ１０）、ヒトコラーゲン結合タンパク質２前駆体（ＣＢＰ２）、プロテアーゼ阻害剤７（ＰＩ７）、プロテアーゼ阻害剤ｌｅｕｓｅｒｐｉｎ ２（ＨＬＳ２）、ヒト血漿プロテアーゼＣ１阻害剤（Ｃ１ ＩＮＨ）、単核細胞／好中球エラスターゼ阻害剤（Ｍ／ＮＥＩ）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤３（ＰＡＩ３）、プロテアーゼ阻害剤４（ＰＩ４）、プロテアーゼ阻害剤５（ＰＩ５）、プロテアーゼ阻害剤１２（ＰＩ１２）、ヒト内皮プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１前駆体（ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）（ＰＡＩ−１）、ヒト胎盤プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２（ＰＡＩ２）、ヒト色素上皮由来因子前駆体（ＰＥＤＦ）、プロテアーゼ阻害剤６（ＰＩ６）、プロテアーゼ阻害剤８（ＰＩ８）、プロテアーゼ阻害剤９（ＰＩ９）、ヒト扁平上皮癌抗原１（ＳＣＣＡ−１）、ヒト扁平上皮癌抗原２（ＳＣＣＡ−２）、Ｔ４結合グロブリン（ＴＢＧ）、Ｍｅｇｓｉｎ、プロテアーゼ阻害剤１４（ＰＩ１４）、それらのフラグメント、それらの分子キメラ、それらの組み合わせ及び／又はそれらの変異体からなる群から選択することができる。

これらのセルピンの多くは異なる名称を有するため、以下の表１に詳細を示す。

有利には、本発明に係るセリンプロテアーゼ阻害剤はセリンプロテアーゼトリプシン様酵素、好ましくはカリクレイン阻害剤であってもよい。本発明に係るカリクレイン阻害剤は、ｈＫ２、ｈＫ３、ｈＫ４、ｈＫ５、ｈＫ６、ｈＫ７、ｈＫ８、ｈＫ９、ｈＫ１０、ｈＫ１１、ｈＫ１２、ｈＫ１３、ｈＫ１４、ｈＫ１５阻害剤から選択される。好ましくは、カリクレイン阻害剤はｈＫ２、ｈＫ５、ｈＫ７、ｈＫ１４阻害剤から選択される。

カリクレイン阻害剤がｈＫ２阻害剤である場合には、阻害剤は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００１０４０号に記載されている阻害剤から選択することができる。国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００１０４０号の開示内容はこの参照によって本願明細書に援用する。好ましくは、本発明に係るカリクレイン阻害剤は、ＭＤ８２０、ＭＤ６２、ＭＤ６１、ＭＤ６７、ＭＤＣＩをからなる群から選択することができる。最も好ましくは、阻害剤はＭＤ６７である。本願は、阻害性ポリペプチド配列と、プロテアーゼに特異的な基質酵素相互作用部位の少なくとも１つのポリペプチド配列と、を含むプロテアーゼの組換え型阻害剤タンパク質並びにプロテアーゼの組換え型阻害剤タンパク質を製造するための方法を開示する。好ましくは、組換え型セリンプロテアーゼ阻害剤は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、４、６、８、１０、１２、１４及びセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有するそれらの生物学的に活性なフラグメントからなる群から選択される。

本発明に係るセリンプロテアーゼ阻害剤の一例として、本願発明者らは、予期せぬことに、以下の表２に示すプロテアーゼｈＫ２に特異的な７種類の新規な組換え型阻害剤タンパク質を見出した。

これらの阻害剤タンパク質は、セルピンの特異性を変更するために、キモトリプシン、肥満細胞キマーゼ、カテプシンＧ、前立腺カリクレインｈＫ２、ＰＳＡ（ｈＫ３）等のヒト酵素を阻害することが知られているα１−アンチキモトリプシン（ｒＡＣＴ）のＲＳＬを修飾することによって得た。国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００１０４０号に記載されているようにファージディスプレイ法によって酵素ｈＫ２の基質として選択されるペプチド配列は、ＲＳＬの切断性結合及び近傍のアミノ酸残基の代わりとして使用されている。通常、組換え型阻害剤は細菌を使用して製造され、アフィニティークロマトグラフィーによって精製されていた。

また、本願発明者らは、ｒＡＣＴ_ＷＴのＲＳＬ構造に位置する残基Ｐ３〜Ｐ３’をプロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ）のＲＳＬをコードする基質ペンタペプチドによって置換することにより、カリクレインｈＫ２及びｈＫ３を阻害することができる組換え型阻害剤（ＭＤＣＩ）を製造できることを見出した。

カリクレイン阻害剤がｈＫ１４阻害剤である場合には、阻害剤は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００５／０００５０４号に記載されている阻害剤から選択することができる。国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００５／０００５０４号の開示内容はこの参照によって本願明細書に援用する。好ましくは、組換え型阻害剤は、ＡＡＴ_Ｇ１、ＡＡＴ_Ｇ１Ｇ、ＡＡＴ_Ｃ１１、ＡＡＴ_Ｃ１１Ｇ、ＡＡＴ_Ｅ５、ＡＡＴ_Ｅ８、ＡＡＴ_Ｆ１１、ＡＡＴ_Ｆ３、ＡＡＴ_Ｇ９、ＡＣＴ_Ｇ１、ＡｃＴ_Ｇ１Ｇ、ＡＣＴ_Ｃ１１、ＡＣＴ_Ｃ１１Ｇ、ＡＣＴ_Ｅ５、ＡＣＴ_Ｅ８、ＡＣＴ_Ｆ１１、ＡＣＴ_Ｆ３、ＡＣＴ_Ｇ９、ＡＣＴ_Ｇ１Ｖ、ＡＣＴ_ＷＴ、ＡＣＴ_Ｃ１１Ｄからなる群から選択することができる。好ましくは、ｈＫ１４プロテアーゼの阻害剤タンパク質は、ＡＡＴ_Ｇ１、ＡＡＴ_Ｇ１Ｇ、ＡＡＴ_Ｃ１１、ＡＡＴ_Ｃ１１Ｇ、ＡＡＴ_Ｅ５、ＡＡＴ_Ｅ８、ＡＡＴ_Ｆ３、ＡＡＴ_Ｇ９、ＡＣＴ_Ｇ１Ｇ、ＡＣＴ_Ｃ１１、ＡＣＴ_Ｃ１１Ｇ、ＡＣＴ_Ｅ５、ＡＣＴ_Ｅ８、ＡＧＴ_Ｆ１１、ＡＣＴ_Ｆ３、ＡＣＴ_Ｇ９、ＡＣＴ_Ｇ１Ｖ又はＡＣＴ_Ｃ１１Ｄである。

本願は、阻害性ポリペプチド配列と、ｈＫ１４プロテアーゼに特異的な基質酵素相互作用部位の少なくとも１つのポリペプチド配列と、を含むｈＫ１４プロテアーゼの組換え型阻害剤タンパク質を開示する。好ましくは、ｈＫ１４プロテアーゼの組換え型阻害剤タンパク質は、生理的条件下において、ｉ）少なくとも４時間の培養後における１１．７以下の阻害化学量論（ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（ＳＩ））と、ｉｉ）少なくとも７５００Ｍ^−１ｓ^−１の会合速度（ｋａ）と、ｉｉｉ）少なくとも３０分間の培養後における１００％の阻害活性と、を有する。

また、セルピンによるシステインプロテアーゼの阻害については数多く報告されているため、プロテアーゼ阻害剤の阻害性ポリペプチド配列はシステインプロテアーゼから選択することもできる（Ｇｅｔｔｉｎｓ Ｐ．Ｇ．Ｗ．，２００２，「Ｓｅｒｐｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ，１０２，４７５１−４８０３）。例としては、セルピン扁平上皮癌抗原１によるカテプシンＫ、Ｌ、Ｓの阻害、α１−アンチキモトリプシンによる前ホルモンチオールプロテナーゼの阻害、ウイルス性セルピンｃｒｍＡによるカスパーゼ１（インターロイキン１β変換酵素）、カスパーゼ３、カスパーゼ８を含むカスパーゼファミリーの阻害並びにヒトセルピンＰＩ９によるカスパーゼ１、４、８を含むカスパーゼファミリーの阻害が挙げられる。

通常、セリンプロテアーゼ阻害剤は組換え型阻害剤タンパク質である。従って、セリンプロテアーゼ阻害剤を調製するために組み換え技術を使用する場合には、ポリペプチドをコードする核酸分子又はフラグメントを使用することが好ましい。

従って、本発明は、上述したセリンプロテアーゼ阻害剤をコードする、精製・単離されたＤＮＡ配列にも関する。

「精製・単離されたＤＮＡ配列」とは、本発明に係るプロテアーゼの組換え型阻害剤タンパク質をコードする核酸分子又は本発明に係るプロテアーゼの組換え型阻害剤タンパク質をコードする核酸が存在する状態を意味する。核酸は、天然環境でみられる他のポリペプチド又は核酸あるいはインビボ又はインビトロにおけるＤＮＡ組換え技術を使用する（細胞培養等）環境における他のポリペプチド又は核酸と関連する物質を含まないか、実質的に含まない。

使用することができるＤＮＡは、例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、１本又は両方の鎖が２つ以上のフラグメントからなる二本鎖ＤＮＡ、１本又は両方の鎖が中断されていないリン酸ジエステル骨格を有する二本鎖ＤＮＡ、１以上の一本鎖部分及び１以上の二本鎖部分を含むＤＮＡ、ＤＮＡ鎖が完全に相補的である二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ鎖が部分的にのみ相補的である二本鎖ＤＮＡ、円形ＤＮＡ、共有的に閉鎖したＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ、共有的に架橋されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、半合成ＤＮＡ、生合成ＤＮＡ、自然に単離されたＤＮＡ、酵素消化されたＤＮＡ、剪断されたＤＮＡ、放射性標識されたＤＮＡ及び蛍光色素標識されたＤＮＡ等の標識されたＤＮＡ、核酸の１つ以上の非天然発生種を含むＤＮＡ等のポリデオキシヌクレオチド配列である。

セリンプロテアーゼ阻害剤をコードするＤＮＡ配列又はセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有するその生物学的に活性なフラグメントは、標準的な化学的方法、例えばリン酸トリエステル法又は自動化合成法及びＰＣＲ法によって合成することができる。

また、本発明に係るセリンプロテアーゼ阻害剤をコードする精製・単離されたＤＮＡ配列は、酵素法によって製造することもできる。そのため、所定の認識配列で核酸分子を開裂させる制限酵素は、組換え型阻害剤タンパク質又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ（又はＲＮＡ）等の核酸配列を含むより大きな核酸分子から核酸配列を単離するために使用することができる。

また、本発明に係るＲＮＡの形態の核酸は、例えば、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、１本又は両方の鎖が２つ以上のフラグメントからなる二本鎖ＲＮＡ、１本又は両方の鎖が中断されていないリン酸ジエステル骨格を有する二本鎖ＲＮＡ、１以上の一本鎖部分及び１以上の二本鎖部分を含むＲＮＡ、ＲＮＡ鎖が完全に相補的である二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ鎖が部分的にのみ相補的である二本鎖ＲＮＡ、共有的に架橋されたＲＮＡ、酵素消化されたＲＮＡ、剪断されたＲＮＡ、ｍＲＮＡ、化学的に合成されたＲＮＡ、半合成ＲＮＡ、生合成ＲＮＡ、自然に単離されたＲＮＡ、放射性標識されたＲＮＡ及び蛍光色素標識されたＲＮＡ等の標識されたＲＮＡ、核酸の１つ以上の非天然発生種を含むＲＮＡ等である。

セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする精製・単離されたＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６〜３７からなる群から好ましくは選択される。

また、本発明は、上述した配列の変異体、すなわち、保存的ヌクレオチド置換（１以上のヌクレオチドが同じ特性を有する別のヌクレオチドによって置換）によって参照配列と異なるヌクレオチド配列を含む。

また、本発明は、皮膚病を治療するための薬剤の調製における、セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする精製・単離されたＤＮＡ配列の使用を含む。

