JP5592045B2 - 免疫抑制特性を有するヒトｃｄ３特異的抗体 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒトＴ細胞マーカーCD3に特異的な結合部位を含有する一価および多価のscFv-抗体に関する。本発明の抗体は、免疫抑制性が強く、サイトカインの有意な放出を引き起こさない。本発明はまた、上記抗体をコードするポリヌクレオチドおよび上記ポリヌクレオチドを含有するベクター、それにより形質転換された宿主細胞および上記抗体の産生におけるそれらの使用に関する。最後に、本発明は、上記のポリヌクレオチド、抗体またはベクターのいずれかを含有する組成物、好ましくは医薬組成物に関する。医薬組成物は、免疫療法（好ましくは急性移植片拒絶に対する）に有用である。
ヒトＴリンパ球上のCD3複合体のε-鎖に指向し(Salmeronら、J. Immunol. 147 (1991), 3047-3052)、ATCC受託番号CRL8001を有するハイブリドーマにより産生されるOKT3、マウスIgG2a mAbは、腎および肝移植後の組織拒絶を防止するために使用され、コルチコステロイドに不応性である移植片拒絶の代替的治療を提供する。インビボで、OKT3の投与は、それがＴ細胞レセプター(TCR)をダウンモジュレートするので循環するCD3+細胞の数において劇的な減少を誘導する。しかし、処置の第１日目に副作用が生じうる。悪寒および発熱がしばしばOKT3の投与に続いて起こり、患者は時には悪心、嘔吐、下痢、呼吸困難、喘鳴、および無菌性髄膜炎を患う。これらの副作用の多くは、サイトカインの放出（特にＴ細胞からの）に起因する。より長期間の使用後、多くの患者はヒト抗マウス抗体(HAMA)応答を発生する。
OKT3単独の結合はＴ細胞を惹起させるのに不十分である。IL-2、IL-6、TNF-αおよびIFN-γのようなサイトカインの放出を誘導するＴ細胞の増殖は、Ｔ細胞およびFcR保有細胞の架橋から生じる。ヒトIgG Fcレセプター(FcγRI、FcγRII、FcγRIII)は、ヒト単球／マクロファージ、Ｂリンパ球、NK細胞および顆粒球上に分布する。それらは全て、親和性が異なるマウスおよびヒトIgGの両方のCH2領域に結合する。かかる抗-CD3 Abの免疫原性は、マウスmAbの可変ドメインおよびヒトAbの定常領域から作られたキメラ抗体を用いることにより低減される。Fcレセプターへの結合を低減させるために、ヒトIgGの特定のクラスに由来するFcドメインが使用されるか、またはFcレセプターに結合する部分のFcドメインに変異が導入される。しかし、Fcドメインの相互作用は完全に排除され得ず、免疫抑制活性の効率は増大しなかった。
従って、本発明の基礎となる技術的課題は、先行技術の手段の欠点を解消する同種移植応答を防止するのにより適切な手段を提供することである。
上記技術的課題の解決手段は特許請求の範囲に特徴付けられる態様を提供することにより達成される。CD3分子をダウンレギュレートすることによるＴ細胞活性化および増殖を抑制することにおけるより効率的な抗体が構築されたが、それらはサイトカインの大規模な放出を引き起こさず、従って不快な副作用の多くが回避されうる。これらの抗体は、所望されない免疫応答が回避されうる手段により可変免疫グロブリンドメイン、いわゆるFvモジュールのみを含む。Fvモジュールは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変ドメイン、それぞれVHおよびVLの会合により形成される。これらの抗体の好ましい態様は、OKT3抗体の可変ドメインにのみ基づくが、重鎖のH100A位（Kabatナンバリングシステムによる）のシステインの代わりにセリンを含む。この変異は、単鎖Fv分子の安定性を改善することが以前に示された(Kipriyanovら、Protein Engineering 10 (1997), 445-453)。驚くことに、かかる抗体、および特に所謂ダイアボディ様式の二価抗体は、混合リンパ球反応(MLR)においてCD3ダウンレギュレーションおよびＴ細胞増殖の阻害により測定されるように本来の親OKT3よりも大きな免疫抑制効果を有し、および親OKT3とは対照的にサイトカインIFN-αおよびIL-2の有意な放出を引き起こさなかった。
従って、本発明は、以下の特徴：
(a)免疫反応を抑制できる；
(b)定常抗体領域を欠いている；および
(c)Ｔ細胞レセプターのCD3複合体上のエピトープに結合する、
により特徴付けられる抗体に関する。
(a)免疫反応を抑制できる；
(b)定常抗体領域を欠いている；および
(c)Ｔ細胞レセプターのCD3複合体上のエピトープに結合する、
により特徴付けられる抗体に関する。
本発明の抗体は、そのMHC特異性に関わらず全てのＴ細胞上のヒトTCR/CD3複合体に対して特異的である。かかる抗体は、炎症性サイトカインの有意な放出を何ら伴うことなく活性化Ｔリンパ球を抑制することができ、従って不快な副作用の多くが回避される。サイトカイン、例えば、IL-2、IFN-γおよびTNF-αの放出は、OKT3と比べて100倍以上少ない。これは、任意の公知の免疫抑制抗体と比べて明確に対照的である。免疫抑制は、かかる慣習的な抗体をヒトに投与することにより達成されうるが、それらの効力は、２つの因子：Ｔ細胞活性化から生じる初期投薬症候群、および非ヒト起源の外来タンパク質の複数回投与から生じる抗グロブリン応答(例えば、HAMA応答)により損なわれる。抗体毒性の症状としては、発熱、悪寒、下痢および嘔吐が挙げられ、重篤な場合には死に至る。該症候群は、一過性Ｔ細胞活性化の結果として炎症性サイトカインの放出により引き起こされる。かかる活性化は、Ｔ細胞上のCD3複合体を架橋するためにアクセサリー細胞上の抗体のFc部分とFcレセプター(FcR)の相互作用に依存する。マウス起源のmAbのFc部分もまた、抗グロブリン応答の主な理由である。本発明の抗体は、免疫グロブリン定常ドメインを欠いており、それ故、FcRと相互作用することができず、また免疫原性が大いに低い。
本発明の抗体は、例えば、以下の方法により、当業者に公知の方法により調製されうる：
(a)ペプチドリンカーにより隔てられているか、またはリンカーなしのいずれかの少なくとも２つの免疫グロブリン可変VHおよびVLドメインをコードする遺伝子を単一の遺伝子構築物に組み合わせること、およびそれを細菌または他の適切な発現系において発現させることによる単鎖Fv-抗体の構築。
(b)ペプチドリンカーにより隔てられるか、またはリンカーなしのいずれかのヒトCD3に対して特異的な少なくとも２つのVHおよびVLを含有する単鎖Fv抗体の、それらの分子内対合を妨げる方向での非共有結合性二量体化または多量体化。
(a)ペプチドリンカーにより隔てられているか、またはリンカーなしのいずれかの少なくとも２つの免疫グロブリン可変VHおよびVLドメインをコードする遺伝子を単一の遺伝子構築物に組み合わせること、およびそれを細菌または他の適切な発現系において発現させることによる単鎖Fv-抗体の構築。
(b)ペプチドリンカーにより隔てられるか、またはリンカーなしのいずれかのヒトCD3に対して特異的な少なくとも２つのVHおよびVLを含有する単鎖Fv抗体の、それらの分子内対合を妨げる方向での非共有結合性二量体化または多量体化。
用語「免疫反応を抑制することができる」は、抗体が、一方で、外来アロ抗原によるＴリンパ球の活性化を防止することができ、他方で既に活性化されたＴ細胞を選択的に枯渇することができることを意味する。
本発明の抗体は、一価、二価または多価抗体でありうる。
好ましい態様では、本発明の抗体は、ペプチドリンカーにより隔てられるか、またはリンカーなしのいずれかによりCD3特異的VHおよびVLドメインを含有する単鎖Fv抗体(scFv)の非共有結合ダイマー(「ダイアボディ」；図１参照)である。
さらに好ましい態様では、本発明の抗体は、CD3-特異的VHおよびVLドメインを含有する２つの単鎖Fv抗体(scFv)(図１参照)を含む。
さらに好ましい態様では、本発明の抗体は、CD3特異的VHおよびVLドメインを含有する単鎖ダイアボディ（図１参照）である。
本明細書中で使用される用語「Fv抗体」は、可変ドメインを含むが定常ドメインを含まない抗体に関する。本明細書中で使用される用語「ペプチドリンカー」は、連結対象の可変ドメインの種類に応じた長さを有する２つの可変ドメインを連結することができる任意のペプチドに関する。ペプチドリンカーは任意のアミノ酸残基を含みうるが、アミノ酸組み合わせSAKTTPまたはSAKTTPKLGGが好ましい。(scFv)2および単鎖ダイアボディ(scDb)の単一scFvを連結するペプチドリンカーは任意のアミノ酸残帰を含みうるが、アミノ酸組み合わせGGGGSの１〜３繰り返しが(scFv)2に好ましく、GGGGSの３から４繰り返しがscDbに好ましい。
