JP2011511766A - 皮膚病の治療におけるセリンプロテアーゼ阻害剤の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
I.非極性又はわずかに極性を有する低分子量の脂肪族残渣:Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
II.極性を有する正に荷電した残基:His、Arg、Lys
III.極性を有する負に荷電した残基及びそれらのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln
IV.高分子量の芳香族残基:Phe、Tyr、Trp
V.高分子量で非極性の脂肪族残基:Met、Leu、Ile、Val、Cys
ファージディスプレイ選択基質を使用したヒトhK2に特異的な組換え型ACT阻害剤の開発
国際特許出願第PCT/IB2004/001040号(ローザンヌ大学)の開示内容を本願明細書に援用する。
hK2及びhK3(PSA)は公知の方法によってヒト精液から精製し(Frenette G,Gervais Y,Tremblay RR,Dube JY.1998,「Contamination of purified prostate−specific antigen preparations by kallikrein hK2」,J Urol 159,1375−8)、抗hK2モノクローナル抗体及び抗PSAモノクローナル抗体は、カナダ・ラバル大学のRR Tremblay教授から寄贈を受けた。ヒトキモトリプシン(Chtr)、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)、ヒトカリクレインhK1、ヒト血漿カリクレイン(PK)、ヒト好中球エラスターゼ(HNE)及び市販のACT(ヒト血漿α1−アンチキモトリプシン)はCalbiochem社から購入した。Z−Phe−Arg−AMC、Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−AMC、Z−Gly−Gly−Arg−AMC、MeOSuc−Ala−Ala−Pro−Val−AMCはCalbiochem社から購入した。CFP−TFRSA−YFP蛍光基質は公知の方法によって得た(Mahajan NP et al.1999,「Novel mutant green fluorescent protein protease substrates reveal the activation of specific caspases during apoptosis」,Chem Biol 6,401−9)。ヒトα1−アンチキモトリプシン(ACT)のcDNAは、ペンシルベニア大学のHarvey Rubin博士から寄贈を受けた。
ACTのcDNAをpQE−9発現ベクター(Qiagen、ドイツ)にサブクローニングし、rACTWTのN末端にHis6タグを導入した後、2つの制限部位Sac II及びMlu Iを、RSLドメインのP1コドンの18bp上流及び18bp下流にそれぞれ導入した。これらの部位は、Stratagene社のquickchange変異誘発プロトコルに従って、Sac II部位についてはオリゴヌクレオチド5’−GTGATTTTGACCGCGGTGGCAGCAG−3’を使用し、Mlu I部位についてはオリゴヌクレオチド5’−GCACAATGGTACGCGTCTCCACTAATG−3’を使用したサイレント変異によって作成した。
基質ファージライブラリーは、修飾pH0508bファージミドを使用して生成した(Lowman et al.,1991,「Selecting high−affinity binding proteins by monovalent phage display」,Biochemistry 12,10832−8)。基質ファージライブラリーは、M13遺伝子IIIのカルボキシル末端ドメイン(コドン249〜406)に先行するGly−Gly−Gly−Ser−repeat−rich領域の両端にHis6タグを有する。ランダムペンタマーは、隣接部位に対応する5’ビオチン化プライマー(5’−TGAGCTAGTCTAGATAGGTG−3’(SEQ ID No.83)及び5’−TGCAGCGACTGCTATGA−3’)を使用し、変性コドンの両端に適当な制限部位が位置する鋳型オリゴヌクレオチド(5’TGAGCTAGTCTAGATAGGTGGCGGTNNSNNSNNSNNSNNSGGGTCGACGTCGGTCATAGCAGTCGCTGCA−3’(Nはヌクレオチドであり、SはG又はCである))のPCR伸長法によって生成した。
ペンタペプチドライブラリーに対して、hK2によるスクリーニングを8回行った。セファロースビーズ(Ni2+−ニトリロ三酢酸樹脂)に結合したNi2+−アンモニア三酢酸100μLを、1mg/mL−1のBSAを含む10mLのNaCl/Piで洗浄した。ファージ粒子(1011)は平衡Ni2+−ニトリロ三酢酸樹脂に添加し、穏やかに撹拌しながら4℃で3時間にわたって結合させた。次に、樹脂を洗浄(NaCl/Pi/BSA 1mg/mL−1、5mMイミダゾール、0.1% Tween 20)して未結合のファージを除去し、NaCl/Pi内で平衡化した。基質ファージを37℃で45分間にわたって27nM(最終濃度)のhK2に暴露した。また、プロテアーゼを使用しない対照スクリーニングも行った。上清に放出された開裂ファージを大腸菌XL1ブルーを使用して増幅し、以降のスクリーニングに使用した。パニングを8回行った後、約15個のクローンを5回目、6回目及び8回目のスクリーニングから選択し、プラスミドDNAを単離し、基質をコードする領域についてシークエンシングを行った。
