JP5512536B2 - トウゴマ植物由来種子優先遺伝子プロモーター - Google Patents
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Description
本出願は、2007年12月4日に出願の米国特許仮出願第60/992,273号「Seed−Preferred Gene Promoters From the Castor Plant.」の出願日の利益を主張する。
本明細書に記載する研究は、一部にエネルギー省からの賞金に支援を受けた;賞金番号DE−FC07−01ID14213。合衆国政府は本発明にある種の権利を有する可能性がある。
プロモーター単離
レグミン様(「54−SSP」)およびオレオシンタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子アノテーションが既知遺伝子への配列に基づく相同性を使用して実現された無作為cDNA塩基配列決定プロジェクトを通して同定された。これらの選択された遺伝子のためのプロモーターは、GenomeWalker(商標)キット(Clontech Laboratories,INC.)を製造元の指示書に従って使用して、PCRベースの「ゲノムウォーキング」を介して単離された。この技法では、配列が既知の短いオリゴヌクレオチドアダプター分子が、いくつかの異なる平滑末端切断制限酵素ですでに消化されたトウゴマゲノムDNAの末端に先ずライゲートされた。一次PCR反応は、アダプター分子にアニールする順方向PCRプライマーおよび54−SSPまたはオレオシン遺伝子のコード領域内のDNAに特異的にアニールする逆方向PCRプライマーを使用して実施された。次に、ネステッドプライマーを使用する第2順目のPCRは、これも既知のアダプターおよび遺伝子特異的配列に基づいて、実施された。この戦略を使用して、選択されたコード配列から上流のDNA配列が単離され、クローニングベクターpCR2.1(Invitrogen Corp.)に挿入され、塩基配列決定された。この過程で使用されるプライマーを以下に示す。
54−SSPプライマー
一次PCR反応プライマー
アダプタープライマー1(順方向プライマー):5’GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3’(配列番号:1)
54−SSPプライマーB(逆方向プライマー):5’GAG AGC AGC GAA GAA GGC TGA ACC ATA G 3’(配列番号:2)
ネステッドPCR反応プライマー
ネステッドアダプタープライマー2(順方向プライマー):5’ACT ATA GGG CAC GCG TGG T 3’(配列番号:3)
54−SSPプライマーA(逆方向プライマー):5’GAG AGC CAT GGA AGA GAA CAA GTA GGA A 3’(配列番号:4)
オレオシンプライマー
一次PCR反応プライマー
アダプタープライマー1(順方向プライマー):5’GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3’(配列番号:5)
オレオシンプライマーB(逆方向プライマー):5’ATA GGC TTG CAG AAT CAG AGC TTC TGG TTA 3’(配列番号:6)
ネステッドPCR反応プライマー
ネステッドアダプタープライマー2(順方向プライマー):5’ACT ATA GGG CAC GCG TGG T 3’(配列番号:7)
オレオシンプライマーA(逆方向プライマー):5’GGT GAC TAA CAA CCG GTG ATT GTT GAT GCT 3’(配列番号:8)
プロモーターの試験
オレオシンおよび54−SSP遺伝子プロモーターの活性を、レポーター遺伝子緑色蛍光タンパク質(GFP)を使用して、植物全体(シロイヌナズナ)において試験した。CopGFP遺伝子の上流にオレオシンまたは54−SSPプロモーターのある発現カセット(Evrogen)を有し、カリフラワーモザイクウイルス35Sターミネーター領域が続くシロイヌナズナ形質転換のためのバイナリーベクターを構築した。以下のベクター、すなわちCopGFPレポーター遺伝子に作動可能に連結されたpDOW2771−54−SSPプロモーターおよびCopGFPレポーター遺伝子に作動可能に連結されたpDOW2772−オレオシンプロモーターのマップは図1に示されている。
脂肪酸合成遺伝子の調節のためのベクター
脂肪酸合成タンパク質の調節のためのベクターは、実施例2において概説した通りに作製される。54−SSPプロモーターの制御下にある脂肪酸合成タンパク質をコードする以下のベクター、すなわち
pSSP:Fad2− Fad2遺伝子に作動可能に連結された54−SSPプロモーター
pSSP:Fad3− Fad3遺伝子に作動可能に連結された54−SSPプロモーター;および
pSSP:KASII− KASII遺伝子に作動可能に連結された54−SSPプロモーター
が作製される。
pOleo:Fad2− Fad2遺伝子に作動可能に連結されたオレオシンプロモーター;
pOleo:Fad3− Fad3遺伝子に作動可能に連結されたオレオシンプロモーター;および
pOleo:KASII− KASII遺伝子に作動可能に連結されたオレオシンプロモーター
が作製される。
pSSP:Fad2:AS− Fad2 RNAに対するアンチセンスに作動可能に連結された54−SSPプロモーター;