より好ましい態様では、本発明の抗体は、ATTC受託番号CRL8001のハイブリドーマにより産生される抗体の可変ドメインに実質的に対応する。
さらにより好ましい態様では、本発明の抗体は、H100A位（Kabatナンバリングシステム）のシステインが別のアミノ酸、好ましくはセリンに置換されていることにより特徴付けられる。
本発明はまた、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドおよび上記ポリヌクレオチドを含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。組換えベクターは、当業者に周知の方法に従って構築されうる；例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.参照。
種々の発現ベクター／宿主系は、本発明の抗体をコードする配列を含み、発現する。これらは、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌；酵母発現ベクターで形質転換された酵母等の微生物；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）または細菌発現ベクター（例えば、TiまたはpBR322プラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系を含むがこれらに限定されない。
「制御エレメント」または「調節配列」は、ベクターの非翻訳領域-エンハンサー、プロモーター、転写および翻訳を行うための宿主細胞タンパク質と相互作用する5'-および3'-非翻訳領域である。かかるエレメントは、その強度および特異性において変化しうる。使用されるベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導可能プロモーターを含む任意の数の適切な転写および翻訳エレメントが使用されうる。例えば、細菌系においてクローニングする場合、Bluescript.RTM.ファージミド(Stratagene, LaJolla, Calif.)またはpSport1.TMプラスミド(Gibco BRL)等のハイブリッドlacZプロモーター等の誘導可能プロモーターが使用されうる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞において使用されうる。植物細胞のゲノムに由来するプロモーターまたはエンハンサー(例えば、熱ショック、RUBISCO；および貯蔵タンパク質遺伝子)または植物ウイルス由来のもの(例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列)がベクターにクローン化されうる。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが好ましい。多コピーの多価の多量体をコードする配列の多コピーを含む細胞株を作製することが必要である場合、SV40またはEBVに基づくベクターが適切な選択マーカーと共に使用されうる。
細菌系において、多数の発現ベクターが本発明の抗体について意図される使用に応じて選択されうる。本発明における使用に適切なベクターとしては、細菌における発現のためのpSKK発現ベクターが挙げられるがこれらに限定されない。
酵母、Saccharomyces cerevisiaeにおいて、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびPGH等の構成的または誘導可能プロモーターを含む多数のベクターが使用されうる；総説については、Grantら、(1987) Methods Enzymol. 153:516-544参照。
植物発現ベクターが使用される場合、本発明の抗体をコードする配列の発現は、任意の多数のプロモーターにより駆動されうる。例えば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーター等のウイルスプロモーターが単独で、またはTMV由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用されうる(Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311)。あるいは、RUBISCOまたは熱ショックプロモーターの小サブユニット等の植物プロモーターが使用されうる(Coruzzi, G.ら、(1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, Rら、(1984) Science 224:838-843;およびWinter, J.ら、(1991) Results Probl.Cell Differ. 17:85-105)。これらの構築物は、直接的DNA形質転換または病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞に導入されうる。かかる技術は、多数の一般に入手可能な総説(例えば、Hobbs, S.およびMurry, L.E.、McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology (1992) New York, N.Y.;pp.191-196)に記載される。
昆虫系もまた、本発明の抗体を発現させるために使用されうる。例えば、あるかかる系では、Autographa Californica核多核体ウイルス(AcNPV)はSpodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusia larvaeにおける外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。上記抗体をコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子等のウイルスの非必須領域にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に配置されうる。上記抗体をコードする遺伝子の首尾よい挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活化し、被覆タンパク質を欠失する組換えウイルスを産生する。組換えウイルスは、次いで、APOPが発現されうるS.frugiperda細胞またはTrichoplusia larvaeを感染させるために使用されうる(Engelhard, E.K.ら、(1994) Proc.Nat.Acad.Sci. 91:3224-3227)。
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベース発現系が使用されうる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、本発明の抗体をコードする配列は、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結されうる。ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域における挿入は、感染宿主細胞において抗体を発現することができる生存可能なウイルスを得るために使用されうる(Logan, J.およびShenk, T. (1984) Proc.Natl.Acad.Sci. 81:3655-3659)。さらに、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサー等の転写エンハンサーが、哺乳動物宿主細胞において発現を増大するために使用されうる。
ヒト人工染色体(HAC)はまた、プラスミドに含まれ、発現されうるよりも大きいDNAの断片を送達するために使用されうる。６〜10MのHACは、治療目的のために従来の送達方法(リポソーム、ポリカチオン性アミノポリマー、または小胞)により構築され、送達される。
