JP5052212B2 - Ldl亜画分を用いた冠動脈疾患の判定方法 - Google Patents
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1.LDL亜画分のうち、陰イオン交換樹脂に対して、結合力が強いLDL亜画分(以下、LDLs)を指標として用いる、冠動脈疾患の判定方法。
2.LDLsのコレステロール濃度を比較することにより、冠動脈疾患を判定する、1に記載の方法。
3.被験者から得られるLDLsのコレステロール濃度が、健常者から得られるLDLsのコレステロール濃度の平均値よりも高い場合に、冠動脈疾患であると判定する、2に記載の方法。
4.溶離液の塩濃度勾配を利用して、LDLからLDLsを分離し、測定したものを指標として用いる、1〜3のいずれか一つに記載の方法。
5.LDLを吸着させるための溶離液(溶離液1)、LDL亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液(溶離液2)、LDL亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液(溶離液3)の塩濃度の異なる溶離液を、溶離液1、2、3の順に陰イオン交換樹脂に流すことにより、LDLからLDLsを分離し、測定したものを指標として用いる、1〜4のいずれか一つに記載の方法。
6.溶離液1の塩濃度が130mmol/Lから180mmol/Lであり、溶離液3の塩濃度が溶離液1の塩濃度より20mmol/Lから50mmol/L高く、溶離液2の塩濃度が、溶離液1の塩濃度よりも高く、溶離液3の塩濃度よりも低い、1〜5のいずれか一つに記載の方法。
7.溶離液2の塩濃度が、溶離液1と溶離液3の塩濃度の差に対して35%から60%分溶離液3より低い、1〜6のいずれか一つに記載の方法。
LDLの亜画分の分離測定方法としては、超遠心分離装置を用いた方法が一般に用いられており、分離する能力も高いが、一方で、手技が難しく、また、超遠心分離装置は高価なため、多くの研究者が利用することは出来ない。NMRやゲルろ過クロマトグラフィーによる測定方法の手技は難しくないが、どちらもLDLの亜画分を分離する能力は十分とは言えない。電気泳動による測定方法も、手技は難しくないが、分離する能力は十分とは言えないし、一般的に定量性という面で性能の低い測定方法である。
図1に装置の形態を示す。実施例に用いた装置構成を下記に示す。
溶離液A(1)は50mM Tris−HCl+1mM EDTA2Na pH7.5、溶離液B(2)は50mM Tris−HCl+1mM EDTA2Na+500mM 過塩素酸ナトリウム pH7.5である。溶離液AとBを流すポンプ(4)はCCPM2(東ソー(株)製)を用いた。CCPM2は、ポンプヘッドを2つもち、溶離液2液のグラディエントを行えるポンプである。溶離液AとBを混合するミキサー(5)はスタティックミキサーC(東ソー(株)製)を用いた。オートサンプラー(6)はAS−8020(東ソー(株)製)を、カラムオーブン(9)はCO−8021(東ソー(株)製)を用いた。カラム(8)はDEAE−NPRカラムサイズ4.6mmI.D.x35mm(東ソー(株)製)を、フィルター(7)はHLC−723GHb3型用のカラムフィルターSタイプ(東ソー(株)製)を用いた。コレステロール反応液(10)はTCHO−CL(セロテック社製)を、ポンプ直前にエアートラップ(11)を設置した。コレステロール反応液のためのポンプ(12)はDP−8020(東ソー(株)製)を用いた。溶離液AとBおよびコレステロール反応液については、脱気装置(3)を設置した。コレステロール反応液のラインに、抵抗管(13)0.1mmI.D.x2mを2つ直列につないで設置した。反応コイル(14)は、0.25mmI.D.x30mとした。検出器はUV−8020(東ソー(株)製)(15)を用いた。溶離液はAとBをあわせて0.5mL/minの流速とし、コレステロール反応液の流速は0.25mL/minとした。カラムオーブンの温度は25℃とし、反応コイルは37℃に保温した。検出器は600nmで検出した。
前述したように、HDL画分をすべて溶出する溶離液(溶離液3’)の塩濃度は130〜180mmol/Lの範囲が好ましいとわかった。このことから、HDL画分を吸着、もしくは、溶出させて、なおかつ、LDL画分を吸着させるための溶離液(溶離液1)も同様に130〜180mmol/Lの範囲が好ましいと言える。実際に図5から8を見ると、LDLの溶出は約30%(塩濃度は、過塩素酸濃度が150mmol/L、50mmol/L トリス緩衝液 pH8.0の塩濃度は28mmol/Lであるので、全体で約180mmol/Lとなる。)から始まっている。また、LDL画分をすべて溶出するための溶離液(溶離液3)は、LDL画分の溶出する溶離液の塩濃度が図6〜8から30〜34%程度(塩濃度で178〜198mmmol/L)となり、30%程度の溶離液を長時間流すか、あるいは、34%程度の溶離液を短時間流すかのどちらかを選択する。このことから、溶離液3の濃度は、30〜34%程度(塩濃度で178〜198mmmol/L)が好ましい濃度となり、溶離液1との差はおおむね20〜50mmol/Lである。