あるいは、本発明に係るセリンプロテアーゼ阻害剤又はカリクレイン阻害剤は、検出可能な標識を含むか、検出可能な標識に結合して検出可能な複合体を形成する。

「検出可能な標識」とは、検出可能な分子又は診断のための検出部位、例えば特定の結合特性を有する酵素又はペプチド（ストレプトアビジン又は西洋ワサビペルオキシダーゼ等）である。検出部位は、同族の特定の検出可能部位（標識アビジン等）に結合することによって検出することができるビオチン等の化学部位をさらに含む。

好ましくは、検出可能な標識は、蛍光標識並びにＭＲＩ−ＣＴ撮像通常使用される標識を含む。多くの蛍光材料が公知であり、標識として利用することができる。例としては、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー、ルシファーイエローが挙げられる。

本発明に係るセリンプロテアーゼ阻害剤又はカリクレイン阻害剤は、放射性標識（例えば、同位体３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、６７Ｃｕ、２２５Ａｃ、２１３ｂｕ、９９Ｔｃ、１８６Ｒｅ）を検出部位と担持することができる。放射性標識を使用する場合には、公知の利用可能な計数法を使用して特定の結合材料を同定・定量することができる。

標識が酵素である場合には、公知の比色、分光光度法、蛍光分光光度法、電流測定又は気体定量法のいずれかによって検出することができる。

放射性標識は、生体外診断法及び生体外・生体内放射線撮像法において有用である。別の態様において、放射性標識は、外科手術の実施前、実施中又は実施後に癌細胞、前癌細胞、腫瘍細胞及び超増殖性細胞の存在及び／又は位置を特定してそのような細胞を除去する放射免疫誘導外科手術（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ−ｇｕｉｄｅｄ ｓｕｒｇｅｒｙ）法に有用である。

生体内撮像の場合には、本発明の標識は、放射性同位体ではなく、造影剤（磁気共鳴造影剤等）に結合させることができる。キレート化剤の例としては、ＥＤＴＡ、ポルフィリン、ポリアミンクラウンエーテル、ポリオキシムが挙げられる。

常磁性イオンの例としては、ガドリニウム、鉄、マンガン、レニウム、ユウロピウム、ランタン、ホルミウム、エルビウムが挙げられる。

また、本発明は、活性物質としての本願明細書に開示するセリンプロテアーゼ阻害剤と、必要に応じて１種以上の製薬学的に許容し得る担体と、を含む医薬組成物に関する。

好ましくは、医薬組成物としての本発明に係る組成物は、通常は血流又は髄液（ＣＳＦ）への注入又は疾患部位又はその近傍への直接注入による任意の適当な経路を介して治療を必要とする患者に投与する。正確な投与量は、組成物の用途（診断、予後、予防又は治療）、例えば剥離の大きさと位置、組成物の正確な特性及びカリクレイン阻害剤又はセリンプロテアーゼ阻害剤に結合した検出可能又な機能的な標識の特性等の多くの要因に応じて決定される。

本発明に係る医薬組成物は、活性物質としての薬学的有効量の組成物と、必要に応じて製薬学的に許容し得る担体、希釈剤及び助剤と、を含む。

「薬学的有効量」とは、ヒト又は動物に投与した場合に検出可能な薬理学的及び／又は生理学的な作用を引き起こす化学物質又は化合物を意味する。

ポリペプチドの薬学的に有効な投与量は、通常は治療する患者の体重１ｋｇあたり０．００１ｎｇ〜１００μｇである。

医薬組成物は、１以上の製薬学的に許容し得る担体、希釈剤及び助剤を含むことができる。

活性化合物の製剤学的に使用可能な製剤への処理を容易にする許容し得る担体、希釈剤、助剤は、採用される投与量及び濃度において被投与者に無毒であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、その他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸やメチオニン等の酸化防止剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコール、べンジルアルコール；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール、べンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；ｍ−クレゾール）；低分子量（約１０未満の残渣）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、イムノグロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、ヒドロキシエチルセルロース（Ｎａｔｒｏｓｏｌ（登録商標））、デキストリン等の単糖類、二糖類、その他の糖類；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；蔗糖、マンニトール、トレハロース、ソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（Ｚｎ蛋白錯体等）；及び／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン界面活性剤が例として挙げられる。

医薬組成物は全身又は局所的に投与することができる。例えば、医薬組成物は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、鼻腔内、経皮的、筋肉内、口腔投与等の非経口投与、埋込型装置による投与又は蠕動手段による投与によって投与することができる。

本発明の医薬組成物は、生体吸収性マトリックスに組み込むか、含浸させることができ、マトリックスは懸濁液、ゲル又は固形担体として投与する。また、マトリックスは、Ｎａｔｒｏｓｏｌ（登録商標）等のバイオポリマーを含むことができる。

また、徐放製剤を調製することもできる。徐放製剤の好適な例としては、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透過性基材が挙げられ、半透過性基材はフィルム又はマイクロカプセル等の成形品である。徐放基材の例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）等）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と［γ］エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能な小球体）等の分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸が挙げられる。

生体内投与に使用する製剤は無菌状態としなければならない。例えば、無菌濾過膜による濾過によって容易に無菌状態とすることができる。

本発明に係る組成物の適当な投与量は、被投与者の年令、性別、健康状態、体重、同時治療の種類、所望の作用に応じて異なる。

適当な投与形態は、疾病、阻害剤、投与方法に応じて異なる。例えば、錠剤、カプセル、トローチ、歯科用軟膏、坐剤、吸入剤、溶液、軟膏、非経口剤が挙げられる。

また、阻害剤のアミノ酸の修飾（変性）は本発明に含まれるため、阻害剤を非水溶性マトリックス又はその他のポリマー担体に架橋させたり、溶解性、吸着性、血管透過性を改良することも有用な場合がある。そのような変形は周知であり、ペプチド等の望ましくない副作用を排除又は抑制することができる。

本発明の別の主題は、哺乳動物における皮膚病の診断、予後、予防又は治療のためのキットであって、組換え型セリンプロテアーゼと、必要に応じて試薬及び／又は取扱説明書と、を含むキットを提供することにある。

本発明に係るキットは、他の医薬組成物及びそれらの組み合わせを含む医薬投与形態をさらに含むことができる。

通常、キットは、容器と、容器上又は容器内に設けられたラベル又は包装挿入物を含む。適当な容器としては、瓶、ガラス瓶、注射器等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の各種材料で形成することができる。容器は、症状を治療するために有効な組成物を保持し、無菌アクセス口（例えば、容器は静脈注射用溶液バッグ又は皮下注射針を貫通させることができるストッパーを有するガラス瓶であってもよい）を有することができる。ラベル又は包装挿入物は、組成物を癌等の任意の症状を治療するために使用することを表示する。

あるいは又はさらに、キットは、静菌剤注射用蒸留水（ＢＷＦＩ）、燐酸緩衝食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液等の薬学的に許容し得るバッファを含む第２（第３）の容器を含むことができる。製品は、その他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、注射器等の市販又はユーザーの見地から望ましいその他の材料をさらに含むことができる。

また、本発明は、本発明に係る化合物の、哺乳動物における皮膚病の診断、予後、予防又は治療のための生体外及び生体内試験の開発と標準化における薬理学ツールとしての使用を提供する。

また、本発明は、組織試料における皮膚病の診断、予後、予防又は治療のための検出分析方法であって、前記組織試料を本発明に係る組成物と接触させ、検出された標識の量を測定し、測定された量を前記組織試料における疾患の有無に相関させることを含む方法を含む。

また、本発明の別の目的は、カリクレイン分子を発現する皮膚細胞を死滅させるための方法であって、前記細胞を本発明に係る組成物と接触させて前記細胞を死滅させ、カリクレイン分子を発現する細胞を破壊するか、カリクレイン分子を発現する細胞の生存を防止することを含む方法を提供することにある。

また、本発明の目的は、セリンプロテアーゼ及び特にカリクレイン分子を発現する皮膚細胞を阻害するための方法であって、前記皮膚細胞を本発明に係る組成物と接触させることを含む方法を提供することにある。

本発明の別の目的は、本願明細書に開示するセリンプロテアーゼ阻害剤又はセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有するその生物学的に活性なフラグメントを含む化粧組成物並びに望ましくない皮膚状態を改善するための前記組成物の使用に関する。

好ましくは、セリンプロテアーゼ阻害剤は、本発明に係る組換え型阻害剤タンパク質である。

通常、セリンプロテアーゼは、カリクレイン、プラスミン、キモトリプシン（Ｃｈｔｒ）、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、トリプターゼ、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）酵素及び／又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

好ましくは、カリクレインはｈＫ２、ｈＫ５、ｈＫ７、ｈＫ１４及び／又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

また、本発明は、セリンプロテアーゼ阻害剤又はセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有するその生物学的に活性なフラグメントの、望ましくない皮膚状態を改善するための化粧組成物の調製における使用を提供する。

当業者には、具体的に説明した実施形態以外に本発明を容易に変更及び変形することができることは明らかであろう。本発明は、本発明の基本的な特徴から逸脱することなく、そのような変更及び変形を含む。また、本発明は、本願明細書において参照又は例示した全ての工程、特徴、組成物及び化合物を個々又は一括して含み、複数の工程又は特徴の全ての組み合わせを含む。従って、本願の開示は例示した態様に限定されるものではなく、本発明は特許請求の範囲及び本発明の範囲に含まれる均等物の意味及び範囲に含まれるあらゆる変形を含む。

本願明細書において各種参考文献を引用しているが、各参考文献の内容は各参照によって本願明細書に援用するものとする。

上記説明は以下の実施例を参照することによりさらに十分に理解されるだろう。ただし、以下の実施例は本発明を実施する方法の例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１
ファージディスプレイ選択基質を使用したヒトｈＫ２に特異的な組換え型ＡＣＴ阻害剤の開発
国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００１０４０号（ローザンヌ大学）の開示内容を本願明細書に援用する。

材料
ｈＫ２及びｈＫ３（ＰＳＡ）は公知の方法によってヒト精液から精製し（Ｆｒｅｎｅｔｔｅ Ｇ，Ｇｅｒｖａｉｓ Ｙ，Ｔｒｅｍｂｌａｙ ＲＲ，Ｄｕｂｅ ＪＹ．１９９８，「Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ｈＫ２」，Ｊ Ｕｒｏｌ １５９，１３７５−８）、抗ｈＫ２モノクローナル抗体及び抗ＰＳＡモノクローナル抗体は、カナダ・ラバル大学のＲＲ Ｔｒｅｍｂｌａｙ教授から寄贈を受けた。ヒトキモトリプシン（Ｃｈｔｒ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、ヒトカリクレインｈＫ１、ヒト血漿カリクレイン（ＰＫ）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）及び市販のＡＣＴ（ヒト血漿α１−アンチキモトリプシン）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から購入した。Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＡＭＣはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から購入した。ＣＦＰ−ＴＦＲＳＡ−ＹＦＰ蛍光基質は公知の方法によって得た（Ｍａｈａｊａｎ ＮＰ ｅｔ ａｌ．１９９９，「Ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｎｔ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｓｐａｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ６，４０１−９）。ヒトα１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）のｃＤＮＡは、ペンシルベニア大学のＨａｒｖｅｙ Ｒｕｂｉｎ博士から寄贈を受けた。

部位特異的な突然変異誘発
ＡＣＴのｃＤＮＡをｐＱＥ−９発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）にサブクローニングし、ｒＡＣＴ_ＷＴのＮ末端にＨｉｓ_６タグを導入した後、２つの制限部位Ｓａｃ ＩＩ及びＭｌｕ Ｉを、ＲＳＬドメインのＰ１コドンの１８ｂｐ上流及び１８ｂｐ下流にそれぞれ導入した。これらの部位は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ変異誘発プロトコルに従って、Ｓａｃ ＩＩ部位についてはオリゴヌクレオチド５’−ＧＴＧＡＴＴＴＴＧＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’を使用し、Ｍｌｕ Ｉ部位についてはオリゴヌクレオチド５’−ＧＣＡＣＡＡＴＧＧＴＡＣＧＣＧＴＣＴＣＣＡＣＴＡＡＴＧ−３’を使用したサイレント変異によって作成した。