特異的開始シグナルはまた、本発明の抗体をコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用されうる。かかるシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。抗体をコードする配列、その開始コドン、および上流配列が適切な発現ベクターに挿入される場合、さらなる転写または翻訳制御シグナルは必要とされ得ない。しかし、コード配列が挿入される場合、ATG開始コドンを含む外来翻訳調節シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、全挿入物の翻訳を確実にするために正確な読み枠内にあるべきである。外来翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の両方の種々の起源であり得る。発現の効率は、文献に記載されるもの等の使用される特定の細胞系に適切なエンハンサーを入れることにより増強されうる(Scharf, Dら、(1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162)。
さらに、宿主細胞株は、所望の様式で挿入された配列の発現を調節する能力または発現された抗体鎖を処理する能力について選択されうる。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入物、折りたたみおよび／または機能を容易にするために使用されうる。特定の細胞マシーナリーを有する種々の宿主細胞がAmerican Type Culture Collection (ATCC; Bethesda, Md.)から入手可能であり、外来抗体鎖の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために選択されうる。
組換え抗体の長期間の高収率での産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、抗体を安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起源および／または内因性発現エレメントおよび同じまたは別のベクター上の選択マーカー遺伝子を含みうる。ベクターの導入に続いて、細胞を、選択培地に移す前に富化培地中で１〜２日間増殖させる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在は、導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞型に適切な組織培養技術を用いて増殖されうる。
形質転換細胞株を回収するために、任意の数の選択系を使用し得る。これらとしては、それぞれ、tk.sup.細胞およびaprt.sup.細胞に使用され得るヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（Wigler, M. ら (1977) Cell 11:223-32）遺伝子およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, I. ら (1980) Cell 22:817-23）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性を選択の根拠として用いることができる；例えば、メトトレキセートに対する耐性を付与するghfr（Wigler, M. ら (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70）; アミノグリコシド、ネオマイシンおよびG-418に対する耐性を付与するnpt（Colbere-Garapin, F. ら(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14）ならびに、それぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンに対する耐性を付与するalsおよびpat（Murry, 上記）。さらなる選択可能な遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するのを可能にするtrpBまたは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するのを可能にするhisDが記載されている（Hartman, S. C. およびR. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 8:8047-51）。最近、形質転換体を同定するためだけでなく、特定のベクター系に起因する一過的または安定的タンパク質発現の量を定量するためにも広く使用されている、アントシアニン、β-グルクロニダーゼおよびその基質GUS、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどの可視マーカーの使用が人気を得てきている（Rhodes, C. A. ら(1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131）。
特に好ましい発現ベクターは、2002年８月16日にDSM 15137で、ブダペスト条約にしたがってDSMZ (Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellen)に寄託されたpSKK3-scFv6_抗CD3である。
本発明はまた、本発明の抗体、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含有する組成物に関する。好ましくは、該組成物は、好ましくは適当な医薬用担体と組み合わされた医薬組成物である。好適な医薬用担体の例は、当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水型エマルジョンなどのエマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。かかる担体は、慣用法により製剤化され得、適当な投薬量で被験体に投与され得る。適切な組成物の投与は、種々の方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与により行なわれ得る。もちろん、投与経路は、治療の種類および医薬組成物内に含まれる化合物の種類に依存する。投薬計画は、担当医師および他の臨床的因子により決定される。医学分野では周知のように、任意の一患者に対する用量は、患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与する具体的な化合物、投与の時間および経路、治療の種類、一般健康状態ならびに同時に投与しているほかの薬物を含む、多くの因子に依存する。
上記の本発明の化合物の好ましい医学的用途は免疫療法、好ましくは急性移植片拒絶、あるいはＩ型糖尿病、多発性硬化症およびリウマチ様関節炎などの自己免疫疾患に対する治療である。
以下の実施例により、本発明をより詳細に説明する。
実施例１：細菌における抗CD3 scFv10およびscFv6抗体の発現のためのプラスミドpHOG-scFv10/抗CD3、pHOG-scFv6/抗CD3、pSKK-scFv10/抗CD3およびpSKK-scFv6/抗CD3の構築
抗CD3 scFv10およびscFv6をコードする遺伝子を構築するため（図２）、抗ヒトCD3 scFv18の遺伝子を含有するプラスミドpHOG21-dmOKT3（Kipriyanovら, 1997, Protein Engineering 10, 445-453）を使用した。クローニング手順を容易にするため、NotI制限部位を、プライマーBi3sk, 5’-CAGCCGGCCATGGCGCAGGTGCAACTGCAGCAGおよびBi9sk, 5’-GAAGATGGATCCAGCGGCCGCAGTATCAGCCCGGTTを用い、scFv18遺伝子のPCR増幅によりプラスミドpHOG21-dmOKT3内に導入した。得られた776 bp PCR 断片を、NcoIおよびNotIで消化し、NcoI/NotI線状化ベクターpHOG21-CD19 (Kipriyanovら, 1996, J. Immunol. Methods 196, 51-62)内にクローン化し、このようにしてプラスミドpHOG21-dmOKT3+Notを作製した。Kabat番号付けスキーム（Kipriyanovら, 1997, Protein Engineering 10, 445-453）に従う100A位にCys-Ser置換を有するOKT VHドメインをコードする遺伝子を、プライマーDP1, 5’-TCACACAGAATTCTTAGATCTATTAAAGAGGAGAAATTAACCおよびDP2, 5’-AGCACACGATATCACCGCCAAGCTTGGGTGTTGTTTTGGCまたはOKT_5, 5’-TATTAAGATATCGGGTGTTGTTTTGGCTGAGGAGのいずれかを用いたPCRにより増幅し、それぞれ10個および６個のアミノ酸のリンカーが続くVHの遺伝子を作製した（図２）。得られた507 bpおよび494 bp PCR断片をNcoIおよびEcoRVで消化し、NcoI/EcoRV線状化プラスミドpHOG21-dmOKT3+Not内にクローン化し、このようにしてプラスミドpHOG21-scFv10/抗CD3およびpHOG21-scFv6/抗CD3をそれぞれ作製した。
