JP5542166B2 - 荷電リポタンパク質複合体およびその使用 - Google Patents

Description

（１．関連出願の引用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／６６５，１８０号（２００５年３月２４日出願）に対する米国特許法第１１９条（ｅ）の下の優先権を主張し、この内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される。

（２．技術的分野）
本開示は、荷電リポタンパク質複合体、その複合体を含む医薬組成物、および脂質代謝異常および／またはそれに関連する疾患、異常、および／または状態を含む、様々な状態または異常を治療または予防するために、その複合体を使用する方法を提供する。

（３．背景）
循環コレステロールは、血漿リポタンパク質−−血中で脂質を運ぶ脂質およびタンパク質組成物の複合体粒子によって運ばれる。血漿中を循環し、そして脂肪運搬システムに関与する、リポタンパク質粒子の４つの主なクラス：キロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）。キロミクロンは、腸管脂肪吸収の短命な産物を構成する。ＶＬＤＬ、および特にＬＤＬは、肝臓（ここで合成される、または食事性供給源から得られる）から、動脈壁を含む肝臓外組織へのコレステロールの伝達を司る。対照的に、ＨＤＬはコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）、特に肝臓外組織から肝臓への、コレステロール脂質の除去を媒介し、肝臓でそれは貯蔵、異化、排泄、または再利用される。ＨＤＬはまた、炎症、酸化脂質およびインターロイキンの輸送に役割を果たす。

リポタンパク質粒子は、コレステロール（通常コレステロールエステルの形式で）およびトリグリセリドから成る疎水性のコアを有する。そのコアは、リン脂質、非エステル化コレステロール、およびアポリポタンパク質を含む表面コートに囲まれている。アポリポタンパク質は、脂質の輸送を媒介し、そして脂質代謝に関与する酵素と相互作用し得るものもある。ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＪ、およびＡｐｏＨを含む、少なくとも１０個のアポリポタンパク質が同定された。ＬＣＡＴ（レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ）、ＣＥＴＰ（コレステロールエステル輸送タンパク質）、ＰＬＴＰ（リン脂質輸送タンパク質）、およびＰＯＮ（パラオキソナーゼ）のような他のタンパク質も、リポタンパク質と関連することが見出された。

冠動脈心疾患、冠動脈疾患およびアテローム性動脈硬化症のような循環器疾患は、血清コレステロールレベルの上昇と圧倒的に関連している。例えば、アテローム性動脈硬化症は、動脈壁内のコレステロールの蓄積によって特徴付けられる、ゆっくりと進行する疾患である。抗しがたい証拠が、アテローム性動脈硬化症の病変に沈着した脂質は、主に血漿ＬＤＬに由来するという理論を支持する；従って、ＬＤＬは一般に「悪玉」コレステロールとして知られるようになった。対照的に、ＨＤＬ血清レベルは、冠動脈心疾患と逆比例する。実際、高いＨＤＬの血清レベルは、負の危険因子であると考えられる。高レベルの血漿ＨＤＬは、冠動脈心疾患に対して保護的であるだけでなく、実際アテローム性動脈硬化症のプラークの退縮を誘発し得るという仮説が立てられる（例えば非特許文献１；非特許文献２；Ｔａｎｇｉｒａｌａら、１９９９、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００（１７）：１８１６−２２；Ｆａｎら、１９９９、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １４７（１）：１３９−４５；Ｄｅｃｋｅｒｔら、１９９９、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００（１１）：１２３０−３５；Ｂｏｉｓｖｅｒｔら、１９９９、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９（３）：５２５−３０；Ｂｅｎｏｉｔら、１９９９、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９９（１）：１０５−１０；Ｈｏｌｖｏｅｔら、１９９８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２（２）：３７９−８５；Ｄｕｖｅｒｇｅｒら、１９９６、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（４）：７１３−１７；Ｍｉｙａｚａｋｉら、１９９５、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１５（１１）：１８８２−８８；Ｍｅｚｄｏｕｒら、１９９５、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １１３（２）：２３７−４６；Ｌｉｕら、１９９４、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３５（１２）：２２６３−６７；Ｐｌｕｍｐら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（２０）：９６０７−１１；Ｐａｓｚｔｙら、１９９４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４（２）：８９９−９０３；Ｓｈｅら、１９９２、Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．Ｊ．（Ｅｎｇｌ）．１０５（５）：３６９−７３；Ｒｕｂｉｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５３（６３４１）：２６５−６７；Ｓｈｅら、１９９０、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５９８：３３９−５１；Ｒａｎ、１９８９、Ｃｈｕｎｇ Ｈｕａ Ｐｉｎｇ Ｌｉ Ｈｓｕｅｈ Ｔｓａ Ｃｈｉｈ（Ｚｈｏｎｇｈｕａ Ｂｉｎｇ Ｌｉ Ｘｕｅ Ｚａ Ｚｈｉとも翻訳される）１８（４）：２５７−６１；Ｑｕｅｚａｄｏら、１９９５、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７２（２）：６０４−１１；Ｄｕｖｅｒｇｅｒら、１９９６、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１６（１２）：１４２４−２９；Ｋｏｐｆｌｅｒら、１９９４、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９０（３）：１３１９−２７；Ｍｉｌｌｅｒら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１４（６００６）：１０９−１１；Ｈａら、１９９２、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１２５（２）：２２３−２９；Ｂｅｉｔｚら、１９９２、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ４７（２）：１４９−５２を参照のこと）。結果として、ＨＤＬは一般に「善玉」コレステロールとして知られるようになった（例えば非特許文献３）を参照のこと）。

ＨＤＬの「保護的」な役割は、多くの研究において確認された（例えば非特許文献４；非特許文献５）。これらの研究において、ＬＤＬレベルの上昇は、心血管リスクの増加と関連しているようであり、一方高いＨＤＬレベルは、心血管の保護を与えるようである。インビボでの研究がさらに、ＨＤＬのウサギへの注入が、コレステロール誘発動脈病変の発生を阻害し得る（Ｂａｄｉｍｏｎら、１９８９、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６０：４５５−６１）および／またはその退縮を誘発し得る（Ｂａｄｉｍｏｎら、１９９０、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：１２３４−４１）ことを示して、ＨＤＬの保護的役割を証明した。

（３．１ コレステロール逆輸送、ＨＤＬ、およびアポリポタンパク質Ａ−Ｉ）
コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）経路は、ほとんどの肝臓外組織からコレステロールを除去するよう機能し、そして体内のほとんどの細胞の構造および機能を維持するために非常に重要である。ＲＣＴは、主に３つの工程から成る：（ａ）コレステロールの流出、すなわち様々な末梢細胞のプールからのコレステロールの最初の除去；（ｂ）流出したコレステロールの細胞への再流入を防止する、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の作用によるコレステロールのエステル化；および（ｃ）加水分解、次いで再利用、貯蔵、胆汁への排泄または胆汁酸への異化のための、ＨＬＤコレステロールおよびコレステロールエステルの肝臓細胞への取り込み。

ＲＣＴの重要な酵素であるＬＣＡＴは、肝臓によって産生され、そしてＨＤＬ画分に付随して血漿中を循環する。ＬＣＡＴは、細胞由来のコレステロールをコレステロールエステルに変換し、それは除去される運命にあるＨＤＬ中に隔離される（Ｊｏｎａｓ ２０００、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５２９（１−３）：２４５−５６を参照のこと）。コレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）およびリン脂質輸送タンパク質（ＰＬＴＰ）は、循環ＨＤＬ集団をさらにリモデリングするために寄与する。
ＣＥＴＰは、ＬＣＡＴによって作られたコレステロールエステルを、他のリポタンパク質、特にＶＬＤＬおよびＬＤＬのような、ＡｐｏＢを含むリポタンパク質に移す。ＰＬＴＰはレシチンをＨＤＬに供給する。ＨＤＬトリグリセリドは、細胞外肝臓トリグリセリドリパーゼによって異化され、そしてリポタンパク質コレステロールは、いくつかのメカニズムで肝臓によって除去される。

ＨＤＬ粒子の機能的な特徴は、ＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏＡ−ＩＩのような、その主なアポリポタンパク質の構成成分によって主に決定される。少量のＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＪも、ＨＤＬに付随して観察された。ＨＤＬは、代謝ＲＣＴカスケードまたは経路の間のリモデリングの状態に依存して、広く様々な異なるサイズおよび上記で述べた成分の異なる混合物で存在する。

各ＨＤＬ粒子は通常、少なくとも１分子、そして通常２から４分子のＡｐｏＡ−Ｉを含む。ＨＤＬ粒子はまた、ＡｐｏＥのみを含み得（ガンマ−ＬｐＥ粒子）、それはまたＰｒｏｆ．Ｇｅｒｄ Ａｓｓｍａｎｎによって記載されたように、コレステロールの流出を司ることが知られている（例えばｖｏｎ Ｅｃｋａｒｄｓｔｅｉｎら、１９９４、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．５（６）：４０４−１６を参照のこと）。ＡｐｏＡ−Ｉは、肝臓または小腸によって、プレプロアポリポタンパク質Ａ−Ｉとして合成され、それはプロアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ｐｒｏＡｐｏＡ−Ｉ）として分泌され、そして迅速に切断されて血漿形式のＡｐｏＡ−Ｉ、２４３アミノ酸の単一ポリペプチド鎖を生ずる（Ｂｒｅｗｅｒら、１９７８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：６２３−３０）。実験的に、直接血流に注入されたプレプロＡｐｏＡ−Ｉも、血漿形式のＡｐｏＡ−Ｉに切断される（Ｋｌｏｎら、２０００、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７９（３）：１６７９−８５；Ｓｅｇｒｅｓｔら、２０００、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１１（２）：１０５−１５；Ｓｅｇｒｅｓｔら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（４５）：３１７５５−５８）。

ＡｐｏＡ−Ｉは、多くの場合プロリンであるリンカー部分によって隔てられた、６から８個の異なる２２アミノ酸のアルファへリックスまたは機能的リピートを含む。リピート単位は、両親媒性のらせんコンフォメーションで存在し（Ｓｅｇｒｅｓｔら、１９７４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８：２４７−５３）、そしてＡｐｏＡ−Ｉの主な生物学的活性、すなわち脂質結合およびレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）活性を与える。

ＡｐｏＡ−Ｉは、脂質と３つの型の安定な複合体を形成する：プレ−ベータ−１ＨＤＬと呼ばれる、小さい、脂質の少ない複合体；プレ−ベータ−２ＨＤＬと呼ばれる、極性脂質（リン脂質およびコレステロール）を含む平板化した円盤状の粒子；および球状または成熟ＨＤＬと呼ばれる、極性および非極性脂質を両方含む球状粒子（ＨＤＬ_３およびＨＤＬ_２）。循環集団中のほとんどのＨＤＬは、ＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏＡ−ＩＩを両方含む（「ＡＩ／ＡＩＩ−ＨＤＬ画分」）。しかし、ＡｐｏＡ−Ｉのみを含むＨＤＬの画分（「ＡＩ−ＨＤＬ画分」）は、ＲＣＴにおいてより有効であるようである。ある疫学的研究は、Ａｐｏ−ＡＩ−ＨＤＬ画分は、アテローム産生抑制性であるという仮説を支持する（Ｐａｒｒａら、１９９２、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１２：７０１−０７；Ｄｅｃｏｓｓｉｎら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２７：２９９−３０７）。

ＨＤＬは、異なる大きさ、脂質組成物、およびアポリポタンパク質組成物を有する粒子の、いくつかの集団から成る。それらを、その水和密度、アポリポタンパク質組成、および電荷の特徴を含むその性質によって分離し得る。例えば、プレ−ベータ−ＨＤＬは、成
熟アルファＨＤＬよりも低い表面電荷によって特徴付けられる。この電荷の差異のために、プレ−ベータ−ＨＤＬおよび成熟アルファＨＤＬは、アガロースゲルにおいて異なる電気泳動の移動度を有する（Ｄａｖｉｄら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１２）：８９５９−８９６５）。

プレ−ベータ−ＨＤＬおよび成熟アルファＨＤＬの代謝も異なる。プレ−ベータ−ＨＤＬは、２つの代謝運命：血漿からの除去および腎臓による異化、または肝臓によって優先的に分解される中程度のサイズのＨＤＬへのリモデリングのいずれかを有する（Ｌｅｅら、２００４、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４５（４）：７１６−７２８）。

細胞表面からのコレステロール転移（すなわちコレステロール流出）のメカニズムは未知であるが、脂質の少ない複合体、プレ−ベータ−１ＨＤＬが、ＲＣＴに関与する末梢組織からのコレステロールの転移の好ましいアクセプターであると考えられる（Ｄａｖｉｄｓｏｎら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２９７５−８２；Ｂｉｅｌｉｃｋｉら、１９９２、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３３：１６９９−１７０９；Ｒｏｔｈｂｌａｔら、１９９２、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３３：１０９１−９７；およびＫａｗａｎｏら、１９９３、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：５０２５−２８；Ｋａｗａｎｏら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：９８１６−２５を参照のこと）。この細胞表面からのコレステロールの動員の過程の間に、プレ−ベータ−１ＨＤＬは、急速にプレ−ベータ２ＨＤＬへ変換される。ＰＬＴＰが、プレ−ベータ−２ＨＤＬの円盤形成の速度を増加させ得るが、ＲＣＴにおけるＰＬＴＰの役割を示すデータは無い。ＬＣＡＴは、円盤状で小さい（プレ−ベータ）および球状（すなわち成熟）ＨＤＬと優先的に反応し、レシチンまたは他のリン脂質の２−アシル基を、コレステロールの遊離の水酸基に転移して、コレステロールエステル（ＨＤＬに保持される）およびリゾレシチンを産生する。ＬＣＡＴ反応は、活性化剤としてＡｐｏＡ−Ｉを必要とする；すなわち、ＡｐｏＡ−Ｉは、ＬＣＡＴの天然の補助因子である。ＨＤＬ中に隔離されたコレステロールの、そのエステルへの変換は、コレステロールの細胞への再流入を防ぎ、最終的な結果としてコレステロールは細胞から除去される。

ＡｐｏＡ−Ｉ−ＨＤＬ画分（すなわち、ＡｐｏＡ−Ｉを含み、そしてＡｐｏＡ−ＩＩを含まない）中の成熟ＨＤＬ粒子におけるコレステロールエステルは、ＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏＡ−ＩＩの両方を含むＨＤＬ（ＡＩ／ＡＩＩ−ＨＤＬ画分）由来のものより効率的に、肝臓によって除去され、そして胆汁へ処理される。これは、部分的には、ＡｐｏＡＩ−ＨＤＬの肝細胞膜へのより効率的な結合により得る。ＨＤＬ受容体の存在が仮説となり、そしてスカベンジャー受容体、クラスＢ、Ｉ型（ＳＲ−ＢＩ）が、ＨＤＬ受容体として同定された（Ａｃｔｏｎら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：５１８−２０；Ｘｕら、１９９７、Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３８：１２８９−９８）。ＳＲ−ＢＩは、ステロイド産生組織（例えば副腎）および肝臓において最も多く発現する（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら、１９９６、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：９８４−９５；Ｒｉｇｏｔｔｉら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３３５４５−４９）。ＨＤＬ受容体の概説に関しては、Ｂｒｏｕｔｉｎら、１９８８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４６：１６−２３を参照のこと。

ＡＴＰ結合カセットトランスポーターＡＩによる最初の脂質付加が、血漿ＨＤＬの形成およびコレステロール流出に関するプレ−ベータ−ＨＤＬ粒子の能力に非常に重要であるようである（ＬｅｅおよびＰａｒｋｓ、２００５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１６（１）１９−２５）。これらの著者によると、この最初の脂質付加が、プレ−ベータ−ＨＤＬがコレステロールアクセプターとしてより効率的に機能することを可能にし、そしてＡｐｏＡ−Ｉが、先在する血漿ＨＤＬ粒子と迅速に会合することを防いで、コレステロール流出のためにより多くのプレ−ベータ−ＨＤＬ粒子が利用可能であるようにする
。

ＣＥＴＰも、ＲＣＴにおいて役割を果たし得る。ＣＥＴＰ活性、またはそのアクセプター、ＶＬＤＬおよびＬＤＬの変化は、ＨＤＬ集団の「リモデリング」に役割を果たす。例えば、ＣＥＴＰ非存在下で、ＨＤＬは除去されない肥大した粒子になる。（ＲＣＴおよびＨＤＬの概説に関しては、ＦｉｅｌｄｉｎｇおよびＦｉｅｌｄｉｎｇ、１９９５、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６：２１１−２８；Ｂａｒｒａｎｓら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３００：７３−８５；Ｈｉｒａｎｏら、１９９７、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７（６）：１０５３−５９を参照のこと）。

ＨＤＬはまた、他の脂質および無極性分子の逆輸送、および解毒、すなわち異化および排泄のための脂質の細胞、臓器、および組織から肝臓への輸送に役割を果たす。そのような脂質は、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、酸化脂質、およびリゾホスファチジルコリンを含む。例えば、ＲｏｂｉｎｓおよびＦａｓｕｌｏ（１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：３８０−８４）は、ＨＤＬは植物ステロールの肝臓による胆汁分泌への輸送を刺激することを示した。