基質ファージディスプレイライブラリーの構築
基質ファージライブラリーは、修飾ｐＨ０５０８ｂファージミドを使用して生成した（Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，「Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２，１０８３２−８）。基質ファージライブラリーは、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩのカルボキシル末端ドメイン（コドン２４９〜４０６）に先行するＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ｒｅｐｅａｔ−ｒｉｃｈ領域の両端にＨｉｓ_６タグを有する。ランダムペンタマーは、隣接部位に対応する５’ビオチン化プライマー（５’−ＴＧＡＧＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＡＧＧＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８３）及び５’−ＴＧＣＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＡＴＧＡ−３’）を使用し、変性コドンの両端に適当な制限部位が位置する鋳型オリゴヌクレオチド（５’ＴＧＡＧＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＡＧＧＴＧＧＣＧＧＴＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＧＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＧＴＣＡＴＡＧＣＡＧＴＣＧＣＴＧＣＡ−３’（Ｎはヌクレオチドであり、ＳはＧ又はＣである））のＰＣＲ伸長法によって生成した。

ＰＣＲ鋳型は公知の方法によって消化・精製し（Ｓｍｉｔｈ Ｇ．Ｐ，Ｓｃｏｔｔ Ｊ．Ｋ．，１９９３，「Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７，２２８−５７）、ＸｂａＩ／ＳａｌＩ消化ｐＨ０５０８ｂベクターに挿入し、エレクトポレーションによってＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｆ⁻）に導入した。ライブラリーの範囲は、アンピシリン及びテトラサイクリン（１００及び１５μｇ／ｍＬ）を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉプレート上に形質転換された細胞の一部をプレーティングすることによって決定した形質転換効率から推定した。１００プラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）／ｍＬの濃度となるようにＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加して形質転換された細胞の残りを一晩培養し、ファージライブラリーを調製した。上清からファージを回収し、ポリ（エチレングリコール）による沈殿によって精製した。シークエンシングのために２００個のクローンを任意に選択し、ライブラリのランダム化を確認した。

ファージディスプレイペンタペプチドライブラリーのスクリーニング
ペンタペプチドライブラリーに対して、ｈＫ２によるスクリーニングを８回行った。セファロースビーズ（Ｎｉ^２＋−ニトリロ三酢酸樹脂）に結合したＮｉ^２＋−アンモニア三酢酸１００μＬを、１ｍｇ／ｍＬ^−１のＢＳＡを含む１０ｍＬのＮａＣｌ／Ｐ_ｉで洗浄した。ファージ粒子（１０^１１）は平衡Ｎｉ^２＋−ニトリロ三酢酸樹脂に添加し、穏やかに撹拌しながら４℃で３時間にわたって結合させた。次に、樹脂を洗浄（ＮａＣｌ／Ｐ_ｉ／ＢＳＡ １ｍｇ／ｍＬ^−１、５ｍＭイミダゾール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）して未結合のファージを除去し、ＮａＣｌ／Ｐ_ｉ内で平衡化した。基質ファージを３７℃で４５分間にわたって２７ｎＭ（最終濃度）のｈＫ２に暴露した。また、プロテアーゼを使用しない対照スクリーニングも行った。上清に放出された開裂ファージを大腸菌ＸＬ１ブルーを使用して増幅し、以降のスクリーニングに使用した。パニングを８回行った後、約１５個のクローンを５回目、６回目及び８回目のスクリーニングから選択し、プラスミドＤＮＡを単離し、基質をコードする領域についてシークエンシングを行った。

組換え野生型ＡＣＴ及びその変異体の構築及び発現
隣接領域に対応するプライマー（５’−ＴＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６７）及び５’−ＴＣＡＣＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６８））を使用し、鋳型オリゴヌクレオチドのＰＣＲ伸長により、Ｐ３とＰ３’の間の位置の反応部位ループの変化に対応する６つの変異体（表３を参照）を生成した。

ｒＡＣＴ_８．２０，５’−ＴＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＡＣＣＣＴＣＣＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＣＧＣＧＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６１）
ｒＡＣＴ_６．３，５’−ＴＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＣＧＴＧＡ−３’（（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６２）
ｒＡＣＴ_８．３，５’−ＴＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＴＴＡＧＴＧＧＡＧＡＣＧＣＧＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６３）
ｒＡＣＴ_６．７，５’−ＴＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＧＴＧＧＡＧＡＣＣＧＣＴＧＡ−３’（（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６４）
ｒＡＣＴ_６．１，５’−ＴＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＡＴＧＡＣＡＡＧＡＴＣＴＡＡＣＴＴＡＧＴＧＧＡＧＡＣＧＣＧＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６５）
ｒＡＣＴ_５．１８，５’−ＴＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＡＣＣＧＡＧＣＧＴＧＴＣＴＣＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＡＣＧＣＧＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８６）

下線を付した配列は反応部位ループにおける新たな開裂部位をコードする。ＰＣＲ産物をＳａｃ ＩＩ及びＭｌｕ Ｉ制限酵素によって消化させ、消化ｒＡＣＴ_ＷＴ構造物にサブクローニングした。組換え型セルピンを大腸菌株ＴＧ１を使用して製造した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２×ＴＹ培地（１６ｇトリプトン、１０ｇ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）において細胞を３７℃で増殖させた（Ａ_６００＝０．５）。次に、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し（最終濃度：０．５ｍＭ）、１６℃で１６時間にわたって組換え型セルピンを発現させた。１００ｍｌの培養液から遠心分離によって細胞を採取し、冷却したＰＢＳに再懸濁させ、フレンチプレスを通過させて可溶性細胞質タンパク質を回収した。細胞片を遠心分離によって除去し、Ｎｉ^２＋−ニトリロ三酢酸アフィニティアガロースビーズを４℃で９０分間にわたって上清に添加し、組換え型セルピンに結合させた。次に、樹脂を２５ｍＭイミダゾール、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄し、結合したタンパク質を５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾールで１０分間にわたって溶離させた。精製終了後、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用して４℃で１６時間にわたってｒＡＣＴの透析を行った。各精製についてブラッドフォード検定によってタンパク質濃度を測定し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ−ｓｔａｉｎｅｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル濃度測定により正規化した（Ｌａｅｍｍｌｉ ＵＫ． １９７０，「Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４」，Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６８０−５）。

阻害分析及び阻害化学量論（ＳＩ）
ｈＫ２及び他の酵素によるｒＡＣＴ_ＷＴ及びその変異体の阻害について阻害化学量論（ＳＩ）値を調べた。初期試験は、ｈＫ２、ＰＳＡ、ｈＫ１、キモトリプシン（Ｃｈｔｒ）、血漿カリクレイン（ＰＫ）、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）酵素に対してモル過剰（１００倍）のｒＡＣＴを使用して行った。反応は反応緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０１％ ＢＳＡ）内において２５℃で３０分間（ＰＳＡの場合には３７℃で９０分間）行い、蛍光基質（Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（ｈＫ１、ｈＫ２、ＰＫ）、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ（Ｃｈｔｒ）、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（ｕＰＡ）、ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＡＭＣ（ＨＮＥ）又はＣＦＰ−ＴＦＲＳＡ−ＹＦＰ（ＰＳＡ））を添加することによって残留酵素活性を測定した。阻害剤の存在下における酵素の活性を非阻害反応と比較した。阻害が観察される反応では、異なる濃度の組換え型セルピンを培養することによってＳＩを調べた。断片的活性（阻害酵素反応の速度／非阻害酵素反応の速度）と酵素に対する阻害剤のモル比（［Ｉ_ｏ］／［Ｅ_ｏ］）の線形回帰分析を使用し、阻害化学量論（切片に対応）を得た。

反応速度論
ｈＫ２、キモトリプシン、ＰＫ、ＨＮＥと各ｒＡＣＴの相互作用の会合速度定数を、疑似一次条件下においてプログレス曲線法を使用して調べた（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＪＦ，Ｗａｌｓｈ ＣＴ． １９８８，「Ｔｈｅ ｂｅｈａｖｉｏｒ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｓｌｏｗ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ６１，２０１−３０１）。これらの条件において、所定量の酵素（２ｎＭ）を各濃度の阻害剤（０〜８００ｎＭ）及び過剰の基質（１０μＭ）と混合した。各反応は反応緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０１％ ＢＳＡ）内において２５℃で４５分間行い、ＦＬｘ８００蛍光９６ウェルマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、米国）を使用して生成物形成速度を測定した。このモデルでは、阻害は反応過程において不可逆的であると考えられ、酵素活性は生成物の生成（Ｐ）（開始速度：ｖ_ｚ）で表され、時間（ｔ）とともに一次速度（ｋ_ｏｂｓ）（阻害剤濃度のみに依存する速度定数）で阻害される。

４つの異なる濃度の各阻害剤について、式１を使用したデータの非線形回帰法によってｋ_ｏｂｓを算出した。阻害剤濃度［Ｉ］に対してｋ_ｏｂｓをプロットすることにより、二次速度定数（ｋ’）（曲線の傾きと等しい（ｋ’＝Δｋ_ｏｂｓ／Δ［Ｉ］）を決定した。阻害剤と基質間の競合のために、基質濃度［Ｓ］及び基質に対する酵素のＫ_ｍを考慮に入れて下記式２を使用して二次速度定数（ｋ）を補正し、ｋ_ａを得た。

Ｚ−ＦＲ−ＡＭＣに対するｈＫ２のＫ_ｍは６７μＭであり、Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ＡＭＣに対するキモトリプシンのＫ_ｍは１４５μＭであり、Ｚ−ＦＲ−ＡＭＣに対するＰＫのＫ_ｍは１７０μＭであり、ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ＡＭＣに対するＨＮＥのＫ_ｍは１３０μＭだった。

複合体形成及び阻害剤分解のウェスタンブロット解析
カリクレインｈＫ２と各組換え型ＡＣＴを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，２００ｍＭ ＮａＣｌ、０，０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００内において１００：１の［Ｉ］_ｏ：［Ｅ］_ｏ比で３７℃で３時間培養した。タンパク質試料を９５℃で５分間加熱した後、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミド、Ｔ：Ｃ比＝１９：１）で分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）硝酸セルロースにエレクトロブロッティングした。マウス抗ｈＫ２モノクローナル抗体及びアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体を使用して遊離ｈＫ２及びｈＫ２−ＡＣＴ複合体を検出した。ＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してウエスタンブロットを可視化した。ｈＫ２とＡＣＴ_８．３又はＡＣＴ_６．７を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，２００ｍＭ ＮａＣｌ、０，０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００内において１０：１の［Ｉ］_ｏ：［Ｅ］_ｏ比で２５℃で３０分間（速度論条件）培養した。抗Ｈｉｓ_６モノクローナル抗体を使用したウェスタンブロットによってタンパク質を検出し、次に上述した二次抗体とプロトコルを使用して検出した。

可溶性組換え野生型及び変異体ＡＣＴの製造
野生型セルピンα１−アンチキモトリプシンを使用してカリクレインｈＫ２の特異的阻害剤を開発した。ｒＡＣＴ_ＷＴのＲＳＬ構造に位置する残基Ｐ３〜Ｐ３’を、上述したファージディスプレイ法によって選択した基質ペンタペプチドで置換した。表４に示す６種類のｒＡＣＴ変異体を設計・作成した。基質ペプチドの切断性結合を、Ｌｅｕ−３５８−Ｓｅｒ−３５９に従ってセルピンのＲＳＬに位置合わせした。ｒＡＣＴ_ＷＴ及びその変異体は、Ｎ末端位置にＨｉｓタグを含む融合タンパク質として大腸菌ＴＧ１において発現させた。それらは低温で製造し、タンパク質蓄積を主として活性可溶性型とした。自然条件下で精製すると、生成レベルは１．０〜２．５ｍｇ／Ｌの間で変動した。変異体６．１及び野生型ＡＣＴ等の精製セルピンの純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で推定）は９８％を超えていた。

ｒＡＣＴ変異体は主としてカリクレインｈＫ２に特異的
ヒト好中球エラスターゼ、キモトリプシン様（Ｃｈｔｒ、ＰＳＡ又はｈＫ３）及びトリプシン様（ｈＫ２、ｈＫ１、ＰＫ、ｕＰＡ）プロテイナーゼを含む酵素をスクリーニングしてｒＡＣＴ変異体の阻害特異性を調べた（表４）。

