JP5522636B2

JP5522636B2 - イオン交換クロマトグラフィーによる血液中のカイロミクロン（ｃｍ）の分離方法、および、メタボリックシンドロームの識別方法

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Publication number: JP5522636B2
Application number: JP2011177582A
Authority: JP
Inventors: 毅山下; 博吉田; 秀夫黒澤; 祐史廣渡
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2011-08-15
Filing date: 2011-08-15
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2027-02-23
Also published as: JP2011227101A

Description

本発明は、血液中に微量に含まれるカイロミクロン（ＣＭ）の分離方法、並びに血液中のリポ蛋白中のコレステロール値を指標としたメタボリックシンドロームの識別方法に関する。

血液中のリポ蛋白には、健康な人においても、比較的多く量が存在するリポ蛋白として、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）があり、健康な人では微量であるが、家族性高脂血症などの疾患患者の血液中に多く存在する中間型リポ蛋白（ＩＤＬ）、食後一過性に増加するリポ蛋白であるカイロミクロン（ＣＭ）がある。また、Ｌｐ（ａ）と呼ばれる微量に存在するリポ蛋白もある。ＣＭは、微量なリポ蛋白ではあるが、カイロミクロンレムナントと呼ばれる動脈硬化性疾患に対する高いリスクとなるリポ蛋白が含まれており、近年、重要視されつつあるリポ蛋白である（非特許文献１）。

このように、ＣＭは、微量ではあるが、動脈硬化性疾患に対するリスクファクターとして重要なリポ蛋白ではある。
ＣＭの分離分析方法としては、超遠心分離装置（非特許文献２）、電気泳動（非特許文献３）、ゲルろ過クロマトグラフィー（非特許文献４）による方法があるが、超遠心分離装置は高価な装置であり汎用性に乏しく、更にＣＭの比重は水より軽いため、浮上時間により分離しなければならないため高度な手技を必要とする。電気泳動による分離の場合、ＣＭは電荷をほとんど有しないため、原点に位置し、血液中の薬物などの不純物の影響を受けやすく分析精度が低いという問題点がある。ゲルろ過クロマトグラフィーの場合において、ＣＭはゲルの細孔径に入らずにボイドの位置に溶出する。ゲルの細孔径は、製造ごとにある程度差が生じてしまうことは避けられず、このゲルの細孔径の差がＣＭの分離に影響を及ぼすために、測定精度が低下するという問題点がある。

また、本発明者らは、以前に陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて血液試料中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの５つのリポ蛋白を分離する方法（非特許文献５）を確立しているが、この方法ではＣＭとＬｐ（ａ）が同時に溶出するため、ＣＭの正確な量を把握することが困難であった。

メタボリックシンドロームは２００５年に診断基準が定められた心筋梗塞や脳梗塞などの動脈硬化性疾患のリスクの高い内臓脂肪が増加する疾患である。その診断基準は、下記である。
１．ウエスト周囲径が男性８５ｃｍ以上、女性９０ｃｍ以上であること。
２．ウエスト周囲径に加えて、次の３項目のうち、２項目以上が当てはまる。
(i)脂質：中性脂肪１３０ｍｇ／ｄＬ以上かつ／または、ＨＤＬコレステロール４０ｍｇ／ｄＬ未満
(ii)血圧：収縮期血圧１３０ｍｍＨｇ以上かつ／または、拡張期血圧８５ｍｍＨｇ以上
(iii)血糖値：空腹時血糖値１１０ｍｇ／ｄＬ以上

以上のようにメタボリックシンドロームは複数の検査により診断するのであるが、それは煩雑であり、この診断基準以外に簡便に判別する方法が望まれている。また、メタボリックシンドロームは、新しい疾患でその治療法は現在発展途上にあり、治療法を研究する上でも、簡便な判別方法の確立は非常に重要である。

ＭｏｎｉｃａＧら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｔｈｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓａｎｄＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，１０（２００３），ｐ１３２．ＣａｓｌａｋｅＭＪら、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＴｅｓｔｉｎｇ２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ、ＡＡＣＣ（２０００），ｐ６２５．山本章ら、血清脂質その臨床、基礎、分析法、中外医学社（１９８１）、ｐ３８４．ＯｋａｚａｋｉＭら、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＴｅｓｔｉｎｇ２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ、ＡＡＣＣ（２０００），ｐ６４７．ＨｉｒｏｗａｔａｒｉＹら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，４４（２００３），ｐ１４０４．ＵｓｕｉＳら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，４３（２００２），ｐ８０５．ＲｙｕＭら、ＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎＪｏｕｒｎａｌ，６８（２００４），ｐ９７５．