ＨＤＬの主な構成成分であるＡｐｏＡ−Ｉは、インビトロでＳＭと会合し得る。ＡｐｏＡ−１をインビトロでウシ脳ＳＭ（ＢＢＳＭ）と再構築する場合、再構築の最高速度は２８℃で起こり、それはＢＢＳＭの相転移温度に近い温度である（Ｓｗａｎｅｙ、１９８３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（２）、１２５４−５９）。ＢＢＳＭ：ＡｐｏＡ−Ｉの比が７．５：１またはそれより低い場合（ｗｔ／ｗｔ）、単一の再構築された均一なＨＤＬ粒子が形成され、それは１粒子あたり３つのＡｐｏＡ−Ｉ分子を含み、そして３６０：１のＢＢＳＭ：ＡｐｏＡ−Ｉモル比を有する。それは電子顕微鏡で、ＡｐｏＡ−Ｉとホスファチジルコリンの高い比のリン脂質／タンパク質における再結合によって得られるものと同様の円盤状の複合体として見える。しかし１５：１（ｗｔ／ｗｔ）のＢＢＳＭ：ＡｐｏＡ−Ｉ比においては、より高いリン脂質：タンパク質モル比（５３５：１）を有する、より大きな直径の円盤状複合体が形成される。これらの複合体はホスファチジルコリンと形成されたＡｐｏＡ−Ｉ複合体より、有意に大きく、より安定であり、そして変性に対してより抵抗性である。

スフィンゴミエリンは（ＳＭ）は、初期コレステロールアクセプター（プレ−ベータ−ＨＤＬおよびガンマ移動性ＡｐｏＥ含有リポタンパク質）において上昇しており、それはＳＭがこれらの粒子のコレステロール流出を促進する能力を増強し得ることを示唆する（ＤａｓｓおよびＪｅｓｓｕｐ、２０００、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２：７３１−６１；Ｈｕａｎｇら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１８３４−３８；ＦｉｅｌｄｉｎｇおよびＦｉｅｌｄｉｎｇ １９９５、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６：２１１−２８）。

（３．２ ＨＤＬおよびＡｐｏＡ−Ｉの保護メカニズム）
ＨＤＬの保護メカニズムの最近の研究は、ＨＤＬの主な構成要素であるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）に注目した。ＡｐｏＡ−Ｉの高い血漿レベルは、冠動脈病変の欠如または減少と関連している（Ｍａｃｉｅｊｋｏら、１９８３、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：３８５−８９；Ｓｅｄｌｉｓら、１９８６、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ７３：９７８−８４）。

実験動物におけるＡｐｏＡ−ＩまたはＨＤＬの注入は、有意な生化学的変化を発現し、およびアテローム性動脈硬化症の病変の程度および重症度を減少させる。ＭａｃｉｅｊｋｏおよびＭａｏ（１９８２、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２：４０７ａ）による最初の報告の後、Ｂａｄｉｍｏｎら（１９８９、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６０：４５５−６１；１９８９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：１２３４−４１）は、コレステロールを与えたウサギにおいて、ＨＤＬ（ｄ＝１．０６３−１．３２５ｇ／ｍｌ）を注入することによって、それらがアテローム性動脈硬化症の病変の程度（４５％の減少）、およびそのコレステロールエステル含有量（５８．５％の減少）を有意に減少させ得ることを見出した。彼らはまた、ＨＤＬの注入は、確立した病変の５０％近い退縮を引き起こすことを見出した。Ｅｓｐｅｒら（１９８７、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ７：５２３ａ）は、ＨＤＬの注入は、初期動脈病変を発症する、遺伝性高コレステロール血症を有するＷａｔａｎａｂｅウサギの血漿リポタンパク質組成を顕著に変化させ得ることを示した。これらのウサギにおいて、ＨＤＬの注入は、保護ＨＤＬおよびアテローム生成ＬＤＬの間の比を２倍以上にし得る。

動物モデルにおいてＨＤＬが動脈疾患を予防する可能性は、ＡｐｏＡ−Ｉがインビトロにおいて線維素溶解活性を発現し得るという観察によってさらに強調された（Ｓａｋｕら、１９８５、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．３９：１−８）。Ｒｏｎｎｅｂｅｒｇｅｒ（１９８７、Ｘｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、Ｓｙｄｎｅｙ、９９０）は、ＡｐｏＡ−Ｉは、ビーグル犬およびカニクイザルにおいて線維素溶解を増加させ得ることを示した。ヒト血漿においてインビトロで同様の活性が注目され得る。Ｒｏｎｎｅｂｅｒｇｅｒは、ＡｐｏＡ−Ｉ処理動物において、脂質の沈着および動脈プラークの形成の減少を確認し得た。

インビトロにおける研究は、ＡｐｏＡ−Ｉおよびレシチンの複合体は、培養動脈平滑筋細胞からの遊離コレステロールの流出を促進し得ることを示す（Ｓｔｅｉｎら、１９７５、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、３８０：１０６−１８）。このメカニズムによって、ＨＤＬもまたこれらの細胞の増殖を抑制し得る（Ｙｏｓｈｉｄａら、１９８４、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．４１：２５８−６６）。

ＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−Ｉ模倣ペプチドを含むＨＤＬによる注入治療も、ＡＢＣ１トランスポーターによって血漿ＨＤＬレベルを調節し、心血管疾患の治療における有効性をもたらすことが示された（例えばＢｒｅｗｅｒら、２００４、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２４：１７５５−１７６０を参照のこと）。

２つの天然に存在するＡｐｏＡ−Ｉのヒト変異が同定され、そこではアルギニン残基がシステインに変異している。アポリポタンパク質Ａ−Ｉ_{Ｍｉｌａｎｏ}（ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍ）において、この置換は残基１７３で起こり、一方アポリポタンパク質Ａ−Ｉ_{Ｐａｒｉｓ}（ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｐ）では、この置換は残基１５１で起こる（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉら、１９８０、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６６：８９２−９００；Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒら、１９８３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２５０８−１３；Ｂｒｕｃｋｅｒｔら、１９９７、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １２８：１２１−２８；Ｄａｕｍら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６１４−２２；Ｋｌｏｎら、２０００、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７９（３）：１６７９−８５）。ＡｐｏＡ−Ｉ_ＭまたはＡｐｏＡ−Ｉ_Ｐいずれかのジスルフィド結合ホモダイマーを含む、再構築ＨＤＬ粒子は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）エマルションを除去する能力、およびコレステロール流出を促進する能力において、野生型ＡｐｏＡ−Ｉを含む再構築ＨＤＬ粒子と同様である（Ｃａｌａｂｒｅｓｉら、１９９７ｂ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１２４２８−３３；Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉら、１９９９、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９：１２５７−６２；Ｄａｕｍら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６１４−２２）。両方の変異において、ヘテロ接合性の個体は、減少したレベルのＨＤＬを有するが、逆説的に、アテローム性動脈硬化症のリスクは低い（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉら、１９８０、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６６：８９２−９００；Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒら、１９８３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２５０８−１３；Ｂｒｕｃｋｅｒｔら、１９９７、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １２８：１２１−２８）。いずれかの変異体を含む再構築ＨＤＬ粒子は、ＬＣＡＴを活性化し得るが、野生型ＡｐｏＡ−Ｉを含む再構築ＨＤＬと比較した場合には効率が低い（Ｃａｌａｂｒｅｓｉら、１９９７ａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３２：３４５−４９；Ｄａｕｍら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６１４−２２）。

ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍ変異は、常染色体優性形質として伝達される；家族内で８世代の保因者が同定された（Ｇｕａｌａｎｄｒｉら、１９８４、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３７：１０８３−９７）。ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍ保因者の個体の状態は、ＨＤＬコレステロールレベルの顕著な減少によって特徴付けられる。これにもかかわらず、保因者の個体は動脈疾患のリスクの明らかな増加を示さない。実際、系図学的記録の調査によって、これらの被験体はアテローム性動脈硬化症から「保護」され得るようである（Ｓｉｒｔｏｒｉら、２００１、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０３：１９４９−１９５４；Ｒｏｍａら、１９９３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１（４）：１４４５−５２０）。

変異の保因者におけるＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍの潜在的な保護効果のメカニズムは、１つのアルファへリックスの喪失および疎水性残基の増加した露出を有する、変異ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍの構造における修飾と関連するようである（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉら、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１６３２−３５）。複数のアルファへリックスの堅固な構造の喪失は、分子の柔軟性の増加を引き起こし、それは正常ＡｐｏＡ−Ｉと比較して、脂質とより容易に会合する。さらに、アポリポタンパク質−脂質複合体は、変性に対してより感受性が高く、従って変異の場合には脂質の伝達も改善されることを示唆する。

Ｂｉｅｌｉｃｋｉら（１９９７、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７（９）：１６３７−４３）は、ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍは、野生型ＡｐｏＡ−Ｉと比較して、限られた膜コレステロールを動員する能力を有することを示した。それに加えて、ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍと膜脂質の会合によって形成された新生ＨＤＬは、野生型ＡｐｏＡ−Ｉによって形成されるより大きな９および１１ｎｍの複合体ではなく、主に７．４ｎｍの粒子であった。これらの観察は、ＡｐｏＡ−Ｉ一次配列におけるＡｒｇ_１７３→Ｃｙｓ_１７３置換は、細胞コレステロール動員および新生ＨＤＬの構築に干渉することを示す。その変異は明らかにコレステロールの細胞からの除去の効率の減少に関連する。従って、そのアテローム産生抑制性質は、ＲＣＴと無関係であり得る。

Ａｒｇ_１７３→Ｃｙｓ_１７３置換に起因する最も著しい構造変化は、ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍのダイマー化である（Ｂｉｅｌｉｃｋｉら、１９９７、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７（９）：１６３７−４３）。ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍは、それ自身とホモダイマーを、そしてＡｐｏＡ−ＩＩとヘテロダイマーを形成し得る。アポリポタンパク質の混合物を含む血液画分の研究は、循環中のダイマーおよび複合体の存在は、アポリポタンパク質の消失半減期の増加の原因であり得ることを示す。そのような消失半減期の増加は、変異の保因者の臨床研究において観察された（Ｇｒｅｇｇら、１９８８、ＮＡＴＯ ＡＲＷ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｕｔａｎｔｓ：Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏＰｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｌｉｍｏｎｅ Ｓ Ｇ）。他の研究は、ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍダイマー（ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍ／ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍ）は、インビトロにおいてＨＤＬ粒子の相互変換における阻害因子として作用することを示す（Ｆｒａｎｃｉｓｃｈｉｎｉら、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２２２４−３１）。

（３．３ 脂質代謝異常および関連する異常の現在の治療）
脂質代謝異常障害は、上昇した血清コレステロールおよびトリグリセリドレベルおよび低下した血清ＨＤＬ：ＬＤＬ比に関連する疾患であり、そして高脂血症、特に高コレステロール血症、冠動脈心疾患、冠動脈疾患、血管および血管周囲疾患、およびアテローム性動脈硬化症のような心血管疾患を含む。動脈不全によって引き起こされる、間欠性跛行のようなアテローム性動脈硬化症に関連する症候群も含まれる。現在、脂質代謝異常障害に関連する上昇した血清コレステロールおよびトリグリセリドを低下させるために、多くの治療が利用可能である。しかし、有効性、副作用、および資格のある患者集団に関して、それぞれそれ自身の欠点および限界を有する。

胆汁酸結合樹脂は、小腸から肝臓への胆汁酸の再利用を妨害する薬物の種類、例えばコレスチラミン（Ｑｕｅｓｔｒａｎ Ｌｉｇｈｔ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）および塩酸コレスチポール（Ｃｏｌｅｓｔｉｄ（登録商標）、Ｔｈｅ
Ｕｐｊｏｈｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）である。経口で摂取した場合、これらの正に荷電した樹脂は、小腸で負に荷電した胆汁酸と結合する。樹脂は小腸から吸収され得ないので、それらは胆汁酸を運んで排泄される。しかし、そのような樹脂の使用は、よくて血清コレステロールレベルを約２０％下げるのみであり、そして便秘およびあるビタミンの欠乏を含む、胃腸管の副作用と関連する。さらに、樹脂は他の薬物と結合するので、他の経口薬剤は、樹脂の摂取の少なくとも１時間前、または４から６時間後に摂取しなければならず、したがって心臓病患者の薬剤レジメを複雑にする。

スタチン系薬剤は、コレステロール生合成経路に関与する重要な酵素であるＨＭＧＣｏＡ還元酵素を阻害することによってコレステロール合成を阻害する、コレステロール低下薬剤である。スタチン系薬剤、例えばロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ（登録商標））、シンバスタチン（Ｚｏｃｏｒ（登録商標））、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標））、フルバスタチン（Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標））、およびアトロバスタチン（Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標））は、胆汁酸結合樹脂と組み合わせて使用する場合もある。スタチン系薬剤は、血清コレステロールおよびＬＤＬ−血清レベルを有意に抑制し、そして冠動脈のアテローム性動脈硬化症の進行を遅らせる。しかし、血清ＨＤＬコレステロールレベルは、中程度に増加するのみである。ＬＤＬ低下効果のメカニズムは、ＬＤＬの産生の抑制および／または異化の増加を引き起こす、ＶＬＤＬ濃度の抑制およびＬＤＬ受容体の細胞発現の誘導の両方を含み得る。肝臓および腎臓機能不全を含む副作用が、これらの薬剤と関連する（Ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第５６版、２００２、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｃｎｏｍｉｃｓ）。

ナイアシン（ニコチン酸）は、栄養補助食品および抗高脂血症薬として使用される、水溶性のビタミンＢ複合体である。ナイアシンは、ＶＬＤＬの産生を抑制し、そしてＬＤＬの低下に有効である。いくつかの場合には、それは胆汁酸結合樹脂と組み合わせて使用される。ナイアシンは、適当な投与量で使用された場合にＨＤＬを増加させ得るが、その有用性は、そのような高用量で使用された場合の重篤な副作用によって制限される。Ｎｉａｓｐａｎ（登録商標）は、純粋なナイアシンよりも少ない副作用を生ずる、徐放性ナイアシンの形式である。ナイアシン／ロバスタチン（Ｎｉｃｏｓｔａｔｉｎ（登録商標））は、ナイアシンおよびロバスタチンを両方含む処方であり、そして各薬剤の利点を合わせる。

フィブラート系薬剤は、高コレステロール血症にも関連し得る、様々な形式の高脂血症（すなわち上昇した血清トリグリセリド）を治療するために使用される脂質低下薬剤の種類である。フィブラート系薬剤は、ＶＬＤＬ画分を減少させ、そしてＨＤＬを中程度に増加させるようであるが、これらの薬剤の血清コレステロールに対する効果は不定である。米国において、クロフィブラート（Ａｔｒｏｍｉｄ−Ｓ（登録商標））、フェノフィブラート（Ｔｒｉｃｏｒ（登録商標））およびベザフィブラート（Ｂｅｚａｌｉｐ（登録商標））のようなフィブラート系薬剤が、抗高脂血薬として認可されたが、高コレステロール血症薬剤としては認可されなかった。例えば、クロフィブラートは、ＶＬＤＬ画分を減少
させることによって、（未知のメカニズムによって）血清トリグリセリドを低下させるよう作用する抗高脂血薬である。血清コレステロールをある患者亜集団において減少させ得るが、薬剤に対する生化学的反応は不定であり、そしてどの患者が好ましい結果を得るかを予測するのはいつも可能なわけではない。Ａｔｒｏｍｉｄ−Ｓ（登録商標）は、冠動脈心疾患の予防に有効であることは示されていない。化学的および薬理学的に関連する薬剤、ゲムフィブロジル（Ｌｏｐｉｄ（登録商標））は、血清トリグリセリドおよびＶＬＤＬコレステロールを中程度に減少させ、そしてＨＤＬコレステロール−ＨＤＬ_２およびＨＤＬ_３細画分およびＡｐｏＡ−ＩおよびＡ−ＩＩの両方（すなわち、ＡＩ／ＡＭＴ−ＨＤＬ画分）を中程度に増加させる、脂質調節薬剤である。しかし、脂質の反応は、特に異なる患者集団の間で不均一である。さらに、冠動脈心疾患の予防が既存の冠動脈心疾患の既往歴または症状を有さない４０−５５歳の間の男性患者において観察されたが、どの程度これらの発見を他の患者集団（例えば女性、より高齢または若年の男性）に外挿し得るかは不明である。実際、確立した冠動脈心疾患を有する患者においては、効果は観察されなかった。悪性腫瘍（特に消化器癌）、胆嚢疾患、および非冠動脈死亡率の増加のような毒性を含む、重篤な副作用が、フィブラート系薬剤の使用と関連する。

閉経後女性における中程度の高コレステロール血症に関して、経口エストロゲン補充療法を考慮し得る。しかし、ＨＤＬの増加は、トリグリセリドの増加を伴い得る。もちろん、エストロゲン治療は特定の患者集団（閉経後女性）に限られ、そして悪性新生物、胆嚢疾患、血栓塞栓性疾患、肝腺腫、血圧の上昇、耐糖能障害、および高カルシウム血症の誘発を含む、重篤な副作用と関連する。

高脂血症の治療に有用な他の薬剤は、エゼチミブ（Ｚｅｔｉａ（登録商標）；Ｍｅｒｃｋ）を含み、それはコレステロールの吸収を遮断または阻害する。しかし、エゼチミブの阻害剤は、ある毒性を示すことが示された。