pSSP:Fad3:AS− Fad3 RNAに対するアンチセンスに作動可能に連結された54−SSPプロモーター;および
pSSP:KASII:AS− KASII RNAに対するアンチセンスに作動可能に連結された54−SSPプロモーター
が作製される。
pOleo:Fad2:AS− Fad2 RNAに対するアンチセンスに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター;
pOleo:Fad3:AS− Fad3 RNAに対するアンチセンスに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター;および
pOleo:KASII:AS− KASII RNAに対するアンチセンスに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター
が作製される。
pSSP:Fad2:si− Fad2 RNAに対するsiRNAに作動可能に連結された54−SSPプロモーター;
pSSP:Fad3:si− Fad3 RNAに対するsiRNAに作動可能に連結された54−SSPプロモーター;および
pSSP:KASII:si− KASII RNAに対するsiRNAに作動可能に連結された54−SSPプロモーター
が作製される。
pOleo:Fad2:si− Fad2 RNAに対するsiRNAに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター;
pOleo:Fad3:si− Fad3 RNAに対するsiRNAに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター;および
pOleo:KASII:si− KASII RNAに対するsiRNAに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター
が作製される。
シロイヌナズナおよびトウゴマ栽培および形質転換
シロイヌナズナおよびトウゴマは通常の条件下で栽培される。ベクターは、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウムツメファシエンス系統GV3101 pMP90に導入され、フローラルディップ法によりシロイヌナズナおよびトウゴマを形質転換するのに使用される(N.Bechtold、J.Ellis、とG.Pelletier(1993)C.R.Acad.Sci.Paris 316、1194〜1198頁)。ベクターは、高速粒子および感染病原体も使用して導入される。形質転換は、最初の開花の約5日後に実施される。
シロイヌナズナおよびトウゴマの種子中の脂肪酸含有量の決定
脂肪酸分析:種子はメチル化され(1mlの1N HCl、メタノール、Supelco、80℃で1時間)、ヘキサンで抽出され、トリメチルシリル化される(100μlのBSTFA−TMCS(ビス(トレイメチルシリル)トリフルオロアセトアミドトリメチルシラン)、Supelco、90℃で45分間)。BSTFA−TMCSはエバポレーションにより取り除かれ、試料はヘキサン中に再懸濁される。試料は、5973質量選択検出器を装備したHewlett−Packard6890ガスクロマトグラフ(GC/MS)およびSupelcoSP−2340シアノキャピラリーカラム(60m×250μm×0.25μm)上で分析される。注射器は225℃に保持され、オーブン温度は変化させ(15℃/分で100〜240℃に続いて240℃で5分間)、およびヘリウム流量は1.1ml/分である。ピークアイデンティティーの指定は、溶出時間対真正基準に基づいて実施され、その質量スペクトルに基づいて確認される。定量化はHewlett−Packardケムステーションソフトウェアを使用して実施される。
シロイヌナズナおよびトウゴマにおける脂肪酸合成の調節
Fad2を介して脂肪酸合成を調節する3種の方法が比較される(遺伝子発現、アンチセンス発現、siRNA発現)。遺伝子抑制の3種の方法を比較するために3種の遺伝子(簡単にスコア化されるので12−不飽和化酵素FAD2および15−不飽和化酵素FAD3、ならびに遺伝子発現における低下の評価のために以前使用されたことがあるのでFAD2)、他にもβ−ケトアシル−ACPシンターゼ(KAS)IIが選ばれる。これらの酵素と脂肪酸合成間の関係は図4に描かれている。
KASII発現の調節
色素体中でKASIIは16Cを18C脂肪酸へ伸長する。KASIIでは、16:0プラス16:1脂肪酸(KASIIの基質)のレベルが産物18:0および18:1プラス代謝物18:2および18:3のレベルと比較される。
FAD2発現の調節
FAD2では、18:1脂肪酸(FAD2の基質)のレベルがその産物18:2および代謝物18:3のレベルと比較される。分析では、18:2は18:3と合わされて、FAD2により不飽和化されている全脂肪酸割合を得る。
FAD3発現の調節
FAD3では、18:1プラス18:2脂肪酸(18:2はFAD3の基質である)のレベルがその産物18:3のレベルと比較される。
Claims (29)
- 配列番号:9または配列番号:10の配列に少なくとも90%同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