上記のように、血液中に微量に含まれるリポ蛋白であるＣＭを分離することは重要であるが、その分離能力が充分、かつ簡便な測定方法がこれまでなかった。本発明の目的は、高価な測定方法や、特別なカラムがなくても、簡便で充分にＣＭを分離することが出来る方法を提供することにある。
また、ＣＭ、または、ＶＬＤＬの中に含まれるコレステロール値を測定することにより、簡便に行えるメタボリックシンドロームの判別法を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討の結果として、本発明を完成するに至った。
すなわち、血液中のＣＭを分離する方法として、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、血液中の微量に存在するＣＭとＬｐ（ａ）を吸着させるための溶離液（溶離液１）、ＣＭを溶出するための溶離液（溶離液２）の塩濃度の異なる溶離液を１、２の順に陰イオン交換カラムに流すことにより、当該陰イオン交換カラムからＣＭを分離し、溶出する方法で、溶離液１は塩濃度が１８０ｍｍｏｌ／Ｌから２００ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液２の塩濃度が２１０ｍｍｏｌ／Ｌから２８０ｍｍｏｌ／Ｌの２つの塩濃度の異なる溶離液を用いることにより、使用する陰イオン交換カラムによって血液試料中に含まれるＣＭを分離溶出する方法を発明した。
また、非特許文献５の方法と本発明を用いることで、血液試料中に存在するＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、Ｌｐ（ａ）の６つのリポ蛋白を順に分離し溶出する方法を確立し、下記の２つのグループの血液試料を測定したところ、メタボリックシンドロームの識別のために血液中のＣＭが含むコレステロール値と血液中のＶＬＤＬが含むコレステロール値が優れていることを見出した。
１．メタボリックシンドローム患者（８名）
２．健常者（１４名）

本発明は、血液中に含まれるリポ蛋白であるＣＭを良好に分離する方法を提供する。そして、ＣＭ、または、ＶＬＤＬの中に含まれるコレステロール値を測定することにより、簡便に行えるメタボリックシンドロームの判別法を提供する。

実施例に用いた装置。実施例１の結果（健常人血清）。実施例１の結果（ＣＭ試料）。実施例２の結果（健常人血清および超遠心分離装置により得られた各リポ蛋白画分）。実施例２の結果（健常人血清を液体クロマトグラフィーで分離した試料のウエスタンブロッティング解析）。実施例３の結果メタボリックシンドロームと健常人の比較（アディポネクチン）。実施例３の結果メタボリックシンドロームと健常人の比較（ＨＤＬコレステロール）。実施例３の結果メタボリックシンドロームと健常人の比較（ＬＤＬコレステロール）。実施例３の結果メタボリックシンドロームと健常人の比較（ＩＤＬコレステロール）。実施例３の結果メタボリックシンドロームと健常人の比較（ＶＬＤＬコレステロール）。実施例３の結果メタボリックシンドロームと健常人の比較（ＣＭコレステロール）。実施例３の結果メタボリックシンドロームと健常人の比較（Ｌｐ（ａ）コレステロール）。

以下に本発明について、詳細に説明する。
上述したように、血液中に微量に存在するＣＭは動脈硬化性疾患と密接な関連性があり、これらのリポ蛋白の分離・分析方法は、動脈硬化性疾患の研究を進める上で、重要である。また、メタボリックシンドロームは、動脈硬化性疾患の高いリスクとなる重要な疾患であり、ＣＭまたはＶＬＤＬの中に含まれるコレステロール値を指標とするメタボリックシンドロームの簡便な判別法の提供は、メタボリックシンドロームあるいは動脈硬化性疾患の進展を研究する上で重要である。

ＣＭの分離分析法としては、超遠心分離装置を用いた方法が一般的ではあるが、装置が高価で、手技も難しい。また、ゲルろ過クロマトグラフィーや電気泳動によっても可能であるが、測定精度が悪い。

