JP5608854B2 - 抗ウイルス剤 - Google Patents

Description

本発明は抗ウイルス剤、より具体的には抗インフルエンザウイルス剤に関する。

梅（Prunus mume）の果実は数々の生理活性作用を有することが知られている。例えば、特許文献１には、梅の果実の抽出物が抗ヘリコバクターピロリ作用を示し、リグナンの一種であるシリガレシノール、ヤンガビンなどがその活性成分であることが記載されている。特許文献２にはその活性本体は不明であるが梅の果実の抽出物がα−グルコシダーゼ阻害作用を示すことが記載されている。特許文献３には梅肉エキスがオートファジー誘導作用を示し、この作用による炎症抑制効果や病原体による感染防御効果等が期待されることが記載されている。

一方、近年、新型インフルエンザウイルスによる世界的な大流行（パンデミック）が起こり、これに対する治療薬が望まれるところである。抗インフルエンザウイルス剤として、これまでにアマンタジン、オセルタミビル（商品名「タミフル」）、ザナミビル（商品名「リベンザ」）などの各種薬剤が提供されているが、アマンタジンはＡ型インフルエンザに対してのみ効果を奏するがＢ型やＣ型には作用を奏しない、オセルタミビルやザナミビルはＣ型インフルエンザには効果を奏しないなどそれぞれ短所を有している。また、いずれの薬剤に対しても耐性株、特にアマンタジンには多くの耐性株が見つかっており、耐性株に対しても有効な抗インフルエンザウイルス剤が求められている。

このような状況下において、非特許文献１には梅果実の抽出物が抗インフルエンザウイルス作用を示すことが記載されているが、具体的な活性成分は報告されていない。また、Lyoniresinol（次の化学式３で示される）等のリグナン類がこれまでに数多く報告されているが、リグナンの９位と２´位がエーテル環を形成したリグナンの報告はない。

特開２００４−３５２６５２号公報 特開２００６−２９９２１号公報 特開２００３−１１３０８８号公報

Sangchai Yingsakmongkon et al., Biol. Pharm. Bull. 31(3)511-515(2008)

本願発明は上記の背景技術に鑑みてなされたものであって、インフルエンザウイルスに対して増殖抑制作用を示す新規な抗ウイルス剤を提供することを目的とする。

本発明は次の式１で示される化合物を提供するものであり、本発明の抗ウイルス剤は次の式１で示される化合物を有効成分とする。ただし、式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は、それぞれ水素原子、炭素数１〜６の直鎖若しくは分岐を有するアルキル基又は炭素数１〜６の直鎖若しくは分岐を有するアシル基であって、Ｒ_１〜Ｒ_７はそれぞれ同一又は異なってもよい。

本発明によると抗ウイルス作用が期待される新規化合物が提供される。

図１は本発明の化合物を取得するための抽出法を示す説明図である。 図２は図１に示した各分画の抗ウイルス作用（定濃度）を示す図である。c-2は精製された化合物Ｉ、pm-1は図１におけるヘキサン抽出物、pm-2は図１におけるジクロロメタン抽出物、pm-3は図１における酢酸エチル抽出物、pm-4は図１におけるブタノール抽出物の作用を示す。 図３は精製された化合物Ｉ（c-2）の抗ウイルス作用（濃度依存性）を示す図である。 図４はインフルエンザウイルス感染細胞の形態変化における抗ウイルス作用を示す画像である。

本発明の抗ウイルス剤は化学式１又は化学式２で示される化合物を有効成分とするものであり、本発明の抗インフルエンザウイルス剤はこれらの化合物を有効成分とするものである。ただし、化学式１中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７はそれぞれ、水素原子、炭素数２〜６の直鎖若しくは分岐を有するアルキル基又は炭素数２〜６の直鎖若しくは分岐を有するアシル基のいずれかであって、Ｒ_１〜Ｒ_７はそれぞれ同一又は異なってもよい。化学式１で示される化合物のうち、Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_５、Ｒ_７がそれぞれメチル基、残るＲ_２、Ｒ_４、Ｒ_６がそれぞれ水素原子である化合物が、化学式２で示される化合物である。

化学式２で示される２´,９−エポキシリオニレシノールは梅干から抽出精製された物質である。当該化合物はメタノールや水・エタノール混合液、ヘキサン、酢酸エチル、ジクロロメタンなどの各種溶媒、好ましくはメタノールなどの親水性溶媒を用いて梅干の果肉から抽出され、その後ジクロロメタンなどの溶媒を用いた溶媒分配やシリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどの適切な分離精製手段によって精製される。また、化学式２で示される化合物は梅干に限らず、梅の果実（青梅）からも抽出精製される。