過剰の阻害剤（［Ｉ］_ｏ／［Ｅ］_ｏ＝１００：１）と共に３０分間培養した場合には、ｈＫ２はｒＡＣＴ_６．２、ｒＡＣＴ_８．３、ｒＡＣＴ_６．７、ｒＡＣＴ_６．１によって完全に阻害されたが、ｒＡＣＴ_８．２０及びｒＡＣＴ_５．１８はそれぞれ酵素活性の９５％及び７３％を阻害した。この条件下では、野生型ｒＡＣＴはｈＫ２に対して阻害活性を全く示さなかった。これらの変異体のうち、２種類（ｒＡＣＴ_８．３及びｒＡＣＴ_５．１８）はｈＫ２に特異的であり、その他の酵素は阻害しなかった。ｒＡＣＴ_６．７及びｒＡＣＴ_６．２は、それぞれ３６％及び１００％の阻害率でＰＫも阻害した。野生型ＡＣＴとしては、変異体ｒＡＣＴ_８．２０は、キモトリプシン様プロテアーゼＣｈｔｒ及びＰＳＡ並びにＰＫ及びＨＮＥを阻害した。組換え型セルピンは、カリクレインｈＫ１及びｕＰＡに対して阻害活性を示さなかった。

ｈＫ２に対する変異体ＡＣＴの阻害化学量論は野生型ＡＣＴと比較して大きく向上
最も有用な比較ができるように、阻害化学量論の決定は、全ての酵素について生理的なｐＨ及びイオン強度条件下で行った。キモトリプシンに対する組換え野生型ＡＣＴのＳＩ値は２（表５）であり、市販のＡＣＴによって同様な条件下で得られた数値と同じだった。

全ての組換え型変異体のＳＩ値を決定するために、ｈＫ２（５ｎＭ）を異なる濃度（６．２５〜５００ｎＭ）のｒＡＣＴ_８．２０、ｒＡＣＴ_６．２、ｒＡＣＴ_８．３、ｒＡＣＴ_６．７、ｒＡＣＴ_６．１、ｒＡＣＴ_５．１８、ｒＡＣＴ_ＷＴと反応緩衝液内において２５℃で３０分間培養した。蛍光基質（１０μＭ）Ｚ−ＦＲ−ＡＭＣを添加することによってｈＫ２の残留活性（速度）を測定した。断片的速度は、非阻害対照の速度（ｖ_ｏ）に対する阻害酵素の速度（ｖ_ｉ）の比に対応する。線形回帰分析を使用してＳＩ値を決定し、Ｉ／Ｅ比（ｘ切片）を推定した。

新たに作成したＡＣＴ変異体は、野生型ＡＣＴよりもｈＫ２に対して低いＳＩ値を示した。変異体ｒＡＣＴ_６．７、ｒＡＣＴ_６．１、ｒＡＣＴ_６．２は、ｈＫ２に対して最も低い阻害化学量論値（それぞれ９、１９、２５）を有していた。変異体ｒＡＣＴ_６．２及びｒＡＣＴ_６．１もＰＫに対して最も低いＳＩ値（それぞれ１８及び１６）を有しており、ｒＡＣＴ_６．７のＳＩ値（２７７）ははるかに高かった。ｈＫ２、ｒＡＣＴ_８．３、ｒＡＣＴ_５．１８に特異的な２種類の組換え型ＡＣＴは、高いＳＩ値（それぞれ３４及び１３９）を有していた。ｈＫ２を含む全てのプロテアーゼについて、ｒＡＣＴ_８．２０阻害剤のＳＩ値は１００よりも高かった。

変異体ＡＣＴは阻害剤の分解を生じることなくｈＫ２と安定な複合体を形成
ｈＫ２とｒＡＣＴ_８．２０、ｒＡＣＴ_６．２、ｒＡＣＴ_８．３、ｒＡＣＴ_６．７、ｒＡＣＴ_６．１、ｒＡＣＴ_５．１８又は野生型ｒＡＣＴを、１００：１のＩ：Ｅ比で３７℃で３時間培養した。マウス抗ｈＫ２抗体を使用し、還元条件下でｈＫ２（ｒＡＣＴ_８．２０）、ｒＡＣＴ_６．２、ｒＡＣＴ_８．３、ｒＡＣＴ_６．７、ｒＡＣＴ_６．１、ｒＡＣＴ_５．１８又は野生型ｒＡＣＴとｒＡＣＴの反応生成物のウェスタンブロット分析を行い、酵素との相互作用後の阻害剤の経過を調べた。ｈＫ２とＡＣＴ変異体を培養すると、遊離ｈＫ２（Ｅ）は完全に消失し、共有結合型複合体（ＥＩ）が形成された。得られた共有結合型複合体は、１６時間の培養期間にわたって高い安定性を示した（データは示さない）。野生型ＡＣＴはゆっくりとｈＫ２を阻害し、３時間の培養後にほとんどが非複合化された。ｈＫ２について測定された高いＳＩ値は、ＡＣＴ変異体阻害剤の非複合体形成分解によるものではなかった。

ＡＣＴ_８．３又はＡＣＴ_６．７とｈＫ２を、１０：１のＩ：Ｅ比で速度論条件（２５℃で３０分間）において培養した。マウスモノクローナル抗ｈｉｓタグを使用し、還元条件下でウェスタンブロットによって複合体の形成を分析した。全ての阻害剤タンパク質は、ｈＫ２との複合体又は非開裂体として存在しており、セルピン酵素相互作用のための基質経路はあまり重要ではないことを示唆している。

変異体ＡＣＴはｈＫ２に対して最も高い会合定数を示す
変異体ＡＣＴの阻害反応速度を、これらの阻害剤に対して反応性を示す各プロテアーゼについて測定した。ｈＫ２と組換え型セルピンの相互作用を、疑似一次条件下においてプログレス曲線法を使用して測定した。ｈＫ２（２ｎＭ）及び基質Ｚ−ＦＲ−ＡＭＣ（１０μＭ）を、所定量（２０〜８００ｎＭ）の阻害剤ｒＡＣＴ_８．２０、ｒＡＣＴ_５．１８、ｒＡＣＴ_６．２、ｒＡＣＴ_８．３、ｒＡＣＴ_６．７、ｒＡＣＴ_６．１に添加した（データは示さず）。代表的なプログレス曲線に対して式１を使用して非線形回帰分析を行い、セルピン濃度に対して速度（ｋ_ｏｂｓ）をプロットした。ｋ_ｏｂｓを決定した後、対応する基質についてプロテアーゼのＫ_ｍを使用して会合定数（ｋａ）を算出した（表６）。キモトリプシンに対する野生型ＡＣＴのｋａ値は公表されているデータと同一だった（Ｃｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００１，「Ｔｈｅ ｓｅｒｐｉｎ ＭＮＥＩ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｅｌａｓｔａｓｅ−ｌｉｋｅ ａｎｄ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｔ ｔｗｏ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０，１５７６２−７０）。組換え型ｒＡＣＴ_６．７はｈＫ２に対して最も高いｋａ値（８９９１Ｍ^−１ｓ^−１）を示したが、ＰＫに対するｋａ値は４５倍低かった。一方、組換え型ｒＡＣＴ_６．２はｈＫ２とＰＫに対して同等なｋａ値を有し、これらのプロテアーゼが識別されていないことを示した。ｈＫ２に特異的な組換え型阻害剤であるｒＡＣＴ_８．３及びｒＡＣＴ_５．１８のｋａ値はさらに低く（それぞれ２４３９及び５９５Ｍ^−１ｓ^−１）、非特異的なＡＣＴ_８．２０はｈＫ２に対してＣｈｔｒ、ＰＫ及びＨＮＥよりも高い１７７９Ｍ^−１ｓ^−１のｋａ値を示した。組換え型セルピンの１つ（ｒＡＣＴ_６．１）はＰＫに対してｈＫ２より高い速度で反応した。

ｒＡＣＴ_ＷＴのＲＳＬ構造に位置する残基Ｐ３〜Ｐ３’を、実施例１に記載したように、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ）のＲＳＬをコードする基質ペンタペプチドで置換した（表６）。

簡単に説明すると、組換えタンパク質ＡＣＴ_ＰＣＩ（ＭＤＣＩ）を製造するために、ＴＧ１細胞を対応する構造で形質転換し、適当な培地内で増殖させた。次に、細胞を最適な密度に誘導し、１６℃で１６時間にわたって組換え型阻害剤を発現させた。

組換え型阻害剤ＡＣＴ_ＰＣＩを細胞質細菌から抽出し、実施例１に記載したように、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって分離した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる組換え型ＡＣＴ発現の分析
実施例１及び２で作成した各阻害剤の純度について、還元条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。

阻害剤の評価
阻害剤をさらに分析し、ヒトカリクレインｈＫ２及びｈＫ３、血漿カリクレイン、トリプシン、ウロキナーゼ、エラスターゼ、トロンビン、ｈＫ１４及びヒトカリクレイン８を阻害する特異性及び親和性について評価した（表７）。ｈＫ２及びｈＫ３は異なる酵素特異性（ｈＫ２：トリプシン様、ｈＫ３：キモトリプシン様）を有しているが、ＡＣＴによって阻害される。ＡＣＴは循環血液における天然のｈＫ３阻害剤であると考えられているが、ｈＫ２の阻害はｈＫ３と比較して弱い。

ｒＡＣＴｓとヒトカリクレインとの阻害反応をウェスタンブロッティングによって分析した（データは示さず）。ＡＣＴの各変異体について、１μｇの阻害剤と１００ｎｇのｈＫ２又はｈＫ３を３７℃で１時間にわたって生理的条件下で培養した。

ｈＫ２に対する特異性のために選択した基質配列を使用した反応ループ内のアミノ酸の変化により、ＡＣＴはｈＫ３を阻害せず、ｈＫ２（ＭＤ８２０、ＭＤ６１、ＭＤ６２）に対して非常に高い特異的を有する阻害剤に形質転換された。これらの結果は、表４に示す結果を裏付けるものである。プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ）の反応ループに基づくＭＤＣＩのみが試験を行った２種類のカリクレイン（ｈＫ２及びｈＫ３）を阻害することができた。

ＭＤ６１及びＭＤ６２は、ｈＫ２に対して非常に高い親和性を有する阻害剤であり、野生型又は市販のα１−アンチキモトリプシンと比較して、（同一条件下において）３分間未満で全てのｈＫ２タンパク質を阻害する。野生型又は市販のα１−アンチキモトリプシンは、同量のｈＫ２を阻害するために１２時間を超える培養を必要とする（データは示さず）。

実施例２−１
ヒトｈＫ１４に特異的な基質活性部位の作成
国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０００５７４号（ローザンヌ大学）の開示内容を本願明細書に援用する。

材料
以下の材料としては、市販の材料を使用した：エラスターゼ、トリプシン、キモトリプシン、血漿カリクレイン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ヒトラミニン１０及び１１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ヒトコラーゲンＩＶ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）、Ｎｉ^２＋−ニトリロ三酢酸アガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）、制限酵素（Ｒｏｃｈｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、抗Ｈｉｓ抗体（Ｓｉｇｍａ）。オリゴヌクレオチドの合成は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＳｙｎｅｒｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨによるＤＮＡシークエンシングによって行った。ヒトカリクレイン２及び前立腺特異的抗原は、公知の方法によってヒト精漿から精製した（Ｆｒｅｎｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｆｒｅｎｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。マトリリン−４はＲ．Ｗａｇｅｎｅｒから寄贈を受けた。

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクトルｐＰＩＣＺαＡへのＫＬＫ１４のクローニング
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，メリーランド州ゲイザースバーグ）を使用し、逆転写酵素によってファーストストランドｃＤＮＡ合成を行った（鋳型：２μｇのヒト小脳ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト））。最終的な反応物質量は２０μＬだった。ＲＴ−ＰＣＲの効率を確認するために、アクチン（ハウスキーピング遺伝子）（ＡｃｔｉｎＳ：５’−ＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴＧＴＧＧＣＴ、ＡｃｔｉｎＡＳ：５’−ＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡ）に特異的なプライマーを使用し、１μＬのｃＤＮをＰＣＲによって増幅した。予想された長さ（３７２塩基対（ｂｐ））を有するアクチンＰＣＲ産物を、臭化エチジウムによって染色した２％アガロースゲル上で可視化した。

１μＬの小脳ｃＤＮＡ（鋳型）、１００ｎｇのプライマー（ＦＰＬ６：５’−ＡＧＧ ＡＴＧ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＣＡ ＴＡＡ ＴＴＧ ＧＴＧ ＧＣＣ ＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６９）及びＲＰＬ６：５’−ＣＣＣ ＡＣＣ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＴＴ ＴＧＴ ＣＣＣ ＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７０））、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，２００μＭデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、０．７５μＬ（２．６Ｕ）のＥｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲポリメラーゼミックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ・マンハイム）を含む５０μＬの反応混合物内において、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｍａｓｔｅｒ ｃｙｃｌｅｒを使用し、成熟ｈＫ１４タンパク質の２２７個のアミノ酸（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＡＫ４８５２４のアミノ酸２５〜２５１に対応）をコードするＫＬＫ１４ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間、９４℃で１０秒間、５２℃で３０秒間、６８℃で１分間（４０サイクル）とし、６８℃で７分間の最終伸長を行った。ＰＣＲに続いて、増幅されたＫＬＫ１４を２％アガロースゲル上において臭化エチジウムで可視化し、抽出し、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで消化させ、標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９）を使用して対応する制限酵素部位においてＥａｓｙｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）の発現ベクターｐＰＩＣＺαＡにライゲーションした。両方向においてベクター特異的プライマーを使用し、自動ＤＮＡシーケンサーによって構造中のＫＬＫ１４配列を確認した。

タンパク質の産生
ＰｍｅＩ線状化ｐＰＩＣＺαＡ−ＫＬＫ１４及び空のｐＰＩＣＺαＡ（陰性対照）を、化学的に能力のあるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母株Ｘ−３３に形質転換し、相同組換えによって酵母ゲノムに組み込んだ。次に、形質転換したＸ−３３細胞を、選択試薬としてＺｅｏｃｉｎ（商標）を含むＹＰＤＳ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％ブドウ糖、１Ｍのソルビトール、２％寒天）プレートに播種した。安定した酵母形質転換体を製造者の推奨に従って選択し、プレート撹拌機（２５０ｒｐｍ）上で緩衝グリセロール複合（ＢＭＧＹ）培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１．３４％酵母窒素原基礎培地、４０ｍｇ／Ｌのビオチン、１％グリセロール）内において３０℃で一晩接種し、ＢＭＭＹ（１％グリセリンの代わりに０．５％メタノールを使用する以外はＢＭＧＹと同じ）内においてＯＤ_６００＝１．０に希釈し、上述した条件で６日間培養した（１％メタノールを毎日補充）。上清を遠心分離（４０００ｘｇ，２０分間）によって回収した。

タンパク質の精製
組換え型ｈＫ１４を、ＡＥＫＴＡＦＰＬＣクロマトグラフィーシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスキャタウェイ）の５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ（商標）カルボキシメチル（ＣＭ）セファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗカラムを使用したカチオン交換によって酵母培養上清から精製した。上清を０．２２μｍのディスポーザブルフィルターで濾過し、Ａｍｉｃｏｎ（商標）ＹＭ１０膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用した限外濾過によって５０倍に濃縮した。次に、濾過・濃縮した上清をＡＥＫＴＡＦＰＬＣシステムのインジェクタに導入し、０．８ｍｌ／分の流量で５ｍＬの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．３）で平衡化したＣＭセファロースカラムに添加した。カラムを上述した平衡緩衝液で洗浄し、吸着されたｈＫ１４を１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．３）内において１５０ｍＬのＫＣｌで３ｍｌ／分の流量で０〜１Ｍに溶離した。５ｍＬの溶出画分を回収し、分析した。ｈＫ１４を含む画分をプールし、Ｂｉｏｍａｘ−１０ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）−１５の遠心分離フィルタ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用して１０倍に濃縮した。精製ｈＫ１４のタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、イリノイ州ロックフォード）を較正に使用するビシンコニン酸方法（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８５）で測定した。組換え型ｈＫ１４タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０）、クマシーブルー染色及び／又は抗ｈＫ１４ポリクローナルウサギ抗体を使用したウェスタンブロット解析を行い（Ｂｏｒｇｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）、組換え型ｈＫ１０について詳細に説明されているように、相同性をタンデム質量分析法で確認した（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，２００１）。

ファージディスプレイペンタペプチドライブラリーのスクリーニング
ｇ３ｐに融合したランダムペンタペプチドのＮ末端に６個のＨｉｓ残基を含む基質ファージライブラリーを生成するために、Ｌｏｗｍａｎ 博士（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州サンフランシスコ）から入手したファージミドを改変した。６個のＨｉｓ残基により、ファージはＮｉ−ＮＴＡカラムに固定された。

ファージミドに挿入されるデュプレックスの調製は、５つのアミノ酸がＮＳＳ（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ、Ｓ＝Ｇ又はＣ）によってコードされた変性オリゴヌクレオチドのＰＣＲ反応によって行った。得られたライブラリーは１．８×１０^８個の形質転換体で構成され、全てのランダム配列を得るために十分だった。

ファージディスプレイ基質ライブラリーに対して、ｈＫ１４によるスクリーニングを６回行った。簡単に説明すると、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＰＢＳ １Ｘ内において基質ファージ（１０^１１）と６０μＬのＮｉ^２＋−ニトリロ三酢酸樹脂を培養し、４回洗浄（ＰＢＳ １Ｘ、ＢＳＡ１ｍｇ／ｍＬ、５ｍＭイミダゾール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）して未結合のファージを除去し、５０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ（ｐＨ７．５）内において３７℃で４５分間にわたって６５ｎＭ（最終濃度）のｈＫ１４に暴露した。放出されたファージを大腸菌ＸＬ１ブルーを使用して増幅し、精製後に以降のスクリーニングに使用した。対応するアミノ酸配列を決定するために、最後のスクリーニングで得られた３２個のクローンのシークエンシングを行った。

ＣＦＰ−ＹＦＰ蛍光基質の発現
供与体としてシアン蛍光タンパク質を使用し、受容体として黄色蛍光タンパク質を使用した組換え型の蛍光基質を公知の方法で作成した（Ｆｅｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。適当な制限部位（ＢｓｓＨＩＩ；ＳａｌＩ）を有する合成遺伝子を使用して、ＣＦＰ及びＹＦＰタンパク質の間のペンタペプチド（太字）を変更してＣＦＰ−ＸＸＸＸＸ−ＹＦＰ−６ｘＨｉｓ組換えタンパク質を作成した。得られた組換えタンパク質は、ＣＦＰ及びＹＦＰタンパク質の間にＧｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＸＸＸＸＸ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒを含んでいた。組換えタンパク質を製造するために、ＴＧ１細胞を対応する構造で形質転換し、Ｎｉ^２＋−ＮＴＡアガロースビーズを使用してアフィニティークロマトグラフィーで精製した。精製されたＣＦＰ−ＹＦＰ組換え型基質の純度と量をＬａｅｍｍｌｉに従ってＳＤＳゲル電気泳動によって評価し、クマシーブルー染色及び特異的抗Ｈｉｓ一次抗体（１／３０００希釈）、マウス抗Ｆａｂ二次抗体（１／５００００希釈）及びＥＣＬ装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用したウェスタンブロット解析を行った。全てのクローンは評価前にシークエンシングを行った。

ＣＦＰ−ＹＦＰ蛍光基質を使用したＫｃａｔ／Ｋｍの直接定量及び特異性調査
各プロテアーゼ及び公知の方法で計算したＫｃａｔ／Ｋｍ値についてＣＦＰ−基質−ＹＦＰタンパク質の基質特異性を調べた（Ｆｅｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。簡単に説明すると、ＣＦＰ−Ｘ５−ＹＦＰタンパク質の蛍光を、黒い９６ウェルプレート内においてマイクロプレート蛍光リーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．）を使用して測定した（４４０ｎｍ（±１５）の励起並びに４８５ｎｍ（±１０）及び５２８ｎｍ（±１０）の発光）。１５０ｎＭの濃度を有する各組換え型基質を、それぞれ８ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、２μＭ、１０ｎＭ、１０ｎＭ、０．５ｎＭの最終濃度でｈＫ１４、キモトリプシン、トリプシン、ＰＳＡ、ｈＫ２、血漿カリクレイン又はエラスターゼと培養した。反応は、反応緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）内において３７℃で６０分間行った。初速度判定のための酵素濃度は、基質リンカーを特異的に加水分解するが、陰性対照として使用したＧＧＧＧＧ基質を加水分解しないレベルに選択した。生成物の生成に対応する蛍光の外観を分光分析によって測定した（４４０ｎｍ（±１５）の励起並びに４８５ｎｍ（±１０）の発光）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した各ペプチドの完全加水分解から得られた検量線に基づき、傾きを１秒毎に発生する生成物のｎｍ単位に変換した。反応速度パラメータｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍは、推定Ｋｍでよりもかなり低い基質濃度を使用して疑似一次条件下で決定した（Ｆｅｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。

開裂産物をＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ二フッ化ポリビニリデン膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｏｄｅｌ ＡＢＩ４９３Ａ）シーケネータを使用して、自動エドマン分解を行って開裂部位を決定した。

ｈＫ１４のためのファージ基質の選択
基質ファージライブラリーをｈＫ１４に対してパニングし、加水分解活性によって開裂した基質を選択した。開裂したファージは大腸菌ＴＧ１細胞で増幅し、酵素消化とスクリーニングを５回行った。放出ファージの量は各回毎に増加し、各選別後のより多数のｈＫ１４感受性ファージの存在を示唆している。最後のスクリーニングで得られた３２個のファージペプチドのアミノ酸配列をシークエンシングによって決定した。基質領域に対応する配列を表１に示す。選択され、開裂したペプチドの６９％は、ｈＫ１４のトリプシン様活性について予想されたようにＰ１位置に塩基性残基を有し、３１％のペプチドはＰ１位置にキモトリプシン様酵素に特異的なチロシン残基を有していた。

ｈＫ１４による基質加水分解の反応速度特性
ファージディスプレイ分析からの配列がｈＫ１４の基質であることを確認し、開裂部位を特定するために、選択された全てのペプチドを蛍光基質形態に構成した。基質系は、基質によって結合されたＣＦＰからＹＦＰまでのエネルギー伝達に基づくものである。プロテアーゼによるリンカーの開裂により、２つのフルオロフォアは分離され、エネルギー輸送のロスが生じる。そのため、４８５ｎｍ（ＣＦＰ発光の波長に対応）における供与体の蛍光強度の上昇を測定することによって基質の加水分解を評価することができる（Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｆｅｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。

全ての基質は、可変有効性レべル及び２０００〜４８１，０００Ｍ^−１ｓ^−１のＫｃａｔ／Ｋｍ値でｈＫ１４によって加水分解された。開裂の特異性は、ｈＫ１４によって加水分解されないＣＦＰ−ＧＧＧＧＧ−ＹＦＰによって実証した（図示せず）。

２００，０００Ｍ^−１ｓ^−１を超えるＫｃａｔ／Ｋｍ値を有する最も良いｈＫ１４基質はＰ１位置にＡｒｇを有していたため、ｈＫ１４感受性のための好ましいＰ１アミノ酸はＡｒｇであることを示唆している（表１）。興味深いことに、ｈＫ１４によって最も効率的に開裂した４つのペプチドのうちの２つはＰ２位置にＧｌｎを含んでいた。一方、様々なアミノ酸がＰ１’位置に見られ、Ｐ１’位置には有意な嗜好がないことを示している。しかしながら、２つの基質はＰ１’位置にアスパラギン酸を有し、比較的効率的に開裂した。