陰イオン交換クロマトグラフィーによるリポ蛋白の分離は、一般的な液体クロマトグラフィーの装置を用いて実施が可能で、分離した後にコレステロールと反応する市販の酵素液（例えば、総コレステロールＥテストワコー、和光純薬株式会社製、または、総コレステロール測定用ＴＣＨＯ−ＣＬ、セロテック社製）と混合して反応させ可視光検出器で測定することが出来て、簡便で定量性も良いことが知られている（非特許文献５）。我々は、この陰イオン交換クロマトグラフィーにより、ＣＭの分離を試みた。２つの溶離液を用いたステップ溶出により、十分な分離を実現した。検討には、健常人の血清（血液試料Ａ）、超遠心分離法で分離したＣＭ試料（ＣＭの含量が約８０％の試料）（比重＜０．９４ｇ／ｍＬ）を用いた。２つの溶離液を用いたステップ溶出の条件で測定した結果として、ＣＭ試料では、その７６％のＣＭ画分が溶離液２により溶出され、健常人血清では、ＣＭコレステロール値が０．３６ｍｇ／ｄＬとなった（実施例１、図２〜３）。

使用する陰イオン交換カラムに充填されるゲルとしては、シリカ系やポリマー系のゲルにジアミノエチル（ＤＥＡＥ）基や第４級アミノエチル（ＱＡＥ）基が結合したもの、また、そのゲルの表面に１０００オングストローム程度の孔があるもの（多孔質）と孔がないもの（非多孔質）があるが、好ましくはリポ蛋白に対して分離性能の高い非多孔質のタイプ、例えばポリマー系の非多孔質タイプの表面にＤＥＡＥ基を持つゲルをカラムに充填したＴＳＫ−ＧＥＬＤＥＡＥ−ＮＰＲ（東ソー株式会社製）が挙げられる。溶離液は、リポ蛋白の分離能力が高い過塩素酸ナトリウムなどのカオトロピックイオンを含んだ溶離液が望ましい。ＣＭを含む対象となる血液試料としては、血清試料や、ＥＤＴＡやヘパリンなどの抗凝固剤を添加して得られた血漿試料が望ましい。

分離に使用する塩濃度の異なる溶離液１、２は、塩濃度の低い順にカラムに流す。この２種類の溶離液の役割としては、溶離液１はＣＭとＬｐ（ａ）を吸着させ、それら以外のリポ蛋白を溶出させ、溶離液２はＣＭだけを溶出させることにある。また、ＣＭの性状（構成物質の含量比率）には、均一ではなく幅があることが知られており（非特許文献２）、溶離液１と２の間に、更に新たな塩濃度を加えたり、分離溶出する条件として、段階的に溶離液を高める条件を加えたりして、ＣＭを複数のピークに分離しても良い。また、溶離液１では、ＣＭとＬｐ（ａ）以外のリポ蛋白であるＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬを溶出するのであるが、溶離液１の前に新たな塩濃度を加えたり、分離溶出する条件として、段階的に溶離液を高める条件を加えたりして、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬなどを分離分析する条件を加えても良い（図４）。

使用する溶離液１、２の塩濃度は、ＣＭを分離する目的として、溶離液１については、ＣＭとＬｐ（ａ）以外のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬのリポ蛋白を溶出させる塩濃度として、１８０ｍｍｏｌ／Ｌから２００ｍｍｏｌ／Ｌが適切である。溶離液２としては、ＣＭを溶出させ、Ｌｐ（ａ）を溶出させない溶離液の塩濃度として、２１０ｍｍｏｌ／Ｌから２８０ｍｍｏｌ／Ｌが適切である。なお、測定に用いている陰イオン交換カラムは１検体ごとに吸着しているリポ蛋白をすべて溶出してから、次の検体の測定に供するのが好ましい。陰イオン交換カラムに吸着力が最も強いリポ蛋白としてＬｐ（ａ）が知られており、このＬｐ（ａ）は塩濃度３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上で溶出可能であるので、吸着しているリポ蛋白をすべて溶出するために用いる溶離液（以下、カラム洗浄液）は、塩濃度３１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であればよい。カラム洗浄液の塩濃度に上限はないが、溶離液の作成などの取扱いを考えると７００ｍｍｏｌ／Ｌまでが適当である。また、使用するカラムや溶離液に入れる塩の種類により若干ことなるが、最も好ましい条件は、ＤＥＡＥ基をもつ非多孔質のポリマー系のゲルを充填したカラムを用い、そのカラムに用いる溶離液に過塩素酸ナトリウムを含み、溶離液１の塩濃度は１９０ｍｍｏｌ／Ｌから１９５ｍｍｏｌ／Ｌ、溶離液２の塩濃度は２４５ｍｍｏｌ／Ｌから２７５ｍｍｏｌ／Ｌである。溶離液を流す量は、使用するカラムや溶離液に入れる塩の種類により若干ことなるが、溶離液１、２をそれぞれカラム容量の６倍以上が適当である。

