JP5555022B2 - 破骨細胞除去フィルタおよび破骨細胞除去装置 - Google Patents

Description

本発明は、破骨細胞除去フィルタおよび破骨細胞除去装置に関するものである。

従来、血液製剤中に含まれる白血球を除去するフィルタが知られている（例えば、特許文献１〜３参照。）。

特開２００３−２３０６２７号公報 特開２００５−２９６４７５号公報 特開２００９−２２７６２号公報

しかしながら、特許文献１〜３のフィルタを使用して、白血球の種類の１つである破骨細胞を生体内の血液中から除去しようとすると、同じく白血球の種類である好中球やリンパ球などの有益な細胞も同時に除去されてしまうという問題がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、血液中から破骨細胞を選択的に除去することができる破骨細胞除去フィルタおよび破骨細胞除去装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、血液が流動可能な流路が形成されている担体と、該担体を収容する容器とを備え、該担体は、少なくとも前記流路の表面に、２５〜７５μｍの直径寸法と７０％以上の気孔率とを有するβリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）多孔体からなる顆粒が前記容器内に充填されてなる破骨細胞除去フィルタを提供する。
本発明によれば、血液を担体内の流路に流動させると、血液中に含まれる破骨細胞が流路内において選択的にβ−ＴＣＰに接着して担体に捕捉される。これにより、血液中から破骨細胞を選択的に除去することができる。

上記発明においては、前記担体を収容する容器を備え、前記担体は、βリン酸三カルシウム多孔体からなる顆粒が前記容器内に充填されてなるので、顆粒を容器内に充填するだけで容易に担体を製造することができる。

また、上記発明においては、前記顆粒が、２５〜７５μｍの直径寸法を有するので、破骨細胞をより効率良く顆粒に接着させて血液中から除去することができる。

また、上記発明の参考例においては、前記顆粒が、７５〜１０５μｍの直径寸法を有していてもよい。
このようにすることで、比較的寸法が大きな破骨細胞も顆粒への接着が容易になり、より効率的に破骨細胞を除去することができる。

また、上記発明においては、前記顆粒が、７０％以上の気孔率を有するので、血液をよりスムーズに流動させることができる。
また、上記発明においては、前記担体を収容する容器を備え、該容器が、ポリカーボネートまたは塩化ビニルからなることが好ましい。
このようにすることで、血液中に含まれる細胞への影響を低減することができる。

また、上記発明においては、前記担体を収容する容器を備え、該容器は、内面がリン脂質膜により被覆されていることが好ましい。
このようにすることで、血液中の赤血球が容器内面に吸着することを防ぐことができる。

また、上記発明においては、前記担体を収容する収容室と、該収容室内に前記血液を流入させる流入口とを有する容器を備え、該収容室が、前記流入口の流動断面積より大きい流動断面積を有していてもよい。
このようにすることで、流入口から流入した血液の流速が収容室において低下するので、血液と担体との接触時間をより長く確保して破骨細胞をより確実に担体に補足させることができる。

また、本発明は、生体内の血液を体外に循環させる血液回路と、該血液回路の途中位置に配置された上記いずれかに記載の破骨細胞除去フィルタとを備える破骨細胞除去装置を提供する。
本発明によれば、生体内の血液を血液回路に循環させることにより、破骨細胞除去フィルタにおいて破骨細胞が選択的に除去された血液を生体内に戻すことができる。

また、本発明は、生体内の血液を体外に循環させる血液回路と、該血液回路の途中位置に配置された複数の上記に記載の破骨細胞除去フィルタを備え、該破骨細胞除去フィルタは、前記血液回路の前段側から後段側に向けて順に、前記担体に充填されている前記顆粒の直径寸法が小さくなっている破骨細胞除去装置を提供する。
このようにすることで、破骨細胞が比較的大きなものから順に多段階で除去され、さらに効率的に破骨細胞を血液中から除去することができる。

上記発明においては、前記血液回路は、前記血液が前記担体を通過する時間が約５分間となる流量で前記血液を循環させることとしてもよい。
このようにすることで、破骨細胞の除去効率をさらに向上することができる。

本発明によれば、血液中から破骨細胞を選択的に除去することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る破骨細胞除去装置を示す全体構成図である。 本発明の一実施形態に係る破骨細胞除去フィルタを示す全体構成図である。 図１の破骨細胞除去装置の変形例を示す図である。 図２の破骨細胞除去フィルタの変形例を示す図である。 β−ＴＣＰに接着した破骨細胞を示す走査型電子顕微鏡写真である。 破骨細胞によるβ−ＴＣＰの貧食の程度を示すグラフであり、（ａ）７５〜１０５μｍと（ｂ）２５〜７５μｍの直径寸法のβ−ＴＣＰ多孔体の顆粒を使用した場合を示している。