化学式１で示される化合物は、化学式２で示される２´,９−エポキシリオニレシノールの誘導体であり、２´,９−エポキシリオニレシノールが有する水酸基の水素原子をアルキル基やアシル基に置換したり、２´,９−エポキシリオニレシノールが有するメトキシ基のメチル基を脱アルキル化したり、他のアルキル基やアシル基に置換するなど通常行われる化学的置換を行うことにより製造される。

本発明においては、化学式１で示される化合物（Ｒ_１〜Ｒ_７が、それぞれ水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はアシル基の何れか）が抗ウイルス剤として用いられる。また、化学式１で示される化合物中、Ｒ_１、Ｒ_３、Ｒ_５、Ｒ_７が同一のアルキル基、Ｒ_２、Ｒ_４、Ｒ_６が水素原子である化合物が抗ウイルス剤として好ましく用いられ、さらに化学式２で示される化合物が抗ウイルス剤として最も望ましく用いられる。

本発明の化合物は抗ウイルス剤として用いられる。本発明の抗ウイルス剤が適用されうるウイルスとして、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒトパピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、はしかウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスなどが挙げられる。これらのウイルスのうち、インフルエンザウイルスが好ましい対象であり、本発明の抗インフルエンザウイルス剤はＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルスなど各種のインフルエンザウイルスに適用される。

本発明の抗ウイルス剤又は抗インフルエンザウイルス剤は担持体や賦形剤を用いることなく化合物単独で使用することもできるが、通常はデンプンや乳糖、マンニットなどの賦形剤、カルボキシメチルセルロースやカルボキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、結晶セルロースやカルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、精製水などの各種製剤製造用の補助成分を用いて、錠剤や顆粒剤、カプセル剤、液剤などの経口的に投与できる剤型又は注射剤や軟膏剤などの非経口的に投与できる剤型として提供される。また、チューインガムやキャンディ、錠菓、飲料等の飲食物に添加し、抗インフルエンザウイルス作用を有する飲食物として提供される。

本発明の抗ウイルス剤又は抗インフルエンザウイルス剤は、経口剤の場合、化学式１又は化学式２に示される化合物として成人において０.００１〜１０００ｍｇ／ｋｇであり、１日乃至数回に分けて投与される。また、投与量は、症状や患者の年齢、性別、動物種等に応じて適宜決定される。さらに、本発明のウイルス剤等は本発明の化合物以外の各種主薬や佐薬が加えられた抗ウイルス剤等として提供してもよい。

以下、下記の実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する

〔化合物の単離精製〕
収穫した青梅を塩付けした後３日間天日干しを行い、さらに梅酢に約１４日漬け込んで梅干を得た。得られた梅干の果肉３.７ｋｇをメタノール１.８Ｌに２４時間漬け込み、ろ過してろ液を得た。また残渣にメタノール１.８Ｌを加え２４時間の漬け込み、ろ過する操作を２回繰り返した。得られたろ液を併せて減圧下で濃縮することにより、メタノール抽出物３４３.５ｇを得た。このメタノール抽出物を水に懸濁後、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、ブタノールで順次抽出し、それぞれの抽出物を調製した（図１）。各抽出物について抗ウイルス活性を測定し、活性の強かったジクロロメタン抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ジクロロメタン/アセトン混合溶媒）で繰り返し処理することにより、化合物Ｉを単離した。

〔化合物の構造決定〕
次に単離された化合物Ｉの構造決定を行った。構造決定は、高分解能ＥＩ−ＭＳを用いた１次元及び２次元ＮＭＲ測定により行った。この結果、単離された化合物Ｉは化学式２で示される２´,９−エポキシリオニレシノールであると同定された。なお、ＮＭＲ測定データは次のとおりである。
（１）分子量：４１８.１６７４（理論値：４１８.１６６３、組成式Ｃ_２２Ｈ_２６Ｏ_８)
（２）^１ＨＮＭＲ：２.２３（１Ｈ,ｍ,Ｈ−８'）,２.２７（１Ｈ,ｍ,Ｈ−８）,２.８９（１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=１６Ｈｚ,Ｈ−７）,３.０８（１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.０,１６.０Ｈｚ,Ｈ−７）,３.４４（３Ｈ,Ｓ,ＯＭｅ−３'）,３.６５（１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.０,１１.０,Ｈ−９'）,３.７６（３Ｈ,Ｓ,ＯＭｅ−５'）,３.７７（１Ｈ,ｍ,Ｈ−９'）,３.８２（１Ｈ,ｍ,Ｈ−９）,３.８３（３Ｈ,Ｓ,ＯＭｅ−５）,３.９９（３Ｈ,Ｓ,ＯＭｅ−３）,４.４４（１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=３.０,１１.８,Ｈ−９）,４.６１（１Ｈ,Ｓ,Ｈ−７'）,５.１９（１Ｈ,Ｓ,ＯＨ−４）,５.３４（１Ｈ,Ｓ,ＯＨ−４'）,６.２７（１Ｈ,Ｓ,Ｈ−６'）,６.３７（１Ｈ,ＳＨ−６）
（３）^１３Ｃ−ＮＭＲ：２９.３（Ｃ−７）,２９.９（Ｃ−７'）,３３.９（Ｃ−８）,４３.４（Ｃ−８'）,５５.８（ＯＭｅ−５）,５５.９（ＯＭｅ−５'）,５９.７（ＯＭｅ−３'）,６１.６（ＯＭｅ−３）,６４.９（Ｃ−９）,８０.３（Ｃ−９'）,１０１.１（Ｃ−６'）,１０５.３（Ｃ−６）,１２２.４（Ｃ−２）,１２３.８（Ｃ−１'）,１３４.７（Ｃ−４'）,１３６.４（Ｃ−４）,１４４.６（Ｃ−３）,１４５.３（Ｃ−３'）,１４５.４（Ｃ−５'）,１４６.１（Ｃ−５）,１５２.９（Ｃ−２'）