抗CD3 scFv10およびscFv6をコードする遺伝子を構築するため（図２）、抗ヒトCD3 scFv18の遺伝子を含有するプラスミドpHOG21-dmOKT3（Kipriyanovら, 1997, Protein Engineering 10, 445-453）を使用した。クローニング手順を容易にするため、NotI制限部位を、プライマーBi3sk, 5’-CAGCCGGCCATGGCGCAGGTGCAACTGCAGCAGおよびBi9sk, 5’-GAAGATGGATCCAGCGGCCGCAGTATCAGCCCGGTTを用い、scFv18遺伝子のPCR増幅によりプラスミドpHOG21-dmOKT3内に導入した。得られた776 bp PCR 断片を、NcoIおよびNotIで消化し、NcoI/NotI線状化ベクターpHOG21-CD19 (Kipriyanovら, 1996, J. Immunol. Methods 196, 51-62)内にクローン化し、このようにしてプラスミドpHOG21-dmOKT3+Notを作製した。Kabat番号付けスキーム（Kipriyanovら, 1997, Protein Engineering 10, 445-453）に従う100A位にCys-Ser置換を有するOKT VHドメインをコードする遺伝子を、プライマーDP1, 5’-TCACACAGAATTCTTAGATCTATTAAAGAGGAGAAATTAACCおよびDP2, 5’-AGCACACGATATCACCGCCAAGCTTGGGTGTTGTTTTGGCまたはOKT_5, 5’-TATTAAGATATCGGGTGTTGTTTTGGCTGAGGAGのいずれかを用いたPCRにより増幅し、それぞれ10個および６個のアミノ酸のリンカーが続くVHの遺伝子を作製した（図２）。得られた507 bpおよび494 bp PCR断片をNcoIおよびEcoRVで消化し、NcoI/EcoRV線状化プラスミドpHOG21-dmOKT3+Not内にクローン化し、このようにしてプラスミドpHOG21-scFv10/抗CD3およびpHOG21-scFv6/抗CD3をそれぞれ作製した。
細菌ペリプラズム内での機能的scFv抗体の収量を増加させるため、至適化発現ベクターpSKK3を作製した（図３）。このベクターは、hok/sokプラスミド無含有細胞自殺系（Thistedら, 1994, EMBO J. 13, 1960-1968）を含むプラスミドpHKK（Hornら, 1996, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 524-532）をもとに構築した。まず、ハイブリッドscFv VH3-VL19をコードする遺伝子を、プラスミドpHOG3-19（Kipriyanovら, 1998, Int. J. Cancer 77, 763-772）から、プライマー5-NDE, 5’-GATATACATATGAAATACCTATTGCCTACGGCおよび3-AFL, 5’-CGAATTCTTAAGTTAGCACAGGCCTCTAGAGACACACAGATCTTTAGを用いたPCRにより増幅した。得られた921 bp PCR 断片を、NdeIおよびAflIIで消化し、NdeI/AflII線状化プラスミドpHKK内にクローン化し、ベクターpHKK3-19を作製した。lacI遺伝子の3’-末端部分を含有するpHKKプラスミドの断片である（lacリプレッサーをコードする）余分なXbaI部位を欠失させるため、強力な転写ターミネーターtHPおよび野生型lacプロモーター／オペレーターを、プライマー5-NAR, 5’-CACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCおよび3-NDE, 5’-GGTATTTCATATGTATATCTCCTTCTTCAGAAATTCGTAATCATGGを用いたPCRにより増幅した。得られた329 bp DNA 断片を、NarIおよびNdeIで消化し、NarI/NdeI線状化プラスミドpHKK3-19内にクローン化し、ベクターpHKK Xbaを作製した。より高度の組換え抗体産生のためのSkp/OmpHペリプラズム因子をコードする遺伝子を導入するため（BothmannおよびPlueckthun, 1998, Nat. Biotechnol. 16, 376-380）、skp遺伝子を、プライマーSkp-3, 5’-CGAATTCTTAAGAAGGAGATATACATATGAAAAAGTGGTTATTAGCTGCAGGおよびSkp-4, 5’-CGAATTCTCGAGCATTATTTAACCTGTTTCAGTACGTCGGを用い、プラスミドpGAH317を鋳型として用いたPCRにより増幅した（HolckおよびKleppe, 1988, Gene 67, 117-124）。得られた528 bp PCR 断片を、AflIIおよびXholで消化し、AflII/Xhol消化プラスミドpHKK Xba内にクローン化し、発現プラスミドpSKK2をもたらした。潜在的免疫原性c-mycエピトープをコードする配列を除去するため、NcoI/XbaI線状化プラスミドpSKK2を、scFv phOx31EをコードするNcoI/XbaI消化902 bp PCR断片のクローニングに使用し（Marksら, 1997, BioTechnology 10, 779-783）、これを、プライマーDP1およびHis-Xba, 5’-CAGGCCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGGGを用いて増幅した。得られたプラスミドpSKK3をNcoIおよびNotIで消化し、プラスミドpHOG21-scFv6/抗-CD3およびpHOG21-scFv10/抗-CD3を、それぞれNcoIおよびNotIで消化した後、715 bpおよび727 bp DNA断片として単離された抗CD3 scFv6およびscFv10をコードする遺伝子のクローニング用ベクターとして使用した。
作製したプラスミドpSKK3-scFv6/抗-CD3（図３）およびpSKK3-scFv10/抗-CD3は、プラスミド性能を改善し、高振とうフラスコ培養かつ高細胞密度発酵条件下で、大腸菌ペリプラズム内での機能的二価産物の蓄積をもたらすといういくつかの特徴を含む。これらは、プラスミド損失を抑制するhok/sok分離後殺傷系であり、強力なタンデムリボソーム結合部位であり、かつ細菌における抗体断片の機能的収量を増加させるペリプラズム因子Skp/OmpHをコードする遺伝子である。この発現カセットは、wt lacプロモーター／オペレーター系の転写制御下にあり、β-ガラクトシダーゼのN-末端ペプチド(lacZ’)をコードする短い配列（大腸菌lacZ遺伝子由来の第１rbs、続いてファージT7の第10遺伝子（T7g10）由来の強力なrbsの転写制御下にあるscFv抗体およびSkp/OmpHペリプラズム因子をコードする遺伝子を有する）を含む。加えて、免疫検出および固定化金属アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)による組換え産物の精製の両方で、scFv-抗体の遺伝子の後には、６個のヒスチジン残基をコードするヌクレオチド配列がある。
実施例２：scFv抗体の細菌における産生および精製
大腸菌K12株RV308（Δlacχ74 galISII::OP308strA）（Maurerら, 1980, J. Mol. Biol. 139, 147-161）（ATCC 31608）を、scFv抗体の機能的発現に使用した。それぞれ発現プラスミドpSKK3-scFv6/抗-CD3およびpSKK3-scFv10/抗-CD3で形質転換した細菌を、100μg/mlアンピシリンおよび100 mMグルコースを含む2×YT培地（2×YTGA）中、26℃で一晩成長させた。一夜培養物を、新たな2×YTGA培地中で、600 nmにおける光学濃度（OD600）が0.1まで希釈し、フラスコ培養物として、激しく攪拌しながら（180〜220 rpm）26℃で、OD600が0.6〜0.8に達するまで成長を継続させた。細菌を5000 gで10分間、20℃での遠心分離により回収し、同容量の新たなYTBS培地（1Mソルビトール、2.5 mMグリシンベタインおよび50μg/mlアンピシリンを含有する2×YT）中に再懸濁した。イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を、最終濃度0.2 mMまで添加し、21℃で14〜16時間、成長を継続させた。細胞を9000 gで20分間、４℃での遠心分離により回収した。可溶性ペリプラズムタンパク質を単離するため、ペレット化した細菌を、初期容量の５％の氷冷200 mM Tris-HCl、20%スクロース、1 mM EDTA、pH 8.0中に再懸濁した。時々攪拌しながら氷上で１時間インキュベーションした後、スフェロプラストを、30000 gで30分間、４℃で遠心分離すると、可溶性ペリプラズム抽出物が上清みとして、スフェロプラストおよび不溶性ペリプラズム物質がペレットとして残った。ペリプラズム抽出物を、50 mM Tris-HCl、1M NaCl、pH 7.0に対して充分に透析し、scFv抗体を単離するための出発物質として使用した。組換え産物を硫酸アンモニウム沈殿により濃縮した（最終濃度70％飽和）。タンパク質沈殿物を、遠心分離（10000 g、４℃、40分）により回収し、初期容量の10％の50 mM Tris-HCl、1M NaCl、pH 7.0に溶解した後、同バッファーに対して充分透析した。Cu2+を充填し、50 mM Tris-HCl、1M NaCl、pH 7.0（開始バッファー）で平衡化したChelating Sepharose（Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany）の５ml容カラムを用い、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)を４℃にて行なった。試料を、重力流によってカラムを通過させることにより負荷した。次いで、カラムを、20カラム容量の開始バッファー、続いて50 mMイミダゾールを含有する開始バッファーで溶出液の吸光度（280 nm）が最小になるまで（約30カラム容量）洗浄した。吸着された物質を50 mM Tris-HCl、1M NaCl、300 mMイミダゾール、pH 7.0で1 ml画分として溶出した。組換えタンパク質を含有する溶出画分を、12％ SDS-PAGEによる還元、続いてクーマシー染色により同定した。陽性画分をプールし、予め充填されたPD-10カラム（Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany）を用いて、50 mM イミダゾール-HCl、50 mM NaCl (pH 7. 0)との溶媒交換に供した。タンパク質溶液の濁度を、遠心分離（30000 g、１時間、４℃）により除去した。
大腸菌K12株RV308（Δlacχ74 galISII::OP308strA）（Maurerら, 1980, J. Mol. Biol. 139, 147-161）（ATCC 31608）を、scFv抗体の機能的発現に使用した。それぞれ発現プラスミドpSKK3-scFv6/抗-CD3およびpSKK3-scFv10/抗-CD3で形質転換した細菌を、100μg/mlアンピシリンおよび100 mMグルコースを含む2×YT培地（2×YTGA）中、26℃で一晩成長させた。一夜培養物を、新たな2×YTGA培地中で、600 nmにおける光学濃度（OD600）が0.1まで希釈し、フラスコ培養物として、激しく攪拌しながら（180〜220 rpm）26℃で、OD600が0.6〜0.8に達するまで成長を継続させた。細菌を5000 gで10分間、20℃での遠心分離により回収し、同容量の新たなYTBS培地（1Mソルビトール、2.5 mMグリシンベタインおよび50μg/mlアンピシリンを含有する2×YT）中に再懸濁した。イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を、最終濃度0.2 mMまで添加し、21℃で14〜16時間、成長を継続させた。細胞を9000 gで20分間、４℃での遠心分離により回収した。可溶性ペリプラズムタンパク質を単離するため、ペレット化した細菌を、初期容量の５％の氷冷200 mM Tris-HCl、20%スクロース、1 mM EDTA、pH 8.0中に再懸濁した。時々攪拌しながら氷上で１時間インキュベーションした後、スフェロプラストを、30000 gで30分間、４℃で遠心分離すると、可溶性ペリプラズム抽出物が上清みとして、スフェロプラストおよび不溶性ペリプラズム物質がペレットとして残った。ペリプラズム抽出物を、50 mM Tris-HCl、1M NaCl、pH 7.0に対して充分に透析し、scFv抗体を単離するための出発物質として使用した。組換え産物を硫酸アンモニウム沈殿により濃縮した（最終濃度70％飽和）。タンパク質沈殿物を、遠心分離（10000 g、４℃、40分）により回収し、初期容量の10％の50 mM Tris-HCl、1M NaCl、pH 7.0に溶解した後、同バッファーに対して充分透析した。Cu2+を充填し、50 mM Tris-HCl、1M NaCl、pH 7.0（開始バッファー）で平衡化したChelating Sepharose（Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany）の５ml容カラムを用い、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)を４℃にて行なった。試料を、重力流によってカラムを通過させることにより負荷した。次いで、カラムを、20カラム容量の開始バッファー、続いて50 mMイミダゾールを含有する開始バッファーで溶出液の吸光度（280 nm）が最小になるまで（約30カラム容量）洗浄した。吸着された物質を50 mM Tris-HCl、1M NaCl、300 mMイミダゾール、pH 7.0で1 ml画分として溶出した。組換えタンパク質を含有する溶出画分を、12％ SDS-PAGEによる還元、続いてクーマシー染色により同定した。陽性画分をプールし、予め充填されたPD-10カラム（Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany）を用いて、50 mM イミダゾール-HCl、50 mM NaCl (pH 7. 0)との溶媒交換に供した。タンパク質溶液の濁度を、遠心分離（30000 g、１時間、４℃）により除去した。
最終精製を、Mono S HR 5/5カラム（Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany）において、50 mM イミダゾール-HCl、50 mM NaCl、pH 7. 0中で、0.05〜1 M NaCl勾配でのイオン交換クロマトグラフィーに行なった。scFv抗体を含有する画分を、Ultrafree-15遠心分離フィルター装置（Millipore, Eschborn, Germany）を用い、50 mM イミダゾール含有PBS、pH 7.0（PBSIバッファー）でのバッファー交換と同時に濃縮した。タンパク質濃度を、Bio-Rad（Munich, Germany）タンパク質アッセイキットを用い、Bradford色素結合アッセイ（Bradford, 1976, Anal. Biochem., 72, 248-254）により測定した。SDS-PAGE解析により、抗CD3 scFv10およびscFv6は、分子量(Mr)約30 kDaの単一のバンドとして移動することが示された（図４）。較正Superdex 200 HR 10/30カラム（Amersham Pharmacia）におけるサイズ排除クロマトグラフィーにより、scFv6は、主にMr 約60 kDaの二量体形態であるが、scFv10は純粋な単量体であることが示された（図５）。
実施例３：細胞結合測定