隣接領域に対応するプライマー(5’−TACCGCGGTCAAAATC−3’(SEQ ID No.67)及び5’−TCACGCGTGTCCAC−3’(SEQ ID No.68))を使用し、鋳型オリゴヌクレオチドのPCR伸長により、P3とP3’の間の位置の反応部位ループの変化に対応する6つの変異体(表3を参照)を生成した。
rACT6.3,5’−TACCGCGGTCAAAATCACCAGGAGGTCTATCGATGTGGAGACGCGTGA−3’((SEQ ID No.62)
rACT8.3,5’−TACCGCGGTCAAAATCAGGGGGAGATCTGAGTTAGTGGAGACGCGTGA−3’(SEQ ID No.63)
rACT6.7,5’−TACCGCGGTCAAAATCAAGCTTAGAACAACATTAGTGGAGACCGCTGA−3’((SEQ ID No.64)
rACT6.1,5’−TACCGCGGTCAAAATCATGACAAGATCTAACTTAGTGGAGACGCGTGA−3’(SEQ ID No.65)
rACT5.18,5’−TACCGCGGTCAAAATCACCGAGCGTGTCTCGCCCGTGGAGACGCGTGA−3’(SEQ ID No.86)
hK2及び他の酵素によるrACTWT及びその変異体の阻害について阻害化学量論(SI)値を調べた。初期試験は、hK2、PSA、hK1、キモトリプシン(Chtr)、血漿カリクレイン(PK)、ウロキナーゼ(uPA)、ヒト好中球エラスターゼ(HNE)酵素に対してモル過剰(100倍)のrACTを使用して行った。反応は反応緩衝液(50mMトリス(pH7.5)、150mM NaCl、0.05% Triton X−100、0.01% BSA)内において25℃で30分間(PSAの場合には37℃で90分間)行い、蛍光基質(Z−Phe−Arg−AMC(hK1、hK2、PK)、Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−AMC(Chtr)、Z−Gly−Gly−Arg−AMC(uPA)、MeOSuc−Ala−Ala−Pro−Val−AMC(HNE)又はCFP−TFRSA−YFP(PSA))を添加することによって残留酵素活性を測定した。阻害剤の存在下における酵素の活性を非阻害反応と比較した。阻害が観察される反応では、異なる濃度の組換え型セルピンを培養することによってSIを調べた。断片的活性(阻害酵素反応の速度/非阻害酵素反応の速度)と酵素に対する阻害剤のモル比([Io]/[Eo])の線形回帰分析を使用し、阻害化学量論(切片に対応)を得た。
hK2、キモトリプシン、PK、HNEと各rACTの相互作用の会合速度定数を、疑似一次条件下においてプログレス曲線法を使用して調べた(Morrison JF,Walsh CT. 1988,「The behavior and significance of slow−binding enzyme inhibitors」,Adv.Enzymol. Relat.Areas Mol.Biol 61,201−301)。これらの条件において、所定量の酵素(2nM)を各濃度の阻害剤(0〜800nM)及び過剰の基質(10μM)と混合した。各反応は反応緩衝液(50mMトリス(pH7.5)、150mM NaCl、0.05% Triton X−100、0.01% BSA)内において25℃で45分間行い、FLx800蛍光96ウェルマイクロプレートリーダー(Biotek、米国)を使用して生成物形成速度を測定した。このモデルでは、阻害は反応過程において不可逆的であると考えられ、酵素活性は生成物の生成(P)(開始速度:vz)で表され、時間(t)とともに一次速度(kobs)(阻害剤濃度のみに依存する速度定数)で阻害される。
カリクレインhK2と各組換え型ACTを、50mM Tris,200mM NaCl、0,05% Triton X−100内において100:1の[I]o:[E]o比で37℃で3時間培養した。タンパク質試料を95℃で5分間加熱した後、SDS PAGE(12%アクリルアミド、T:C比=19:1)で分離し、Hybond−ECL(Amersham Pharmacia)硝酸セルロースにエレクトロブロッティングした。マウス抗hK2モノクローナル抗体及びアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体を使用して遊離hK2及びhK2−ACT複合体を検出した。ECL検出キット(Amersham Pharmacia Biotech)を使用してウエスタンブロットを可視化した。hK2とACT8.3又はACT6.7を、50mM Tris,200mM NaCl、0,05% Triton X−100内において10:1の[I]o:[E]o比で25℃で30分間(速度論条件)培養した。抗His6モノクローナル抗体を使用したウェスタンブロットによってタンパク質を検出し、次に上述した二次抗体とプロトコルを使用して検出した。
野生型セルピンα1−アンチキモトリプシンを使用してカリクレインhK2の特異的阻害剤を開発した。rACTWTのRSL構造に位置する残基P3〜P3’を、上述したファージディスプレイ法によって選択した基質ペンタペプチドで置換した。表4に示す6種類のrACT変異体を設計・作成した。基質ペプチドの切断性結合を、Leu−358−Ser−359に従ってセルピンのRSLに位置合わせした。rACTWT及びその変異体は、N末端位置にHisタグを含む融合タンパク質として大腸菌TG1において発現させた。それらは低温で製造し、タンパク質蓄積を主として活性可溶性型とした。自然条件下で精製すると、生成レベルは1.0〜2.5mg/Lの間で変動した。変異体6.1及び野生型ACT等の精製セルピンの純度(SDS−PAGE分析で推定)は98%を超えていた。