従って、血清コレステロールを低下させ、ＨＤＬ血清レベルを増加させ、脂質代謝異常および／または脂質代謝異常に関連する疾患、状態、および／または異常を予防および／または治療するのにより有効な、より安全な薬剤に対する必要性が存在する。

例えば、ＨＤＬ、およびリン脂質と複合体化した組み換え形式のＡｐｏＡ−Ｉは、無極性または両親媒性分子、例えばコレステロールおよび誘導体（オキシステロール、酸化ステロール、植物ステロール等）、コレステロールエステル、リン脂質および誘導体（酸化リン脂質）、トリグリセリド、酸化産物、およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）の吸い込み装置／スカベンジャーとして作用し得る（例えば、Ｃａｓａｓら、１９９５、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．Ｎｏｖ５９（５）：５４４−５２を参照のこと）。ＨＤＬはまた、ＴＮＦ−アルファおよび他のリンホカインのスカベンジャーとしても作用し得る。ＨＤＬはまた、ヒト血清パラオキソナーゼ、例えばＰＯＮ−１、２、３の担体としても作用し得る。ＨＤＬに付随するエステラーゼであるパラオキソナーゼは、酸化に対して細胞構成成分を保護するために重要である。酸化ストレスの間に起こるＬＤＬの酸化は、アテローム性動脈硬化症の発生に直接関係するようである（Ａｖｉｒａｍ、２０００、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｒｅｓ．３３ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８５−９７）。パラオキソナーゼは、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患に対する感受性に役割を果たしているようである（Ａｖｉｒａｍ、１９９９、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ ５（９）：３８１−８６）。ヒト血清パラオキソナーゼ（ＰＯＮ−１）は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に結合する。その活性は、アテローム性動脈硬化症と逆比例する。ＰＯＮ−１は、有機リン酸を加水分解し、そしてＨＤＬおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化の阻害によって、アテローム性動脈硬化症に対して保護し得る（Ａｖｉｒａｍ、１９９９、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ ５（９）：３８１−８６）。実験的研究が、この保護は、酸化リポタンパク質中の特定の脂質過酸化物を加水分解するＰＯＮ−１の能力に関連することを示唆する。ＰＯＮ−１活性を保存または増強する介入が、アテローム性動脈硬化症および冠動脈心疾患の発症を遅らせるのに役立ち得る。

ＨＤＬはさらに、抗血栓剤およびフィブリノーゲン縮小剤としての、および出血性ショックにおける薬剤としての役割を有する（Ｃｏｃｋｅｒｉｌｌら、ＷＯ０１／１３９３９、２００１年３月１日公開）。ＨＤＬ、および特にＡｐｏＡ−１は、敗血症によって産生されたリポポリサッカライドの、ＡｐｏＡ−Ｉを含む脂質粒子への変換を促進し、リポポリサッカライドの機能的中和を引き起こすことが示された（Ｗｒｉｇｈｔら、ＷＯ９５３４２８９、１９９５年１２月２１日公開；Ｗｒｉｇｈｔら、米国特許第５，９２８，６２４号、１９９９年７月２７日発行；Ｗｒｉｇｈｔら、米国特許第５，９３２，５３６号、１９９９年８月３日発行）。

しかし、治療的投与のために必要な大量のアポリポタンパク質によって、および産生の最終的な収率の低いことを考慮して、タンパク質産生のコストによって、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍ、ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｐおよび他の変異体、および再構築ＨＤＬの治療的利用は、現在限られている。初期の臨床試験によって、心血管疾患の治療に関して、投与量範囲は注入あたり１．５−４ｇの間のタンパク質であることが示唆された。完全な治療に必要な注入の回数は不明である（例えば、Ｅｒｉｋｓｓｏｎら、１９９９、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００（６）：５９４−９８；Ｃａｒｌｓｏｎ、１９９５、Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｉｓ．５：８５−９１；Ｎａｎｊｅｅら、２０００、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２０（９）：２１４８−５５；Ｎａｎｊｅｅら、１９９９、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９（４）：９７９−８９；Ｎａｎｊｅｅら、１９９６、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１６（９）：１２０３−１４を参照のこと）。従って、脂質代謝異常の疾患、状態、および／または異常を治療および／または予防する新規の方法を開発する必要性が存在する。

本申請の第２項または他のあらゆる項における、あらゆる参考文献の引用または同定は、そのような参考文献が本発明に対する従来技術として利用可能であることの承認と解釈されない。

Ｂａｄｉｍｏｎら、１９９２、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８６（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩＩ）：８６−９４ ＤａｎｓｋｙおよびＦｉｓｈｅｒ、１９９９、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００：１７６２−６３ Ｚｈａｎｇら、２００３、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０８：６６１−６６３ Ｍｉｌｌｅｒら、１９７７、Ｌａｎｃｅｔ １（８０１９）：９６５−６８ Ｗｈａｙｎｅら、１９８１、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ３９：４１１−１９

（４．概要）
本開示は、荷電リポタンパク質複合体、その複合体を含む組成物、およびその複合体を使用して、脂質代謝異常、および／またはそれに伴う様々な疾患、異常および／または状態を含む、様々な異常および状態を治療および／または予防する方法を提供する。その複合体は、一般的に２つの画分、アポリポタンパク質画分および脂質画分を含み、そして重要な成分として特定の量の荷電したリン脂質（または２つまたはそれ以上の異なる、典型的には同様に荷電したリン脂質）を含むリポタンパク質である。荷電したリン脂質は、生理学的ｐＨで正または負に荷電し得るが、多くの実施態様において負に荷電している。いくつかの実施態様において、荷電したリン脂質は、１つまたはそれ以上のホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、および／またはホスファチジン酸を含む。

アポリポタンパク質画分は、複合体に含まれた場合にコレステロールを可動化し得る、１つまたはそれ以上のタンパク質、ペプチドまたはペプチドアナログ（「アポリポタンパク質」と呼ばれる）を含む。そのようなアポリポタンパク質の特定の例は、ＡｐｏＡ−Ｉである。他の特定の例が、本明細書中の下記でさらに記載される。

脂質画分は一般的に、１つまたはそれ以上の中性リン脂質および荷電したリン脂質を含み、そして任意で、例えばトリグリセリド、コレステロール、コレステロールエステル、リゾリン脂質、およびその様々なアナログおよび／または誘導体のような、さらなる脂質を含み得る。いくつかの実施態様において、荷電リポタンパク質複合体は、そのような任意の脂質を含まない。

中性リン脂質は、生理学的ｐＨで約ゼロの有効電荷を有するあらゆるリン脂質であり得る。いくつかの実施態様において、中性リン脂質は、生理学的ｐＨで約ゼロの有効電荷を有する双性イオンである。いくつかの実施態様において、中性リン脂質は、レシチン（ホスファチジルコリンまたは「ＰＣ」としても知られる）を含む。いくつかの実施態様において、中性リン脂質はスフィンゴミエリン（「ＳＭ」）を含む。いくつかの実施態様において、中性リン脂質はレシチンおよびＳＭの混合物を含む。脂質画分がレシチンまたはＳＭのいずれか、少なくとも１つの荷電したリン脂質、および任意で他の脂質を含む荷電リポタンパク質複合体の実施態様は、３つの「主な」構成成分：アポリポタンパク質、レシチンまたはスフィンゴミエリン、および荷電したリン脂質を含むので、「三元」複合体と呼ばれる。脂質画分がレシチンおよびＳＭの両方、少なくとも１つの荷電したリン脂質、および任意で他の脂質を含む荷電リポタンパク質複合体の実施態様は、「四元」複合体と呼ばれる。

荷電リポタンパク質複合体の脂質画分を構成する荷電したリン脂質の全量は変動し得るが、典型的には約０．２から１０ｗｔ％の範囲である。いくつかの実施態様において、脂質画分は、約０．２から２ｗｔ％、０．２から３ｗｔ％、０．２から４ｗｔ％、０．２から５ｗｔ％、０．２から６ｗｔ％、０．２から７ｗｔ％、０．２から８ｗｔ％、または０．２から９ｗｔ％の合計の、荷電したリン脂質を含む。いくつかの実施態様において、脂質画分は、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９または３．０ｗｔ％、および／またはこれらの値のいずれかを終了点として含む範囲の合計の荷電したリン脂質を含む。いくつかの実施態様において、脂質画分は、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９または３．０ｗｔ％から、約４、５、６、７、８、９、または１０ｗｔ％までの合計の荷電したリン脂質を含む。

脂質画分を構成する中性リン脂質の全量も変動し得、そして荷電したリン脂質および含まれるあらゆる任意の脂質の量に依存する。任意の脂質を含まない実施態様において、脂質画分は一般的に、約９０から９９．８ｗｔ％の全中性リン脂質を含む。

上記で述べたように、中性リン脂質はレシチン、ＳＭ、またはレシチンおよびＳＭの混合物を含み得る。レシチンおよび／またはＳＭは、中性リン脂質の大部分を構成し得る、またはあるいは、中性リン脂質はレシチンおよび／またはＳＭに加えて中性リン脂質を含み得る。中性リン脂質がレシチンを含むがＳＭは含まない実施態様において、中性リン脂質は典型的には約５から１００ｗｔ％のレシチンを含む。いくつかの実施態様において、中性リン脂質は１００ｗｔ％のレシチンを含む。

中性リン脂質がＳＭを含むがレシチンは含まない実施態様において、中性リン脂質は一般的に約５から１００ｗｔ％のＳＭを含む。いくつかの実施態様において、中性リン脂質は１００ｗｔ％のＳＭを含む。

中性リン脂質がレシチンおよびＳＭの混合物を含む実施態様において、全中性リン脂質を構成する混合物の量、および混合物を構成するレシチンおよびＳＭの相対的な量（すなわち、レシチン：ＳＭモル比）は両方とも変動し得る。典型的には、中性リン脂質は約５から１００ｗｔ％のレシチン／ＳＭ混合物を含む。いくつかの実施態様において、中性リン脂質は全部レシチンおよびＳＭから成る（すなわち、１００ｗｔ％のレシチンおよびＳＭの混合物）。

レシチン対ＳＭのモル比（レシチン：ＳＭ）は変動し得るが、典型的には約２０：１から１：２０の範囲である。いくつかの実施態様において、レシチン：ＳＭモル比は、約１０：３から１０：６の範囲である。他の実施態様において、レシチン：ＳＭモル比は約１：２０から３：１０の範囲である。

任意の脂質は、もし含まれるなら、一般的に脂質画分の約５０ｗｔ％またはそれ以下を構成する。いくつかの実施態様において、脂質画分は約３０ｗｔ％より少ない全任意脂質を含む。特定の実施態様において、脂質画分は約５ｗｔ％、１０ｗｔ％、または２０ｗｔ％より少ない全任意脂質を含む。

荷電リポタンパク質複合体の脂質対アポリポタンパク質モル比も変動し得る。いくつかの実施態様において、荷電リポタンパク質複合体は、約２：１から約２００：１の範囲の脂質：アポリポタンパク質モル比を含む。いくつかの実施態様において、脂質：アポリポタンパク質モル比は約５０：１である。

本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体は、ミセル構造から、天然に存在するプレ−ベータＨＤＬ粒子に類似した小さい円盤状粒子、天然に存在するアルファ−ＨＤＬ粒子に類似したより大きな円盤状粒子、天然に存在するＨＤＬ_２またはＨＤＬ_３に類似した大きな球状粒子まで、様々な形、大きさ、および形式をとり得る。本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体の望ましい大きさおよび形は、当該分野で公知であるように、脂質画分を構成する脂質の構成成分および重量（またはモル）比、および脂質：アポリポタンパク質モル比を調節することによってコントロールし得る（例えば、Ｂａｒｔｅｒら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４２４３−４２５０を参照のこと）。

いくつかの実施態様において、荷電リポタンパク質複合体は、円盤状粒子の形式であり、ここで脂質画分は実質的に合計で約９０から９９．８ｗｔ％の中性リン脂質、および合計で約０．２から１０ｗｔ％の負に荷電したリン脂質から成る。その円盤状粒子は、大きく（例えば約１０から１４ｎｍの扁平の直径を有する）、または小さく（例えば約５から１０ｎｍの扁平の直径を有する）あり得る。円盤状粒子の大きさは、当該分野で公知であるように、脂質：アポリポタンパク質モル比を調節することによってコントロールし得る（例えばＢａｒｔｅｒら、１９９６、前出を参照のこと）。粒子の大きさを、例えばサイズ排除カラムクロマトグラフィーを用いて決定し得る。

医薬組成物は一般的に、本明細書中で記載されたような荷電リポタンパク質複合体を含み、そして任意で１つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、および／または希釈剤を含み得る。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、投与に適当な、単位投与量で包装される。例えば、いくつかの実施態様において、組成物は、密閉バイアル中に包装された単位投与量の乾燥（例えば凍結乾燥）荷電リポタンパク質複合体を含む。そのような組成物は水、生理学的溶液（生理食塩水のような）、または緩衝液による再構築、および注射による投与に適当である。そのような組成物は任意で、荷電複合体の再構築を促進するために、１つまたはそれ以上の抗固化および／または抗凝集剤を、または再構築した懸濁液のｐＨ、浸透圧、および／または塩分を調節するためにデザインされた１つまたはそれ以上の緩衝化剤、糖または塩（例えば塩化ナトリウム）を含み得る。

本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体および組成物は、コレステロールの流出および／または除去をもたらす、および／または促進することが期待され、そして従って例えば脂質代謝異常、および／または脂質代謝異常に関連する、または脂質または毒素、生体異物等のような無極性分子の消費、蓄積、または除去（例えば脂肪の沈着、細胞分解）に関連する疾患、状態および／または異常を含む、様々な状態および異常の治療および／または予防に有用であることが期待される。本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体および組成物で治療または予防し得る、そのような疾患、異常、および／または関連する状態の制限しない例は、末梢血管疾患、高血圧、炎症、アルツハイマー病、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、および例えば脳卒中、虚血発作、一過性虚血発作、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、狭心症、腎血管性高血圧、腎血管不全、間欠性跛行、重症虚血肢、休息痛、および壊疽のような、アテローム性動脈硬化症の種々の臨床症状を含む。

その方法は一般的に、特定の適応症を治療または予防するのに有効な量の、本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体または医薬品複合体を被験体に投与することを含む。その複合体および／または組成物を、単独で（単独療法として）投与し得る、またはあるいは脂質代謝異常および／またはその関連する状態、疾患および／または異常を治療および／または予防するのに有用な他の治療薬剤と付属的に投与し得る。本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体および組成物を付属的に投与し得る治療薬剤の制限しない例は、胆汁酸結合樹脂、ＨＭＧＣｏＡ−還元酵素阻害剤（スタチン系薬剤）、ナイアシン、樹脂、コレステロール吸収の阻害剤およびフィブラート系薬剤を含む。