ヒトCD3+ Ｔ細胞白血病ジャーカット細胞株を、フローサイトメトリー実験に使用した。細胞を、５％ CO2を含む加湿雰囲気中、37℃で、10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリンGナトリウム、100μg/ml硫酸ストレプトマイシン（すべて、Invitrogen, Groningen, The Netherlands製）を添加したRPMI 1640中で培養した。1 x 106細胞を、希釈したscFv抗体またはmAb OKT3（Orthoclone, OKT3, Cilag, Sulzbach, Gemany）を含む、２%熱不活化ウシ胎児血清（FCS, Invitrogen, Groningen, The Netherlands）および0.1%アジ化ナトリウム（Roth, Karlsruhe, Germany）を添加した0.1 mlリン酸緩衝生理食塩水（PBS, Invitrogen, Groningen, The Netherlands）（FACSバッファーという）とともに、45分間、氷上でインキュベートした。FACSバッファーで洗浄した後、細胞を、0.01 mg/ml抗(His)6 マウスmAb 13/45/31-2（Dianova, Hamburg, Germany）とともに同バッファー0.1 ml中で45分間、氷上でインキュベートした。第２洗浄サイクル後、細胞を、0.015 mg/ml FITC結合ヤギ抗マウスIgG（Dianova. Hamburg, Germany）0.1 mlとともに、先と同条件下でインキュベートした。次いで、細胞を再度洗浄し、２μg/mlヨウ化プロピジウム（Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany）を含有するFACSバッファー 0.5 ml中に再懸濁し、死細胞を排除した。1 x 104染色細胞の蛍光を、Beckman-Coulter Epics XLフローサイトメーター（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）を用いて測定した。平均蛍光(F)を、System-IIおよびExpo32ソフトウェア（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）を用いて算出し、バックグラウンド蛍光を差し引いた。平衡化解離定数(Kd)を、ソフトウェアプログラムPRISM（GraphPad Software, San Diego, CA）を用いて実験値をラインウィーバー-バーク式：1/F = 1/Fmax + (Kd/Fmax)(1/[Ab])にフィッティングさせることにより決定した。
ヒトCD3+ Ｔ細胞白血病ジャーカット細胞株を、フローサイトメトリー実験に使用した。細胞を、５％ CO2を含む加湿雰囲気中、37℃で、10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリンGナトリウム、100μg/ml硫酸ストレプトマイシン（すべて、Invitrogen, Groningen, The Netherlands製）を添加したRPMI 1640中で培養した。1 x 106細胞を、希釈したscFv抗体またはmAb OKT3（Orthoclone, OKT3, Cilag, Sulzbach, Gemany）を含む、２%熱不活化ウシ胎児血清（FCS, Invitrogen, Groningen, The Netherlands）および0.1%アジ化ナトリウム（Roth, Karlsruhe, Germany）を添加した0.1 mlリン酸緩衝生理食塩水（PBS, Invitrogen, Groningen, The Netherlands）（FACSバッファーという）とともに、45分間、氷上でインキュベートした。FACSバッファーで洗浄した後、細胞を、0.01 mg/ml抗(His)6 マウスmAb 13/45/31-2（Dianova, Hamburg, Germany）とともに同バッファー0.1 ml中で45分間、氷上でインキュベートした。第２洗浄サイクル後、細胞を、0.015 mg/ml FITC結合ヤギ抗マウスIgG（Dianova. Hamburg, Germany）0.1 mlとともに、先と同条件下でインキュベートした。次いで、細胞を再度洗浄し、２μg/mlヨウ化プロピジウム（Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany）を含有するFACSバッファー 0.5 ml中に再懸濁し、死細胞を排除した。1 x 104染色細胞の蛍光を、Beckman-Coulter Epics XLフローサイトメーター（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）を用いて測定した。平均蛍光(F)を、System-IIおよびExpo32ソフトウェア（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）を用いて算出し、バックグラウンド蛍光を差し引いた。平衡化解離定数(Kd)を、ソフトウェアプログラムPRISM（GraphPad Software, San Diego, CA）を用いて実験値をラインウィーバー-バーク式：1/F = 1/Fmax + (Kd/Fmax)(1/[Ab])にフィッティングさせることにより決定した。
フローサイトメトリー実験により、表面上にCD3を発現するジャーカット細胞に対するscFv抗体の特異的相互作用が示された。scFv6について得られた蛍光強度は、scFv10のものよりも有意に高く、これらの２つの抗体について、親和性値における10倍の差を反映する（図６、表１）。scFv6について推定される親和性値は、mAb OKT3のものにかなり近く、したがって、細胞表面に対するscFv6の二価結合が確認される。
実施例４：インビトロ細胞表面保持
直接結合実験においてscFv6、scFv10およびOKT3間の差の生物学的関連性を調べるため、CD3+ジャーカット細胞の表面におけるscFv抗体のインビトロ保持を、フローサイトメトリーにより測定した（図７）。細胞表面保持アッセイは、保持されたscFv抗体の検出を、マウス抗(His)6 mAb 13/45/31-2（0.01 mg/ml, Dianova. Hamburg, Germany）、次いでFITC結合ヤギ抗マウスIgG（0.015 mg/ml, Dianova. Hamburg, Germany）を用いて行なった以外は、記載のようにして（Adamsら, 1998, Cancer Res. 58, 485-490）、細胞表面抗原のインターナリゼーションを抑制する条件下で37℃にて行なった。抗体の動力学解離定数 (Koff)および解離の半減期(t1/2)の値を、ソフトウェアプログラムPRISM（GraphPad Software, San Diego, CA）を用い、実験データの一相指数関数崩壊フィット(one-phase exponential decay fit)から推定した。一価scFv10は、比較的短い保持半減期(1.02分)を有したが、scFv6およびOKT3は、それぞれ、1.5倍および2.5倍長いt1/2を有し、したがって、直接結合実験から推定した高結合親和性と充分相関する（図７、表１）。
直接結合実験においてscFv6、scFv10およびOKT3間の差の生物学的関連性を調べるため、CD3+ジャーカット細胞の表面におけるscFv抗体のインビトロ保持を、フローサイトメトリーにより測定した（図７）。細胞表面保持アッセイは、保持されたscFv抗体の検出を、マウス抗(His)6 mAb 13/45/31-2（0.01 mg/ml, Dianova. Hamburg, Germany）、次いでFITC結合ヤギ抗マウスIgG（0.015 mg/ml, Dianova. Hamburg, Germany）を用いて行なった以外は、記載のようにして（Adamsら, 1998, Cancer Res. 58, 485-490）、細胞表面抗原のインターナリゼーションを抑制する条件下で37℃にて行なった。抗体の動力学解離定数 (Koff)および解離の半減期(t1/2)の値を、ソフトウェアプログラムPRISM（GraphPad Software, San Diego, CA）を用い、実験データの一相指数関数崩壊フィット(one-phase exponential decay fit)から推定した。一価scFv10は、比較的短い保持半減期(1.02分)を有したが、scFv6およびOKT3は、それぞれ、1.5倍および2.5倍長いt1/2を有し、したがって、直接結合実験から推定した高結合親和性と充分相関する（図７、表１）。