ヒト好中球エラスターゼ、キモトリプシン様(Chtr、PSA又はhK3)及びトリプシン様(hK2、hK1、PK、uPA)プロテイナーゼを含む酵素をスクリーニングしてrACT変異体の阻害特異性を調べた(表4)。
最も有用な比較ができるように、阻害化学量論の決定は、全ての酵素について生理的なpH及びイオン強度条件下で行った。キモトリプシンに対する組換え野生型ACTのSI値は2(表5)であり、市販のACTによって同様な条件下で得られた数値と同じだった。
hK2とrACT8.20、rACT6.2、rACT8.3、rACT6.7、rACT6.1、rACT5.18又は野生型rACTを、100:1のI:E比で37℃で3時間培養した。マウス抗hK2抗体を使用し、還元条件下でhK2(rACT8.20)、rACT6.2、rACT8.3、rACT6.7、rACT6.1、rACT5.18又は野生型rACTとrACTの反応生成物のウェスタンブロット分析を行い、酵素との相互作用後の阻害剤の経過を調べた。hK2とACT変異体を培養すると、遊離hK2(E)は完全に消失し、共有結合型複合体(EI)が形成された。得られた共有結合型複合体は、16時間の培養期間にわたって高い安定性を示した(データは示さない)。野生型ACTはゆっくりとhK2を阻害し、3時間の培養後にほとんどが非複合化された。hK2について測定された高いSI値は、ACT変異体阻害剤の非複合体形成分解によるものではなかった。
変異体ACTの阻害反応速度を、これらの阻害剤に対して反応性を示す各プロテアーゼについて測定した。hK2と組換え型セルピンの相互作用を、疑似一次条件下においてプログレス曲線法を使用して測定した。hK2(2nM)及び基質Z−FR−AMC(10μM)を、所定量(20〜800nM)の阻害剤rACT8.20、rACT5.18、rACT6.2、rACT8.3、rACT6.7、rACT6.1に添加した(データは示さず)。代表的なプログレス曲線に対して式1を使用して非線形回帰分析を行い、セルピン濃度に対して速度(kobs)をプロットした。kobsを決定した後、対応する基質についてプロテアーゼのKmを使用して会合定数(ka)を算出した(表6)。キモトリプシンに対する野生型ACTのka値は公表されているデータと同一だった(Cooley et al.,2001,「The serpin MNEI inhibits elastase−like and chymotrypsin−like serine proteases through efficient reactions at two active sites」,Biochemistry 40,15762−70)。組換え型rACT6.7はhK2に対して最も高いka値(8991M−1s−1)を示したが、PKに対するka値は45倍低かった。一方、組換え型rACT6.2はhK2とPKに対して同等なka値を有し、これらのプロテアーゼが識別されていないことを示した。hK2に特異的な組換え型阻害剤であるrACT8.3及びrACT5.18のka値はさらに低く(それぞれ2439及び595M−1s−1)、非特異的なACT8.20はhK2に対してChtr、PK及びHNEよりも高い1779M−1s−1のka値を示した。組換え型セルピンの1つ(rACT6.1)はPKに対してhK2より高い速度で反応した。
実施例1及び2で作成した各阻害剤の純度について、還元条件下においてSDS−PAGE分析を行った。
阻害剤をさらに分析し、ヒトカリクレインhK2及びhK3、血漿カリクレイン、トリプシン、ウロキナーゼ、エラスターゼ、トロンビン、hK14及びヒトカリクレイン8を阻害する特異性及び親和性について評価した(表7)。hK2及びhK3は異なる酵素特異性(hK2:トリプシン様、hK3:キモトリプシン様)を有しているが、ACTによって阻害される。ACTは循環血液における天然のhK3阻害剤であると考えられているが、hK2の阻害はhK3と比較して弱い。
ヒトhK14に特異的な基質活性部位の作成
国際特許出願第PCT/IB2006/000574号(ローザンヌ大学)の開示内容を本願明細書に援用する。
以下の材料としては、市販の材料を使用した:エラスターゼ、トリプシン、キモトリプシン、血漿カリクレイン(Calbiochem)、ヒトラミニン10及び11(Chemicon)、ヒトコラーゲンIV(Life Technologies)、T4 DNAリガーゼ(Invitrogen)、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Qbiogene)、Ni2+−ニトリロ三酢酸アガロースビーズ(Qiagen)、制限酵素(Roche、Amersham Pharmacia、Promega)、抗His抗体(Sigma)。オリゴヌクレオチドの合成は、Invitrogen及びSynergene Biotech GmbHによるDNAシークエンシングによって行った。ヒトカリクレイン2及び前立腺特異的抗原は、公知の方法によってヒト精漿から精製した(Frenette et al.,1997;Frenette et al.,1998)。マトリリン−4はR.Wagenerから寄贈を受けた。