一方、Ｐ１位置にＬｙｓを有する全ての基質は、３４，０００Ｍ^−１ｓ^−１以下の低いＫｃａｔ／Ｋｍ値で開裂した。同様に、Ｐ１位置にチロシンを有する基質の開裂速度は、１３４，０００Ｍ^−１ｓ^−１のＫｃａｔ／Ｋｍ値を有するペプチドＧ９以外は非常に低かった。Ｐ１位置にリジン又はチロシンを有する基質の約５０％がグリシン残基を有していたＰ１’位置を除き、アミノ酸は他の位置において復元されなかった。ただし、Ｐ１’位置に見られたグリシン残基の大部分は、選択されたペンタペプチド基質（選択されたペプチドの位置５はＬｙｓ又はＴｙｒ残基）に隣接するファージリンカー領域に由来するものだった。

好ましい選択された基質の特異性
選択された基質の多くは他のプロテアーゼによる開裂に潜在的な感受性を有するモチーフを含んでいたため、ｈＫ２、血漿カリクレイン、ＰＳＡ、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼがｈＫ１４基質を開裂させる程度を測定した（表８）。各基質は、基質リンカーを特異的に開裂させるが、ＧＧＧＧＧ対照基質を加水分解しない酵素濃度で試験を行った。

予想通り、トリプシン様基質のほとんどは、ｈＫ１４選択性と厳密な相関を有していない可変的な有効性でトリプシンによって開裂した。例えば、ペンタペプチドＶＧＳＬＲ及びＲＱＴＮＤはｈＫ１４に最も適した基質だが、約５０，０００，０００Ｍ^−１ｓ^−１のＫｃａｔ／Ｋｍ値を示すＬＳＧＧＲ等の他のペプチドと比較して、トリプシンによってそれほど効率的に開裂しなかった。一方、Ｐ２位置にＧｌｎを有するぺプチドは、ｈＫ１４及びトリプシンの好適な基質だった。低いトリプシン様ｈＫ１４活性を有する２つのｈＫ１４基質（ＲＶＴＳＴ及びＶＶＭＫＤ）並びにキモトリプシン様ｈＫ１４活性を有する５つの基質のうちの４つはトリプシンによって開裂しなかった。

ｈＫ１４、キモトリプシン及びエラスターゼに対してほとんど同じｋｃａｔ／Ｋｍ値を有する基質ＴＶＤＹＡを除き、全てのキモトリプシン様基質はキモトリプシンによってｈＫ１４よりも効率的に開裂した。また、エラスターゼは、ＰＳＡによってわずかに開裂する２つの選択されたペプチドＴＳＹＬＮ及びＹＱＳＬＮを分解した。

好ましい基質は、ｈＫ１、ｈＫ２、ＰＳＡ、ＰＫ等の他のヒトカリクレインと比較してｈＫ１４に対して高い選択性を示した。ｈＫ２のみが、ｈＫ１４の少なくとも５倍低いＫｃａｔ／Ｋｍ値でトリプシン様基質のほとんどを分解した。例えば、ＮＱＲＳＳペプチドは、ｈＫ２及びＰＫよりも２７倍及び７８倍ｈＫ１４に対して選択的であり、Ｆ３ペプチドは高いｈＫ１４特異性を示し、別のカリクレインによる開裂を全く検出できなかった。

実施例２−２
材料
以下の材料としては、市販の材料を使用した：エラスターゼ、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、血漿カリクレイン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）、Ｎｉ^２＋−ニトリロ三酢酸アガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）、制限酵素（Ｒｏｃｈｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、抗Ｈｉｓ抗体、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｓｉｇｍａ）。蛍光基質Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＡＭＣはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から購入し、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣはＢａｃｈｅｍから購入し、Ａｂｚ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−ＮＨ２はＮｅｏｓｙｓｔｅｍから購入した。オリゴヌクレオチドの合成は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＳｙｎｅｒｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨによるＤＮＡシークエンシングによって行った。ヒトカリクレイン２、５、１３、１４は酵母系で製造した（Ｙｏｕｓｅｆ ｅｔ ａｌ．，０３ｃ；Ｋａｐａｄｉａ ｅｔ ａｌ．，０３；Ｂｏｒｇｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，０３）。ヒトカリクレイン６は２９３ヒト胎児腎臓細胞系で製造し、ヒトカリクレイン８はバキュロウイルスベクター及びＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞を使用して製造した（Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，９７；Ｋｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，０３）。ＨＫ６及びｈＫ８はＬｙｓ−Ｃで活性化した（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，９８）。

組換え野生型ＡＡＴ及びＡＣＴ並びにそれらの変異体の発現ベクターの構築
ヒトＡＡＴ ｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国）を、オリゴヌクレオチド５’−ＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＡＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＧＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７１）及び５’−ＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＧＧＴＧＧＧＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７２）を使用してＰＣＲによって増幅した。増幅したＡＡＴの遺伝子のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをベクターｐＱＥ９（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）にクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓ６−タグを有する成熟ＡＡＴのオープンリーディングフレームを含むプラスミドｐＡＡＴを得た。ＫａｓＩ及びＢｓｕ３６Ｉ制限部位を生成するサイレント突然変異を、ＲＳＬドメインのＰ１コドンの２４ｂｐ上流及びと１１ｂｐ下流においてｐＡＡＴ２４に導入した。制限部位は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ変異誘発プロトコルに従って、ＫａｓＩ部位についてはオリゴヌクレオチド５’−ＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＣＡＴＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７３）を使用し、Ｂｓｕ３６Ｉ部位については５’−ＧＴＣＴＡＴＣＣＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣ−３’を使用して作成した。野生型ＡＣＴを発現するプラスミドの構築は文献に記載されている（Ｃｌｏｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。

ｒＡＡＴ及びｒＡＣＴ変異体は、適当な鋳型オリゴヌクレオチド：ｒＡＡＴ_Ｅ８、５’−ＣＣＡＴＧＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＣＴＡＴＣＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７５）；ｒＡＡＴ_Ｇ９、５’−ＣＣＡＴＧＴＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＣＧＴＴＧＡＣＴＡＣＧＣＴＡＴＣＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７６）、ｒＡＣＴ_Ｅ８、５’−ＴＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＣＴＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＣＧＣＧＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７７）、ｒＡＣＴ_Ｇ９、５’−ＴＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＡＡＡＣＣＧＴＴＧＡＣＴＡＣＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＣＧＣＧＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７８）から増幅した対応するＤＮＡフラグメントでＲＳＬ領域を置換することによって製造した。鋳型は、隣接領域に対応するプライマー５’−ＧＣＴＧＧＣＧＣＣＡＴＧＴＴＴＣＴＡＧＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７９；ＡＡＴ変異体１）、５’−ＴＴＧＴＴＧＡＡＣＴＴＧＡＣＣＴＣＡＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８０； ＡＡＴ変異体２）及び５’−ＧＴＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８１；ＡＣＴ変異体１）、５’−ＴＣＡＣＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８２； ＡＣＴ変異体２）を使用して増幅した。得られたＰＣＲフラグメントは、ＫａｓＩ／Ｂｓｕ３６ＩフラグメントとしてｐＡＡＴにクローニングし、ＭｌｕＩ／ＳａｃＩＩフラグメントとしてｒＡＣＴＷＴ構造にクローニングし、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。位置Ｐ４及びＰ２’間の反応部位ループにおける変化を表９に示す。

組換え型セルピンの発現と精製
組換え型セルピンは大腸菌株ＴＧ１を使用して製造した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２×ＴＹ培地（１６ｇトリプトン、１０ｇ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）において細胞を３７℃で増殖させた（Ａ_６００＝０．５〜０．７）。イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し（最終濃度：０．５ｍＭ（ｒＡＣＴタンパク質の製造）又は０．１ｍＭ（ｒＡＡＴタンパク質の製造））、１８℃で１６時間にわたって組換え型セルピンを発現させた。細胞を遠心分離によって回収し、０．１体積の冷却したＰＢＳ ２Ｘに再懸濁した。氷上においてリゾチーム（０．５ｍｇ／ｍＬ）と共に４５分間にわたって培養した後、可溶性細胞質タンパク質を４回の凍結／解凍サイクルによって抽出し、ＤＮＡをＤＮアーゼＩで分解した。細胞片を遠心分離によって除去し（２５分、１７，５００ｇ）、Ｎｉ^２＋−ニトリロ三酢酸アフィニティアガロースビーズを４℃で９０分間にわたって上清に添加し、組換え型セルピンに結合させた。樹脂を５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭイミダゾールで３回洗浄し、結合したタンパク質を５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾールで溶離させた。溶離したタンパク質を５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用して４℃で１６時間透析し、タンパク質の純度をクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、イリノイ州ロックフォード）を標準として使用するビシンコニン酸方法（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８５）で測定した。ＡＡＴＥ８、ＡＣＴＥ８、ＡＡＴＧ９、ＡＣＴＧ９をトリプシン及びキモトリプシンによってそれぞれ滴定した。

阻害化学量論（ＳＩ）
ｒＡＡＴ、ｒＡＣＴ及びそれらの変異体のＳＩ値を、各プロテアーゼを各濃度の阻害剤と培養することによって測定した。反応緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０１％ＢＳＡ）内において３７℃で４時間培養した後、残留活性を蛍光基質（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）を添加して検出した。蛍光は、黒い９６ウェルプレート内においてマイクロプレート蛍光リーダーＦＬｘ８００（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用して測定した（３４０ｎｍ（±１５）の励起並びに４８５ｎｍ（±１０）の発光）。ＳＩ値は、断片的速度（阻害酵素反応の速度（ｖｉ）／非阻害酵素反応の速度（ｖ０））と酵素に対する阻害剤のモル比（［Ｉ_ｏ］／［Ｅ_ｏ］）の線形回帰分析の切片に対応する。

反応速度分析
ｈＫ１４と各阻害剤の相互作用の会合速度定数を、疑似一次条件下においてプログレス曲線法を使用して調べた（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｗａｌｓｈ，１９８８）。これらの条件において、所定量の酵素（２ｎＭ）を各濃度の阻害剤（０〜８０ｎＭ）及び過剰の基質（２０μＭ）と混合した。反応は反応緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０１％ ＢＳＡ）内において３７℃で４５分間行い、ＦＬｘ８００蛍光９６ウェルマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、米国）を使用して生成物形成速度を測定した。阻害は反応過程において不可逆的であると考えられ、酵素活性は生成物の生成（Ｐ）（開始速度：ｖ_ｚ）で表され、時間（ｔ）とともに一次速度（ｋ_ｏｂｓ）（阻害剤濃度のみに依存する速度定数）で阻害される。

４つの異なる濃度の各阻害剤について、式１を使用したデータの非線形回帰法によってｋ_ｏｂｓを算出した。阻害剤濃度［Ｉ］に対してｋ_ｏｂｓをプロットすることにより、二次速度定数（ｋ’）（曲線の傾きと等しい（ｋ’＝Δｋ_ｏｂｓ／Δ［Ｉ］）を決定した。阻害剤と基質間の競合のために、基質濃度［Ｓ］及び基質に対する酵素のＫ_ｍを考慮に入れて下記式２を使用して二次速度定数（ｋ）を補正し、ｋ_ａを得た。

ＭｅＯＳｕｃ−ＶＰＲ−ＡＭＣの場合のｈＫ１４のＫ_ｍは８μＭだった。ただし、ｈＫ１４プロテアーゼの純度及び特異的活性に応じてＫ_ｍは変動する。

酵素−阻害剤複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
所定量（１〜２μｇ）の阻害剤を、ＳＩ値の０．５倍、１倍又は２倍に対応する量のｈＫ１４と共に、反応緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）内において４時間培養した。試料を９０℃で１０分間加熱し、還元条件下で１０％ＳＤＳゲルに溶解し、クマシーブルー染色によって可視化した。

組み換え型ｒＡＡＴ及びｒＡＣＴ変異体の阻害特異性（表９）
２ｎＭのトリプシン、キモトリプシン、血漿カリクレイン、ヒト好中球エラスターゼ又はトロンビン及び１０ｎｍのｈＫ２、ｈＫ３、ｈＫ５、ｈＫ６、ｈＫ８、ｈＫ１３又はｈＫ１４を、１００ｎＭ又は５００ｎＭの組換え型阻害剤と共に３７℃で３０分間培養した。蛍光基質（Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（トリプシン及び血漿カリクレイン）、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ（キモトリプシン）、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（トロンビン）、ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＡＭＣ（ヒト好中球エラスターゼ）又はＡｂｚ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−ＮＨ２（ヒトカリクレイン））を添加して残留活性を検出した。