以下に、本発明の一実施形態に係る破骨細胞除去フィルタ１および破骨細胞除去装置１００について図１〜図４を参照して説明する。
本実施形態に係る破骨細胞除去装置１００は、図１に示されるように、患者の体内の血液を体外で循環させる血液回路２と、該血液回路２の途中位置に設けられた破骨細胞除去フィルタ１とを備えている。

血液回路２は、動脈側チューブ３ａおよび静脈側チューブ３ｂと、動脈側チューブ３ａの途中位置に設けられた輸送ポンプ４と、動脈側チューブ３ａに接続された抗血液凝固剤バック５とを備えている。

動脈側チューブ３ａおよび静脈側チューブ３ｂは、一端に穿刺針６ａ，６ｂを有し、動脈側チューブ３ａの他端が後述する容器７の流入口７ａに接続され、静脈側チューブ３ｂの他端が後述する容器７の流出口７ｃに接続されている。
輸送ポンプ４は、動脈側チューブ３ａの一端側から他端側に向けて、血液を輸送するようになっている。輸送ポンプ４は、例えば、１ｍｌ／分の流量で血液を輸送する。
抗血液凝固剤バッグ５は、例えば、ヘパリンやカルシウムキレート剤などの抗血液凝固剤の溶液を収容し、バルブＶを介して動脈側チューブ３ａと接続されている。

破骨細胞除去フィルタ１は、図２に示されるように、流入口７ａおよび流出口７ｃを有する容器７と、該容器７内に充填されたβ−ＴＣＰ多孔体の顆粒Ａからなる担体８とを備えている。

容器７は、流入口７ａと流出口７ｃとの間の収容室７ｃ内が、メッシュ９によって流動方向に３つの空間に区画されている。担体８は、収容室内７ｃの区画された３つの空間のうち中央の空間にβ−ＴＣＰ多孔体の顆粒Ａが充填されることにより構成され、β−ＴＣＰ多孔体の顆粒Ａ同士間の隙間が互いに連通することにより、血液が流動可能な流路を形成している。メッシュ９は、β−ＴＣＰ多孔体の顆粒Ａの直径寸法より小さい孔径を有し、顆粒Ａが流入口７ａおよび流出口７ｃへ流出することを禁止している。

収容室７ｃは、流入口７ａおよび流出口７ｃに比べて十分に大きな内径寸法を有している。これにより、担体８における流動断面積が、流入口７ａおよび流出口７ｃにおける流動断面積より大きくなり、血液が流入口７ａから収容室７ｃ内に流入すると収容室７ｃ内において流速が低下して担体８内を遅い流速で流動するようになっている。

容器７は、ポリカーボネートや塩化ビニルなど、生体適合性に優れた材質からなるものが使用される。また、容器７の内面は、リン脂質の被膜によってコートされている。リン脂質としては、例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ、日本油脂社製）が好ましい。これにより、容器７内において血液をゆっくり流動させても、血球が容器７の内面に吸着することを防ぐことができる。

β−ＴＣＰ多孔体としては、７０％以上の気孔率を有するものが用いられる。このようにすることで、顆粒Ａ同士間に形成された流路のみならず気孔も介して血液をスムーズに流動させることができる。また、β−ＴＣＰ多孔体の顆粒Ａは、２５〜７５μｍの直径寸法を有するものが用いられる。

また、輸送ポンプ４を作動させて流入口７ａから容器７内に血液を流入させたときに、血液が担体８を通過するのに要する時間が約５分になるように、収容室７ｃの内径と、担体８の流動方向の長さ寸法とが設計されている。

このように構成された破骨細胞除去フィルタ１および破骨細胞除去装置１００の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る破骨細胞除去装置１００を使用するには、動脈側チューブ３ａの穿刺針６ａを患者の動脈に穿刺し、静脈側チューブ３ｂの穿刺針６ｂを患者の静脈に穿刺し、輸送ポンプ４を作動させると同時にバルブＶを開放させることにより、患者の体内の血液を、動脈から、動脈側チューブ３ａ、破骨細胞除去フィルタ１および静脈側チューブ３ｂを介して静脈に循環させることができる。