Superscript(商標)preamplification system(Gibco BRL,メリーランド州ゲイザースバーグ)を使用し、逆転写酵素によってファーストストランドcDNA合成を行った(鋳型:2μgのヒト小脳RNA(Clontech、カリフォルニア州パロアルト))。最終的な反応物質量は20μLだった。RT−PCRの効率を確認するために、アクチン(ハウスキーピング遺伝子)(ActinS:5’−ACAATGAGCTGCGTGTGGCT、ActinAS:5’−TCTCCTTAATGTCACGCACGA)に特異的なプライマーを使用し、1μLのcDNをPCRによって増幅した。予想された長さ(372塩基対(bp))を有するアクチンPCR産物を、臭化エチジウムによって染色した2%アガロースゲル上で可視化した。
PmeI線状化pPICZαA−KLK14及び空のpPICZαA(陰性対照)を、化学的に能力のあるP.pastoris酵母株X−33に形質転換し、相同組換えによって酵母ゲノムに組み込んだ。次に、形質転換したX−33細胞を、選択試薬としてZeocin(商標)を含むYPDS(1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%ブドウ糖、1Mのソルビトール、2%寒天)プレートに播種した。安定した酵母形質転換体を製造者の推奨に従って選択し、プレート撹拌機(250rpm)上で緩衝グリセロール複合(BMGY)培地(1%酵母抽出物、2%ペプトン、100mMリン酸カリウム(pH6.0)、1.34%酵母窒素原基礎培地、40mg/Lのビオチン、1%グリセロール)内において30℃で一晩接種し、BMMY(1%グリセリンの代わりに0.5%メタノールを使用する以外はBMGYと同じ)内においてOD600=1.0に希釈し、上述した条件で6日間培養した(1%メタノールを毎日補充)。上清を遠心分離(4000xg,20分間)によって回収した。
組換え型hK14を、AEKTAFPLCクロマトグラフィーシステム(Amersham Biosciences、ニュージャージー州ピスキャタウェイ)の5mL HiTrap(商標)カルボキシメチル(CM)セファロースFast Flowカラムを使用したカチオン交換によって酵母培養上清から精製した。上清を0.22μmのディスポーザブルフィルターで濾過し、Amicon(商標)YM10膜(Millipore Corporation、マサチューセッツ州ベッドフォード)を使用した限外濾過によって50倍に濃縮した。次に、濾過・濃縮した上清をAEKTAFPLCシステムのインジェクタに導入し、0.8ml/分の流量で5mLの10mM MES緩衝液(pH5.3)で平衡化したCMセファロースカラムに添加した。カラムを上述した平衡緩衝液で洗浄し、吸着されたhK14を10mM MES(pH5.3)内において150mLのKClで3ml/分の流量で0〜1Mに溶離した。5mLの溶出画分を回収し、分析した。hK14を含む画分をプールし、Biomax−10 Ultrafree(登録商標)−15の遠心分離フィルタ装置(Millipore Corporation、マサチューセッツ州ベッドフォード)を使用して10倍に濃縮した。精製hK14のタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン(Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックフォード)を較正に使用するビシンコニン酸方法(Smith et al.,1985)で測定した。組換え型hK14タンパク質の純度をSDS−PAGEによって分析し(Laemmli、1970)、クマシーブルー染色及び/又は抗hK14ポリクローナルウサギ抗体を使用したウェスタンブロット解析を行い(Borgono et al.,2003)、組換え型hK10について詳細に説明されているように、相同性をタンデム質量分析法で確認した(Luo et al.,2001)。
g3pに融合したランダムペンタペプチドのN末端に6個のHis残基を含む基質ファージライブラリーを生成するために、Lowman 博士(Genentech、カリフォルニア州サンフランシスコ)から入手したファージミドを改変した。6個のHis残基により、ファージはNi−NTAカラムに固定された。
供与体としてシアン蛍光タンパク質を使用し、受容体として黄色蛍光タンパク質を使用した組換え型の蛍光基質を公知の方法で作成した(Felber et al.,2004)。適当な制限部位(BssHII;SalI)を有する合成遺伝子を使用して、CFP及びYFPタンパク質の間のペンタペプチド(太字)を変更してCFP−XXXXX−YFP−6xHis組換えタンパク質を作成した。得られた組換えタンパク質は、CFP及びYFPタンパク質の間にGly−Ala−Leu−Gly−Gly−XXXXX−Gly−Ser−Thrを含んでいた。組換えタンパク質を製造するために、TG1細胞を対応する構造で形質転換し、Ni2+−NTAアガロースビーズを使用してアフィニティークロマトグラフィーで精製した。精製されたCFP−YFP組換え型基質の純度と量をLaemmliに従ってSDSゲル電気泳動によって評価し、クマシーブルー染色及び特異的抗His一次抗体(1/3000希釈)、マウス抗Fab二次抗体(1/50000希釈)及びECL装置(Amersham)を使用したウェスタンブロット解析を行った。全てのクローンは評価前にシークエンシングを行った。