好ましい塩としては、上述のとおり過塩素酸ナトリウムが使用されるが、その他、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化カリウムなどが上げられる。また、溶離液の塩濃度とは加えた試薬の解離しているイオンの塩濃度であり、過塩素酸ナトリウムの場合には、ほぼ１００％が解離しているので、過塩素酸ナトリウムを１００ｍｍｏｌ／Ｌ入れた場合には、その塩濃度は１００ｍｍｏｌ／Ｌとなる。緩衝液に依存する塩濃度はその試薬の解離定数から算出するが、実施例で使用した５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス緩衝液はｐＨ７．５のときの解離した分子の濃度（塩濃度）は、トリスのｐＫａ＝８．１から算出すると約４０ｍｍｏｌ／Ｌとなる。

使用する溶離液には、緩衝液を加え、ｐＨを６から９に調製することが好ましい。加える緩衝液の種類としては、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などが上げられる。
分離した各リポ蛋白のフラクション（ＣＭとＬｐ（ａ）以外のリポ蛋白のフラクション、ＣＭのフラクション、Ｌｐ（ａ）のフラクション）の検出方法としては、それぞれのフラクションを試験管に取得して、それぞれの中のリポ蛋白を構成する成分を測定することが出来る。リポ蛋白を構成する成分とその測定法の例としては、コレステロール；コレステロールオキシダーゼを用いた呈色試薬で測定する方法、中性脂肪；リポプロテインリパーゼを用いた呈色試薬で測定する方法、リン脂質；ホスホリパーゼＤを用いた呈色試薬で測定する方法、ビタミンＥ；逆相クロマトグラフィーによる方法、アポリポ蛋白（Ａ−１やＢやＥなど）；抗体を用いたラテックス凝集法などがあげられる。また、コレステロールオキシダーゼを用いた呈色試薬で測定する方法、中性脂肪；リポプロテインリパーゼを用いた呈色試薬で測定する方法、については、非特許文献４、５、６に示されているように、フラクションを取らずにカラムからの溶出液に配管中で一定流速にて酵素試薬を混合し反応させ検出することにより良好に各リポ蛋白を検出、定量することが可能である。

本発明を用いて構築したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、Ｌｐ（ａ）の分離分析条件を用いて得られたメタボリックシンドロームの測定値と健常者の値を比較したところ、ＶＬＤＬコレステロール値とＣＭコレステロール値について、有為差が認められた（表４、図１０、１１）。また、その有為差は、ＶＬＤＬコレステロール値に比べ、ＣＭコレステロール値の方が大きかった（実施例３）。メタボリックシンドロームの病態として、比較的軽度な脂質代謝の異常が認められるので、軽度の脂質代謝でも変化が生じやすいＶＬＤＬとＣＭに値の差が見られたと考えられる。

これらのことから、ＶＬＤＬコレステロール値、または、ＣＭコレステロール値、特にＣＭコレステロール値は、メタボリックシンドロームの疾患の識別に有用な指標であると言える。

血液中のＣＭが含むコレステロール値やＶＬＤＬが含むコレステロール値は上述のとおりにクロマトグラフィーにより分離し、そして、カラムから溶出した分離したＣＭやＶＬＤＬのリポ蛋白を含む溶液に、配管中に一定流速で酵素試薬を混合し反応させ検出することにより、各リポ蛋白のピークを確認出来る。そして、このピーク面積から各リポ蛋白中のコレステロール値をもとめることができる。

以下に本発明について、実施例を用いて説明する。ただし、本発明は実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
図１に装置の形態を示す。実施例に用いた装置構成を下記に示す。
実施例に用いた装置は図１に示す。溶離液Ａ（１）は５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、溶離液Ｂ（２）は５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ+５００ｍＭ過塩素酸ナトリウムｐＨ７．５である。溶離液ＡとＢを流すポンプ（４）は２台のＤＰ−８０２０（東ソー（株）製）を用いた。ＤＰ−８０２０ポンプは、２台を制御することにより、２つの溶離液のグラディエントを行えるポンプである。溶離液ＡとＢを混合するミキサー（５）はスタティックミキサーＣ（東ソー（株）製）を用いた。オートサンプラー（６）はＡＳ−８０２０（東ソー（株）製）を、カラムオーブン（９）はＣＯ−８０２１（東ソー（株）製）を用いた。カラム（８）はＤＥＡＥ−ＮＰＲカラムサイズ３．０ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５ｍｍ（東ソー（株）製）を、フィルター（７）はＨＬＣ−７２３ＧＨｂ３型用のカラムフィルターＳタイプ（東ソー（株）製）を用いた。コレステロール反応液（１０）はＴＣＨＯ−ＣＬ（セロテック社製）を、ポンプ直前にエアートラップ（１１）を設置した。コレステロール反応液のためのポンプ（１２）はＤＰ−８０２０（東ソー（株）製）を用いた。溶離液ＡとＢおよびコレステロール反応液については、脱気装置（３）を設置した。コレステロール反応液（コレステロール反応液は、主要な成分としてコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム、４―アミノアンチピリンが含まれる。）のラインに、抵抗管（１３）０．１ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２ｍを２つ直列につないで設置した。反応コイル（１４）は、０．２５ｍｍＩ．Ｄ．ｘ３０ｍとした。検出器はＵＶ−８０２０（東ソー（株）製）（１５）を用いた。溶離液はＡとＢをあわせて０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速とし、コレステロール反応液の流速は０．２０ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムオーブンの温度は２５℃とし、反応コイルは３７℃に保温した。検出器は６００ｎｍで検出した。使用したＤＥＡＥ−ＮＰＲカラムは、粒子系が２．５μｍで交換基容量が０．２３ｍｅｑ／ｍＬ−ｇｅｌのポリマー系非多孔質ゲルを充填したものである。測定の形態としては、まず、血清などのリポ蛋白を含んだ試料をオートサンプラー（６）から注入する。注入する配管はポンプ（４）とカラム（８）の間に設置されており、ポンプ（４）から溶離液を流すことにより試料はカラムに導入される。カラム（８）にポンプ（４）により比較的塩濃度の低い溶離液（溶離液Ｂの割合が低い）を予め流すことにより、カラム（８）を平衡化しておいて、試料中のリポ蛋白をカラムに吸着させる。続いて、溶離液Ｂの流す割合を溶離液Ａに比べ高めてカラムに流す溶離液の塩濃度を高めることにより、吸着力の弱いリポ蛋白から順にカラム出口から溶出してくる。この溶出液とコレステロール反応液（１０）を混合し、反応コイル（１４）に導いて反応させる。反応液はコレステロールの量に依存して発色する試薬となっているので、その色を検出器（１５）で測定することでコレステロール量に依存するクロマトグラムを取得し、そのピーク面積により、各リポ蛋白のコレステロール含量を算出するものである。

溶離液による溶出パターンを、０．０分から５．０分はＢの組成を３０．０％に固定し、５．０分から５．５分はＢの組成を３０．０％から４５．０％へのリニアグラディエントとし、５．５分から１０．５分はＢの組成を４５．０％に固定し、１０．５分から１１．０分はＢの組成を４５．０％から１００．０％へのリニアグラディエントとし、１１．０分から１６．０分はＢの組成を１００．０％に固定し、１６．０分から１６．５分はＢの組成を１００．０％から３０．０％へのリニアグラディエントとし、１６．５分から２５．０分はＢの組成を３０．０％に固定した。測定は、２５分サイクルで分析した。なお、本分析条件について、前述した溶離液１、２は、それぞれ、溶離液１がＢの組成３０％、溶離液２がＢの組成４５％にあたり、それぞれの塩濃度は、溶離液１が１９０ｍｍｏｌ／Ｌ、溶離液２が２６５ｍｍｏｌ／Ｌとなる。

検討に用いた健常人の血液試料（以下、血液試料Ａ）としては、総コレステロール２５０ｍｇ／ｄＬ、中性脂肪８９ｍｇ／ｄＬの血清を用いた。空腹時の健常人の血清には、ＣＭはほとんど含まれない。本分析条件において、血液試料ＡのＣＭコレステロール値は０．３６ｍｇ／ｄＬと非常に微量であった（図２）。また、本分析条件で、健常人血清から超遠心分離装置を用いて得られたＣＭ（比重＜０．９４ｇ／ｍＬ）を分析した。このＣＭ試料は、ＣＭが微量にしか含まれていない健常人の血清から取得したこともあり、ＣＭの含量は８０％程度と推定される。分析結果は、ＣＭを溶出させる溶離液２の位置に全体のピーク面積の７６％のピークが認められ、良好な分離パターンが得られたことが明らかである（図３）。

次に、それぞれの溶離液の最適な塩濃度を求めるために、溶離液１、２の塩濃度を変更して分析を実施した。まず、溶離液１の濃度をＢ２４〜３８％（１６０〜２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）において、血液試料Ａを測定して、ＣＭのピーク面積から算出されるコレステロール値を評価した（表１）。Ｂ２４％（１６０ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が５．７２ｍｇ／ｄＬと高く、ＣＭ以外のリポ蛋白画分が含まれていることが推定されたが、Ｂ２８％（１８０ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が１．０８ｍｇ／ｄＬと急激に低くなり、ＣＭ以外のリポ蛋白画分の量が低下した。Ｂ３０％（１９０ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が０．３６ｍｇ／ｄＬと、ＣＭピークに含まれるＣＭ以外のリポ蛋白画分の量がさらに低下し、ＣＭの純度が高まっていることがわかる。Ｂ３４、３６、３８％（２１０、２２０、２３０ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭの回収量が０．０４ｍｇ／ｄＬ以下と極端に少なく、使用出来ない条件であることがわかるが、Ｂ３２％（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭの回収量（０．０９ｍｇ／ｄＬ）が上昇し、使用可能な条件であることがわかる。Ｂ３１％（１９５ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭの回収量が０．２０ｍｇ／ｄＬと更に高い回収量が得られている。これらのことから、使用可能な溶離液１の塩濃度はＢ２８〜３２％（１８０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ）であり、最良の塩濃度はＢ３０〜３１％（１９０〜１９５ｍｍｏｌ／Ｌ）であることがわかった。なお、純度の高いＣＭ画分をピークとして得たい場合には、回収量の低いＢ３２％（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いることが、ＣＭ以外のリポ蛋白が含まれる量が低くなると考えられるため、好ましい。

続いて、溶離液２について、濃度をＢ３２〜５１％（２００〜２９５ｍｍｏｌ／Ｌ）において、血液試料Ａを測定してＣＭのピーク面積から算出されるコレステロール値を評価した（表２）。Ｂ３２％（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が０．１０ｍｇ／ｄＬと低く、ＣＭが溶離液２で完全に溶出されないことが予想された。Ｂ３４％（２１０ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が０．２０ｍｇ／ｄＬと上昇し、良好に分離されていると判断できる。Ｂ４１％（２４５ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が０．３１ｍｇ／ｄＬと更に高くなり、更に良好に分離されたと判断された。Ｂ５１％（２９５ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が１．８２ｍｇ／ｄＬと高くなり、溶離液２でＣＭだけでなく、Ｌｐ（ａ）も一部溶出していることが予想された。Ｂ４８％（２８０ｍｍｏｌ／Ｌ）では、ＣＭコレステロール値が０．２６ｍｇ／ｄＬと低下し、良好な分離が得られた。Ｂ４７％（２７５ｍｍｏｌ／Ｌ）でも、ＣＭコレステロール値が０．３３ｍｇ／ｄＬとＢ４８％（２８０ｍｍｏｌ／Ｌ）のＣＭコレステロール値（０．２６ｍｇ／ｄＬ）よりやや高く、良好に分離され回収された。これらのことから、使用可能な溶離液２の塩濃度はＢ３４〜４８％（２１０〜２８０ｍｍｏｌ／Ｌ）であり、最良の塩濃度はＢ４１〜４７％（２４５〜２７５ｍｍｏｌ／Ｌ）であることがわかった。