いかなる作動の理論にも拘束されることを意図しないが、脂質画分を構成する荷電したリン脂質は、本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体および組成物に、従来のリポタンパク質複合体より改善された治療的性質を与えると考えられる。腎臓で分解される小さい円盤状プレ−ベータＨＤＬおよび肝臓によって認識され、そこでそのコレステロールが保存、再利用、代謝（胆汁酸として）、または除去（胆汁中に）される大きな円盤状および／または球状ＨＤＬの間の重要な違いの一つは、粒子の電荷である。小さい円盤状プレ−ベータＨＤＬは、負に荷電した大きな円盤状および／または球状ＨＤＬより低い負の表面電荷を有する。いかなる作動の理論にも拘束されることを意図しないが、より高い負の荷電は、肝臓による粒子の認識を引き起こし、そして従って腎臓による粒子の異化を回避する因子の１つであると考えられる。部分的には荷電したリン脂質の存在のために、本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体および組成物は、従来のリポタンパク質複合体よりも長く循環中に留まる、または電荷は電荷依存性の方式でリポタンパク質の半減期に影響を与えると考えられる。そのより長い循環（存在）時間が、コレステロールの可動化（複合体にコレステロールを蓄積するより長い時間を与えることによって）およびエステル化（ＬＣＡＴにエステル化反応を触媒するより長い時間を提供することによって）を促進することが期待される。電荷はまた、コレステロールの捕獲および／または除去の速度を増加させ、それによってより多い量でコレステロールの除去を促進し得る。結果として、本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体および組成物は、より少ない複合体および／または組成物しか投与する必要がなく、そしてより少ない頻度であるので、従来のリポタンパク質治療に対して治療的有用性を提供することが期待される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
アポリポタンパク質画分および脂質画分を含む、再構築された荷電リポタンパク質複合体であって、該脂質画分は、中性リン脂質および約０．２〜３ｗｔ％の荷電したリン脂質を含む、再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目２）
前記中性リン脂質は、レシチンまたはスフィンゴミエリンを含む、項目１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目３）
前記中性リン脂質は、レシチンとスフィンゴミエリンとの混合物を含む、項目１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目４）
レシチン：スフィンゴミエリンのモル比は、約１００：５〜５：１００の範囲内である、項目３に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目５）
前記脂質画分は、任意の脂質をさらに含む、項目１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目６）
脂質：アポリポタンパク質モル比が、約２：１〜２００：１の範囲に及び、ここで該アポリポタンパク質値はＡｐｏＡ−Ｉ当量で表される、項目１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目７）
前記脂質：アポリポタンパク質モル比が、約２０：１〜６０：１の範囲に及ぶ、項目６に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目８）
前記脂質：アポリポタンパク質モル比が、約５０：１の範囲内である、項目６に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目９）
約２〜４ＡｐｏＡ−Ｉ当量、約１分子の荷電したリン脂質および約４００分子の中性リン脂質を含む、項目１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目１０）
約２〜４ＡｐｏＡ−Ｉ当量、約１分子の荷電したリン脂質および約２００分子の中性リン脂質を含む、項目１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目１１）
前記荷電したリン脂質は、ホスファチジルイノシトールを含む、項目１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目１２）
前記荷電したリン脂質は、ホスファチジルセリンを含む、項目１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目１３）
前記荷電したリン脂質は、ホスファチジン酸を含む、項目１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目１４）
前記荷電したリン脂質は、ホスファチジルグリセロールを含む、項目１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目１５）
前記荷電したリン脂質は、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸およびこれらの混合物より選択される、項目１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目１６）
前記スフィンゴミエリンは、Ｄ−エリトロース−スフィンゴミエリンおよび／またはＤ−エリトロース−ジヒドロスフィンゴミエリンを含む、項目１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目１７）
中性リン脂質および／または荷電したリン脂質のアシル鎖は、各々互いに独立して、６〜２４個の炭素原子を含む飽和炭化水素、モノ不飽和炭化水素およびポリ不飽和炭化水素から選択される、項目１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目１８）
前記中性および／または荷電したリン脂質の各アシル鎖は同じである、項目１７に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目１９）
前記中性リン脂質および／または荷電したリン脂質の各アシル鎖は異なっている、項目１７に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目２０）
前記中性リン脂質および荷電したリン脂質のアシル鎖は、同じ数の炭素原子を含む、項目１７に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目２１）
前記中性リン脂質および荷電したリン脂質のアシル鎖は、異なる飽和の程度を有する、項目１７に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目２２）
前記アポリポタンパク質は、プレプロアポリポタンパク質、プレプロＡｐｏＡ−Ｉ、プロＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉ、プレプロＡｐｏＡ−ＩＩ、プロＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、プレプロＡｐｏＡ−ＩＶ、プロＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、プレプロＡｐｏＥ、プロＡｐｏＥ、ＡｐｏＥ、プレプロＡｐｏＡ−Ｉ _{Ｍｉｌａｎｏ} 、プロＡｐｏＡ−Ｉ _{Ｍｉｌａｎｏ} 、ＡｐｏＡ−Ｉ _{Ｍｉｌａｎｏ} 、プレプロＡｐｏＡ−Ｉ _{Ｐａｒｉｓ} 、プロＡｐｏＡ−Ｉ _{Ｐａｒｉｓ} 、およびＡｐｏＡ−Ｉ _{Ｐａｒｉｓ} ならびにこれらの混合物より選択される、項目１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目２３）
前記アポリポタンパク質は、ホモダイマーおよび／またはヘテロダイマーを含む、項目２２に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目２４）
前記アポリポタンパク質は、モノマーを含む、項目２２に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目２５）
前記アポリポタンパク質は、ＡｐｏＡＩペプチド模倣物を含む、項目１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目２６）
アポリポタンパク質画分および脂質画分を含む、再構築された荷電リポタンパク質複合体であって、該脂質画分は、実質的にレシチン、スフィンゴミエリンおよび約１〜１０ｗｔ％の荷電したリン脂質からなる、再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目２７）
前記脂質画分は、約１〜４ｗｔ％の荷電したリン脂質を含む、項目２６に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目２８）
前記脂質画分は、約１〜３ｗｔ％の荷電したリン脂質を含む、項目２６に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目２９）
前記脂質画分は、約１〜２ｗｔ％の荷電したリン脂質を含む、項目２６に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目３０）
前記荷電したリン脂質は、ホスファチジルイノシトールを含む、項目２６に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目３１）
前記荷電したリン脂質は、ホスファチジルセリンを含む、項目２６に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目３２）
前記荷電したリン脂質は、ホスファチジン酸を含む、項目２６に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目３３）
前記荷電したリン脂質は、ホスファチジルグリセロールを含む、項目２６に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目３４）
前記荷電したリン脂質は、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールおよびこれらの混合物より選択される、項目２６に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目３５）
脂質：アポリポタンパク質モル比が、約２：１〜２００：１であり、ここで該アポリポタンパク質についての値は、ＡｐｏＡ−Ｉ当量で表される、項目２６に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目３６）
前記脂質：アポリポタンパク質モル比は、約５０：１である、項目３５に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目３７）
前記アポリポタンパク質は、プレプロアポリポタンパク質、プレプロＡｐｏＡ−Ｉ、プロＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉ、プレプロＡｐｏＡ−ＩＩ、プロＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、プレプロＡｐｏＡ−ＩＶ、プロＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、プレプロＡｐｏＥ、プロＡｐｏＥ、ＡｐｏＥ、プレプロＡｐｏＡ−Ｉ _{Ｍｉｌａｎｏ} 、プロＡｐｏＡ−Ｉ _{Ｍｉｌａｎｏ} 、ＡｐｏＡ−Ｉ _{Ｍｉｌａｎｏ} 、プレプロＡｐｏＡ−Ｉ _{Ｐａｒｉｓ} 、プロＡｐｏＡ−Ｉ _{Ｐａｒｉｓ} 、ＡｐｏＡ−Ｉ _{Ｐａｒｉｓ} およびこれらの混合物より選択される、項目２６に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目３８）
前記アポリポタンパク質は、ホモダイマーおよび／またはヘテロダイマーである、項目３７に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目３９）
前記アポリポタンパク質は、モノマーである、項目３７に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目４０）
前記アポリポタンパク質は、ＡｐｏＡＩ模倣物を含む、項目２６に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目４１）
実質的に２〜４ＡｐｏＡ−Ｉ当量、２分子の荷電したリン脂質、５０〜８０分子のレシチンおよび２０〜５０分子のＳＭからなる、項目２６に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目４２）
実質的に２〜４ＡｐｏＡ−Ｉ当量、２分子の荷電したリン脂質、５０分子のレシチンおよび５０分子のＳＭからなる、項目４１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目４３）
実質的に２〜４ＡｐｏＡ−Ｉ当量、２分子の荷電したリン脂質、８０分子のレシチンおよび２０分子のＳＭからなる、項目４１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目４４）
実質的に２〜４ＡｐｏＡ−Ｉ当量、２分子の荷電したリン脂質、７０分子のレシチンおよび３０分子のＳＭからなる、項目４１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目４５）
実質的に２〜４ＡｐｏＡ−Ｉ当量、２分子の荷電したリン脂質、６０分子のレシチンおよび４０分子のＳＭからなる、項目４１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目４６）
前記２〜４ＡｐｏＡ−Ｉ当量は、２〜４分子のＡｐｏＡ−Ｉである、項目４１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目４７）
前記２〜４ＡｐｏＡ−Ｉ当量は、１〜２分子のＡｐｏＡ−Ｉ _Ｍ ダイマーである、項目４１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目４８）
前記２〜４ＡｐｏＡ−Ｉ当量は、１２〜４０分子の単一へリックスＡｐｏＡ−Ｉ模倣物ペプチドである、項目４１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目４９）
前記レシチンは、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣおよびこれらの混合物より選択される、項目４１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目５０）
前記ＳＭは、Ｄ−エリトロース−スフィンゴミエリン、Ｄ−エリトロース−ジヒドロスフィンゴミエリンおよびこれらの混合物より選択される、項目４１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目５１）
前記荷電したリン脂質は、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸およびこれらの混合物より選択される、項目４１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
（項目５２）
項目１〜５１のいずれか１項に記載の荷電リポタンパク質複合体および薬学的に許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤を含む、医薬組成物。
（項目５３）
被験体における脂質代謝異常または脂質代謝異常に関連する疾患を処置する方法であって、該方法は、有効量の項目１〜５１のいずれか１項に記載の荷電リポタンパク質複合体を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目５４）
前記投与される荷電リポタンパク質複合体の量は、前記被験体の遊離のアポリポタンパク質または複合体化アポリポタンパク質の血清レベルをベースラインレベルと比較して約１０〜３００ｍｇ／ｄＬ上昇させるために有効である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記投与される荷電リポタンパク質複合体の量は、注射１回あたり約１〜１００ｍｇ／ｋｇＡｐｏＡ−Ｉ当量の範囲におよぶ、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記荷電リポタンパク質複合体は、静脈内投与される、項目５３に記載の方法。
（項目５７）
脂質代謝異常を処置するために実施される、項目５３に記載の方法。
（項目５８）
脂質代謝異常に関連する疾患を処置するために実施される、項目５３に記載の方法。
（項目５９）
前記荷電リポタンパク質複合体は、胆汁酸樹脂、ナイアシン、スタチン、フィブラートおよび／またはコレステロール吸収阻害剤と一緒に投与される、項目５３に記載の方法。
（項目６０）
前記荷電リポタンパク質複合体は、該荷電複合体ならびに薬学的に許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物の形態で投与される、項目５３に記載の方法。

図１は、プロＡｐｏ−ＡＩ（３３ｗｔ％）およびスフィンゴミエリン（６７ｗｔ％）から成る無電荷リポタンパク質複合体のクロマトグラムを提供する； 図２は、プロＡｐｏ−ＡＩ（３３ｗｔ％）、スフィンゴミエリン（６５ｗｔ％）およびホスファチジルグリセロール（２ｗｔ％）から成る荷電リポタンパク質複合体の実施態様のクロマトグラムを提供する； 図３は、ウサギにおいて、コントロール、無電荷リポタンパク質複合体（ＩＩＡと表示された曲線）、または本明細書中で記載されたような荷電リポタンパク質複合体の実施態様（ＩＩＢと表示された曲線）を投与した後、時間の関数として測定された、ＨＤＬ中の遊離コレステロールの全量を図示するグラフを提供する；および 図４は、コントロール、無電荷リポタンパク質複合体（グループＩＩＡ；２匹の動物）、または本明細書中で記載されたような荷電リポタンパク質複合体の実施態様（グループＩＩＢ；２匹の動物）を投与したウサギにおいて、時間の関数として測定された、ＨＤＬ中の遊離コレステロールの平均量を図示するグラフを提供する。

（６．詳細な説明）
本開示は、特に脂質代謝異常および／または脂質代謝異常に関連する疾患、異常および／または状態の治療および／または予防に有用な、荷電リポタンパク質複合体および組成物を提供する。概要の項で議論したように、荷電リポタンパク質複合体は、２つの主な画分、アポリポタンパク質画分および脂質画分を含み、そして重要な成分として特定の量の１つまたはそれ以上の荷電したリン脂質を含む。

荷電リポタンパク質複合体は、ヒト血清のような天然の供給源から単離し得る（本明細書中で「単離荷電リポタンパク質複合体」と呼ばれる）、またはその個々の成分から作成または再構築し得る（本明細書中で「再構築荷電リポタンパク質複合体」と呼ばれる）。当業者によって認識されるように、再構築荷電リポタンパク質複合体は、その様々な成分の正体および量を、選択的にコントロールし得るので、多くの適用において有利であり得る。

（６．１ アポリポタンパク質およびアポリポタンパク質ペプチド）
荷電リポタンパク質複合体のアポリポタンパク質画分を構成するアポリポタンパク質の性質は、成功のために決定的ではない。実質的に、本明細書中で記載されたような治療的および／または予防的利点を提供する、あらゆるアポリポタンパク質および／またはその誘導体またはアナログを、荷電複合体中に含み得る。さらに、あらゆるアルファへリックスペプチドまたはペプチドアナログ、またはアポリポタンパク質（例えばＡｐｏＡ−Ｉのような）の活性を「模倣」して、ＬＣＡＴを活性化し得る、および脂質と会合した場合に円盤状粒子を形成し得る、あらゆる他の型の分子が、荷電複合体を構成し得、そして従って「アポリポタンパク質」の定義に含まれる。適当なアポリポタンパク質の例は、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、およびＡｐｏＥのプレプロアポリポタンパク質形式；ヒトＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、およびＡｐｏＥのプロ−および成熟形式；および活性な多型形式、アイソフォーム、変種および変異体および短縮形式を含むがこれに限らず、その最もよくあるものはＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍ（ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍ）およびＡｐｏＡ−Ｉ_Ｐ（ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｐ）である。システイン残基を含むアポリポタンパク質変異体も知られており、そしてそれも使用し得る（例えば米国２００３／０１８１３７２を参照のこと）。アポリポタンパク質は、モノマーまたはダイマーの形式であり得、それはホモダイマーまたはヘテロダイマーであり得る。例えば、プロ−および成熟ＡｐｏＡ−Ｉ（Ｄｕｖｅｒｇｅｒら、１９９６、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１６（１２）：１４２４−２９）、ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍ（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉら、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１６３２−３５）、ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｐ（Ｄａｕｍら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６１４−２２）、ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｓｈｅｌｎｅｓｓら、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１４）：８６３７−４６；Ｓｈｅｌｎｅｓｓら、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（１５）：９９２９−３５）、ＡｐｏＡ−ＩＶ（Ｄｕｖｅｒｇｅｒら、１９９１、Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１（２）：３７３−８３）、ＡｐｏＥ（ＭｃＬｅａｎら、１９８３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（１４）：８９９３−９０００）、ＡｐｏＪおよびＡｐｏＨのホモおよびヘテロダイマー（可能な場合には）を使用し得る。アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質が複合体に含まれた場合にいくらかの生物学的活性を保持する限り、Ｈｉｓタグのような、その単離を促進するエレメント、または他の目的のためにデザインされた他のエレメントに対応する残基を含み得る。

そのようなアポリポタンパク質を、動物供給源（および特にヒト供給源）から精製し得る、または当該分野で周知であるように組み換え的に産生し得る、例えばＣｈｕｎｇら、１９８０、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２１（３）：２８４−９１；Ｃｈｅｕｎｇら、１９８７、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２８（８）：９１３−２９を参照のこと。米国特許第５，０５９，５２８、５，１２８，３１８、６，６１７，１３４号、および米国公開第２００２／０１５６００７、２００４／００６７８７３、２００４／００７７５４１、および２００４／０２６６６６０号も参照のこと。

本明細書中で記載される荷電複合体および組成物におけるアポリポタンパク質として使用するために適当な、アポリポタンパク質に対応するペプチドおよびペプチドアナログ、およびＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、およびＡｐｏＥの活性を模倣するアゴニストの制限しない例は、米国特許第６，００４，９２５、６，０３７，３２３および６，０４６，１６６号（Ｄａｓｓｅｕｘらに対して発行）、米国特許第５，８４０，６８８号（Ｔｓｏに対して発行）、米国公開第２００４／０２６６６７１、２００４／０２５４１２０、２００３／０１７１２７７および２００３／００４５４６０号（Ｆｏｇｅｌｍａｎに対して）、および米国公開第２００３／００８７８１９号（Ｂｉｅｌｉｃｋｉに対して）において開示され、その開示は本明細書中でその全体として参考文献に組み込まれる。これらのペプチドおよびペプチドアナログは、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸またはＬ−およびＤ−アミノ酸の混合物から構成され得る。それらはまた、１つまたはそれ以上の周知のペプチド／アミドアイソスターのような、１つまたはそれ以上の非ペプチドまたはアミド結合を含み得る。そのような「ペプチドおよび／またはペプチド模倣物」アポリポタンパク質を、例えば米国特許第６，００４，９２５、６，０３７，３２３および６，０４６，１６６号において記載された技術を含む、当該分野で公知のペプチド合成のあらゆる技術を用いて合成または製造し得る。

荷電複合体は、単一の型のアポリポタンパク質、または同じまたは異なる種由来であり得る２つまたはそれ以上の異なるアポリポタンパク質の混合物を含み得る。必要ではないが、荷電リポタンパク質複合体は、好ましくは、治療に対する免疫反応を誘発するのを回避するために、治療される動物種由来の、またはそれにアミノ酸配列が対応するアポリポタンパク質を含む。ペプチド模倣物アポリポタンパク質の使用も、免疫反応を抑制または回避し得る。

（６．２ リン脂質）
荷電複合体および組成物の脂質画分は、２つの型のリン脂質：中性リン脂質および荷電したリン脂質を含む。本明細書中で使用される場合、「中性リン脂質」は、生理学的ｐＨで約ゼロの有効電荷を有するリン脂質である。多くの実施態様において、中性リン脂質は双性イオンであるが、他の型の正味中性リン脂質が公知であり、そして使用し得る。中性リン脂質は、レシチンおよび／またはＳＭの１つまたは両方を含み、そして任意で他の中性リン脂質を含み得る。いくつかの実施態様において、中性リン脂質はレシチンを含むがＳＭは含まない。他の実施態様において、中性リン脂質はＳＭを含むがレシチンは含まない。さらに他の実施態様において、中性リン脂質はレシチンおよびＳＭを両方含む。これら特定の例示実施態様は全て、レシチンおよび／またはＳＭに加えて中性リン脂質を含み得るが、多くの実施態様において、そのようなさらなる中性リン脂質は含まない。