各プロテアーゼ及び公知の方法で計算したKcat/Km値についてCFP−基質−YFPタンパク質の基質特異性を調べた(Felber et al.,2004)。簡単に説明すると、CFP−X5−YFPタンパク質の蛍光を、黒い96ウェルプレート内においてマイクロプレート蛍光リーダー(Bio−Tek Instruments, Inc.)を使用して測定した(440nm(±15)の励起並びに485nm(±10)及び528nm(±10)の発光)。150nMの濃度を有する各組換え型基質を、それぞれ8nM、0.1nM、0.3nM、2μM、10nM、10nM、0.5nMの最終濃度でhK14、キモトリプシン、トリプシン、PSA、hK2、血漿カリクレイン又はエラスターゼと培養した。反応は、反応緩衝液(50mMトリス(pH7.5)、100mM NaCl、0.05% Triton−X100)内において37℃で60分間行った。初速度判定のための酵素濃度は、基質リンカーを特異的に加水分解するが、陰性対照として使用したGGGGG基質を加水分解しないレベルに選択した。生成物の生成に対応する蛍光の外観を分光分析によって測定した(440nm(±15)の励起並びに485nm(±10)の発光)。SDS−PAGEで評価した各ペプチドの完全加水分解から得られた検量線に基づき、傾きを1秒毎に発生する生成物のnm単位に変換した。反応速度パラメータkcat/Kmは、推定Kmでよりもかなり低い基質濃度を使用して疑似一次条件下で決定した(Felber et al.,2004)。
基質ファージライブラリーをhK14に対してパニングし、加水分解活性によって開裂した基質を選択した。開裂したファージは大腸菌TG1細胞で増幅し、酵素消化とスクリーニングを5回行った。放出ファージの量は各回毎に増加し、各選別後のより多数のhK14感受性ファージの存在を示唆している。最後のスクリーニングで得られた32個のファージペプチドのアミノ酸配列をシークエンシングによって決定した。基質領域に対応する配列を表1に示す。選択され、開裂したペプチドの69%は、hK14のトリプシン様活性について予想されたようにP1位置に塩基性残基を有し、31%のペプチドはP1位置にキモトリプシン様酵素に特異的なチロシン残基を有していた。
ファージディスプレイ分析からの配列がhK14の基質であることを確認し、開裂部位を特定するために、選択された全てのペプチドを蛍光基質形態に構成した。基質系は、基質によって結合されたCFPからYFPまでのエネルギー伝達に基づくものである。プロテアーゼによるリンカーの開裂により、2つのフルオロフォアは分離され、エネルギー輸送のロスが生じる。そのため、485nm(CFP発光の波長に対応)における供与体の蛍光強度の上昇を測定することによって基質の加水分解を評価することができる(Mitra et al.,1996;Felber et al.,2004)。
選択された基質の多くは他のプロテアーゼによる開裂に潜在的な感受性を有するモチーフを含んでいたため、hK2、血漿カリクレイン、PSA、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼがhK14基質を開裂させる程度を測定した(表8)。各基質は、基質リンカーを特異的に開裂させるが、GGGGG対照基質を加水分解しない酵素濃度で試験を行った。
材料
以下の材料としては、市販の材料を使用した:エラスターゼ、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、血漿カリクレイン(Calbiochem)、T4 DNAリガーゼ(Invitrogen)、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Qbiogene)、Ni2+−ニトリロ三酢酸アガロースビーズ(Qiagen)、制限酵素(Roche、Amersham Pharmacia、Promega)、抗His抗体、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体(Sigma)。蛍光基質Z−Phe−Arg−AMC、Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−AMC、Z−Gly−Gly−Arg−AMC、MeOSuc−Ala−Ala−Pro−Val−AMCはCalbiochem社から購入し、Boc−Val−Pro−Arg−AMCはBachemから購入し、Abz−Thr−Phe−Arg−Ser−Ala−Dap(Dnp)−NH2はNeosystemから購入した。オリゴヌクレオチドの合成は、Invitrogen及びSynergene Biotech GmbHによるDNAシークエンシングによって行った。ヒトカリクレイン2、5、13、14は酵母系で製造した(Yousef et al.,03c;Kapadia et al.,03;Borgono et al.,03)。ヒトカリクレイン6は293ヒト胎児腎臓細胞系で製造し、ヒトカリクレイン8はバキュロウイルスベクター及びHighFive昆虫細胞を使用して製造した(Little et al.,97;Kishi et al.,03)。HK6及びhK8はLys−Cで活性化した(Shimizu et al.,98)。
ヒトAAT cDNA(Invitrogen、英国)を、オリゴヌクレオチド5’−TATGGATCCGATGATCCCCAGGGAGA3’(SEQ ID No.71)及び5’−CGCGAAGCTTTTATTTTTGGGTGGGA3’(SEQ ID No.72)を使用してPCRによって増幅した。増幅したAATの遺伝子のBamHI−HindIIIフラグメントをベクターpQE9(Qiagen、ドイツ)にクローニングし、N末端His6−タグを有する成熟AATのオープンリーディングフレームを含むプラスミドpAATを得た。KasI及びBsu36I制限部位を生成するサイレント突然変異を、RSLドメインのP1コドンの24bp上流及びと11bp下流においてpAAT24に導入した。制限部位は、Stratagene社のquickchange変異誘発プロトコルに従って、KasI部位についてはオリゴヌクレオチド5’−ACTGAAGCTGCTGGCGCCGAGCTCTTAGAGGCCATA−3’(SEQ ID No.73)を使用し、Bsu36I部位については5’−GTCTATCCCCCCTGAGGTCAAGTTC−3’を使用して作成した。野生型ACTを発現するプラスミドの構築は文献に記載されている(Cloutier et al.,2004)。
組換え型セルピンは大腸菌株TG1を使用して製造した。100μg/mLのアンピシリンを含む2×TY培地(16gトリプトン、10g酵母抽出物、5g/L NaCl)において細胞を37℃で増殖させた(A600=0.5〜0.7)。イソプロピルチオ−β−D−ガラクトシド(IPTG)を添加し(最終濃度:0.5mM(rACTタンパク質の製造)又は0.1mM(rAATタンパク質の製造))、18℃で16時間にわたって組換え型セルピンを発現させた。細胞を遠心分離によって回収し、0.1体積の冷却したPBS 2Xに再懸濁した。氷上においてリゾチーム(0.5mg/mL)と共に45分間にわたって培養した後、可溶性細胞質タンパク質を4回の凍結/解凍サイクルによって抽出し、DNAをDNアーゼIで分解した。細胞片を遠心分離によって除去し(25分、17,500g)、Ni2+−ニトリロ三酢酸アフィニティアガロースビーズを4℃で90分間にわたって上清に添加し、組換え型セルピンに結合させた。樹脂を50mMトリス(pH7.5)、150mM NaCl,20mMイミダゾールで3回洗浄し、結合したタンパク質を50mMトリス(pH7.5)、150mM NaCl、150mMイミダゾールで溶離させた。溶離したタンパク質を50mMトリス(pH7.5)、150mM NaCl、0.01% Triton X−100を使用して4℃で16時間透析し、タンパク質の純度をクマシーブルー染色SDS−PAGEによって評価した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン(Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックフォード)を標準として使用するビシンコニン酸方法(Smith et al.,1985)で測定した。AATE8、ACTE8、AATG9、ACTG9をトリプシン及びキモトリプシンによってそれぞれ滴定した。
rAAT、rACT及びそれらの変異体のSI値を、各プロテアーゼを各濃度の阻害剤と培養することによって測定した。反応緩衝液(50mMトリス(pH7.5)、150mM NaCl、0.05% Triton X−100、0.01%BSA)内において37℃で4時間培養した後、残留活性を蛍光基質(Boc−Val−Pro−Arg−AMC)を添加して検出した。蛍光は、黒い96ウェルプレート内においてマイクロプレート蛍光リーダーFLx800(Bio−Tek Instruments,Inc.)を使用して測定した(340nm(±15)の励起並びに485nm(±10)の発光)。SI値は、断片的速度(阻害酵素反応の速度(vi)/非阻害酵素反応の速度(v0))と酵素に対する阻害剤のモル比([Io]/[Eo])の線形回帰分析の切片に対応する。
hK14と各阻害剤の相互作用の会合速度定数を、疑似一次条件下においてプログレス曲線法を使用して調べた(Morrison and Walsh,1988)。これらの条件において、所定量の酵素(2nM)を各濃度の阻害剤(0〜80nM)及び過剰の基質(20μM)と混合した。反応は反応緩衝液(50mMトリス(pH7.5)、150mM NaCl、0.05% Triton X−100、0.01% BSA)内において37℃で45分間行い、FLx800蛍光96ウェルマイクロプレートリーダー(Biotek、米国)を使用して生成物形成速度を測定した。阻害は反応過程において不可逆的であると考えられ、酵素活性は生成物の生成(P)(開始速度:vz)で表され、時間(t)とともに一次速度(kobs)(阻害剤濃度のみに依存する速度定数)で阻害される。
所定量(1〜2μg)の阻害剤を、SI値の0.5倍、1倍又は2倍に対応する量のhK14と共に、反応緩衝液(50mMトリス(pH7.5)、150mM NaCl、0.05% Triton X−100)内において4時間培養した。試料を90℃で10分間加熱し、還元条件下で10%SDSゲルに溶解し、クマシーブルー染色によって可視化した。
2nMのトリプシン、キモトリプシン、血漿カリクレイン、ヒト好中球エラスターゼ又はトロンビン及び10nmのhK2、hK3、hK5、hK6、hK8、hK13又はhK14を、100nM又は500nMの組換え型阻害剤と共に37℃で30分間培養した。蛍光基質(Z−Phe−Arg−AMC(トリプシン及び血漿カリクレイン)、Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−AMC(キモトリプシン)、Z−Gly−Gly−Arg−AMC(トロンビン)、MeOSuc−Ala−Ala−Pro−Val−AMC(ヒト好中球エラスターゼ)又はAbz−Thr−Phe−Arg−Ser−Ala−Dap(Dnp)−NH2(ヒトカリクレイン))を添加して残留活性を検出した。