複合体の安定性
ＳＩ値の０倍、１倍、２倍に対応する量の阻害剤と共にＨＫ１４（２ｎＭ）を培養した。反応緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０１％ＢＳＡ）内において３７℃で４、８又は２４時間培養した後，２０μＭの蛍光基質（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）を添加して残留活性を検出した。阻害反応の傾き（速度）を、阻害剤を使用しない場合の対応する反応の傾きで除算した。

可溶性組換セルピンの設計と製造
ｈＫ１４に特異的な阻害剤を開発するために、ファージディスプレイ法を使用してｈＫ１４について選択した２つの基質ペンタペプチドによってｒＡＡＴｗｔ及びｒＡＣＴｗｔの切断性結合の周囲の５つの残基を置換した（Ｆｅｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，０５）。ｈＫ１４酵素活性のプロファイリングにより、ｈＫ１４は二元的なトリプシン様活性及びキモトリプシン様活性を有することが示された。そのため、トリプシン様活性及びキモトリプシン様活性に特異的な２つの基質ペプチド（８Ｅ及びＧ９）を有する阻害剤を開発することにした。これらの基質の切断性結合をｒＡＡＴｗｔ及びｒＡＣＴｗｔのＰ１−Ｐ１’に従って位置合わせした。セルピン変異体のＲＳＬ領域を表９に示す。

組換え型セルピンは可溶性の活性型として製造され、ニッケルアフィニティカラムを使用して一段階工程によって細胞質タンパク質から天然条件下で精製した。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、各阻害剤及びｒＡＡＴ及びｒＡＣＴ変異体の単一バンドは、わずかに速く移動するタンパク質ＡＡＴ_Ｅ８を除いて、分子量に対応する４５〜５０ｋＤａの見かけの大きさで移動することが明らかになった（データは示さず）。全ての阻害剤は、濃度測定分析によって９５％を超える純度を有すると推定された（収率が１〜５ｍｇ／Ｌの範囲）。

阻害化学量論、会合定数及び複合体安定度
阻害化学量論（ＳＩ）は、生理的条件（ｐＨ及びイオン強度）下で調べた。ＳＩは、ｈＫ１４分子を阻害するために必要な阻害剤分子の数を示す。ＳＩ値が１より大きい場合であっても滴定曲線は直線的であり、反応が完全に終了したことを示している。セルピン変異体のＳＩ値は、７．４のＳＩ値を有していたｒＡＡＴ_Ｅ８以外は１〜１．５だった（表１０）。野生型ＡＣＴは試験条件下でｈＫ１４と反応しなかったが、ＡＡＴＷＴ（ＳＩ値＝１）はｈＫ１４に対する優れた阻害剤であることが判明した。ＡＣＴのＲＳＬ領域をｈＫ１４基質ペプチドで置換することにより、酵素に対する反応性を生じさせ、高い親和性を有する阻害剤を作成することができた。一方、ＡＡＴＷＴを骨格として使用すると、全ての阻害剤は野生型ほど効率的ではなかったため、ＲＳＬの変性はそれほど好ましいものではなかった（表１０）。

算出されたＳＩ値は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって示されるようにｈＫ１４との反応後のセルピンの開裂型及び複合体の比と一致していた（データは示さず）。各変異体を、ＳＩ値未満、ＳＩ値と同等又はＳＩ値を超える、プロテアーゼに対する阻害剤の比率に対応する濃度のｈＫ１４と共に培養した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、各セルピン変異体とｈＫ１４の共有結合型複合体（Ｃ）の形成を示し、見かけの分子量は様相値と一致していた。ｈＫ１４濃度がＳＩ値の０．５倍である場合には、明らかに非複合遊離ｈＫ１４によって生成した分解型の複合体が観察された。

阻害剤複合体に加えて、ｈＫ１４との反応によって加水分解された阻害剤のフラクションが生成し、分子サイズはＲＳＬの反応部位又はその近傍において開裂したセルピンと一致していた。ＳＩ値が約１である場合には（ＡＡＴ−Ｇ９、ＡＣＴ−Ｅ８及びＡＣＴ−Ｇ９）、フラクションの量は大きく減少した。一方、１を超えるＳＩ値を有する唯一の変異体であるｒＡＡＴ_Ｅ８はｈＫ１４との基質挙動を示し、不可逆的な複合体の形成ではなく、阻害剤の開裂型の蓄積が主として生じた。予想したとおり、比率［Ｉ］_ｏ／［Ｅ］_ｏがＳＩ値を超えていた場合には完全な阻害剤の存在が観察された（複合体の弱いバンド）。

予期せぬことに、ＡＡＴＧ９について複合体の比較的遅い崩壊が観察された場合でも、複合体のほとんどはＳＤＳ安定であり（データは示さず）、８時間の培養後にｈＫ１４活性が再び現れた。

組換え型セルピンによるヒトｈＫ１４の阻害の反応速度分析は、ｈＫ１４のモル比を変化させて過剰の阻害剤を使用して疑似一次条件下において行った。セルピンとの反応による酵素の時間依存的不活性化を連続的にモニターし、基質ターンオーバー率の減少を調べた。各セルピン濃度における反応のプログレス曲線を式１に当てはめ、速度定数（ｋ_ｏｂｓ）を示す数値を算出した。会合速度定数（ｋ_ａ）は、ｈＫ１４阻害剤の濃度に対するｋ_ｏｂｓ値の傾きから決定した。阻害剤骨格（ＡＡＴ又はＡＣＴ）にかかわらず、基質８Ｅで修飾した組換え型セルピンは、同等のＧ９阻害剤よりも優れたｋ_ａ値を示した。

キモトリプシン様基質（ｒＡＡＴＧ_９及びｒＡＣＴＧ_９）で修飾したセルピンは、ｈＫ１４に対する中程度の親和性のみを示し、会合定数は２１７，０００及び７４，０００Ｍ^−１ｓ^−１だった。一方、ｒＡＣＴＥ８は５７５’０００Ｍ^−１ｓ^−１の会合定数を有していた。

組み換え型ｒＡＡＴ及びｒＡＣＴ変異体の阻害特異性
ｈＫ１４阻害剤の阻害特異性を定義するために、精製した変異体と各種プロテイナーゼの反応を調べた。最初に、トリプシン、キモトリプシン、血漿カリクレイン、ヒト好中球エラスターゼ及びトロンビンを含む、広い特異性を有するプロテナーゼについて調べた。また、同じプロテアーゼファミリーに属する酵素（ｈＫ２、ｈＫ３、ｈＫ５、ｈＫ６、ｈＫ８、ｈＫ１３）に対するｈＫ１４阻害剤の特異性を評価した（表１１）。ｈＫ１４を過剰の阻害剤（［Ｉ］_ｏ／［Ｅ］_ｏ＝５０：１）と共に３０分間培養した場合には、全ての修飾セルピン及びｒＡＡＴｗｔについて残留活性は検出されなかった。これらの条件では、ｒＡＣＴｗｔのみがｈＫ１４に対して弱い阻害活性（１７％）を示した。８Ｅ基質で修飾したセルピンは、他の酵素が阻害剤によって阻害されたため、中程度の特異性を示した。ＡＡＴＧ９とＡＣＴＧ９について非常に高い特異性が観察され、キモトリプシン及びｈＫ５（わずかに阻害）を除き、試験を行った酵素のいずれも阻害されなかった。

実施例３
活性ｈＫ１４の製造と精製
ヒトカリクレイン１４を上述したように製造及び精製した。

ファージディスプレイ法を使用したｈｋ１４の基質ペプチドの選択
基質ファージライブラリーをｈＫ１４に対してパニングし、加水分解活性によって加水分解した基質を選択した。開裂したファージは大腸菌ＴＧ１細胞で増幅し、酵素消化とスクリーニングを５回行った。放出ファージの量は各回毎に増加し、各選別後のより多数のｈＫ１４感受性ファージを確認した。最後のスクリーニングで得られた３２個のファージペプチドのアミノ酸配列をシークエンシングによって決定した。基質領域に対応する配列を表８に示す。選択され、開裂したペプチドの６９％は、ｈＫ１４のトリプシン様活性について予想されたようにＰ１位置に少なくとも１つの塩基性残基を有し、３１％のペプチドはＰ１位置にキモトリプシン様酵素に特異的なチロシン残基を有していた。

ｈＫ１４による基質加水分解の反応速度特性
ファージディスプレイ分析からの配列がｈＫ１４の基質であることを確認し、開裂部位を特定するために、選択された全てのペプチドを蛍光基質形態に構成した。全ての基質は、可変有効性レべル及び２０００〜４８１，０００Ｍ^−１ｓ^−１のＫｃａｔ／Ｋｍ値でｈＫ１４によって加水分解された。開裂の特異性は、ｈＫ１４によって加水分解されないＣＦＰ−ＧＧＧＧＧ−ＹＦＰによって実証した。

２００，０００Ｍ^−１ｓ^−１を超えるＫｃａｔ／Ｋｍ値を有する最も良いｈＫ１４基質はＰ１位置にＡｒｇを有していたため、ｈＫ１４感受性のための好ましいＰ１アミノ酸はＡｒｇであることを示唆している（表１３）。興味深いことに、ｈＫ１４によって最も効率的に開裂した４つのペプチドのうちの２つはＰ２位置にＧｌｕを含んでいた。一方、様々なアミノ酸がＰ１’位置に見られ、Ｐ１’位置には有意な嗜好がないことを示している。しかしながら、２つの基質はＰ１’位置にアスパラギン酸を有し、比較的効率的に開裂した。

一方、Ｐ１位置にＬｙｓを有する全ての基質は、３４，０００Ｍ^−１ｓ^−１よりも低いＫｃａｔ／Ｋｍ値で開裂した。同様に、Ｐ１位置にチロシンを有する基質の開裂速度は、１３４，０００Ｍ^−１ｓ^−１のＫｃａｔ／Ｋｍ値を有するペプチドＧ９以外は非常に低かった。Ｐ１位置にリジン又はチロシンを有する基質の約５０％がグリシン残基を有していたＰ１’位置を除き、アミノ酸は他の位置において復元されなかった。

選択された基質の多くは他のプロテアーゼによる開裂に潜在的な感受性を有するモチーフを含んでいたため、ｈＫ２、血漿カリクレイン、ＰＳＡ、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼがｈＫ１４基質を開裂させる程度を測定した（表１２）。各基質は、基質リンカーを特異的に開裂させる酵素濃度で試験を行った。

予想通り、トリプシン様基質のほとんどは、ｈＫ１４選択性と厳密な相関を有していない可変的な有効性でトリプシンによって開裂した。例えば、ペンタペプチドＶＧＳＬＲ及びＲＱＴＮＤはｈＫ１４に最も適した基質だが、トリプシンの場合に約５０，０００，０００Ｍ^−１ｓ^−１のＫｃａｔ／Ｋｍ値を示すＬＳＧＧＲペプチド等の他のペプチドと比較して、トリプシンによってそれほど効率的に開裂しなかった。一方、Ｐ２位置にＧｌｎを有するぺプチドは、ｈＫ１４及びトリプシンの好適な基質だった。キモトリプシン様基質を除き、ｈＫ１４基質（ＲＶＴＳＴ及びＶＶＭＫＤ）はトリプシンによって開裂しなかった。

ｈＫ１４、キモトリプシン及びエラスターゼに対してほとんど同じｋｃａｔ／Ｋｍ値を有する基質ＴＶＤＹＡを除き、全てのキモトリプシン様基質はキモトリプシンによってｈＫ１４よりも効率的に開裂した。また、エラスターゼは、ＰＳＡ及びＴＳＹＬＮによってわずかに開裂する２つの選択されたペプチドＴＳＹＬＮ及びＹＱＳＬＮを分解した。

選択された基質は、ｈＫ１、ｈＫ２、ＰＳＡ、ＰＫ等の他のヒトカリクレインと比較してｈＫ１４に対して高い選択性を示した。ｈＫ２のみが、ｈＫ１４の少なくとも５倍低いＫｃａｔ／Ｋｍ値でトリプシン様基質のほとんどを分解した。例えば、ＮＱＲＳＳペプチドは、ｈＫ２及びＰＫよりも２７倍及び７８倍ｈＫ１４に対して選択的である。

