JP5495215B2 - 梗塞後治療用のナノ粒子−幹細胞コンジュゲート - Google Patents
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Description
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(HMSC)をin vitroで培地(MSCGM Bullet Kit、Lonza,Inc.)を使用して37℃、5%CO2加湿インキュベータセットに入れて数代の継代、培養した。MSCにおけるCD44受容体の分布を測定するために、コンフルエントなMSC単層を最初に4.0%ホルムアルデヒド溶液で固定し、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、ブロッキング緩衝液(1%BSA/PBS)に曝露した。もう一度洗浄した後、細胞をヒトCD44抗原(20μg/mlマウス抗ヒトCD44 lgG2a(Serotec Inc))に対する一次抗体と共にインキュベートした。抗体溶液を除去し、細胞をPBSで洗浄し、次いで蛍光標識二次抗体(FITCコンジュゲート抗マウスIgG)と共にインキュベートした。PBSでもう一度洗浄した後、MSC単層を蛍光顕微鏡下で観察した。
10μg/ml、50μg/ml及び500μg/mlのポリ−L−リシン(44kDa)のPBS溶液(カルシウム及びマグネシウムを有する)を調製した。次いで、コンフルエントなMSC単層を洗浄した後、さまざまな濃度のポリ−L−リシンに曝露した。もう一度PBSで洗浄した後、MSC単層をフルオレセインアミン標識ヒアルロナンに37℃でさらに10分間曝露した。続いて、結合しなかったフルオレセインアミン標識ヒアルロナンをPBSで洗浄することによって除去し、蛍光顕微鏡下で観察した。
1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml及び20μg/mlキトサン(612kDa)の溶液をPBS中で構成した。次いで、コンフルエントなMSC単層をさまざまな濃度のキトサンに曝露した。PBSでもう一度洗浄した後、MSC単層をフルオレセインアミン標識ヒアルロナンに曝露し、蛍光顕微鏡によって観察した。ヒアルロナン濃度を一定に保持しながらキトサン濃度を変更する根拠は、MSC表面に結合したキトサンの量が細胞表面に結合することができるヒアルロナンの量を制限することにある。上記のとおり、この根拠は、高分子電解質二重層被膜の全体にわたる「密度」は、キトサン高分子電解質の第1の層の濃度を変更することによって調節できることを示すものであった。
この試験で使用されるナノ粒子は、200nMの直径を有する市販のFluoSphereビーズ(Invitrogen Inc.、カタログ番号F8764)であり、このビーズは蛍光標識(励起/発光波長は505/515nM)されており、その表面に正に帯電したアミン基を有し、それにより負に帯電したヒアルロナンと静電気的に結合することができる。コンフルエントなMSC単層を上記のとおりキトサン/ヒアルロアン高分子電解質二重層(1及び5μg/mlのキトサン)、次いで1mg/ml非標識ヒアルロナンで被覆した。次いで、被覆したMSCを0.02%v/vナノ粒子懸濁物(PBS、pH7.4)に37℃で10分間曝露した。続いて、MSC単層をCa2+フリーPBSで洗浄し、次いで0.05%w/vトリプシン/EDTAに10分間曝露した後、蛍光顕微鏡下、励起波長500nmで観察した。
−80℃の冷蔵庫において10%v/vジメチルスルホキシド(DMSO)中で、トリプシンで解離させたナノ粒子コンジュゲートMSCに凍結融解を施した。2時間後、クライオバイアル中の凍結した細胞懸濁物を液体窒素に浸漬し、少なくとも1週間保存した。凍結融解した細胞を培地で戻し、新たな細胞培養皿に再播種した。
前述のとおり、コンフルエントなMSC単層を、キトサン/ヒアルロナン高分子電解質二重層被膜を介してナノ粒子とコンジュゲートさせた。ある群をすぐにVectashield DAPI封入溶液(Vector Laboratories,Inc.)で固定したが、別の群はトリプシンで解離させずにさらに24時間培養した後、Vectashieldで固定した。ナノ粒子コンジュゲートMSCの0時間及び24時間の時点での共焦点画像は、マルチポイント共焦点システムに搭載されたデジタルカメラによって取得した。切片の光学的厚さを0.250μm/切片の一定に保持し、撮像される全体の体積は20〜25μmの厚さであった。光学スタックの層を1つずつ除去して、細胞に対するナノ粒子の位置及び厚さを示すことができた。