SI値の0倍、1倍、2倍に対応する量の阻害剤と共にHK14(2nM)を培養した。反応緩衝液(50mMトリス(pH7.5)、150mM NaCl、0.05% Triton X−100、0.01%BSA)内において37℃で4、8又は24時間培養した後,20μMの蛍光基質(Boc−Val−Pro−Arg−AMC)を添加して残留活性を検出した。阻害反応の傾き(速度)を、阻害剤を使用しない場合の対応する反応の傾きで除算した。
hK14に特異的な阻害剤を開発するために、ファージディスプレイ法を使用してhK14について選択した2つの基質ペンタペプチドによってrAATwt及びrACTwtの切断性結合の周囲の5つの残基を置換した(Felber et al.,05)。hK14酵素活性のプロファイリングにより、hK14は二元的なトリプシン様活性及びキモトリプシン様活性を有することが示された。そのため、トリプシン様活性及びキモトリプシン様活性に特異的な2つの基質ペプチド(8E及びG9)を有する阻害剤を開発することにした。これらの基質の切断性結合をrAATwt及びrACTwtのP1−P1’に従って位置合わせした。セルピン変異体のRSL領域を表9に示す。
阻害化学量論(SI)は、生理的条件(pH及びイオン強度)下で調べた。SIは、hK14分子を阻害するために必要な阻害剤分子の数を示す。SI値が1より大きい場合であっても滴定曲線は直線的であり、反応が完全に終了したことを示している。セルピン変異体のSI値は、7.4のSI値を有していたrAATE8以外は1〜1.5だった(表10)。野生型ACTは試験条件下でhK14と反応しなかったが、AATWT(SI値=1)はhK14に対する優れた阻害剤であることが判明した。ACTのRSL領域をhK14基質ペプチドで置換することにより、酵素に対する反応性を生じさせ、高い親和性を有する阻害剤を作成することができた。一方、AATWTを骨格として使用すると、全ての阻害剤は野生型ほど効率的ではなかったため、RSLの変性はそれほど好ましいものではなかった(表10)。
hK14阻害剤の阻害特異性を定義するために、精製した変異体と各種プロテイナーゼの反応を調べた。最初に、トリプシン、キモトリプシン、血漿カリクレイン、ヒト好中球エラスターゼ及びトロンビンを含む、広い特異性を有するプロテナーゼについて調べた。また、同じプロテアーゼファミリーに属する酵素(hK2、hK3、hK5、hK6、hK8、hK13)に対するhK14阻害剤の特異性を評価した(表11)。hK14を過剰の阻害剤([I]o/[E]o=50:1)と共に30分間培養した場合には、全ての修飾セルピン及びrAATwtについて残留活性は検出されなかった。これらの条件では、rACTwtのみがhK14に対して弱い阻害活性(17%)を示した。8E基質で修飾したセルピンは、他の酵素が阻害剤によって阻害されたため、中程度の特異性を示した。AATG9とACTG9について非常に高い特異性が観察され、キモトリプシン及びhK5(わずかに阻害)を除き、試験を行った酵素のいずれも阻害されなかった。
活性hK14の製造と精製
ヒトカリクレイン14を上述したように製造及び精製した。
基質ファージライブラリーをhK14に対してパニングし、加水分解活性によって加水分解した基質を選択した。開裂したファージは大腸菌TG1細胞で増幅し、酵素消化とスクリーニングを5回行った。放出ファージの量は各回毎に増加し、各選別後のより多数のhK14感受性ファージを確認した。最後のスクリーニングで得られた32個のファージペプチドのアミノ酸配列をシークエンシングによって決定した。基質領域に対応する配列を表8に示す。選択され、開裂したペプチドの69%は、hK14のトリプシン様活性について予想されたようにP1位置に少なくとも1つの塩基性残基を有し、31%のペプチドはP1位置にキモトリプシン様酵素に特異的なチロシン残基を有していた。
ファージディスプレイ分析からの配列がhK14の基質であることを確認し、開裂部位を特定するために、選択された全てのペプチドを蛍光基質形態に構成した。全ての基質は、可変有効性レべル及び2000〜481,000M−1s−1のKcat/Km値でhK14によって加水分解された。開裂の特異性は、hK14によって加水分解されないCFP−GGGGG−YFPによって実証した。
阻害剤の特異性を変化させるために、α1−アンチキモトリプシン(ACT)及びα1−アンチトリプシン(AT又はAAT)のRSLの修飾を行った。次に、選択された基質(G1、C11E5、8E、F3、F11、G9)をセルピンの反応部位ループに移植し、ヒトカリクレインhK14を阻害することができる新しい変異体を生成した。ぺプチドG1及びC11の配列を使用して二以上の阻害剤変異体を作成した。
ネザートン症候群マウスモデルを使用し、局所投与によるMDPK67b(rACT6.7)の潜在的な皮膚病治療効果を調べた。
2%ナトロソル(w/v)に2mg/mLの分子を添加した。処方は、トリプシン(代用生体内基質)に対するMDPK67b阻害性を維持する生体外拡散評価基準に従って選択した。溶液として調製した2mg/mLのMDPK67bを、分子シヤリングを防止するためにゆっくりと撹拌しながら、2%ナトロソル(w/v)及びPBS1X(pH7.4)に4℃で添加した。ヒドロゲルのない適切な阻害剤製剤を製造するために、混合物を撹拌しながら4℃で慎重に均質化した。塊及びシヤリングなく均質な製剤を得るために、ナトロソルは粉末としてMDPK67b溶液に添加した。
MDPK67bを与えたKLK5遺伝子導入マウスとMDPK67bを与えていないKLK5遺伝子導入マウスを比較すると、賦形剤群(第1群)と比較してMDPK67b群(第2群)では病変サイズが減少した。賦形剤対照群のほとんどで病変サイズは増加したが、MDPK67b投与群のほとんどが病変サイズの減少を示した。