本研究は、ｈＫ１４の２種類のペンタペプチド基質であるトリプシン様基質及びキモトリプシン様基質を特定した。しかしながら、いくつかの芳香族残基を含む基質の選択にもかかわらず、ｈＫ１４は、トリプシン様開裂特異性ではなく、キモトリプシン様開裂特異性を有していた。最も高いＫｃａｔ／Ｋｍを有する基質はＰ１位置にアルギニンを有しており、アルギニン酸に対する選択性を示している（表１４）。一方、リジンはＰ１位置においてチロシンよりも適していないように思われる。これらのアミノ酸が同一のペプチド内に存在していた場合には、ｈＫ１４チロシン残基の後に開裂した。また、キモトリプシン様基質の１つであるＴＶＤＹＡは、リジン−Ｐ１基質（３４，０００Ｍ^−１ｓ^−１）よりも有意に高い反応速度（１３４，０００Ｍ^−１ｓ^−１）を有していた。Ｐ１’位置に関してはｈＫ１４の選択性は観察されなかった。Ｐ１’位置では、最適な基質において小さく、荷電されていない疎水性の正又は負に荷電された残基等の異なるアミノ酸が見られ、他の周囲位置の分析により、ｈＫ１４は様々なアミノ酸に受容され得ることが示された。これは、ｈＫ１４がトリプシン又はキモトリプシンのような広範囲の活性を有することを意味するものではなく、状況に応じて異なる配列を開裂させる能力があることを示すものである。

トリプシン様活性に劣るとしても、ｈＫ１４のキモトリプシン様活性は興味深いものである。本願発明者らの知る限りでは、カリスタチン及びいくつかの誘導ペプチドにおいてｈＫ１によって開裂するＰｈｅ−Ｐｈｅ結合を除き、これが二元的活性を有するヒトカリクレインに関する最初の記載である。従って、ｈＫ１４の特異性ポケットの立体配座は、基質Ｐ１位置において芳香族及び塩基性アミノ酸側鎖を収容し、ｈＫ１４の二元的なキモトリプシン様活性及びトリプシン様活性をもたらす。

ｈＫ１４特異的阻害剤の開発
阻害剤の特異性を変化させるために、α１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）及びα１−アンチトリプシン（ＡＴ又はＡＡＴ）のＲＳＬの修飾を行った。次に、選択された基質（Ｇ１、Ｃ１１Ｅ５、８Ｅ、Ｆ３、Ｆ１１、Ｇ９）をセルピンの反応部位ループに移植し、ヒトカリクレインｈＫ１４を阻害することができる新しい変異体を生成した。ぺプチドＧ１及びＣ１１の配列を使用して二以上の阻害剤変異体を作成した。

より有効な比較ができるように、阻害化学量論（ＳＩ）及び阻害反応速度（ｋａ）の決定は、全ての酵素について生理的なｐＨ及びイオン強度条件下で行った。新たに作成したＡＣＴ変異体のほとんどは、野生型ＡＣＴよりもｈＫ１４に対して低いＳＩ値を示した。これらの変異体ｒＡＣＴ_Ｃ１１、ｒＡＣＴ_Ｃ１１Ｄ、ｒＡＣＴ_Ｇ９及びｒＡＣＴ_Ｅ８は、ｈＫ１４に対して最も低い阻害化学量論値（それぞれ４．８、２．８、１．５、１．２）及び最も高い会合定数（６５，０００、７４，０００、７５，０００、５７５，０００ Ｍ^−１ｓ^−１）を有していた。

ＡＣＴとは対照的に、セルピンＡＡＴｗｔは２６３，０００Ｍ^−１ｓ^−１の会合定数を有するｈＫ１４に適した阻害剤である。全てのＡＡＴ変異体はＡＡＴｗｔよりも低い会合定数を有していたが、それぞれ１６８，０００、２１７，０００、２４２，０００、２５７，０００及び６３，０００Ｍ^−１ｓ^−１のｋａを示すＡＡＴＧ１、ＡＡＴＧ９、ＡＡＴＥ８、ＡＡＴＧ１ｇ及びＡＡＴＣ１１等の、ＡＡＴ変異体のいくつかは高い反応速度でｈＫ１４と反応する。２種類のＡＴ変異体のみがｈＫ１４を阻害しなかった。

トリプシン、ヒト好中球エラスターゼ、キモトリプシン、血漿カリクレイン（ＰＫ）、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、トロンビンを含む酵素をスクリーニングし、ｈＫ１４に対するＳＩ値が１０未満であるＡＣＴ及びＡＡＴ変異体の阻害特異性を調べた（表１８）。過剰の阻害剤（［Ｉ］_ｏ／［Ｅ］_ｏ＝５０：１）と共に３０分間培養した場合には、ｈＫ１４は完全に（１００％）阻害された。この条件下では、ＡＡＴｗｔ（１００％阻害）と比較して、野生型ＡＣＴはｈＫ１４に対して１７％の阻害活性を示した。これらのＡＣＴ変異体のうち、２種類（ｒＡＣＴ_Ｃ１１及びｒＡＣＴ_Ｃ１１Ｄ）はｈＫ１４に対する特異性を示し、トリプシンとキモトリプシン以外の酵素は阻害しなかった。ＡＡＴ変異体の場合には、ＡＡＴｗｔと比較して明らかに高いｈＫ１４に対する特異性を示した。ＡＡＴ_Ｇ９はｈＫ１４に対して非常に特異的であり、トリプシン様プロテアーゼに対する反応性は示さなかった。

ＡＣＴ変異体を阻害する他のｈＫ１４を、ｈＫ１４に関連する組織カリクレインに対してスクリーニングした。試験を行ったカリクレインの異なったサブセットに対して部分的な阻害が観察された。

ｈＫ１４ファージディスプレイ選択基質のＲＳＬ開裂部位の置換により、野生型セルピン（ＡＣＴ及びＡＡＴ）はｈＫ１４に対して高い感受性を有する阻害剤（特に特有の反応性を示すＡＡＴＧ９）に変換された。本願発明者らの知る限りでは、これはｈＫ１４に特異的な阻害剤の開発に関する最初の報告である。いくつかの組換え型阻害剤がｈＫ１４以外の酵素を阻害したという事実は、トリプシン様プロテアーゼ間には基質相同性があるために驚くべきものではない。また、他の酵素に対する組換え型阻害剤の反応速度も測定する必要がある。

実施例４
ネザートン症候群マウスモデルを使用し、局所投与によるＭＤＰＫ６７ｂ（ｒＡＣＴ_６．７）の潜在的な皮膚病治療効果を調べた。

設計例
２％ナトロソル（ｗ／ｖ）に２ｍｇ／ｍＬの分子を添加した。処方は、トリプシン（代用生体内基質）に対するＭＤＰＫ６７ｂ阻害性を維持する生体外拡散評価基準に従って選択した。溶液として調製した２ｍｇ／ｍＬのＭＤＰＫ６７ｂを、分子シヤリングを防止するためにゆっくりと撹拌しながら、２％ナトロソル（ｗ／ｖ）及びＰＢＳ１Ｘ（ｐＨ７．４）に４℃で添加した。ヒドロゲルのない適切な阻害剤製剤を製造するために、混合物を撹拌しながら４℃で慎重に均質化した。塊及びシヤリングなく均質な製剤を得るために、ナトロソルは粉末としてＭＤＰＫ６７ｂ溶液に添加した。

滅菌性を維持するために、溶液はオートクレーブ処理するか、０．２２μｍのフィルタで濾過した。

ＭＤＰＫ６７ｂ ２ｍｇ／ｍＬ／ヒドロキシエチルセルロース製剤は、４ｍｇのＭＤＰＫ６７ｂ、２ｍｌのＰＢＳ１ｘ（ｐＨ７．４）及び０．０４ｇのナトロソルを含んでいた。製剤は、４℃で保存するか、一晩凍結乾燥した後に−２０℃で保存した。生体内における使用前にＭＤＰＫ６７ｂのプロテアーゼ阻害性を生体外で調べた。

ＭＤＰＫ６７ｂの潜在的治療効果は、病変重症度（低重症度（１）〜高重症度（４））の異なる１２匹の遺伝子変異ＫＬＫ５マウス群で評価した（図３０）。第１群には０．３ｍｌの賦形剤と２％ナトロソルを１日に１回与え、第２群には２８日間にわたって２％ナトロソルに０．３ｍＬのＭＤＰＫ６７ｂを添加（２ｍｇ／ｍＬ）して１日に１回与えた。この期間は、マウスモデルにおける２回の表皮更新に対応する。

マウスにおける病変重傷度及び病変サイズ表現型の変化を監視した。病変サイズは３日毎に測定し、病変重傷度は毎日調べた。

結果（図３１）
ＭＤＰＫ６７ｂを与えたＫＬＫ５遺伝子導入マウスとＭＤＰＫ６７ｂを与えていないＫＬＫ５遺伝子導入マウスを比較すると、賦形剤群（第１群）と比較してＭＤＰＫ６７ｂ群（第２群）では病変サイズが減少した。賦形剤対照群のほとんどで病変サイズは増加したが、ＭＤＰＫ６７ｂ投与群のほとんどが病変サイズの減少を示した。

病変サイズの明らかな増加は、第１群の３匹及び第２群の１匹で観察された。病変サイズのわずかな増加は、第２群の１匹で観察された。第１群の１匹では変化が見られなかった。病変サイズの減少は、第１群の１匹及び第２群の３匹で観察された。防御効果は重傷度の低いマウスで大きいように思われた。

また、ＭＤＰＫ６７ｂの局所投与によって病変重傷度は明確に影響を受けた。１ＭＤＰＫ６７ｂを与えた被験動物の１匹は表現型の完全な復帰を示した。第２のＭＤＰＫ６７ｂ投与マウスでは部分的な復帰が見られた。防御効果は重傷度の低いマウスで大きいように思われた。

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Claims (10)

1. ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８の組替え型セリンプロテアーゼ阻害剤の、ネザートン症候群を治療するための薬剤の調製における使用。
2. 請求項１において、前記セリンプロテアーゼが、カリクレイン、プラスミン、キモトリプシン（Ｃｈｔｒ）、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、トリプターゼ、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）酵素及び／又はそれらの組み合わせからなる群から選択される使用。
3. 請求項２において、前記カリクレインが、ｈＫ２、ｈＫ３、ｈＫ４、ｈＫ５、ｈＫ６、ｈＫ７、ｈＫ８、ｈＫ９、ｈＫ１０、ｈＫ１１、ｈＫ１２、ｈＫ１３、ｈＫ１４又はｈＫ１５、及び／又はそれらの組み合わせからなる群から選択される使用。
4. 請求項３において、前記カリクレインが、ｈＫ２、ｈＫ５、ｈＫ７、及びｈＫ１４、及び／又はそれらの組み合わせからなる群から選択される使用。
5. 皮膚病を治療又は予防するためのキットであって、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８の組換え型セリンプロテアーゼ阻害剤と、試薬及び／又は取扱説明書と、を含むキット。
6. ネザートン症候群を改善するための化粧組成物であって、薬学的有効量の、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８の組換え型セリンプロテアーゼ阻害剤を含む化粧組成物。
7. 請求項６において、前記セリンプロテアーゼが、カリクレイン、プラスミン、キモトリプシン（Ｃｈｔｒ）、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、トリプターゼ、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）酵素及び／又はそれらの組み合わせからなる群から選択される化粧組成物。
8. 請求項７において、前記カリクレインが、ｈＫ２、ｈＫ３、ｈＫ４、ｈＫ５、ｈＫ６、ｈＫ７、ｈＫ８、ｈＫ９、ｈＫ１０、ｈＫ１１、ｈＫ１２、ｈＫ１３、ｈＫ１４又はｈＫ１５、及び／又はそれらの組み合わせからなる群から選択される化粧組成物。
9. 請求項８において、前記カリクレインが、ｈＫ２、ｈＫ５、ｈＫ７、ｈＫ１４及び／又はそれらの組み合わせからなる群から選択される化粧組成物。
10. ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８の組替え型セリンプロテアーゼ阻害剤の、ネザートン症候群を改善するための化粧組成物の調製における使用。