解離定数(Kd)は、図６に示すラインウィーバー-バークプロットから推定した。Koff値は、図７に示すジャーカット細胞表面保持実験から推定した。抗体-抗原複合体の解離の半減期値(t1/2)は、ln2/Koff比から推定した。
実施例５：末梢血単球細胞(PBMC)の単離
ヒトPBMCを、密度勾配遠心分離により、健常志願者のヘパリン処理末梢血から単離した。血液試料を、PBS（Invitrogen, Groningen, The Netherlands）で２回希釈し、Histopaque-1077（Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany）のクッション上に重層し、800 gで25分間遠心分離した。界面上に位置するPBMCを回収し、使用前にPBSで３回洗浄した。
ヒトPBMCを、密度勾配遠心分離により、健常志願者のヘパリン処理末梢血から単離した。血液試料を、PBS（Invitrogen, Groningen, The Netherlands）で２回希釈し、Histopaque-1077（Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany）のクッション上に重層し、800 gで25分間遠心分離した。界面上に位置するPBMCを回収し、使用前にPBSで３回洗浄した。
実施例６：細胞増殖アッセイ
単離したPBMCを、10%熱不活化FCS、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリンGナトリウム塩および0.1 mg/ml硫酸ストレプトマイシン（すべて、Invitrogen, Groningen, The Netherlands製）を添加したRPMI 1640中に再懸濁し、96ウェル平底組織培養皿（Greiner, Frickenhausen, Germany）に、ウェルあたり2 x 105の細胞密度で配置した。三連の培養物を、５％ CO2を含む加湿雰囲気中、37℃で、表示された時間、続いて18時間、0.01 mM 5-ブロモ-2’-デオキシウリジン(BrdU)をパルス(pulsing)しながら、可溶性抗体の段階希釈物とともにインキュベートした。BrdUの取り込みを、製造業者の指示書にしたがって細胞増殖ELISA（Roche, Mannheim, Germany）により調べた。
単離したPBMCを、10%熱不活化FCS、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリンGナトリウム塩および0.1 mg/ml硫酸ストレプトマイシン（すべて、Invitrogen, Groningen, The Netherlands製）を添加したRPMI 1640中に再懸濁し、96ウェル平底組織培養皿（Greiner, Frickenhausen, Germany）に、ウェルあたり2 x 105の細胞密度で配置した。三連の培養物を、５％ CO2を含む加湿雰囲気中、37℃で、表示された時間、続いて18時間、0.01 mM 5-ブロモ-2’-デオキシウリジン(BrdU)をパルス(pulsing)しながら、可溶性抗体の段階希釈物とともにインキュベートした。BrdUの取り込みを、製造業者の指示書にしたがって細胞増殖ELISA（Roche, Mannheim, Germany）により調べた。
24〜36時間のインキュベーションの間、scFv6もscFv10も、自系（それぞれドナーＡ単独およびドナーＢ単独）および混合（ドナーＡ＋Ｂ）の両方のリンパ球培養物の増殖を誘導しなかった。対照的に、mAb OKT3 は、試験したすべての24時間培養物に対し、明らかに、FcγRを有する細胞を介するCD3架橋による高有糸分裂活性を示した（図８）。
OKT3誘導Ｔ細胞増殖は、72〜90時間インキュベートした自系PBMC培養物において有意に高かったが、scFv6およびscFv10は、24時間インキュベーションの場合と比べ、わずかな効果を示したにすぎなかった（図９）。抗体処理なしで72時間インキュベートした混合PBMC培養物（ドナーＡ＋Ｂ）では、混合リンパ球反応（MLR）が示された。混合PBMC培養物のOKT3での処理は、MLRに対して影響を与えなかったが、両scFv抗体は、MLRを濃度依存的に抑制することができ、したがって、10 μg/mlの濃度でバックグラウンドレベルに達した。
実施例７：サイトカイン放出の解析
活性化リンパ球によるサイトカイン分泌の測定のため、2 x 106 PBMCを、24ウェルプレート（Greiner, Frickenhausen, Germany）の個々のウェル内で、10%熱不活化FCS、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリンGナトリウム塩および0.1 mg/ml硫酸ストレプトマイシン（すべて、Invitrogen, Groningen, The Netherlands製）を添加したRPMI 1640中で、表示した抗体とともに平板培養した。IL-2、TNF-αおよびIFN-γの分泌の測定のため、培養上清みのアリコートを、それぞれ24時間、36時間および72時間後に回収した。市販のELISAキットを用い、IL-2 （Pharmingen, San Diego, CA）TNF-αおよびIFN-γ（Endogen, Cambridge, MA）についてサイトカインレベルを二連で測定した。
活性化リンパ球によるサイトカイン分泌の測定のため、2 x 106 PBMCを、24ウェルプレート（Greiner, Frickenhausen, Germany）の個々のウェル内で、10%熱不活化FCS、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリンGナトリウム塩および0.1 mg/ml硫酸ストレプトマイシン（すべて、Invitrogen, Groningen, The Netherlands製）を添加したRPMI 1640中で、表示した抗体とともに平板培養した。IL-2、TNF-αおよびIFN-γの分泌の測定のため、培養上清みのアリコートを、それぞれ24時間、36時間および72時間後に回収した。市販のELISAキットを用い、IL-2 （Pharmingen, San Diego, CA）TNF-αおよびIFN-γ（Endogen, Cambridge, MA）についてサイトカインレベルを二連で測定した。
自系および混合の両方のPBMC培養物において、OKT3は、IL-2（図１０）、IFN-γ（図１１）およびTNF-α（図１２）の強い放出を誘導した。対照的に、それぞれscFv6およびscFv10で処理した自系PBMC培養物は、IL-2（図１０）、IFN-γ（図１１）およびTNF-α（図１２）を産生しなかった。抗体なしでインキュベートした混合リンパ球培養物は、同種異系刺激の結果として有意な量のサイトカインの放出を示した。このIL-2およびIFN-γの分泌は、scFv抗体により用量依存的に抑制され得た（図10および11）。二価scFv6は、scFv10よりもほぼ10倍高い有効性をした。対照的に、mAb OKT3は、混合PBMC培養物において、サイトカイン放出の抑制でなく、むしろ誘導を有した。
実施例８：抗CD3抗体で処理したPBMC上の表面抗原の改変
初期活性化マーカーとしてIL-2レセプターのαサブユニット（CD25）の細胞表面発現の測定のため、2 x 106 PBMCを、24ウェルプレート（Greiner, Frickenhausen, Germany）の個々のウェル内で、10%熱不活化FCS、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリンGナトリウム塩および0.1 mg/ml硫酸ストレプトマイシン（すべて、Invitrogen, Groningen, The Netherlands製）を添加したRPMI 1640中で、表示した抗体とともに平板培養した。90時間のインキュベーション後、細胞を回収し、フローサイトメトリー解析のため、実施例３に記載のようにして、PE結合抗CD25 mAb B1.49.9および対応するイソタイプ対照（すべてBeckman-Coulter, Krefeld, Germany社製）で染色した。104リンパ球を、Beckman-Coulter Epics XLフローサイトメーター（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）で解析した。平均蛍光(F)を、System-IIソフトウェア（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）を用いて算出し、バックグラウンド蛍光を差し引いた。