使用されるＳＭの正体は、成功のために決定的ではない。従って、本明細書中で使用される場合、「ＳＭ」という表現は、天然の供給源由来のスフィンゴミエリンだけではなく、天然に存在するＳＭのように、ＬＣＡＴによる加水分解を受けない、天然に存在するＳＭのアナログおよび誘導体も含む。ＳＭは、構造がレシチンに非常に類似したリン脂質であるが、レシチンと異なり、グリセロールバックボーンを持たず、そして従ってアシル鎖を結合するエステル結合を有さない。それより、ＳＭはセラミドバックボーンを有し、アミド結合がアシル鎖をつなぐ。ＳＭはＬＣＡＴの基質ではなく、そして一般的にそれによって加水分解されない。しかし、それはＬＣＡＴの阻害剤として作用し得る、または基質リン脂質の濃度を希釈することによってＬＣＡＴ活性を減少させ得る。ＳＭは加水分解さ
れないので、それは循環中により長く留まる。この特徴が、ＳＭを含む荷電リポタンパク質複合体が、ＳＭを含まないアポリポタンパク質複合体より長い期間の薬理学的効果（コレステロールの可動化）を有し、そしてより多くの脂質、特にコレステロールを集めることを可能にすることが期待される（例えば米国公開第２００４／００６７８７３号において記載されたアポリポタンパク質複合体を参照のこと、その開示は本明細書中でその全体として参考文献に組み込まれる）。この効果は、治療のために、ＳＭを含まないリポタンパク質複合体に関して必要であるよりも、より少ない頻度または少ない投与量が必要であることを引き起こし得る。

ＳＭは、実質的にあらゆる供給源由来であり得る。例えば、ＳＭは乳、卵、または脳から得ることができる。ＳＭアナログまたは誘導体も使用し得る。有用なＳＭアナログおよび誘導体の制限しない例は、パルミトイルスフィンゴミエリン、ステアロイルスフィンゴミエリン、Ｄ−エリトロ−Ｎ−１６：０−スフィンゴミエリンおよびそのジヒドロアイソマー、Ｄ−エリトロ−Ｎ−１６：０−ジヒドロ−スフィンゴミエリンを含むがこれに限らない。

天然の供給源から単離されたスフィンゴミエリンを、１つの特定の飽和または不飽和アシル鎖において人工的に濃縮し得る。例えば、乳スフィンゴミエリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａ．）は、長い飽和アシル鎖（すなわち、２０またはそれ以上の炭素原子を有するアシル鎖）によって特徴付けられる。対照的に、卵スフィンゴミエリンは、短い飽和アシル鎖（すなわち、２０より少ない炭素原子を有するアシル鎖）によって特徴付けられる。例えば、乳スフィンゴミエリンの約２０％しかＣ１６：０（１６炭素、飽和）アシル鎖を持たない一方、卵スフィンゴミエリンの約８０％がＣ１６：０アシル鎖を含む。溶媒抽出を用いて、乳スフィンゴミエリンの構成成分を、卵スフィンゴミエリンのものに匹敵するアシル鎖構成成分を有するよう濃縮し得、逆も同じである。

ＳＭは、それが特定のアシル鎖を有するよう、半合成であり得る。例えば、乳スフィンゴミエリンを、まず乳から精製し得、次いで１つの特定のアシル鎖、例えばＣ１６：０アシル鎖を切断して、そして別のアシル鎖と置換し得る。ＳＭをまた、例えば大規模合成によって、完全に合成し得る。例えば１９９３年６月１５日に発行された、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎｓと題された、Ｄｏｎｇら、米国特許第５，２２０，０４３号；Ｗｅｉｓ、１９９９、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ １０２（１−２）：３−１２を参照のこと。

半合成または合成ＳＭを構成するアシル鎖の長さおよび飽和レベルは、選択的に変化させ得る。アシル鎖は、飽和または不飽和であり得、そして約６から約２４までの炭素原子を含み得る。各鎖は、同じ数の炭素原子を含み得る、またはあるいは、各鎖は異なる数の炭素原子を含み得る。いくつかの実施態様において、半合成または合成ＳＭは、１つの鎖は飽和しており、そして１つの鎖は不飽和であるような、混合アシル鎖を含む。そのような混合アシル鎖ＳＭにおいて、鎖の長さは同じまたは異なり得る。他の実施態様において、半合成または合成ＳＭのアシル鎖は、どちらも飽和しているか、またはどちらも不飽和であるかのいずれかである。再び、その鎖は同じまたは異なる数の炭素原子を含み得る。いくつかの実施態様において、半合成または合成ＳＭを構成するアシル鎖はどちらも同じである。特定の実施態様において、その鎖は、例えばオレイン酸、パルミチン酸、またはステアリン酸のような、天然に存在する脂肪酸のアシル鎖に対応する。別の特定の実施態様において、両方のアシル鎖が飽和しており、そして６から２４の炭素原子を含む。半合成および合成ＳＭに含まれ得る、一般に存在する脂肪酸に存在するアシル鎖の制限しない例を、下記の表１で提供する：

ＳＭと同様に、使用されるレシチンの正体は成功のために決定的でない。また、ＳＭと同様に、レシチンは天然の供給源由来である、またはそれから単離し得る、または合成的に得ることができる。天然の供給源から単離される適当なレシチンの例は、卵ホスファチジルコリンおよびダイズホスファチジルコリンを含むがこれに限らない。適当なレシチンのさらなる制限しない例は、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、１−オレオイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、およびそのエーテル誘導体またはアナログを含む。

ＳＭと同様に、天然の供給源由来またはそれから単離されたレシチンを、特定のアシル鎖を含むように濃縮し得る。半合成または合成レシチンを採用する実施態様において、ＳＭに関連して上記で議論したように、アシル鎖の正体を選択的に変化させ得る。本明細書中で記載された荷電複合体のいくつかの実施態様において、レシチンの両方のアシル鎖は同一である。ＳＭおよびレシチンを両方含む荷電リポタンパク質複合体のいくつかの実施態様において、ＳＭおよびレシチンのアシル鎖は全て同一である。特定の実施態様において、アシル鎖はミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、またはステアリン酸のアシル鎖に対応する。

脂質画分は、荷電したリン脂質も含む。本明細書中で使用される場合、「荷電したリン脂質」は、生理学的ｐＨにおいて有効電荷を有するリン脂質である。荷電したリン脂質は、単一の型の荷電したリン脂質、または２つまたはそれ以上の異なる、典型的には同様の電荷のリン脂質の混合物を含み得る。いくつかの実施態様において、荷電したリン脂質は、負に荷電したグリセロリン脂質である。荷電したリン脂質の正体は、成功のために決定的ではない。適当な負に荷電したリン脂質の特定の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、およびホスファチジン酸を含むがこれに限らない。いくつかの実施態様において、負に荷電したリン脂質は、１つまたはそれ以上のホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、および／またはホスファチジン酸を含む。

ＳＭおよびレシチンと同様に、負に荷電したリン脂質は、天然の供給源由来であり得る、または化学合成によって調製し得る。合成の負に荷電したリン脂質を採用する実施態様において、ＳＭに関連して上記で議論したように、アシル鎖の正体を選択的に変化させ得る。本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体のいくつかの実施態様において、負に荷電したリン脂質上のアシル鎖はどちらも同一である。本明細書中で記載された三元および四元荷電リポタンパク質複合体のいくつかの実施態様において、ＳＭ、レシチン、および負に荷電したリン脂質上のアシル鎖は全て同一である。特定の実施態様において、荷電したリン脂質および／またはＳＭは全て、Ｃ１６：０またはＣ１６：１アシル鎖を有する。別の特定の実施態様において、荷電したリン脂質、レシチンおよび／またはＳＭのアシル鎖は、パルミチン酸のアシル鎖に対応する。さらに別の特定の実施態様において、荷電したリン脂質、レシチンおよび／またはＳＭのアシル鎖は、オレイン酸のアシル鎖に対応する。

荷電複合体を構成する負に荷電したリン脂質の全量は、変動し得る。典型的には、脂質画分は、約０．２から１０ｗｔ％の負に荷電したリン脂質を含む。いくつかの実施態様において、脂質画分は、約０．２から１ｗｔ％、０．２から２ｗｔ％、０．２から３ｗｔ％、０．２から４ｗｔ％、０．２から５ｗｔ％、０．２から６ｗｔ％、０．２から７ｗｔ％、０．２から８ｗｔ％、または０．２から９ｗｔ％の合計の、負に荷電したリン脂質を含む。いくつかの実施態様において、脂質画分は、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０ｗｔ％、および／またはこれらの値のいずれかを終点として含む範囲の合計の、負に荷電したリン脂質を含む。いくつかの実施態様において、脂質画分は、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０ｗｔ％の合計の、負に荷電したリン脂質から、約４、５、６、７、８、９または１０ｗｔ％の合計の、負に荷電したリン脂質を含む。

本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体に負に荷電したリン脂質を含むことは、従来の複合体と比較して、その複合体により高い安定性（溶液中）およびより長い製品有効期間を与えることが期待される。それに加えて、負に荷電したリン脂質の使用は、粒子の凝集を最低限にし（例えば電荷の反発によって）、それによって所定の投与レジメ中に存在する利用可能な複合体の数を効果的に増加させ、そして腎臓ではなく肝臓による認識のための複合体のターゲティングを助けることが期待される。

いくつかのアポリポタンパク質は、インビボにおいて１つのリポタンパク質複合体から別のものへと交換する（これはアポリポタンパク質ＡｐｏＡ−Ｉに関して事実である）。そのような交換の過程の間、アポリポタンパク質は、典型的にはそれとともに１つまたはそれ以上のリン脂質分子を運ぶ。この性質のために、本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体が、内因性ＨＤＬに負に荷電したリン脂質を「播種（ｓｅｅｄ）」し、それによってそれらを腎臓による除去に対してより抵抗性のアルファ粒子へ変換することが期待される。従って、本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体および組成物の投与は、ＨＤＬの血清レベルを増加させる、および／または内因性ＨＤＬの半減期および内因性ＨＤＬの代謝を変化させることが期待される。これはコレステロール代謝および脂質逆輸送の変化を引き起こすことが期待される。

中性および荷電したリン脂質に加えて、脂質画分は、任意でさらなる脂質を含み得る。リゾリン脂質、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、グリセリド、トリグリセリド、およびコレステロールおよびその誘導体を含むがこれに限らない、実質的にあ
らゆる型の脂質を使用し得る。

含まれる場合には、そのような任意の脂質は、典型的には脂質画分の約５０ｗｔ％未満を構成するが、いくつかの例ではより多くの任意の脂質が含まれ得る。いくつかの実施態様において、荷電リポタンパク質複合体の脂質画分は、任意の脂質を含まない。

概要の項で示したように、荷電リポタンパク質複合体の脂質画分を構成する中性リン脂質の全量は変動し得、そして含まれる荷電したリン脂質の全量、および任意の脂質が含まれるかどうかに依存して、典型的には約５０から９９．８ｗｔ％の範囲である。任意の脂質が含まれない特定の実施態様は、典型的には約９０から９９．８ｗｔ％の全中性リン脂質を含む。レシチンおよびＳＭを両方含む脂質画分の適当なレシチン：ＳＭモル比は、概要の項に記載されている。

特定の実施態様において、荷電リポタンパク質複合体は三元複合体であり、そこで脂質画分は実質的には約９０から９９．８ｗｔ％のＳＭおよび約０．２から１０ｗｔ％の負に荷電したリン脂質、例えば約０．２−１ｗｔ％、０．２−２ｗｔ％、０．２−３ｗｔ％、０．２−４ｗｔ％、０．２−５ｗｔ％、０．２−６ｗｔ％、０．２−７ｗｔ％、０．２−８ｗｔ％、０．２−９ｗｔ％、または０．２−１０ｗｔ％の合計の、負に荷電したリン脂質から成る。別の特定の実施態様において、荷電リポタンパク質複合体は三元複合体であり、そこで脂質画分は、実質的には約９０から９９．８ｗｔ％のレシチンおよび約０．２から１０ｗｔ％の合計の、負に荷電したリン脂質、例えば約０．２−１ｗｔ％、０．２−２ｗｔ％、０．２−３ｗｔ％、０．２−４ｗｔ％、０．２−５ｗｔ％、０．２−６ｗｔ％、０．２−７ｗｔ％、０．２−８ｗｔ％、０．２−９ｗｔ％、または０．２−１０ｗｔ％の合計の負に荷電したリン脂質から成る。

さらに別の特定の実施態様において、荷電リポタンパク質複合体は四元複合体であり、そこで脂質画分は実質的には約９．８から９０ｗｔ％のＳＭ、約９．８から９０ｗｔ％のレシチン、および約０．２−１０ｗｔ％の負に荷電したリン脂質、例えば約０．２−１ｗｔ％から、０．２−２ｗｔ％、０．２−３ｗｔ％、０．２−４ｗｔ％、０．２−５ｗｔ％、０．２−６ｗｔ％、０．２−７ｗｔ％、０．２−８ｗｔ％、０．２−９ｗｔ％、０．２−１０ｗｔ％までの合計の、負に荷電したリン脂質から成る。

その複合体はまた、任意で例えばパラオキソナーゼ（ＰＯＮ）またはＬＣＡＴのような他のタンパク質、抗酸化剤、シクロデキストリン、および／またはコレステロールを複合体のコアまたは表面に捕獲するのに役立つ他の物質を含み得る。その複合体は、任意で循環半減期を増加させるためにペグ化され得る（例えばポリエチレングリコールまたは他のポリマーで覆われる）。

当業者によって認識されるように、本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体のアポリポタンパク質画分に対する脂質画分のモル比は変動し得、そして他の因子の中でも、アポリポタンパク質画分を構成するアポリポタンパク質の正体、脂質画分を構成する荷電したリン脂質の正体および量、および荷電リポタンパク質複合体の望ましい大きさに依存する。ＡｐｏＡ−Ｉのようなアポリポタンパク質の生物学的活性は、アポリポタンパク質を構成する両親媒性のへリックスによって媒介されると考えられるので、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質当量を用いて脂質：アポリポタンパク質モル比のアポリポタンパク質画分を表すのが便利である。へリックスを計算するために使用する方法に依存して、ＡｐｏＡ−Ｉは６−１０の両親媒性へリックスを有することが一般的に受け入れられている。他のアポリポタンパク質を、それらが含む両親媒性へリックスの数に基づいて、ＡｐｏＡ−Ｉ当量に置き換えて表現し得る。例えば、典型的にはジスルフィド架橋ダイマーとして存在するＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍは、ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍの各分子がＡｐｏＡ−Ｉの分子の２倍の数の両親媒性へリックスを含むので、２ＡｐｏＡ−Ｉ当量として表現し得る。逆に、単一の両親媒性へリックスを含むペプチドアポリポタンパク質は、各分子はＡｐｏＡ−Ｉの分子の１／１０−１／６の数の両親媒性へリックスを含むので、１／１０−１／６ＡｐｏＡ−Ｉ当量として表現し得る。一般的に、荷電リポタンパク質複合体の脂質：ＡｐｏＡ−Ｉ当量モル比（本明細書中で「Ｒ_ｉ」として定義される）は、約２：１から１００：１の範囲である。いくつかの実施態様において、Ｒ_ｉは約５０：１である。約６５０−８００のリン脂質のＭＷを用いて、重量の比を得ることができる。

荷電リポタンパク質複合体の大きさを、Ｒ_ｉを変化させることによってコントロールし得る。すなわち、Ｒ_ｉが小さいほど、円盤も小さい。例えば、大きな円盤は典型的には約２００：１から１００：１の範囲のＲ_ｉを有し、一方小さい円盤は典型的には約１００：１から３０：１の範囲のＲ_ｉを有する。

いくつかの特定の実施態様において、荷電リポタンパク質複合体は、２−４ＡｐｏＡ−Ｉ当量（例えば、２−４分子のＡｐｏＡ−Ｉ、１−２分子のＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍダイマー、または６−１０の単一へリックスペプチド分子）、１分子の荷電したリン脂質、および４００分子の全中性リン脂質を含む大きな円盤である。別の特定の実施態様において、荷電リポタンパク質複合体は、２−４ＡｐｏＡ−Ｉ当量、１分子の荷電したリン脂質、および２００分子の全中性リン脂質を含む小さい円盤である。

荷電リポタンパク質複合体を構成する様々なアポリポタンパク質および／またはリン脂質分子を、安定な同位元素（例えば^１３Ｃ、^１５Ｎ、^２Ｈ等）；放射性同位元素（例えば^１４Ｃ、^３Ｈ、^１２５Ｉ等）；フルオロフォア；化学発光物質；または酵素マーカーを含む、あらゆる当該分野で公知の検出可能なマーカーで標識し得る。

（６．３ 荷電リポタンパク質複合体を作成する方法）
本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体を、小胞、リポソーム、タンパクリポソーム、ミセル、および円盤状粒子を含むがこれに限らない、様々な形式で調製し得る。当業者に周知の様々な方法を使用して、荷電リポタンパク質複合体を調製し得る。リポソームまたはタンパクリポソームを調製するために利用可能な多くの技術を使用し得る。例えば、アポリポタンパク質を適当なリン脂質と同時超音波処理して（槽またはプローブ超音波処理器を用いて）複合体を形成し得る。あるいは、アポリポタンパク質を、前もって形作った脂質小胞と組み合わせ、荷電リポタンパク質複合体の自発的な形成を引き起こし得る。荷電リポタンパク質複合体をまた、界面活性剤透析法によって形成し得る；例えばアポリポタンパク質、荷電したリン脂質、ＳＭおよび／またはレシチン、およびコール酸塩のような界面活性剤の混合物を透析して界面活性剤を除去し、そして再構築して荷電リポタンパク質複合体を形成する（例えばＪｏｎａｓら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８：５５３−８２を参照のこと）、または押し出し装置を用いることによって、またはホモジナイゼーションによって形成し得る。