- 配列番号:9または配列番号:10の配列に少なくとも90%相同性を有するヌクレオチド配列に作動可能に連結された目的のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1に記載の単離された核酸。
- 目的のヌクレオチド配列がタンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびsiRNAからなるグループから選択される分子をコードする、請求項2に記載の単離された核酸。
- 請求項1に記載の単離された核酸を含むベクター。
- 配列番号:9または配列番号:10の配列に少なくとも90%相同性を有するヌクレオチド配列に作動可能に連結された目的のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項4に記載のベクター。
- 目的のヌクレオチド配列がタンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびsiRNAからなるグループから選択される分子をコードする、請求項4に記載のベクター。
- 選択可能なマーカーをさらに含む、請求項5に記載のベクター。
- 選択可能なマーカーがホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子である、請求項7に記載のベクター。
- 請求項1に記載の単離された核酸を導入遺伝子として含む植物種子細胞。
- 請求項1に記載の単離された核酸が細胞のゲノムに安定的に組み込まれている、請求項9に記載の植物種子細胞。
- 細胞が、シロイヌナズナ属、ヒマワリ、ワタ細胞、ナタネ、トウモロコシ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、ダイズ、およびトウゴマ属細胞からなるグループから選択される、請求項9に記載の植物種子細胞。
- 細胞が請求項4に記載のベクターを含む、請求項9に記載の植物種子細胞。
- 請求項1に記載の単離された核酸を導入遺伝子として含む植物。
- 植物がシロイヌナズナ属、ヒマワリ、ワタ細胞、ナタネ、トウモロコシ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、ダイズ、およびトウゴマ属からなるグループから選択される、請求項13に記載の植物。
- 植物が請求項4に記載のベクターを含む、請求項13に記載の植物。
- 植物が請求項9に記載の細胞を含む、請求項13に記載の植物。
- 請求項1に記載の単離された核酸を含む種子。
- 種子がシロイヌナズナ属、ヒマワリ、ワタ細胞、ナタネ、トウモロコシ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、ダイズ、およびトウゴマ属種子からなるグループから選択される、請求項17に記載の種子。
- 請求項17に記載の種子であって、該種子から育った植物が請求項4に記載のベクターを含む、種子。
- 請求項17に記載の種子であって、該種子から育った植物が請求項9に記載の細胞を含む、種子。
- 目的のヌクレオチド配列によりコードされる分子の発現を、種子優先(seed preferred)の形で促進する方法であって、請求項1に記載の単離された核酸を目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結することを含み、種子の細胞中の目的のヌクレオチド配列を発現させる方法。
- 目的のヌクレオチド配列によりコードされる分子が、タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびsiRNAからなるグループから選択される、請求項21に記載の方法。
- 種子の細胞中で目的のヌクレオチド配列によりコードされる分子を産生する方法であって、および請求項2に記載の核酸を種子細胞に供給すること、および、目的のヌクレオチド配列を発現させること、
を含む方法。 - 目的のヌクレオチド配列によりコードされる分子が、タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびsiRNAからなるグループから選択される、請求項23に記載の方法。
- 植物種子の細胞中で標的の発現を調節する方法であって、
請求項2に記載の核酸を種子細胞に供給すること、であって、前記目的のヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチド又は前記細胞中の標的の発現を調整する事が可能なsiRNAをコードし、および種子細胞中の目的のヌクレオチド配列を発現させること、を含む方法。 - 植物細胞が、トウゴマ、シロイヌナズナ、ヒマワリ、ワタ、ナタネ、トウモロコシ、ヤシ、タバコ、ピーナッツまたはダイズの細胞からなるグループから選択される、請求項25に記載の方法。
- 標的が遺伝子、オリゴヌクレオチド配列、および/またはタンパク質である、請求項25に記載の方法。
- 標的が、脂肪酸合成、分解、貯蔵、および/または調節に関与するタンパク質から選択される、請求項25に記載の方法。
- 標的が、ACCアーゼ、FAS、KASI、KASII、KASIII、Fad2、およびFad3からなるグループから選択される、請求項25に記載の方法。
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