続いて、溶離液１、２のカラムに流す時間を検討した。検討は、これまでと同様に血液試料Ａを測定してＣＭのピーク面積から算出されるコレステロール値を評価した（表３）。評価における、溶離液１、２の塩濃度をそれぞれＢ３１％（１９５ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｂ４３％（２５５ｍｍｏｌ／Ｌ）溶離液１、２の一定の塩濃度で溶離液を流す時間を０．５分、１分、２分、３分、５分、７分、１０分、１５分、２０分と変化させた。塩濃度を変化させる際には、溶離液の変化によるベースラインのノイズを軽減するために、短い時間のリニアグラディエントを用いているが、その時間はそれぞれ０．１分、０．２分、０．３分、０．５分、０．５分、０．５分、０．５分、０．５分、０．５分とし、１検体当りの測定サイクルはそれぞれ１０分、１２分、１５分、１９分、２５分、３１分、４０分、５５分、７０分とした。なお、これまでの溶離液１、２の評価に使用した分析条件は、溶離液１、２の一定の塩濃度で溶離液を流す時間が５分の条件にあたる。溶離液を流す時間が０．５分ではＣＭコレステロール値が１８１．０５ｍｇ／ｄＬとＣＭ以外のリポ蛋白が多く含まれ、分離が良好ではないと言える。溶離液を流す時間が２分においては、ＣＭコレステロール値が０．９７ｍｇ／ｄＬと良好に分離されたと判断できる。特に、溶離液を流す時間３分（ＣＭコレステロール値０．５１ｍｇ／ｄＬ）から、溶離液を流す時間１０分（ＣＭコレステロール値０．２６ｍｇ／ｄＬ）においては、良好に分離されたと判断された。これらの結果から、溶離液を流す量は２分（カラム体積の６倍）以上、好ましくは、３分（カラム体積の９倍）から１０分（カラム体積の２８倍）が望ましい。

（実施例２）
実施例１と同じ装置を用い、ＣＭとＬｐ（ａ）と同時にＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬを分離分析する測定法の検討を行った。
溶離液の溶出パターンは、０．０分から３．５分はＢの組成を２０．０％に固定、３．５分から８．５分はＢの組成を２４．０％に固定、８．５分から１１．０分はＢの組成を２７．０％に固定、１１．０分から１４．５分はＢの組成を３２．０％に固定、１４．５分から１７．５分はＢの組成を４５．０％に固定、１７．５分から１８．５分はＢの組成を４５．０％から１００．０％にリニアグラディエント、１８．５分から２１．５分はＢの組成を１００．０％に固定、２１．５分から２２．５分はＢの組成を１００．０％から２０．０％にリニアグラディエント、２２．５分から３１．０分はＢの組成を１００．０％に固定とした。なお、１検体の測定時間は３１分とした。

健常人の血清検体と、健常人から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＨＤＬ（比重（比重１．１２５ｍｇ／ｍｌ以上）、Ｌｐ（ａ）（比重１．０６０〜１．１２５ｍｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ（比重１．０１９〜１．０６０ｍｇ／ｍｌ）、ＩＤＬ（比重１．００６〜１．０１９ｍｇ／ｍｌ）、ＶＬＤＬ（比重０．９３０〜１．００６ｍｇ／ｍｌ）、高脂血症患者から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＣＭ（比重０．９４ｍｇ／ｍｌ以下）を測定した。

ＨＤＬ試料については、溶出時間３．３分に主たるピークが見られ、Ｌｐ（ａ）試料については、溶出時間３．３分に主たるピークが見られ、７．３分と２１．６分にマイナーなピークが確認され、ＬＤＬ試料は、溶出時間７．５分に主たるピークが見られ、溶出時間１２．４分にマイナーなピークが確認された。Ｌｐ（ａ）試料には、Ｌｐ（ａ）とＨＤＬとＬＤＬの混合物であるので、Ｌｐ（ａ）試料を測定したときの、３．３分のピークはＨＤＬであり、７．３分のピークはＬＤＬであり、２１．６分のピークがＬｐ（ａ）であると考えられる。ＩＤＬ試料は、溶出時間１２．４分に主たるピークが見られ、溶出時間１４．８分にマイナーなピークが確認され、ＶＬＤＬ試料は、溶出時間１４．８分に主たるピークが見られ、溶出時間１８．２分にマイナーなピークが確認され、ＣＭ試料では、溶出時間１８．２分に主たるピークが見られた（図４）。また、この分離条件において、健常人の血清検体を測定し、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、Ｌｐ（ａ）のピークをコレステロール反応液と混合せずに、各ピークについてピークトップを中心として１．５分間取得し、このフラクション試料を５％アクリルアミド濃度のＳＤＳ電気泳動を行い、ウエスタンブロットの手法により解析した。なお、抗体は人のアポリポ蛋白Ｂ１００とアポリポ蛋白（ａ）に対するヤギポリクロナール抗体とヤギ抗体に対するウサギ抗体にアルカリフォスファターゼを結合させた２次抗体を用いた。発色には化学発光基質（ＣＤＰ−ｓｔａｒパーキンエルマ社）を用いた。結果を図５に示したが、アポリポ蛋白Ｂ１００抗体を用いた解析結果においては、予想通りＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、Ｌｐ（ａ）において、アポリポ蛋白Ｂ１００の強いバンドが検出され、ＣＭについても弱いバンドが検出され、ＨＤＬについては検出されなかった。また、アポリポ蛋白（ａ）抗体を用いた解析結果においても、予想通り、Ｌｐ（ａ）においてのみアポリポ蛋白（ａ）が検出された。なお、アポリポ蛋白（ａ）はＬｐ（ａ）の構成蛋白である。これらの結果から、健常人の血清検体において見られる溶出時間３．３分、７．５分、１２．４分、１４．８分、１８．２分、２１．６分のピークは、それぞれ、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、Ｌｐ（ａ）のピークであると言える（図４）。