いくつかの実施態様において、荷電リポタンパク質複合体を、米国公開第２００４／００６７８７３号の実施例１において記載された、コール酸塩分散法によって調製し得、その開示は本明細書中で参考文献に組み込まれる。簡単には、乾燥脂質をＮａＨＣＯ_３緩衝液中で水和し、次いで全ての脂質が分散するまでボルテックスおよび超音波処理する。コール酸塩溶液を加え、定期的にボルテックスおよび超音波処理して、それが透明になって脂質コール酸塩ミセルが形成されたことを示すまで、混合物を３０分間インキュベートする。ＮａＨＣＯ_３緩衝液中のプロＡｐｏＡ−Ｉを加え、そして溶液を約３７℃−５０℃で１時間インキュベートする。溶液中の脂質：プロＡｐｏＡ−Ｉの比は、１：１から２００：１（モル／モル）であり得るが、いくつかの実施態様において、その比は約２：１の脂質重量対タンパク質重量（ｗｔ／ｗｔ）である。

コール酸塩を、当該分野で周知の方法によって除去し得る。例えば、透析、限外ろ過によって、または親和性ビーズまたは樹脂に対する吸着によるコール酸塩分子の除去によって、コール酸を除去し得る。１つの実施態様において、親和性ビーズ、例えばＢＩＯ−ＢＥＡＤＳ（登録商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を荷電リポタンパク質複合体およびコール酸塩の調節物に加えてコール酸塩を吸着する。別の実施態様において、調製物、例えば荷電リポタンパク質複合体およびコール酸塩のミセル調製物を、親和性ビーズを充填したカラムに通す。

特定の実施態様において、調製物をシリンジ中のＢＩＯ−ＢＥＡＤＳ（登録商標）に添加することによって、コール酸塩を荷電リポタンパク質複合体の調製物から除去する。次いでシリンジをバリアフィルムで密閉し、そして振とうしながら４℃で一晩インキュベートする。使用前に、コール酸塩がビーズによって吸着されるＢＩＯ−ＢＥＡＤＳ（登録商標）に溶液を注入することによって、コール酸塩を除去する。

荷電リポタンパク質複合体は、複合体がＨＤＬ、特にプレ−ベータ−１またはプレ−ベータ−２ＨＤＬ集団中のＨＤＬに類似した大きさおよび密度を有する場合、循環中で増加した半減期を有することが期待される。長い有効期間を有する安定な調製物を、凍結乾燥によって産生し得る。例えば、下記で記載される同時凍結乾燥手順は、安定な処方および簡単な処方／粒子調製過程を提供する。同時凍結乾燥法は、米国特許第６，２８７，５９０号（２００１年９月１１日発行、Ｄａｓｓｅｕｘによる、Ｐｅｐｔｉｄｅ／ｌｉｐｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏ−ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎと題された）においても記載され、それは本明細書中でその全体として参考文献に組み込まれる。凍結乾燥荷電リポタンパク質複合体を、医薬品の再処方のために大量の供給を調製するために、または被験体への投与の前に、滅菌水または適当な緩衝化溶液で再水和することによって再構築し得る、個々のアリコートまたは投与量単位を調製するために使用し得る。

米国特許第６，００４，９２５、６，０３７，３２３、６，０４６，１６６および６，２８７，５９０号（本明細書中でその全体として参考文献に組み込まれる）は、ＨＤＬに類似した特徴を有する荷電リポタンパク質複合体を調製するための簡単な方法を開示する。この方法は、有機溶媒（または溶媒混合物）中での、アポリポタンパク質および脂質溶液の同時凍結乾燥、および凍結乾燥粉末の水和の間の荷電リポタンパク質複合体の形成を含み、以下の利点を有する：（１）その方法は、非常に少ない工程しか必要でない；（２）その方法は、安価な溶媒を使用する；（３）含まれる成分のほとんどまたは全てを、計画された複合体を形成するために使用し、従って他の方法によくある、開始材料の無駄を回避する；（４）保存の間非常に安定であり、できた複合体を使用の直前に再構築し得る凍結乾燥複合体を形成する；（５）できた複合体は通常、形成後および使用前にさらに精製する必要がない；（６）コール酸塩のような界面活性剤を含む毒性化合物が回避される；および（７）産生方法を容易にスケールアップし得、そしてＧＭＰ生産（すなわち、エンドトキシン遊離の環境における）に適当である。

いくつかの実施態様において、当該分野において通常公知である同時凍結乾燥法を使用して、荷電リポタンパク質複合体を調製する。簡単には、その同時凍結乾燥工程は、有機溶媒または溶媒混合物中で、アポリポタンパク質（「Ａｐｏ」）およびリン脂質を共に可溶化すること、またはＡｐｏおよびリン脂質を別々に可溶化し、そしてそれらを混合することを含む。溶媒または溶媒混合物の望ましい特徴は：（ｉ）疎水性の脂質および両親媒性のタンパク質を溶解し得る、中程度の相対的な極性；（ｉｉ）溶媒は、残留有機溶媒に関連する潜在的な毒性を回避するために、ＦＤＡ溶媒ガイドライン（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ、第６２巻２４７号）によってクラス２または３の溶媒であるべきである、（ｉｉｉ）凍結乾燥中の簡単な溶媒除去を保証するために、低い沸点、（ｉｖ）凍結をより速く、冷却器の温度をより高くし、および従って凍結乾燥機の浪費をより少なくするために、高い融点。好ましい実施態様において、氷酢酸を使用する。例えばメタノール、氷酢酸、キシレン、またはシクロヘキサンの組み合わせも使用し得る。

次いでＡｐｏ／脂質溶液を凍結乾燥して、均一なＡｐｏ／脂質粉末を得る。凍結乾燥条件を最適化して、凍結乾燥Ａｐｏ／脂質粉末中の残留溶媒の量を最少にして溶媒の蒸発を迅速にすることができる。凍結乾燥条件の選択は、当業者によって決定し得、そして溶媒の性質、容器、例えばバイアルの型および寸法、保持溶液、充填容積、および使用する凍結乾燥機の特徴に依存する。有機溶媒の除去および複合体をうまく形成するために、凍結乾燥前の脂質／Ａｐｏ溶液の濃度は、１０から５０ｍｇ／ｍｌの濃度のＡｐｏＡ−Ｉ当量および２０から１００ｍｇ／ｍｌの濃度の脂質の範囲であり得る。

適当なｐＨおよび浸透圧の水性溶媒でＡｐｏ−脂質凍結乾燥粉末を水和した後、Ａｐｏ−脂質複合体が自然に形成される。いくつかの実施態様において、その溶媒はスクロース、トレハロース、グリセリンおよび他のような安定化剤も含み得る。いくつかの実施態様において、脂質が複合体を形成するために、溶液を転移温度より上の温度に数回加熱しなければならない。荷電リポタンパク質複合体をうまく形成するために、脂質のタンパク質に対するモル比は、２：１から２００：１までであり得（ＡｐｏＡ−Ｉ当量で表現される）、そして好ましくは約２：１の脂質重量対タンパク質重量（ｗｔ／ｗｔ）である。粉末を水和して、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質当量で表現される約５−３０ｍｇ／ｍｌの最終的な複合体濃度を得る。

いくつかの実施態様において、ＮＨ_４ＣＯ_３水性溶液中のＡｐｏ溶液を凍結乾燥することによって、Ａｐｏ粉末を得る。Ａｐｏおよび脂質の均一な溶液を、その粉末およびＡｐｏを氷酢酸に溶解することによって形成する。次いでその溶液を凍結乾燥し、そして凍結乾燥粉末を水性溶媒で水和することによって、ＨＤＬ様の荷電リポタンパク質複合体が形成される。

いくつかの実施態様において、Ａｐｏ−脂質複合体を調製するためにホモジナイゼーションを使用する。この方法を使用して、ＡｐｏダイズＰＣ複合体を調製し得、そしてＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍ−ＰＯＰＣ複合体の処方に通常使用する。ホモジナイゼーションを、荷電リポタンパク質複合体の形成に容易に適応させ得る。簡単には、この方法は、Ｕｌｔｒａｔｕｒｅｘ^ＴＭによるＡｐｏの水性溶液中の脂質懸濁液の形成、および高圧ホモジナイザーを用いて、懸濁液が透明−乳白色の溶液になり、そして複合体が形成されるまで、形成された脂質−タンパク質懸濁液をホモジナイズすることを含む。ホモジナイゼーション中、脂質転移より上の高い温度を使用する。１−１４時間の長時間、そして高圧で溶液をホモジナイズする。

いくつかの実施態様において、荷電リポタンパク質複合体を、リン脂質と、ペプチドまたはタンパク質溶液または懸濁液の同時凍結乾燥によって形成し得る。ペプチド／タンパク質、荷電したリン脂質、ＳＭおよび／またはレシチン（プラスあらゆる他の選択されたリン脂質）の、有機溶媒または有機溶媒混合物中の均一な溶液を、凍結乾燥し得、そして凍結乾燥粉末の水性緩衝液による水和によって、荷電リポタンパク質複合体が自発的に形成し得る。有機溶媒またはその混合物の例は、酢酸、酢酸およびキシレン、酢酸およびシクロヘキサン、およびメタノールおよびキシレンを含むがこれに限らない。

脂質に対するタンパク質（ペプチド）の適当な割合は、できた複合体が適当な物理的および化学的性質、すなわち通常（しかし必ずしもそうではない）ＨＤＬと同様の大きさを有するよう、経験的に決定し得る。溶媒中のできたＡｐｏおよび脂質の混合物を凍結し、そして乾燥するまで凍結乾燥する。凍結乾燥を促進するために、さらなる溶媒を混合物に加えなければならない場合もある。この凍結乾燥産物を、長期間保存することができ、そして安定なままであることが期待される。

荷電リポタンパク質複合体の溶液または懸濁液を得るために、凍結乾燥産物を再構築し得る。この目的のために、凍結乾燥粉末を適当な容積まで水性溶液で再水和し（典型的には５−２０ｍｇの荷電リポタンパク質複合体／ｍｌ）、それは例えば静脈内注射に便利である。好ましい実施態様において、凍結乾燥粉末を、リン酸緩衝化生理食塩水、炭酸水素生理食塩水、または生理食塩水溶液で再水和する。混合物を攪拌またはボルテックスして、再水和を促進する。一般的に、再構築工程を、複合体の脂質成分の相転移温度と同じまたはそれより高い温度で行うべきである。再構築数分以内に、再構築荷電リポタンパク質複合体の透明な調製物が生じる。

他の方法は、溶液をスプレーし、そして溶媒を蒸発させるスプレー乾燥を含む（高温または減圧のいずれかにおいて）。脂質およびアポリポタンパク質を、同じ溶媒または異なる溶媒に可溶化し得る。次いでバイアルに充填するために粉末充填物を使用し得る。

アポリポタンパク質および脂質由来の凍結乾燥粉末を、機械的にも混合し得る。アポリポタンパク質および脂質を含む均一な粉末を、次いで水和して、適当な大きさおよび適当な脂質：アポリポタンパク質モル比の複合体が自発的に形成し得る。

できた再構築調製物のアリコートを特徴付けて、調製物中の複合体が望ましいサイズ分布、例えばＨＤＬのサイズ分布を有することを確認し得る。再構築調製物の特徴付けは、サイズ排除ろ過、ゲルろ過、カラムろ過、ゲル浸透クロマトグラフィー、および非変性ゲル電気泳動を含むがこれに限らない、当該分野で公知のあらゆる方法を用いて行い得る。

例えば、凍結乾燥荷電リポタンパク質粉末の水和後、またはホモジナイゼーションまたはコール酸透析の最後に、形成されたＡｐｏ−脂質ＨＤＬ様粒子を、その大きさに関して特徴付け、できた溶液の濃度、最終的なｐＨ、および浸透圧、ある場合には脂質および／またはアポリポタンパク質の完全性を特徴付ける。できた荷電リポタンパク質粒子の大きさは、その有効性の決定要因であり、従ってこの測定は、典型的には粒子の特徴付けに含まれる。

いくつかの実施態様において、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、例えば１×３０ｃｍのＳｕｐｅｒｄｅｘ^ＴＭカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を備えた高速液体クロマトグラフィーシステムおよびＵＶ検出器を使用し得る。０．５ｍｌ／分の流速で送達される１４０ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭの炭酸水素ナトリウムから成る炭酸水素緩衝化生理食塩水で、複合体を溶出する。注入する複合体の典型的な量は、タンパク質重量に基づいて０．１から１ｍｇである。複合体を、２８０ｎｍにおける吸収によってモニターし得る。

荷電リポタンパク質粒子溶液のタンパク質および脂質濃度を、タンパク質およびリン脂質アッセイ、およびＨＰＬＣ、ゲルろ過クロマトグラフィー、質量分析、ＵＶまたはダイオードアッセイ、蛍光、弾性光散乱および他を含む様々な検出器と組み合わせたＧＣのようなクロマトグラフィー法を含むがこれに限らない、当該分野で公知のあらゆる方法によって測定し得る。脂質およびタンパク質の完全性も、同じクロマトグラフィー技術およびペプチドマッピング、ＳＤＳ−ｐａｇｅゲル、タンパク質のＮ−およびＣ−末端配列決定、および脂質に関して脂質酸化を決定するための標準的なアッセイによって決定し得る。

本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体または組成物の均一性および／または安定性を、ゲルろ過クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー法を含むがこれに限らない、当該分野で公知のあらゆる方法によって測定し得る。例えば、いくつかの実施態様において、単一のピークまたは限られた数のピークが安定な複合体と関連し得る。複合体の安定性を、時間につれて新しいピークの出現をモニターすることによって決定し得る。新しいピークの出現は、粒子の不安定性による複合体間の再編成の徴候である。

荷電複合体におけるアポリポタンパク質に対するリン脂質の最適な比を、ゲル電気泳動移動度アッセイ、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＤＬ受容体との相互作用、ＡＴＰ結合カセット輸送体（ＡＢＣＡ１）による認識、肝臓による取り込み、および薬物動態学／薬力学を含むがこれに限らない、当該分野で公知の多くの機能的アッセイを用いて決定し得る。例えば、ゲル電気泳動移動度アッセイを用いて、荷電複合体におけるアポリポタンパク質に対するリン脂質の最適な比を決定し得る。本明細書中で記載された荷電複合体は、天然のプレ−ベータ−ＨＤＬまたはアルファ−ＨＤＬ粒子と同様の電気泳動移動度を示すべきである。従って、いくつかの実施態様において、天然プレ−ベータ−ＨＤＬまたはアルファ−ＨＤＬ粒子を、荷電複合体の移動度を決定するための基準として使用し得る。

別の例として、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、天然プレ−ベータ−ＨＤＬ粒子と比較した、本明細書中で記載された荷電複合体の大きさを決定し得る。天然プレ−ベータ−ＨＤＬ粒子は一般的に、１０−１２ｎｍより大きくなく、そして円盤状粒子は通常約７−１０ｎｍである。

別の例として、どの複合体が天然プレ−ベータ−ＨＤＬ粒子と一番近いかを同定する、またはどの複合体が、コレステロールまたは脂質を細胞から除去および／または可動化するのに最も有効であるかを同定するために、ＨＤＬ受容体を機能的アッセイにおいて使用し得る。１つのアッセイにおいて、複合体をＡＢＣＡ−１受容体に結合するその能力に関して試験し得る。そのようなアッセイは、ＡＢＣＡ−１依存または非依存のコレステロールの除去を区別し得る。ＡｐｏＡ−Ｉはそのようなアッセイのために最もよいリガンドであると考えられるが、小さいミセルまたは小さい円盤状粒子のような複合体も、強力なＡＢＣＡ−１リガンドである。使用し得るＡＢＣＡ−１結合アッセイは、Ｂｒｅｗｅｒら、２００４、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２４：１７５５−１７６０において記載される。

別の例として、ＡＢＣＡ−１発現細胞は、遊離のＡｐｏＡ−Ｉを、そしてより低い程度に天然プレ−ベータ−ＨＤＬ粒子を認識することが公知である（Ｂｒｅｗｅｒら、２００４、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２４：１７５５−１７６０）。これらの実施態様において、天然プレ−ベータ−ＨＤＬ粒子のＡＢＣＡ−１細胞の認識を、本明細書中で記載された荷電複合体のいずれか一つと比較して、天然プレ−ベータ−ＨＤＬ粒子に最もよく似ている複合体を同定し得る。

天然プレ−ベータ−ＨＤＬ粒子に最もよく似ている荷電複合体を同定するための、比較的単純なアプローチは、肝臓に再構築荷電複合体を含む溶液を灌流し、そして肝臓によって取り込まれた量を測定することである。

いくつかの実施態様において、荷電複合体の薬物動態学／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）を、ウサギにおける単回の注射後に測定し得る。これらの実施態様において、ＡｐｏＡ−Ｉの濃度を、動態のマーカーとして使用する。薬力学を、単回の注射後にベースラインを超えて可動化したコレステロールの量、およびＨＤＬ画分中のコレステロールの量として測定し得る。ＰＫおよびＰＤは、リン脂質の性質、リン脂質の組成、脂質：アポリポタンパク質のモル比および複合体のリン脂質濃度に依存する。例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）／ＡｐｏＡ−Ｉ複合体は、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）／ＡｐｏＡ−Ｉ複合体より長い半減期を有する。スフィンゴミエリン／ＡｐｏＡ−Ｉ複合体は、ＥＰＣ／ＡｐｏＡ−Ｉ複合体よりも長い半減期を有する。ヒトにおけるヒトＡｐｏＡ−Ｉの半減期は、約５から６日である。

別の実施態様において、荷電複合体の薬力学を、時間につれたＨＤＬ画分におけるコレステロールエステル化の速度をフォローすることによって測定し得る。ＬＣＡＴは、血液中でコレステロールエステル化の原因である唯一の酵素である。コレステロールエステル化の速度は、粒子の質を評価する良いパラメーターである。ＬＣＡＴが分子プローブとして作用し、四元複合体がＬＣＡＴによって認識されるなら、エステル化の速度はより高い。これは、表面が理想的、荷電が理想的、形態が理想的であり、そして２つの基質（ＬＣＡＴはまずアシル鎖をリン脂質から加水分解し（エステラーゼ活性）、そして次いでコレステロールの遊離ＯＨをエステル化して（エステラーゼ活性）コレステロールエステルを形成する）が接近可能および正しい濃度であることを意味する。また、それはその粒子が、反応の産物：リゾリン脂質およびコレステロールエステルを可溶化および捕捉するためによい大きさおよび構成であることを意味し、そうでなければ反応は停止する。

（６．４ 医薬組成物）
開示によって企図される医薬組成物は、インビボでの投与および伝達に適当な、薬学的に許容可能な担体中に、活性成分として荷電リポタンパク質複合体を含む。ペプチドは酸性および／または塩基性末端および／または側鎖を含み得るので、ペプチド模倣物アポリポタンパク質は、遊離の酸または塩基の形式、または薬学的に許容可能な塩の形式で組成物に含まれ得る。アミド化、アシル化、アセチル化、またはペグ化タンパク質のような修飾タンパク質も使用し得る。

注射可能な組成物は、水性または油性媒体中の活性成分の滅菌懸濁液、溶液、またはエマルションを含む。組成物はまた、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤のような、処方薬剤も含み得る。注射のための組成物を、単位投与量形式、例えばアンプルまたは複数回投与容器で提示し得、そしてさらに保存剤を含み得る。注入のために、組成物を、エチレン酢酸ビニルまたは当該分野で公知のあらゆる他の適合性物質のような、荷電リポタンパク質複合体と適合性の物質で作られた注入バッグで供給し得る。

あるいは、注射可能な組成物を、使用前に、滅菌パイロジェン遊離水、緩衝液、デキストロース溶液等を含むがこれに限らない適当な媒体で再構築するために、粉末形式で提供し得る。このために、Ａｐｏを凍結乾燥し得る、または同時凍結乾燥した荷電リポタンパク質複合体を調製し得る。保存した組成物を、単位投与量形式で供給し、そしてインビボで使用する前に再構築し得る。

延長した伝達のために、活性成分を、埋め込み、例えば皮下、皮内、または筋肉内注射による投与のためにデポー組成物として処方し得る。従って、例えば、Ａｐｏ−脂質複合体またはアポリポタンパク質単独を、適当なポリマーまたは疎水性物質（例えば許容可能な油中のエマルションとして）と、またはリン脂質気泡またはイオン交換樹脂中に処方し得る。

あるいは、皮下吸収のために活性成分をゆっくりと放出する、接着性のディスクまたはパッチとして製造された経皮伝達システムを使用し得る。このために、透過増強剤を使用して、活性成分の経皮浸透を促進し得る。本明細書中で記載された荷電複合体を、虚血性心疾患および高コレステロール血症を有する患者で使用するためのニトログリセリンパッチに組み込むことによって、特別の利点を達成し得る。

あるいは、カテーテルまたはパーフューザー（ｐｅｒｆｕｓｏｒ）を用いて、局所的または壁内（血管壁内）に伝達をし得る（例えば米国公開２００３／０１０９４４２号を参照のこと）。

もし望ましいなら、組成物を、活性成分を含む１つまたはそれ以上の単位投与量形式を含み得る、包装または分注装置中で提示し得る。例えば、包装は、ブリスター包装のような、金属またはプラスチック箔を含み得る。その包装または分注装置は、投与の指示を伴い得る。

（６．５ 治療の方法）
本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体および組成物を、リポタンパク質複合体が有用であることが示された、実質的に全ての目的のために使用し得る。特定の実施態様において、その複合体および組成物を、脂質代謝異常および／または脂質代謝異常に関連する実質的にあらゆる疾患、状態および／または異常を治療または予防するために使用し得る。本明細書中で使用される場合、「脂質代謝異常」または「脂質代謝異常の」という用語は、以下の状態：冠動脈心疾患；冠動脈疾患；心血管疾患、高血圧、再狭窄、血管または血管周囲疾患；脂質代謝異常障害；異リポタンパク血症；高レベルの低密度リポタンパク質コレステロール；高レベルの超低密度リポタンパク質コレステロール；低レベルの高密度リポタンパク質；高レベルのリポタンパク質Ｌｐ（ａ）コレステロール；高レベルのアポリポタンパク質Ｂ；アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化症の治療および予防を含む）；高脂血症；高コレステロール血症；家族性高コレステロール血症（ＦＨ）；家族性複合型高脂血症（ＦＣＨ）；高トリグリセリド血症、低アルファリポタンパク血症、および高コレステロール血症リポタンパク質（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）のような、リポタンパク質リパーゼ欠損症に関連する、変化したレベルの脂質を含むがこれに限らない、血漿中の脂質の異常に上昇したまたは減少したレベルを指す。

脂質代謝異常に関連する疾患は、冠動脈心疾患、冠動脈疾患、急性冠症候群、心血管疾患、高血圧、再狭窄、血管または血管周囲疾患、脂質代謝異常障害；異リポタンパク血症；高レベルの低密度リポタンパク質コレステロール；高レベルの超低密度リポタンパク質コレステロール；低レベルの高密度リポタンパク質；高レベルのリポタンパク質Ｌｐ（ａ）コレステロール；高レベルのアポリポタンパク質Ｂ；アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化症の治療および予防を含む）；高脂血症；高コレステロール血症；家族性高コレステロール血症（ＦＨ）；家族性複合型高脂血症（ＦＣＨ）；高トリグリセリド血症、低アルファリポタンパク血症、および高コレステロール血症リポタンパク質（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）のような、リポタンパク質リパーゼ欠損症を含むがこれに限らない。

本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体および組成物を使用して、現在当該分野において公知である有効投与量より約２から２５倍少ない（ＡｐｏＡ−Ｉ当量で）範囲のリン脂質の投与量が、疾患を治療または予防するのに、または寛解性効果をもたらすのに有効であると期待される。

１つの実施態様において、本方法は、本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体または組成物を、少なくとも投与後１日間、投与前のベースライン（最初の）レベルより約１０ｍｇ／ｄＬから３００ｍｇ／ｄＬ高い範囲の、遊離または複合体アポリポタンパク質の血清レベルを達成するために有効な量で被験体に投与することを含む、脂質代謝異常に関連する疾患を治療または予防する方法を含む。

別の実施態様において、本方法は、本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体または組成物を、少なくとも投与後１日間、投与前の最初のＨＤＬ−コレステロール画分より少なくとも約１０％高いＨＤＬ−コレステロール画分の循環血漿濃度を達成するために有効な量で被験体に投与することを含む、脂質代謝異常に関連する疾患を治療または予防する方法を含む。

別の実施態様において、本方法は、本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体または組成物を、投与後５分および１日の間に、３０および３００ｍｇ／ｄＬの間のＨＤＬ−コレステロール画分の循環血漿濃度を達成するために有効な量で被験体に投与することを含む、脂質代謝異常に関連する疾患を治療または予防する方法を含む。

別の実施態様において、本方法は、本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体または組成物を、投与後５分および１日の間に、３０および３００ｍｇ／ｄＬの間のコレステロールエステルの循環血漿濃度を達成するために有効な量で被験体に投与することを含む、脂質代謝異常に関連する疾患を治療または予防する方法を含む。

さらに別の実施態様において、本方法は、本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体または組成物を、少なくとも投与後１日間、投与前のベースライン（最初の）レベルより少なくとも約１０％高い便コレステロール排泄の増加を達成するために有効な量で被験体に投与することを含む、脂質代謝異常に関連する疾患を治療または予防する（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ）方法を含む。

本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体または組成物を、単独で、または前述の状態を治療または予防するために使用される他の薬剤との併用療法において使用し得る。そのような治療は、関与する薬剤の同時または連続的な投与を含むがこれに限らない。例えば、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化症の治療において、荷電リポタンパク質処方を、いずれか１つまたはそれ以上の、現在使用されているコレステロール低下療法、例えば胆汁酸樹脂、ナイアシン、スタチン系薬剤、コレステロール吸収の阻害剤および／またはフィブラート系薬剤と共に投与し得る。そのような併用レジメは、各薬剤がコレステロール合成および輸送の異なる標的に対して作用するので、特に有用な治療効果を生じ得る；すなわち、胆汁酸樹脂はコレステロール再利用、キロミクロンおよびＬＤＬ集団に影響を与える；ナイアシンは主にＶＬＤＬおよびＬＤＬ集団に影響を与える；スタチン系薬剤は、コレステロール合成を阻害し、ＬＤＬ集団を減少させる（およびおそらくＬＤＬ受容体発現を増加させる）；一方本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体は、ＲＣＴに影響を与え、ＨＤＬを増加させ、そしてコレステロールの流出を促進する。

別の実施態様において、本明細書中で記載された荷電リポタンパク質または組成物を、冠動脈心疾患；冠動脈疾患；心血管疾患、高血圧、再狭窄、血管または血管周知疾患、脂質代謝異常障害；異リポタンパク血症；高レベルの低密度リポタンパク質コレステロール；高レベルの超低密度リポタンパク質コレステロール；低レベルの高密度リポタンパク質；高レベルのリポタンパク質Ｌｐ（ａ）コレステロール；高レベルのアポリポタンパク質Ｂ；アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化症の治療および予防を含む）；高脂血症；高コレステロール血症；家族性高コレステロール血症（ＦＨ）；家族性複合型高脂血症（ＦＣＨ）；高トリグリセリド血症、低アルファリポタンパク血症、および高コレステロール血症リポタンパク質のような、リポタンパク質リパーゼ欠損症を治療または予防するために、フィブラート系薬剤と組み合わせて使用し得る。典型的な処方および治療レジメを下記で説明する。

本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体または組成物を、循環中での生物学的利用能を保証するあらゆる適当な経路によって投与し得る。ＳＭを含む実施態様の重要な特徴は、単独で投与されるアポリポタンパク質（Ａｐｏ）またはＡｐｏペプチドに関しては、有効であると期待される有効投与量の１−１０％より少ない投与量で、およびＡｐｏ−ダイズＰＣ（またはＡｐｏ−卵ＰＣまたはＡｐｏ−ＰＯＰＣ）投与のために必要である有効投与量より２−２５倍少ない投与量で、荷電リポタンパク質複合体を投与し得ることである。現在利用可能な治療レジメに必要な大量のアポリポタンパク質（２から５日ごとに１回の投与あたり２０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、平均サイズのヒトあたり１．４から８ｇ）ではなく、２から１０日ごとに約４０ｍｇから２ｇ／人くらい低い投与量（静脈内注射）のアポリポタンパク質の投与が必要である。

本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体または組成物を、小さいＨＤＬ画分、例えばプレ−ベータ、プレ−ガンマおよびプレ−ベータ様ＨＤＬ画分、アルファＨＤＬ画分、ＨＤＬ３および／またはＨＤＬ２画分を増加させる投与量で投与し得る。いくつかの実施態様において、投与量は、例えば磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または血管内超音波検査（ＩＶＵＳ）のような画像化技術によって測定されるような、アテローム性動脈硬化症のプラークの減少を達成するために有効である。ＩＶＵＳによってフォローされるパラメーターは、ベースラインからのアテローム体積のパーセントにおける変化、および全アテローム体積の変化を含むがこれに限らない。ＭＲＩによってフォローされるパラメーターは、ＩＶＵＳに関するもの、および脂質の構成およびプラークの石灰化を含むがこれに限らない。

プラークの退縮を、それ自身のコントロールとして患者を使用して測定し得る（時間ゼロ対最後の注入の最後、または最後の注入後数週間以内、または治療の開始後３ヶ月、６ヶ月、または１年以内における時間ｔ）。

静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内、皮下（ＳＣ）、および腹腔内（ＩＰ）注射を含む、非経口投与経路によって、最もよい投与を達成し得る。ある実施態様において、投与は、パーフューザー（ｐｅｒｆｕｓｏｒ）、インフィルトレーター（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｏｒ）またはカテーテルによる。いくつかの実施態様において、荷電リポタンパク質複合体を、注射によって、皮下埋め込みポンプによって、またはデポー調製物によって、非経口投与によって得られるものと同等の循環血漿濃度を達成する量で投与する。その複合体はまた、例えばステントまたは他の装置に吸収させ得る。

様々な異なる治療レジメによって投与を達成し得る。例えば、注射の累積の全量が１日の毒性投与量に達しないように、１日の間に、数回の静脈内注射を定期的に投与し得る。あるいは、１回の静脈内注射を、約３から１５日ごとに、好ましくは約５から１０日ごとに、そして最も好ましくは約１０日ごとに投与し得る。さらに別の選択肢では、投与あたり（５０−２００ｍｇ）の間の投与量で約１−５投与から始めて、次いで投与あたり２００ｍｇおよび１ｇの間の反復投与が続く、増加する投与量を投与し得る。患者の必要性に依存して、投与は１時間以上の間の遅い注入による、１時間より短い速い注入による、または単回のボーラス注射により得る。

いくつかの実施態様において、一式の注射として投与し、そして次いで６ヶ月から１年間停止し、そして次いで別の一続きを開始し得る。次いで注射の維持シリーズを毎年または３から５年ごとに投与し得る。一連の注射を、１日で（複合体の特定の血漿レベルを維持するための注入）、数日（例えば８日間の期間で４回の注射）、または数週間（例えば４週間の期間で４回の注射）で行い、そして次いで６ヶ月から１年後に再開し得る。

他の投与経路を使用し得る。例えば経口粘膜、胃および／または小腸の厳しい環境における活性成分の分解を回避または最低限にするために、適当な処方（例えば腸溶コーティング）を使用するなら、例えば経口投与経路（経口摂取、頬側、および舌下経路を含むがこれに限らない）によって、胃腸管からの吸収を達成し得る。あるいは、膣および直腸投与形式のような、粘膜組織による投与を、胃腸管における分解を回避または最低限にするために利用し得る。他の実施態様において、本発明の処方を、経皮的に（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）（例えば経皮的に（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ））、または吸入によって投与し得る。好ましい経路は、レシピエントの状態、年齢およびコンプライアンスによって変化し得ることが認識される。

本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体または組成物の実際の投与量は、投与経路によって変化し得る。

米国特許第６，００４，９２５、６，０３７，３２３、および６，０４６，１６６号（Ｄａｓｓｅｕｘらに対して発行された、本明細書中でその全体として参考文献に組み込まれる）において記載された動物モデルシステムで得られたデータは、ＡｐｏＡ−ＩペプチドはＨＤＬ成分に付随し、そしてヒトにおいて約５日間の予測半減期を有することを示す。従って、いくつかの実施態様において、荷電リポタンパク質複合体を、平均サイズのヒトあたり、２から１０日ごとに、投与あたり約０．１ｇ−１ｇの間の荷電リポタンパク質複合体の投与量で、静脈内注射によって投与し得る。

様々な荷電リポタンパク質複合体の毒性および治療的有効性を、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な投与量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順を用いて決定し得る。毒性および治療的効果の間の投与量比は治療係数であり、そしてそれをＬＤ５０／ＥＤ５０比として表し得る。大きな治療係数を示す荷電リポタンパク質複合体が好ましい。フォローし得るパラメーターの制限しない例は、肝機能トランスアミナーゼ（正常ベースラインレベルの２倍以下）を含む。これは、多すぎるコレステロールが肝臓に運ばれ、そしてそのような量を同化できないことを示す。赤血球からのコレステロールの可動化は、それらを脆弱にする、またはその形に影響を与えるので、赤血球に対する影響もモニターし得る。

医療行為の前数日から数週間（例えば予防的治療）、または医療行為の間または後に患者を治療し得る。投与は、血管形成、頚動脈アブレーション、ｒｏｔｏｂｌａｄｅｒまたは臓器移植（例えば心臓、腎臓、肝臓等）のような、他の侵襲的治療に付随し得る、または同時であり得る。