実施例7:トリプシンで解離させたナノ粒子コンジュゲートMSCの再付着を定量するためのMTTアッセイ
Claims (23)
- 負の表面電荷を有する細胞、
前記細胞の表面と静電気的にコンジュゲートしている、正に帯電した生体適合性高分子電解質の第1の層、
任意選択で、前記第1の層と静電気的に架橋している、負に帯電した生体適合性高分子電解質の第2の層、
任意選択で、電荷が交互である生体適合性高分子電解質の静電気的に架橋したさらなる層であり、同様に帯電した高分子電解質が化学的に同一でも異なっていてもよい、層、及び
最も外側の高分子電解質層と静電気的にコンジュゲートしている、前記最外層と反対の表面電荷を有する1種又は複数の生体適合性ナノ粒子
を含む構築物であって、
前記ナノ粒子が1種又は複数の生物活性剤を含む、構築物。 - 前記負に帯電した生体適合性高分子電解質の第2の層が選択される、請求項1に記載の構築物。
- 前記生体適合性高分子電解質の静電気的に架橋したさらなる層が選択される、請求項2に記載の構築物。
- 前記細胞が、骨格筋芽細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、心筋の細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞及び前駆細胞からなる群から選択される、請求項1、2又は3に記載の構築物。
- 前記細胞が成体幹細胞である、請求項4に記載の構築物。
- 前記成体幹細胞が間葉幹細胞である、請求項5に記載の構築物。
- 前記正に帯電した各層の正に帯電した生体適合性高分子電解質が独立に、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、アミノデキストラン、ポリオルニチン及びキトサンからなる群から選択される、請求項1、2又は3に記載の構築物。
- 前記正に帯電した各層の正に帯電した高分子電解質がキトサンである、請求項7に記載の構築物。
- 前記負に帯電した各層の負に帯電した生体適合性高分子電解質が独立に、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン硫酸、β−シクロデキストリン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメトキシセルロース、カルボキシメチルデンプン、ポリ硫酸化グルコソグリカン、ムコ多糖、アニオン性オリゴ糖、ポリヌクレオチド及びヒアルロナンからなる群から選択される、請求項2又は3に記載の構築物。
- 前記負に帯電した各層の負に帯電した高分子電解質がヒアルロナンである、請求項9に記載の構築物。
- 前記ナノ粒子が生体安定性である、請求項1、2又は3に記載の構築物。
- 前記ナノ粒子が生分解性である、請求項1、2又は3に記載の構築物。
- 前記生物活性剤が、前記ナノ粒子内に封入されている、又は前記ナノ粒子の外表面に結合している、請求項11に記載の構築物。
- 前記生物活性剤が、前記ナノ粒子内に封入されている、前記ナノ粒子の外表面に結合している、又は前記ナノ粒子の構造中に組み込まれている、請求項12に記載の構築物。
- 前記生物活性剤が1種又は複数の細胞生存促進剤を含む、請求項13又は14に記載の構築物。
- 前記正に帯電した高分子電解質及び負に帯電した高分子電解質の層が、前記細胞表面の一部にのみ適用されている、請求項1、2又は3に記載の構築物。
- 請求項1に記載の構築物を有効成分として含有する、医薬組成物。
- 心臓の疾患又は障害である疾患又は障害を治療するための、請求項17に記載の医薬組成物。
- 前記心臓の疾患又は障害が心筋梗塞である、請求項18に記載の医薬組成物。
- 針注射によって患者に投与されるための、請求項17に記載の医薬組成物。
- 前記針注射が針注射カテーテルを含む、請求項20に記載の医薬組成物。
- 埋め込み型医療デバイスによって投与されるための、請求項17に記載の医薬組成物。
- 前記埋め込み型医療デバイスがステントを含む、請求項22に記載の医薬組成物。
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