この場合に、本実施形態によれば、破骨細胞除去フィルタ１において、血液中に含まれる細胞のうち破骨細胞が選択的にβ−ＴＣＰ多孔体の顆粒Ａの表面に接着して捕捉される。これにより、例えば、骨粗鬆症やリウマチなど、破骨細胞の過剰な増殖によって引き起こされる病気の治療として本実施形態に係る破骨細胞除去装置１００を使用した場合に、標的とする破骨細胞を選択的に除去し、血液中の有益な他の細胞はそのまま患者の体内へ還すことができるという利点がある。

また、収容室７ｃ内においては血液の流速を十分に緩やかにするとともに血液を十分に長い時間にわたって担体８と接触させることにより、血液中の破骨細胞をより確実にβ−ＴＣＰ多孔体の顆粒Ａに接着させて破骨細胞の除去効率を向上することができるという利点がある。

なお、上記実施形態においては、血液回路２の途中位置に１つの破骨細胞除去フィルタ１を配置することとしたが、これに代えて、図３に示されるように、複数の破骨細胞除去フィルタ１を直列に配置してもよい。この場合、各破骨細胞除去フィルタ１には、直径の異なるβ−ＴＣＰ多孔体の顆粒Ａを使用することが好ましく、動脈側チューブ３ａから静脈側チューブ３ｂに向かって順にβ−ＴＣＰ多孔体の顆粒Ａの直径が小さくなるように破骨細胞除去フィルタ１を配置することがさらに好ましい。例えば、前段の破骨細胞除去フィルタ１には、直径が７５〜１０５μｍのβ−ＴＣＰ多孔体の顆粒を使用し、後段の破骨細胞除去フィルタ１には、直径が２５〜７５μｍのβ−ＴＣＰ多孔体の顆粒を使用することが好ましい。

破骨細胞は、複数の単核細胞が融合した多核細胞であり、大きさにばらつきがある。したがって、血液回路２の上流から下流に向かって顆粒Ａの直径を順次小さくすることにより、破骨細胞を大きさによって段階的に確実に除去することができる。

また、上記実施形態においては、容器７および担体８の形状は図２に例示したものに限定されず、適宜変更可能である。例えば、図４に示されるように、担体８は、メッシュ状の内容器１０内に顆粒Ａを充填することにより構成され、収容室７ｃ内には、担体８が配置された部分を除いて流入口７ａ側の空間と流出口７ｃ側の空間とを区画する壁１１が設けられていてもよい。

また、上記実施形態においては、担体８として、β−ＴＣＰ多孔体の顆粒Ａを容器７内に充填することにより形成されたものを例示したが、担体８の構成はこれに限定されるものではなく、血液を流動可能な流路を形成し、該流路の表面にβ−ＴＣＰを保持していればよい。例えば、表面をβ−ＴＣＰで被覆した平板を、流路となる隙間を空けて板圧方向に複数枚積層することにより担体８を形成してもよい。

以下に、本発明の実施例について図５および図６を参照して説明する。
〔実施例１〕
血液中から破骨細胞の前駆細胞を以下の手順で分離した。
健常な成人男性から、抗血液凝固剤としてヘパリンを用いて採血した。採血した血液（末梢血）を該血液と等量のＴｒｉｓ緩衝液で希釈した。次に、２．４ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）に対して３ｍｌの希釈した血液を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳの上に重層し、１８〜２０℃において４００×ｇで３０分間遠心分離した。次に、上層を除去し、中間層（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳの上の層）の分画を採取した。

次に、採取した分画に、該分画の体積の３倍の体積のＴｒｉｓ緩衝液を添加してピペッティングし、１８〜２０℃において６０〜１００×ｇで１０分間遠心分離した。次に、上清を除去し、残ったペレットにＴｒｉｓ緩衝液を６〜８ｍｌ添加してピペッティングした後、８〜２０℃において４００×ｇで３０分間遠心分離することにより、分画に含まれる細胞を洗浄した。次に、上清を除去し、残ったペレットに２％のＦＢＳおよび１ｍＭのＥＤＴＡを添加したＰＢＳ（−）を添加し、細胞密度を５×１０^７個／ｍｌに調整した。以上の操作により、血液中から単球およびリンパ球を分離した。

次に、分離した単球およびリンパ球の細胞群の中から、ＥａｓｙＳｅｐ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｕｔｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｋｉｔ（以下、キットという。）およびＥａｓｙＳｅｐ Ｍａｇｎｅｔ（ともにＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用して、ＣＤ１４陽性を示す単球、すなわち、破骨細胞前駆細胞を分離した。