〔抗ウイルス活性〕
図１に示す各抽出物及び精製された化合物Ｉ（図１におけるｃ-２成分）についてウイルス増殖抑制作用を調べた。
（細胞とウイルス）
細胞はＭＤＣＫ細胞を用いた。１０％ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地を入れたシャーレにて培養し、confluentのものを実験に用いた。ウイルスはインフルエンザウイルスＡｏＲＰ８（e94422B）株を用いた。ウイルスはＭＤＣＫ細胞で増殖させ、遠心分離して得られた上清をウイルス液（約１×１０^５ｐｆｕ／ｍｌ）として実験に用いた。

（各抽出物のインフルエンザウイルス増殖への影響）
上記で得られたウイルス液０.１mlを上記と同様にシャーレ培養したＭＤＣＫ細胞に３７℃で５０分吸着させた。そこに、サンプル０.１mlを含む１０％ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地を追加して、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で５時間培養した。培養後、培養細胞を回収し、−８０℃に保存した。陰性対照として、ＤＭＳＯを含む１０％ＦＣＳ添加ＥＭＥ培地を追加したものを用いた。サンプルには各抽出物及び化合物Ｉをそれぞれ４０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌを含むように１０％ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地で溶解した溶液を用いた。

（ウイルスの定量）
ウイルスの定量はＲＴ-real-timeＰＣＲ法により行った。凍結保存した感染細胞を室温で融解し、BioRupture（XOSMOBIO社）を用い超音波破壊し、遠心分離後、上清からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの抽出・精製はQIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN社）により行われた。抽出ＲＮＡのＲＮＡ量はQbit fluoreometer（Invitrogen社）を用いて定量した。精製したＲＮＡは、抽出後凍結保存することなくＲＴ反応に用いた。ＲＴ反応にはiScript Select cDNA Synthesis Kit（BioRad社）を用い、添付のプロトコールに従って操作を行った。ＲＴ反応後、反応液２μｌを用いてreal-timeＰＣＲによりウイルスＲＮＡ量の定量を行った。Real-timeＰＣＲ法には、iTaq Supermix With ROX（BioRad社）を用いた。その結果を図２及び図３に示す。図２にはサンプル濃度２００μｇ／ｍｌにおけるウイルス増殖抑制効果を、図３にはサンプル（化合物Ｉ）の濃度４０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌにおけるウイルス増殖抑制効果を示す。なお、各図の縦軸は、Amplification cycles(time)を示す。

（インフルエンザウイルス感染に対する細胞の形態変化）
次に、インフルエンザウイルスを感染した培養細胞の形態変化を観察することにより、化合物Ｉによる抗ウイルス作用（感染抑制効果）を確認した。培養したＭＤＣＫ細胞に上記ウイルス液を３７℃で３０〜６０分吸着させ、培養細胞１個当たり６〜９個のウイルスを感染させた。次に、上記サンプル（２００μｇ／ｍｌ含有）を２０μｌ／ｍｌ（培地）で加え、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で６時間培養して位相差顕微鏡で観察撮影した。その結果を図４に示す。化合物Ｉを加えた場合にはそれを加えなかった場合に比べて明らかにウイルス感染による影響が抑えられていた。

以上のように、梅干果肉から抽出された２´,９−エポキシリオニレシノールは抗インフルエンザウイルス作用を有することが理解された。

本発明によると新規な抗ウイルス剤が提供される。

Claims (4)

1. 次の化学式１で示される化合物。
   ただし、式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は、それぞれ水素原子、炭素数１〜６の直鎖若しくは分岐を有するアルキル基又は炭素数１〜６の直鎖若しくは分岐を有するアシル基であって、Ｒ_１〜Ｒ_７はそれぞれ同一又は異なってもよい。
2. 次の化学式２で示される化合物。
   
3. 請求項１又は請求項２に記載の化合物を有効成分とする抗ウイルス剤。
4. 請求項１又は請求項２に記載の化合物を有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤。