JP5534297B2 - シトクロム由来のヘム鉄を含む鉄補給又は鉄強化用製剤 - Google Patents
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Description
[態様1]
シトクロム由来のヘム鉄を含む鉄補給又は鉄強化用製剤。
[態様2]
シトクロムが細胞外分泌型シトクロムbである、態様1に記載の製剤。
[態様3]
細胞外分泌型シトクロムbが糸状菌に属する菌由来である、態様1又は2に記載の製剤。
[態様4]
糸状菌がアスペルギルス属の菌である、態様3記載の製剤。
[態様5]
アスペルギルス属の菌がアスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・オリゼ、又はアスペルギルス・ニガーである、態様4記載の製剤。
[態様6]
シトクロムを構成するポリペプチドが以下の(a)、(b)又は(c)のポリペプチドから成る、態様1記載の製剤:
(a) 配列番号2又は配列番号4で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド;
(b) 配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されたアミノ酸配列から成るポリペプチド;又は
(c) 配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチド。
[態様7]
シトクロムの蛋白質分解酵素による分解物である、態様1ないし6のいずれか一項に記載の製剤。
[態様8]
食品添加剤である、態様1ないし7のいずれか一項に記載の製剤。
[態様9]
態様1ないし7のいずれか一項に記載の製剤を含む食品組成物。
[態様10]
態様1ないし7のいずれか一項に記載の鉄補給又は強化用製剤の製造方法であって、シトクロムを蛋白質分解酵素で処理して分解しヘム鉄を調製することを含む、該製造方法。
(a) 配列番号2又は配列番号4で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド;
(b) 配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されたアミノ酸配列から成るポリペプチド;又は
(c) 配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列と70%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチド。尚、これらポリペプチドはヘムB(プロトヘムIX)を補欠分子族として含有できるものである。
(d)配列番号1又は配列番号3に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(e)塩基配列(d)から成るポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は
(f)塩基配列(d)から成るポリヌクレオチドと70%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
また、遺伝子組換え技術以外にも、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・オリゼ、又はアスペルギルス・ニガーに対して、古来から知られている菌株改良の手法、例えば変異処理後、細胞外分泌型シトクロムbの高生産菌株を選択するという手法、及び/又は、培養条件の検討によってシトクロムbの生産性を向上させるという手法もある。
遺伝子組換え微生物でシトクロムbを取得した場合、又は変異処理等で得られた微生物でシトクロムbを取得した場合のどちらの方法においても、培養液をそのまま、又は精製をして使用することができるが、本発明においては、その生産方法は限定されない。
1)培養
パインデックス2%(松谷化学工業社製)(W/V)、トリプトン1%(BD社製)(W/V)、リン酸二水素カリウム0.5%(ナカライテスク社製)(W/V)、硫酸マグネシウム七水和物0.05%(W/V)(ナカライテスク社製)および水からなる液体培地150mLを、500mL容の坂口フラスコに入れ、シリコセンで栓をした後、121℃、20分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に対して、アスペルギルス・テレウスNIH2624株、及びアスペルギルス・オリゼ RIB40株をそれぞれ別々に接種し、30℃で62時間振とう培養したものを培養液とした。
2)Total RNA抽出
実施例1−1)に記載の方法によって培養したそれぞれの湿菌体2gを液体窒素によって凍結後、illustra RNAspin Mini Kit(GEヘルスケア社製)を用いて、0.1mgのTotal RNAを抽出した。
3)cDNAライブラリーの調製
抽出したそれぞれのTotal RNAから、逆転写酵素およびアダプター付きオリゴdTプライマーを用いた逆転写反応によりcDNAライブラリーを調製した。反応にはPrime Script RT-PCR Kit(TAKARA社製)を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。
4) 細胞外電子伝達タンパク質の大腸菌へのサブクローニング
以下の表1に示した2組のプライマーを合成し、それぞれを実施例1−3)で調製したアスペルギルス・テレウスNIH2624株、及びアスペルギルス・オリゼ RIB40株のcDNAライブラリーに対して、PCR法により細胞外電子伝達タンパク質の構造遺伝子領域を増幅した。それぞれのカビからのTotal-RNA抽出およびcDNA合成は常法に従った。PCRプライマーとして、フォワード側に制限酵素BglIIで認識される配列(四角枠内)を付加したプライマー(AT Cytb Bgl2_F、AO Cytb Bgl2_F)をデザインし、リバース側にそれぞれXhoIとNcoIで認識される配列(四角枠内)を付加したプライマー(AT Cytb Xho1_R、AO Cytb Nco1_R)をデザインした。
なお、PCRは、市販のポリメラーゼpfu ultra(STRATAGENE社製)を使用し、反応条件は〔94℃/2分→(94℃/30秒→55℃/30秒→72℃/1分)×30サイクル〕とした。
なお、本ベクターは文献1(アスペルギルス属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、38、12、P831-838、2000)に記載してある、アスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモータを使用し、目的遺伝子が発現可能なベクターを調製した。
これらの発現用ベクターを大腸菌JM109株に導入して形質転換した。Illustra plasmidprep Mini Flow Kit(GEヘルスケア社製)を用いて、得られた形質転換体のうちそれぞれ3クローンずつよりプラスミドを抽出し、インサートの配列解析をおこなったところ、全てのプラスミドで目的の遺伝子が確認できた。
5)
しかしながら、取得したアスペルギルス・テレウスNIH2624株由来の遺伝子が公開配列(配列番号1)と比べて10塩基欠失していたため、欠失箇所を含む周辺275塩基を人工合成し、アスペルギルス・テレウスNIH2624株由来細胞外電子伝達タンパク質遺伝子の該当箇所に挿入した。作製した遺伝子断片は実施例1−4)記載の方法と同様にして、大腸菌にクローニングした後、遺伝子解析を行った結果、公開配列と同じ目的の遺伝子が取得できた。
なお、本発明により取得したアスペルギルス・テレウスNIH2624株、及びアスペルギルス・オリゼRIB40株由来の細胞外電子伝達タンパク質の遺伝子配列及びアミノ酸配列を配列番号1及び2、並びに、配列番号3及び4に夫々示す。
1)カビの形質転換と目的タンパク質の発現確認
実施例1−4)及び5)で調製した発現用ベクターを用いて、公知文献1、3(清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、P494−502、2000)に記載の方法に準じて、細胞外電子伝達タンパク質を生産する組み換えカビをそれぞれ作製した。
なお、使用する宿主カビは公知文献2(BioSci. Biotech. Biochem., 61(8), 1367-1369, 1997)にあるように、1997年(平成9年)に醸造試験場で育種され、転写因子の解析、各種酵素の高生産株の育種などに利用され、分譲されているものが入手可能である。
Czapek-Dox固体培地で形質転換体を選択した後、実施例1−1)に記載の液体培地10mLを太試験管(22mm×200mm)に入れて、形質転換を植菌し、30℃で62時間振とう培養した。培養終了後、培養上清を遠心(3,000×g、20分)し、沈殿を取り除いたものを粗タンパク質サンプルとした。粗タンパク質を15.0%ポリアクリルアミドゲルを使用しLaemmLiらの方法に従い、SDS-PAGEによる分析を実施した。泳動後にCBB染色し、移動度を分子量マーカー(GEヘルスケア社製のLMW Marker)のそれと比較して目的タンパク質の発現を確認したところ、分子量約30kDaのところに目的タンパク質の発現が確認された。
パインデックス2%(松谷化学工業社製)(W/V)、トリプトン1%(BD社製)(W/V)、リン酸二水素カリウム0.5%(ナカライテスク社製)(W/V)、硫酸マグネシウム七水和物0.05%(W/V)(ナカライテスク社製)および水からなる液体培地150mLを、500mL容の坂口フラスコに入れ、シリコセンで栓をした後、121℃、20分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に実施例3で作製した組み換えカビをそれぞれ接種し、30℃で62時間振とう培養したものを種培養液とした。
3)本培養
パインデックス2%(松谷化学工業社製)(W/V)、トリプトン1%(BD社製)(W/V)、リン酸二水素カリウム0.5%(ナカライテスク社製)(W/V)、硫酸マグネシウム七水和物0.05%(W/V)(ナカライテスク社製)、消泡剤および水からなる液体培地3.5LをpH6.0に調製し、5L容のジャーファメンターに入れた。121℃、20分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、上記1)で調製した培養液45mLをそれぞれ別々に接種し、30℃で62時間、通気撹拌の条件で培養した。培養液をろ過して得た培養上清を粗タンパク質溶液として使用した。
上記培養液からさらに、以下4)‐6)により細胞外分泌型シトクロムbと思われる細胞外電子伝達タンパク質をそれぞれ単離精製した。
4)濃縮・脱塩
粗タンパク質溶液を分画分子量10000の限外ろ過膜「ペリコン2モジュール」(ミリポア社製)で濃縮し、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に置換して、粗タンパク質濃縮液を調整した。
前記粗タンパク質液を、60% 飽和硫酸アンモニウム液(pH7.5)になるように調整後、遠心分離し得られた上清を、60% 硫酸アンモニウムを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化したButyl-TOYOPEAL650Mカラムに通液して目的タンパク質を吸着させ、同緩衝液で洗浄したのち、60%‐30% の硫酸アンモニウム濃度でのグラジエント溶出法でタンパク質を溶出させた。目的画分については、350nm‐600nmのスペクトル解析を行い、シトクロムb562に特徴的な562nmにおける還元スペクトルが観察されたものについて回収した。
7)DEAE-セルロファインA-500(生化学工業社製)による精製
前記活性画分を限外濾過膜「ペリコン2モジュール」で濃縮し、脱塩後5mM トリス・塩酸緩衝液(pH8.0)と平衡化させ、前記緩衝液で平衡化したDEAE-セルロファインA-500に吸着させ、同緩衝液で洗浄したのち、同緩衝液と0.2MNaClを含む同緩衝液でグラジエント溶出法でタンパク質を溶出させて、目的画分を集めた。得られた精製タンパク質を、15.0%ポリアクリルアミドゲルを使用しLaemmLiらの方法に従い、SDS-PAGEによる分析を実施した。泳動後にCBB染色し、移動度を分子量マーカー(GEヘルスケア社製のLMW Marker)のそれと比較した結果、単一(分子量約30kDa)になっていることが確認できた。
(1)赤色を呈している。
(2)シトクロムb562に特徴的な吸収スペクトル(427、531、562nm)を有する。
(3)公知文献4(Simultaneous Determination of Hemes a,b,and c from Pyridine Hemochrome Spectra, Analytical Biochemistry 161,1-14(1987))に記載の手法で吸収スペクトルを測定した結果、ヘモクロームbの吸収スペクトルと同一の556nm近傍に特徴的な吸収極大が認められる。
実施例2にて取得した、ヘムを含んだタンパク質を含む水溶液に市販のプロテアーゼ(アルカラーゼ(ノボザイムズ))を添加して、55℃、2時間作用させ、80℃、30分の熱処理によって、ヘム鉄を含む画分を沈殿物として回収した。この画分を0.05N−NaOHの弱アルカリ溶液で溶解することにより、可溶化した、蛋白質分解酵素による分解物であるヘム鉄を取得することができた。
実施例3で取得したヘム鉄を含んだ分解物(ヘムタンパク質)の食品への添加例を以下に示す。
1)タブレット
含水結晶ブドウ糖 100g、炭酸カルシウム 5g、シュガーエステル 1g、香料 0.5gに、ヘムタンパク質 1gを混合した後、打錠機により加圧成型して、鉄強化タブレットを得た。
2)クッキー
薄力粉 200g、バター 120g、グラニュー糖 80g、卵黄 1 個に、ヘムタンパク質 0.5gを混合し、これをオーブンで180℃ 、10 分間焼き上げ、鉄強化クッキーを得た。
3)ふりかけ
いりごま 100g、味付けごま 100g、味付け削り節 100g、味付けのり 100 に、ヘムタンパク質10gをよく混合して、鉄強化ふりかけを得た。
4)飴
上白糖 100g、水飴 100gを少量の水に溶解し、減圧下130℃で煮詰めた。その後、ヘムタンパク質 1g、クエン酸 1gを添加した後、冷却して鉄強化飴を得た。
5)飲料
異性化糖20g、クエン酸0.5g、香料0.1g、ヘムタンパク質0.05gを混合し、水で総量100gにして、容器に充填。加熱殺菌後、冷却することで鉄強化飲料を得た。
Claims (5)
- 以下の(a)、(b)又は(c)のポリペプチド:
(a) 配列番号2又は配列番号4で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド;
(b) 配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されたアミノ酸配列から成るポリペプチド;又は
(c) 配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチド:
から構成される細胞外分泌型シトクロムb由来のヘム鉄を含む鉄補給又は鉄強化用製剤。 - ヘム鉄が細胞外分泌型シトクロムbの蛋白質分解酵素による分解物である、請求項1に記載の製剤。
- 食品添加剤である、請求項1又は2記載の製剤。
- 請求項1ないし3のいずれか一項に記載の製剤を含む食品組成物。
- 請求項1ないし3のいずれか一項に記載の鉄補給又は強化用製剤の製造方法であって、請求項1に記載の細胞外分泌型シトクロムbを蛋白質分解酵素で処理して分解しヘム鉄を調製することを含む、該製造方法。
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