実施例1と同じ装置を用い、溶離液のpHは8.0として、検討を行った。溶離液の溶出パターンは、0.0分から0.01分はBの組成を8.0%(その他の組成は全てA、以下同じ)に固定、0.01分から3.0分はBの組成を19.0%に固定、3.0分から6.0分はBの組成を24.5%に固定、6.0分から9.5分はBの組成を27.8%に固定、9.5分から13.0分はBの組成を29.5%に固定、13.0分から16.5分はBの組成を33.0%に固定、16.5分から20.0分はBの組成を43.0%に固定、20.0分から25.0分はBの組成を63.0%に固定、25.0分から35.0分はBの組成を8.0%に固定した。なお、1検体の測定時間は35分とした。
実施例2と同じ条件で、LDLfとLDLsの溶出条件を検討することを目的として、LDLfを溶出する溶離液をB25.0〜29.0%(過塩素酸ナトリウム125〜145mmol/l)に変動させて、測定を実施した。高脂血症患者2名の血清試料を用いた。結果を表1と2に示す。また、そのLDLs/LDLfの比率(%)の変動を図11に示した。図11から、溶離液B26.3%(過塩素酸ナトリウム131.5mmol/l)以下になると急激に高くなることがわかる。溶離液B26.3%でLDLf画分を溶出する前の溶離液はB24.5%であり、LDLs画分を溶出する溶離液はB29.5%であるので、LDL亜画分を溶出する条件として、2番目に流す溶離液と3番目に流す溶離液の塩濃度の差はB%として3.2%であり、1番目に流す溶離液と3番目に流す溶離液の塩濃度の差はB%として5%であるので、その割合(低下率)は64%である。このことから、安定して測定するには、2番目に流す溶離液の塩濃度の低下率としては64%以下である必要がある。
実施例3で記述したLDLsについて、LDL亜画分への溶出条件の影響を確認するために、LDLfを溶出する溶離液をB25.5〜29.0%(過塩素酸ナトリウム127.5〜145mmol/l)に変動させて、測定を実施した(表3)。3つの高脂血症患者の血清試料を用いた。2番目に流す溶離液の塩濃度の低下率が約35%〜60%の場合、LDLsの測定値は変動するものの、各患者間の測定値の順序には変動がないことが分かる。
測定方法は、実施例1と同じとした。ただし、カラムは同じ種類であるが充填を別に行なったものであり、そのため分離条件を一部変更した。
2 溶離液B
3 脱気装置
4 ポンプ
5 ミキサー
6 オートサンプラー
7 フィルター
8 カラム
9 カラムオーブン
10 コレステロール反応液
11 エアートラップ
12 コレステロール反応液のためのポンプ
13 抵抗管
14 反応コイル
15 検出器
Claims (4)
- LDL亜画分のうち、陰イオン交換樹脂に対して、結合力が強いLDL亜画分(以下、LDLs)を指標として用いる、冠動脈疾患の判定方法であって、LDLを吸着させるための溶離液(溶離液1)、LDL亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液(溶離液2)、LDL亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液(溶離液3)の塩濃度の異なる溶離液を、溶離液1、2、3の順に陰イオン交換樹脂に流すことにより、LDLからLDLsを分離し、かつ溶離液1の塩濃度が130mmol/Lから180mmol/Lであり、溶離液3の塩濃度が178mmol/Lから198mmol/Lであり(ただし、溶離液3の塩濃度が溶離液1の塩濃度より高い)、溶離液2の塩濃度が、溶離液1の塩濃度よりも高く、溶離液3の塩濃度よりも低い、前記方法。
- LDLsのコレステロール濃度を比較することにより、冠動脈疾患を判定する、請求項1に記載の方法。
- 被験者から得られるLDLsのコレステロール濃度が、健常者から得られるLDLsのコレステロール濃度の平均値よりも高い場合に、冠動脈疾患であると判定する、請求項2に記載の方法。
- 溶離液2の塩濃度が、溶離液1と溶離液3の塩濃度の差に対して35%から60%分溶離液3より低い、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
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