具体的には、ポリスチレン製のチューブ内において、分離した細胞群の懸濁液１ｍｌに対して、キットに付属のカクテル５０μｌを添加して十分に混合した後、チューブを２〜８℃で１０分間静置した。次に、細胞懸濁液１ｍｌに対して、予め３０秒間撹拌したキットに付属のマグネット粒子液５０μｌを添加して十分に混合し、チューブを２〜８℃で５分間静置した。次に、チューブをＥａｓｙＳｅｐ Ｍａｇｎｅｔに取り付け、その状態で別のポリスチレン製のチューブに細胞懸濁液を回収した。以上の操作により、破骨細胞前駆細胞を分離した。

〔実施例２〕
破骨細胞がβ−ＴＣＰ多孔体に接着してβ−ＴＣＰを貧食している様子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察した。
実施例１で分離した破骨細胞前駆細胞を、直径寸法が７５〜１０５μｍのβ−ＴＣＰ多孔体の顆粒と混合し、一定期間インキュベートした後、ＳＥＭにより観察した。その観察結果を図５に示す。符号Ａはβ−ＴＣＰ多孔体の顆粒を示し、符号Ｂは破骨細胞を示している。この観察結果から、破骨細胞がβ−ＴＣＰに接着して貧食することが確認された。

〔実施例３〕
破骨細胞のβ−ＴＣＰの貧食作用を以下の実験により検討した。
まず、実施例１で分離した破骨細胞前駆細胞を、細胞数が２×１０^６個／ｍｌになるようにＨａｎｋ’ｓ緩衝液で調製した。次に、マイクロプレートの各ウェルに、細胞数を調整した破骨細胞前駆細胞の細胞懸濁液５０μｌと、５×１０^−５モルのルミノールおよびβ−ＴＣＰ多孔体の顆粒を含んだ懸濁液５０μｌとを添加し、３７℃でインキュベートした。

β−ＴＣＰ多孔体の顆粒は、β−ＴＣＰの最終濃度が０、０．０１、０．１、０．５および１ｍｇ／ｍｌになるように、各ウェルに添加した。また、β−ＴＣＰ多孔体の顆粒として、直径が２５〜７５μｍのものと直径が７５〜１０５μｍのものとを使用した。

そして、インキュベート中に、マイクロプレートリーダを用いてルミノールからの発光を経時的に測定した。破骨細胞がβ−ＴＣＰを貧食することにより活性酸素が産生され、該活性酸素とルミノールが反応することによりルミノールが発光する。発光したルミノールの発光強度から、破骨細胞のβ−ＴＣＰの貧食作用の程度を評価した。その結果を図６（ａ），（ｂ）に示す。

図６（ａ），（ｂ）は、横軸がインキュベート時間を示し、縦軸がルミノールの発光強度を相対光単位（ＲＵＬ）で示している。この実験結果から、直径寸法が７５〜１０５μｍの顆粒よりも、直径寸法が２５〜７５μｍの顆粒を使用した方が効率的に破骨細胞によるβ−ＴＣＰの浸食が進むことが確認された。また、破骨細胞がβ−ＴＣＰと接触してから約５分間でその貧食作用が最大となることが確認された。

すなわち、本発明に係る破骨細胞除去フィルタにおいて、β−ＴＣＰ多孔体の顆粒として直径寸法が２５〜７５μｍのものを使用することにより、破骨細胞の除去効率を向上することができることが示唆された。また、破骨細胞をβ−ＴＣＰ多孔体と約５分間接触させることにより、さらに確実に破骨細胞をβ−ＴＣＰ多孔体に捕捉できることが示唆された。

１ 破骨細胞除去フィルタ
２ 血液回路
３ａ 動脈側チューブ
３ｂ 静脈側チューブ
４ 輸送ポンプ
５ 抗血液凝固剤バッグ
６ａ，６ｂ 穿刺針
７ 容器
７ａ 流入口
７ｂ 流出口
７ｃ 収容室
８ 担体
９ メッシュ
１０ 内容器
１１ 壁
１００ 破骨細胞除去装置
Ａ β−ＴＣＰ多孔体の顆粒
Ｂ 破骨細胞
Ｖ バルブ

Claims (2)

1. 血液が流動可能な流路が形成されている担体と、
   該担体を収容する容器とを備え、
   該担体は、少なくとも前記流路の表面に、２５〜７５μｍの直径寸法と７０％以上の気孔率とを有するβリン酸三カルシウム多孔体からなる顆粒が前記容器内に充填されてなる破骨細胞除去フィルタ。
2. 生体内の血液を体外に循環させる血液回路と、
   該血液回路の途中位置に配置された請求項１に記載の破骨細胞除去フィルタとを備える破骨細胞除去装置。

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