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Claims (22)
- セリンプロテアーゼ阻害剤又はセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有するその生物学的に活性なフラグメントの、皮膚病を治療するための薬剤の調製における使用。
- 請求項1において、前記セリンプロテアーゼ阻害剤が組換え型阻害剤タンパク質である使用。
- 請求項1又は2において、前記セリンプロテアーゼが、カリクレイン、プラスミン、キモトリプシン(Chtr)、ウロキナーゼ(uPA)、トリプターゼ、好中球エラスターゼ(HNE)酵素及び/又はそれらの組み合わせからなる群から選択される使用。
- 請求項3において、前記カリクレインが、hK2、hK5、hK7、hK14及び/又はそれらの組み合わせからなる群から選択される使用。
- 請求項1〜4のいずれか1項において、前記皮膚病が、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、乾癬、皮膚剥離症候群からなる群から選択される使用。
- 請求項5において、前記皮膚病がネザートン症候群である使用。
- 請求項1〜6のいずれか1項において、前記組換え型セリンプロテアーゼ阻害剤が、SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14及びセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有するそれらの生物学的に活性なフラグメントからなる群から選択される使用。
- 請求項1〜6のいずれか1項において、前記セリンプロテアーゼ阻害剤が、SEQ ID No.39〜59及びセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有するそれらの生物学的に活性なフラグメントからなる群から選択される使用。
- 哺乳動物における皮膚病を治療又は予防するための方法であって、組換え型セリンプロテアーゼ阻害剤又はセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有するその生物学的に活性なフラグメントを含む医薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
- 請求項9において、前記セリンプロテアーゼが、カリクレイン、プラスミン、キモトリプシン(Chtr)、ウロキナーゼ(uPA)、トリプターゼ、好中球エラスターゼ(HNE)酵素及び/又はそれらの組み合わせからなる群から選択される方法。
- 請求項10において、前記カリクレインが、hK2、hK5、hK7、hK14及び/又はそれらの組み合わせからなる群から選択される方法。
- 請求項11において、前記皮膚病が、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、乾癬、皮膚剥離症候群からなる群から選択される方法。
- 請求項12において、前記皮膚病がネザートン症候群である方法。
- 請求項9〜13のいずれか1項において、前記組換え型セリンプロテアーゼ阻害剤が、SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14及びセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有するそれらの生物学的に活性なフラグメントからなる群から選択される方法。
- 請求項9〜13のいずれか1項において、前記セリンプロテアーゼ阻害剤が、SEQ ID No.39〜59及びセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有するそれらの生物学的に活性なフラグメントからなる群から選択される方法。
- 皮膚病を治療又は予防するためのキットであって、組換え型セリンプロテアーゼと、必要に応じて試薬及び/又は取扱説明書と、を含むキット。
- 望ましくない皮膚状態を改善するための化粧組成物であって、薬学的有効量の組換え型セリンプロテアーゼ阻害剤又はセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有するその生物学的に活性なフラグメントを含む化粧組成物。
- 請求項17において、前記セリンプロテアーゼ阻害剤が組換え型阻害剤タンパク質である化粧組成物。
- 請求項18において、前記セリンプロテアーゼが、カリクレイン、プラスミン、キモトリプシン(Chtr)、ウロキナーゼ(uPA)、トリプターゼ、好中球エラスターゼ(HNE)酵素及び/又はそれらの組み合わせからなる群から選択される化粧組成物。
- 請求項21において、前記カリクレインが、hK2、hK5、hK7、hK14及び/又はそれらの組み合わせからなる群から選択される化粧組成物。
- セリンプロテアーゼ阻害剤又はその生物学的に活性なフラグメントの、望ましくない皮膚状態を改善するための化粧組成物の調製における使用。
- 組織試料における皮膚病の診断又は予後のための検出分析方法であって、検出可能な標識を有する組換え型セリンプロテアーゼ阻害剤に前記組織試料を接触させ、前記標識の量を測定し、前記測定された量を前記組織試料における疾患の有無に相関させることを含む方法。
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