初期活性化マーカーとしてIL-2レセプターのαサブユニット（CD25）の細胞表面発現の測定のため、2 x 106 PBMCを、24ウェルプレート（Greiner, Frickenhausen, Germany）の個々のウェル内で、10%熱不活化FCS、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリンGナトリウム塩および0.1 mg/ml硫酸ストレプトマイシン（すべて、Invitrogen, Groningen, The Netherlands製）を添加したRPMI 1640中で、表示した抗体とともに平板培養した。90時間のインキュベーション後、細胞を回収し、フローサイトメトリー解析のため、実施例３に記載のようにして、PE結合抗CD25 mAb B1.49.9および対応するイソタイプ対照（すべてBeckman-Coulter, Krefeld, Germany社製）で染色した。104リンパ球を、Beckman-Coulter Epics XLフローサイトメーター（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）で解析した。平均蛍光(F)を、System-IIソフトウェア（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）を用いて算出し、バックグラウンド蛍光を差し引いた。
OKT3の存在下で培養したPBMCは、フローサイトメトリーで測定すると、その表面上の初期活性化マーカーIL-2R （CD25）の強い上方調節を示した（図１２）。対照的に、scFv6またはscFv10のいずれかで処理したPBMC培養物は、いずれもCD25発現のレベル上昇を示さなかった（図１３）。したがって、これらの結果は、scFv6およびscFv10は、mAb OKT3とは異なり、Ｔ細胞活性化特性を有さないことを明白に示す。
実施例９：抗ＣＤ３抗体で処理したリンパ球上のTCR/CD3の調節および被覆
リンパ球上の細胞表面TCR/CD3の調節および被覆を測定するため、2 x 106 PBMCを、24ウェルプレート（Greiner, Frickenhausen, Germany）の個々のウェル内で、10%熱不活化FCS、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリンGナトリウム塩および0.1 mg/ml硫酸ストレプトマイシン（すべて、Invitrogen, Groningen, The Netherlands製）を添加したRPMI 1640中で、表示した抗体とともに平板培養した。24時間のインキュベーション後、細胞を回収し、フローサイトメトリー解析のため、FITC結合抗OKT3（Dr. Moldenhauer, German Cancer Research Center, Heidelberg）またはPC-5結合抗TCRα/β（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）および対応するイソタイプ対照（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）で染色した。細胞を、Ｔリンパ球について抗CD5抗体（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）で対比染色し、Beckman-Coulter Epics XLフローサイトメーター（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）で解析した。CD5陽性細胞由来のOKT3-FITCおよびTCR-PC5の平均蛍光(F)を、System-IIソフトウェア（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）を用いて算出した。CD3調節の計算および被覆を以前に記載（Cole, M. S. ら, 1997, J. Immunol. 159, 3613-3621）のようにして行なった。
リンパ球上の細胞表面TCR/CD3の調節および被覆を測定するため、2 x 106 PBMCを、24ウェルプレート（Greiner, Frickenhausen, Germany）の個々のウェル内で、10%熱不活化FCS、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリンGナトリウム塩および0.1 mg/ml硫酸ストレプトマイシン（すべて、Invitrogen, Groningen, The Netherlands製）を添加したRPMI 1640中で、表示した抗体とともに平板培養した。24時間のインキュベーション後、細胞を回収し、フローサイトメトリー解析のため、FITC結合抗OKT3（Dr. Moldenhauer, German Cancer Research Center, Heidelberg）またはPC-5結合抗TCRα/β（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）および対応するイソタイプ対照（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）で染色した。細胞を、Ｔリンパ球について抗CD5抗体（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）で対比染色し、Beckman-Coulter Epics XLフローサイトメーター（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）で解析した。CD5陽性細胞由来のOKT3-FITCおよびTCR-PC5の平均蛍光(F)を、System-IIソフトウェア（Beckman-Coulter, Krefeld, Germany）を用いて算出した。CD3調節の計算および被覆を以前に記載（Cole, M. S. ら, 1997, J. Immunol. 159, 3613-3621）のようにして行なった。
結合した抗体であり、したがって、FITC結合抗OKT3により検出され得ない、Ｔリンパ球の表面上のCD3分子の数で規定される被覆は、最低濃度のOKT3および抗CD3 scFv6を用いた一実験においてのみ観察された（図１４）。抗体処理後に失われたＴ細胞の表面上のTCR/CD3複合体の割合を示すCD3調節は、0.1μg/ml〜10μg/mlの間の範囲の濃度のOKT3および抗CD3 scFv6により効率的に（＞90％）誘導される（図１４）。対照的に、抗CD3 scFv10の調節活性は、ずっと低く、10μg/mlを超える濃度でのみ観察することができた（図１４）。
Claims (9)
- 以下の特性：
(a)免疫反応を抑制することができる；
(b)定常抗体領域を欠いている；
(c)Ｔ細胞レセプターのCD3複合体上のエピトープに結合する；および
(d)二価ダイアボディである、
により特徴付けられる抗体を含んでなる医薬組成物であって、該抗体の可変ドメインが、ATCC受託番号CRL8001のハイブリドーマにより産生される抗体の可変ドメインに相当する、医薬組成物。 - 該抗体の可変VHドメインと可変VLドメインが、ペプチドリンカーSAKTTPを介して連結されている請求項１記載の医薬組成物。
- 該抗体のH100A位(Kabatナンバリングシステム)のシステインがセリンに置換されている請求項１記載の医薬組成物。
- 該抗体がインビトロでＴ細胞活性化特性を有さない、請求項１〜３いずれか記載の医薬組成物。
- pSKK3-scFv_6-抗-CD3(DSM 15137)である発現ベクター。
- 請求項５記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
- 免疫療法のための医薬組成物の調製における、以下の特性：
(a)免疫反応を抑制することができる；
(b)定常抗体領域を欠いている；
(c)Ｔ細胞レセプターのCD3複合体上のエピトープに結合する；および
(d)二価ダイアボディである、
により特徴付けられる抗体の使用であって、該抗体の可変ドメインが、ATCC受託番号CRL8001のハイブリドーマにより産生される抗体の可変ドメインに相当する、使用。 - 抗体が請求項３に規定される抗体である請求項７記載の使用。
- 前記免疫療法が急性移植片拒絶に対する治療である請求項７または８記載の使用。
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