（実施例３）
実施例２の分析条件を用いて、メタボリックシンドローム８例（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ）、健常人１４例について、種々の項目を比較した（表４）。なお、用いた症例はすべて男性である。有為差検定には、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ法を用いた。一般的にメタボリックシンドロームの判定に有用であると言われているアディポネクチン（非特許文献７）については、測定したところ推測通り、健常人に比べメタボリックシンドローム群で低値であり、有為差が認められた（表４、図６）。続いて、本発明により得られた測定値であるＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、Ｌｐ（ａ）の６つのリポ蛋白に含まれるコレステロール値を比較した。ＨＤＬについては、メタボリックシンドロームの診断基準にも含まれている項目であるので、当然有為差は認められた（表４、図７）。ＬＤＬとＩＤＬについては、健常人とメタボリックシンドロームにおいて有為差は認められなかった（表４、図８、９）。ＶＬＤＬとＣＭについては、健常人とメタボリックシンドロームにおいて有為差が認められ、メタボリックシンドロームを判別するに能力の高い指標になることが確認された（表４、図１０、１１）。ＶＬＤＬとＣＭについて、健常人とメタボリックシンドロームを有為差検定したときのＵ値は、ＶＬＤＬで１７．５、ＣＭで８．５となり、特にＣＭでその有為差は高かった。なお、アディポネクチンについて有為差検定を行ったときのＵ値は、８．０でありＣＭのＵ値（８．５）と同等であることから、アディポネクチンとＣＭコレステロール値のメタボリックシンドロームの判別能力は同等であると言える。このような、判別を行う場合には、通常、健常人を複数測定し、それらの値の平均値＋２倍の標準偏差の値を閾値として、対象者を判別する。本技術の場合には、表４の結果から、ＶＬＤＬコレステロールの場合、その値が健常人の平均値＋２倍の標準偏差１６．３ｍｇ／ｄＬより高いと、その対象者がメタボリックシンドロームであると判定でき、また、ＣＭコレステロールの場合、その値が健常人の平均値＋２倍の標準偏差２．４ｍｇ／ｄＬより高いと、その対象者がメタボリックシンドロームであると判定できる。表４のメタボリックシンドローム８名のデータにこの閾値を当てはめると、８名中の６名がＶＬＤＬコレステロールの場合でもＣＭコレステロールの場合でも判別できることがわかる（表５中のメタボリックシンドローム検体番号３番と４番は判別できてない）。この結果を考えても、図１０および図１１のそれぞれの値の分布を見ても、ＶＬＤＬコレステロール値、および、ＣＭコレステロール値はメタボリックシンドロームの判別において優れた性能を持つことは明らかである。Ｌｐ（ａ）については、健常人とメタボリックシンドロームにおいて有為差が認められメタボロックシンドロームで高値を示しているものの、個々のデータを見ると、３名の健常人で３ｍｇ／ｄＬより高く、メタボリックシンドロームを判別する指標として望ましくないことが確認された（表４、図１２）。

１溶離液Ａ
２溶離液Ｂ
３脱気装置
４ポンプ
５ミキサー
６オートサンプラー
７フィルター
８カラム
９カラムオーブン
１０コレステロール反応液
１１エアートラップ
１２コレステロール反応液のためのポンプ
１３抵抗管
１４反応コイル
１５検出器

Claims

血液中のカイロミクロン（ＣＭ）が含むコレステロール値を測定し、その値が２．４ｍｇ／ｄＬよりも高いときにメタボリックシンドロームであると識別する方法。
血液中のＶＬＤＬ（超低比重リポ蛋白）が含むコレステロール値を測定し、その値が１６．３ｍｇ／ｄＬよりも高いときにメタボリックシンドロームであると識別する方法。