ある実施態様において、荷電リポタンパク質複合体を、コレステロール合成がスタチン系薬剤またはコレステロール合成阻害剤によってコントロールされている患者に投与する。他の実施態様において、荷電リポタンパク質複合体を、結合樹脂、例えばコレスチラミンのような半合成樹脂による、または胆汁酸塩およびコレステロールを捕捉するため、胆汁酸排泄を増加させ、そして血中コレステロール濃度を低下させるために繊維、例えば植物繊維による治療を受けている患者に投与する。

（６．６ 他の使用法）
本明細書中で記載された荷電リポタンパク質複合体および組成物を、例えば診断的目的のために、血清ＨＤＬを測定するためのインビトロにおけるアッセイにおいて使用し得る。ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩおよびＡｐｏペプチドは、血清のＨＤＬ画分に付随するので、荷電リポタンパク質複合体を、ＨＤＬ集団、およびプレ−ベータ１およびプレ−ベータ２ＨＤＬ集団の「マーカー」として使用し得る。さらに、荷電リポタンパク質複合体を、ＲＣＴにおいて有効なＨＤＬの亜集団のマーカーとして使用し得る。このために、荷電リポタンパク質複合体を、患者の血清サンプルに加え得、または混合し得、適当なインキュベーション時間の後、組み込まれた荷電リポタンパク質複合体を検出することによって、ＨＤＬ成分をアッセイし得る。標識荷電リポタンパク質複合体（例えば放射性標識、蛍光標識、酵素標識、色素等）を用いて、または荷電リポタンパク質複合体に特異的な抗体（または抗体断片）を用いたイムノアッセイによって、これを達成し得る。

あるいは、標識荷電リポタンパク質複合体を、循環器系を視覚化するための、またはＲ
ＣＴをモニターするための、またはＨＤＬがコレステロール流出に活性であるべき脂肪線条、アテローム性動脈硬化症の病変等におけるＨＤＬの蓄積を視覚化するためのイメージング手順（例えばＣＡＴスキャン、ＭＲＩスキャン）において使用し得る。

あるプロＡｐｏＡ−Ｉ脂質複合体の調製および特徴付けに伴う例およびデータが、米国特許公開第２００４／００６７８７３号において記載され、その開示は本明細書中でその全体として参考文献に組み込まれる。

あるプロＡｐｏＡ−Ｉ脂質複合体を用いて動物モデルシステムにおいて得られたデータが、米国特許公開第２００４／００６７８７３号において記載され、その開示は本明細書中でその全体として参考文献に組み込まれる。

（７．実施例）
実施例１：プロＡｐｏＡ−Ｉ、スフィンゴミエリン、およびホスファチジルグリセロールの調製
タンパク質プロＡｐｏＡ−Ｉは、Ｕｎｉｔｅ ｄｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｍｅｕｒｉｃｅ、 Ｈｔｅ Ｅｃｏｌｅ Ｌｕｃｉａ Ｄｅ Ｂｒｏｕｃｋｅｒｅ、１ Ａｖｅｎｕｅ Ｅｍｉｌｅ Ｇｒｙｚｏｎ、Ｂ−１０７０ Ａｎｄｅｒｌｅｃｈｔ、 Ｂｅｌｇｉｕｍによって、約９０ｍｇのタンパク質を含む凍結乾燥した個々の１００ｍＬフラスコで供給された。バッチ番号は２００６０２０２であった。タンパク質を、使用まで約４℃で保存した。凍結乾燥前、プロＡｐｏＡ−Ｉの含量は、３．２２５ｍｇ／ｍＬであり、尿素含量は約０．０１１ｍｇ／ｍＬであった。約６３０ｍｇのプロＡｐｏＡ−Ｉを２５．６ｍＬの酢酸／水５％に溶解することによって、プロＡｐｏＡ−Ｉの溶液を作成した。溶液の最終的な濃度は２５ｍｇ／ｍＬであった。

卵由来のスフィンゴミエリン（Ｃｏａｔｓｏｍｅ（登録商標）ＮＭ−１０）は、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１−５６、Ｏｏｈａｍａ−Ｃｈｏ、Ａｍａｇａｓａｋｉ−Ｓｈｉ、６６０−００９５、Ｊａｐａｎによって供給された。バッチ番号は０５０２ＥＳ１であった。スフィンゴミエリンを、使用まで約−２０℃で保存した。スフィンゴミエリンの純度は、９９．１％であった。７９９．４ｍｇの精製スフィンゴミエリンを、１６ｍＬの酢酸／水５％に溶解して、最終的な濃度を５０ｍｇ／ｍＬにすることによって、スフィンゴミエリンの溶液を作成した。

ナトリウム塩としての１，２−ジパルミトイル−ＳＮ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ−Ｎａ、Ｃｏａｔｓｏｍｅ（登録商標）ＭＧ−６０６０ＬＳ）は、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１−５６、Ｏｏｈａｍａ−Ｃｈｏ、Ａｍａｇａｓａｋｉ−Ｓｈｉ、６６０−００９５、Ｊａｐａｎによって供給された。バッチ番号は０３０９６５１Ｌであった。ＤＰＰＧ−Ｎａを、使用まで約−２０℃で保存した。ＤＰＰＧ−Ｎａの純度は、９９．２％であった。４９．１ｍｇのＤＰＰＧ−Ｎａを、１ｍＬの酢酸／水５％に溶解して、最終的な濃度を５０ｍｇ／ｍＬにすることによって、ＤＰＰＧ−Ｎａの溶液を作成した。

実施例２：コントロール無電荷リポタンパク質複合体の調製
プロＡｐｏＡ−Ｉ（３３ｗｔ％）およびスフィンゴミエリン（６７ｗｔ％）から成るコントロール無電荷リポタンパク質複合体を、下記で記載するように調製した。

コントロール無電荷リポタンパク質複合体の処方を、２５ｍｇ／ｍＬのプロＡｐｏＡ−Ｉ５．６ｍＬを、５０ｍｇ／ｍＬのスフィンゴミエリン約５．６ｍＬと、１００ｍＬのガラスフラスコ中で混合することによって調製した。できた混合物を、０．２２μｍのナイロンフィルターを通してろ過した。混合物を約５０℃で加熱し、そして次いで手で攪拌しながら液体窒素中で凍結した。凍結の直後、フラスコを凍結乾燥器に１５時間置いた。凍結乾燥後、フラスコを約４０℃で４時間減圧下に置いた。できた処方を、使用まで約４℃で保存した。

１４０ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３を含む１４ｍＬの溶液を、コントロール無電荷リポタンパク質複合体の凍結乾燥処方を含むガラスフラスコに加えた。できた溶液を、２０ｍＬの溶液中の１Ｍ ＮａＯＨを０．７５ｍＬ加えることによって塩基性ｐＨに調整した。溶液を手で攪拌し、約５０℃で加熱し、そして次いで少なくとも１時間超音波槽に置いた。できた処方中のプロＡｐｏＡ−Ｉの濃度は、１０ｍｇ／ｍＬであった。処方をＨＰＬＣシステムに注入して、無電荷リポタンパク質複合体の存在を確認した。図１は、本明細書中で記載されたように作成した無電荷リポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムの例を提供する。

実施例３：テスト荷電リポタンパク質複合体の調製
プロＡｐｏＡ−Ｉ（３３ｗｔ％）、スフィンゴミエリン（６５ｗｔ％）、およびホスファチジルグリセロール（２ｗｔ％）から成る荷電リポタンパク質複合体を、下記で記載するように調製した。

荷電リポタンパク質複合体の処方を、２５ｍｇ／ｍＬのプロＡｐｏＡ−Ｉ５．６ｍＬを、５０ｍｇ／ｍＬのスフィンゴミエリン約５．６ｍＬ、および５０ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＧ−ＮＡ約０．１５ｍＬと、１００ｍＬのガラスフラスコ中で混合し、そして次いでできた混合物を０．２２μｍのナイロンフィルターを通してろ過することによって調製した。混合物を約５０℃で加熱し、そして手で攪拌しながら液体窒素中で凍結した。凍結の直後、フラスコを凍結乾燥器に１５時間置いた。凍結乾燥後、フラスコを約４０℃で４時間減圧下に置いた。できた処方を、使用まで約４℃で保存した。

１４ｍＬの１４０ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３を、上記で記載した凍結乾燥処方を含むガラスフラスコに加えた。できた溶液を、２０ｍＬの溶液中１ＭのＮａＯＨを０．７５ｍＬ加えることによって塩基性ｐＨに調整した。溶液を手で攪拌し、約５０℃で加熱し、そして次いで少なくとも１時間超音波槽に置いた。できた処方中のプロＡｐｏＡ−Ｉの濃度は、１０ｍｇ／ｍＬであった。処方をＨＰＬＣシステムに注入して、非荷電リポタンパク質複合体の存在を確認した。図２は、本明細書中で記載されたように作成した荷電リポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムの例を提供する。

実施例４：動物モデルシステム
３から４ｋｇの間のＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄオスウサギを、上記で記載した無電荷および荷電複合体によるコレステロールの可動化を試験するために使用した。動物は、ＣＥＧＡＶ、Ｆｒａｎｃｅによって供給され、そして個々に独特の耳の刺青で同定された。ウサギを、Ａｖｏｇａｄｒｏ（Ｆｒａｎｃｅ）動物施設で、個々のケージに収容した。動物の収容場所および世話は、Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ８６／６０９／ＥＥＣの勧告に従った。Ａｖｏｇａｄｒｏの動物施設は、Ｆｒｅｎｃｈ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓから得た協定番号Ｂ３１１８８０１を有する。Ａｖｏｇａｄｒｏにおける一般的な実施および現在の標準的な操作手順（ＳＯＰ）に従って、全ての動物を同様に、健康に注意を払って管理した。

動物室の条件は以下のようであった：温度：２２±２℃、相対湿度：５５±１５％、および１２時間の光／１２時間の闇のサイクル。温度および相対湿度を毎日記録し、そして研究の生データと共に保存した。各ウサギを１日１回観察し、あらゆる異常な発見を観察したように記録し、そしてＳｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒに報告した。

研究の開始前少なくとも７日間、動物を順応させた。動物に、毎日コントロールされたペレットの食餌を自由に与えた。水は、研究を通して自由に摂取可能であった。

複合体を投与する前に、動物を一晩絶食させた。複合体の投与直前に動物の体重を測定した。複合体を、１．５ｍＬ／ｋｇに対応する、１５ｍｇ／ｋｇの投与量比率で静脈内投与した。投与した容積は、体重に基づいた。複合体の投与の約６時間後に摂食を再開した。記録した治療の詳細は、投与量の計算、投与した投与量、日付、および投与時間を含んでいた。

血液サンプルの採取前に、動物を一晩絶食させた。血液サンプルを、頚静脈または耳の辺縁静脈から採った。ＥＤＴＡを含む針を装着したシリンジを用いて、血液を頚静脈から採った（サンプリング時間あたり約１ｍＬの血液）。採取後すぐ、血液サンプルを約４℃に保って血液サンプルの変質を避けた。血液試料を遠心した（約５℃で、３５００ｇで１０分間）。血漿試料を分離およびアリコートに分け（少なくとも２００μＬの３つのアリコート（アリコートＡ、Ｂ、Ｃ））、そして約−８０℃で保存した。残った血液塊は廃棄した。

実施例５：荷電リポタンパク質複合体はコレステロールを可動化する
コントロールリポタンパク質複合体（処方ＩＩＡ）または荷電リポタンパク質複合体（処方ＩＩＢ）を、上記で記載されたように調製し、そしてグループあたり２匹のウサギに投与した（１５ｍｇの複合体／ｋｇ体重）。

血液サンプル（１ｍｌ）を、投与前、投与の５分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間および６時間後に採った。血漿サンプルを、発表された方法（例えばＵｓｕｉ，Ｓ．ら、２００２、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４３：８０５−１４を参照のこと）によって、全コレステロール、遊離コレステロールおよびトリグリセリドに関して分析した。エステル化されたコレステロールの濃度を、全コレステロール含量から遊離コレステロール含量を引くことによって計算した。各動物に関するＨＤＬ結果中の遊離コレステロールを図３に図示する。コントロールグループ（グループＩＩＡ）およびテストグループ（グループＩＩＢ）を構成する２匹の動物の平均値を、図４に図示する。

予測されたように、コントロールおよびテストリポタンパク質複合体はどちらもコレステロールを可動化し、テストグループの平均がコントロールグループの平均と比較して増加した可動化を示した。

全ての引用された文献は、個々の出版物、特許または特許申請それぞれが、明確におよび個々に、全ての目的のためにその全体として本明細書中で参考文献に組み込まれることが示されたように同じ程度、その全体としておよび全ての目的のために本明細書中で参考文献に組み込まれる。

あらゆる出版物の引用は、提出日より前の開示に関するものであり、そして本発明が以前の発明によってそのような出版物に先立つ権利がないことを承認するとは解釈されない。

当業者に明らかであるように、本発明の多くの修飾およびバリエーションが、その意図および範囲から離れることなくなされ得る。記載された特定の実施態様は、例のためにのみ提供され、そして本発明は、そのような請求が権利のある同等物の全範囲とともに、添付の請求の用語によってのみ制限される。

Claims (20)

1. ＡｐｏＡ−Ｉアポリポタンパク質画分および脂質画分を含む、再構築された荷電リポタンパク質複合体であって、該脂質画分は、スフィンゴミエリンおよび合計０．２〜１０ｗｔ％（ただし３ｗｔ％を除く）の量の１種以上の負に荷電したリン脂質からなり、該脂質画分の、該ＡｐｏＡ−Ｉアポリポタンパク質画分に対するモル比は、２：１〜２００：１の範囲内である、再構築された荷電リポタンパク質複合体。
2. 前記負に荷電したリン脂質の合計は０．２〜７ｗｔ％である、請求項１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
3. 前記負に荷電したリン脂質の合計は０．２〜４ｗｔ％である、請求項１に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
4. 前記負に荷電したリン脂質は、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸およびこれらの混合物より選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
5. 前記スフィンゴミエリンは、Ｄ−エリトロース−スフィンゴミエリンおよび／またはＤ−エリトロース−ジヒドロスフィンゴミエリンを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
6. 前記スフィンゴミエリンおよび／または負に荷電したリン脂質のアシル鎖は、各々互いに独立して、６〜２４個の炭素原子を含む、飽和炭化水素、モノ不飽和炭化水素およびポリ不飽和炭化水素から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
7. 前記スフィンゴミエリンおよび荷電したリン脂質のアシル鎖は、同じ数の炭素原子を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
8. 前記スフィンゴミエリンおよび荷電したリン脂質のアシル鎖は、異なる飽和の程度を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
9. 前記ＡｐｏＡ−Ｉアポリポタンパク質は、成熟ヒトＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉ_{Ｍｉｌａｎｏ}、およびＡｐｏＡ−Ｉ_{Ｐａｒｉｓ}ならびにこれらの混合物より選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
10. 前記ＡｐｏＡ−Ｉアポリポタンパク質は、モノマーの形態である、請求項９に記載の再構築された荷電リポタンパク質複合体。
11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の荷電リポタンパク質複合体および薬学的に許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤を含む、ＨＤＬ遊離コレステロールを増加させるための医薬組成物。
12. 炎症、アルツハイマー病、脳卒中、虚血発作、一過性虚血発作、心筋梗塞、狭心症、腎血管性高血圧、腎血管不全、間欠性跛行、重症虚血肢、休息痛、壊疽、冠動脈心疾患、冠動脈疾患、急性冠動脈症候群、心血管疾患、高血圧、再狭窄、血管疾患、血管周囲疾患、脂質代謝異常障害、異リポタンパク血症、高レベルの低密度リポタンパク質コレステロール、高レベルの超低密度リポタンパク質コレステロール、低レベルの高密度リポタンパク質、高レベルのリポタンパク質Ｌｐ（ａ）コレステロール、高レベルのアポリポタンパク質Ｂ、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、家族性複合型高脂血症、およびリポタンパク質リパーゼ欠損症からなる群より選択される、被験体における脂質代謝異常または脂質代謝異常に関連する疾患を処置するための組成物であって、該組成物は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の荷電リポタンパク質複合体を含む、組成物。
13. 前記リポタンパク質リパーゼ欠損症が、高トリグリセリド血症、低アルファリポタンパク血症、および高コレステロール血症からなる群より選択される、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記脂質代謝異常に関連する疾患が、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈症候群、心筋梗塞、狭心症または脳卒中からなる群より選択される、請求項１２に記載の組成物。
15. 前記組成物中に存在する前記荷電リポタンパク質複合体の量は、前記被験体の遊離のアポリポタンパク質または複合体化アポリポタンパク質の血清レベルをベースラインレベルと比較して１０〜３００ｍｇ／ｄＬ上昇させるために有効である、請求項１２に記載の組成物。
16. 前記組成物中に存在する前記荷電リポタンパク質複合体の量は、注射１回あたり１〜１００ｍｇ／ｋｇ ＡｐｏＡ−Ｉ当量の範囲におよぶ、請求項１２に記載の組成物。
17. 前記組成物が静脈内投与されることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
18. 脂質代謝異常を処置するための、請求項１２に記載の組成物。
19. 前記組成物が、胆汁酸樹脂、ナイアシン、スタチンおよび／またはフィブラートと一緒に投与されることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
20. 薬学的に許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。