JP5477888B2 - 単鎖プライマ−プロモータ−セレクタ構造とivtを用いたメッセージ発生量及び対立遺伝子コピー数の決定 - Google Patents
単鎖プライマ−プロモータ−セレクタ構造とivtを用いたメッセージ発生量及び対立遺伝子コピー数の決定 Download PDFInfo
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Description
本特許出願は、2005年9月21日に出願された米国仮特許出願第60/719063号に対する優先権を主張する。
本発明は、部分的に中小企業技術革新制度(SBIR)基金番号DAMD17−03−C−0047 Cから、米軍により管理されているプログラム下で資金提供を受けて開発されたものである。政府が本発明の権利を有している。
下記のものは、確実に下の用語及び表現の理解を手伝うための背景技術とすることができる。これらの参考文献は、時に著者、番号、又はその他の筋書によって下の本文に引用される。
− 単機能プライマのみが用いられ、実施の際に、一実施例においてmRNA鋳型の消化、及び第2のプライマとDNAポリメラーゼの導入を必要とする第2のDNA鎖合成は不要でありなくすことができる。;
− 第二鎖合成を可能にするために通常必要とされるRNaseHを用いたRNA消化ステップもまた、なくすことができる;この反応がヘテロ二本鎖部分ではないT7及びセレクタ配列のみを用いるので、mRNA−cDNAのヘテロ二本鎖の存在がsst−IVTを妨げない。
− ターゲットに特異的なプライマは、配列とセレクタ配列の長さによって決まる転写配列又は長さの影響を受けることなく、対象のmRNAターゲットに沿ってどこにでも配置できる;下記のように、コード化された微小粒子への転写物捕捉の効率を最大化するために、転写物は短い(出願第10/974,036を参照);転写物は異なる配列を有しており、その結果、異なる遺伝子並びに有意な配列類似性を示す遺伝子ファミリ内の遺伝子の検出と計数が可能である;
− ここに、より詳細に記するように、比較的簡単にしたプロトコルによって、好ましくはREADフォーマットを用いて、同時ターゲット捕捉と、増幅と、「単一チューブ」及び均一のフォーマットにおける多重検出を含むいくつかのステップを組合せることができる。ここに述べるように、統合もまた、最小化を促進する。
例1では、配列特異的RTプライマ、T7プロモータ、及びRTプライマに独自に関連するセレクタ部分配列を具える構造を用いて、適切な反応状態下でのsst−IVTの性能を説明している。ここに示すように、そのモデル系においては、1fmolのプライマ/rxnまで(ここでは、他の場合と同様に、特に記述されていなければ、反応量(“rxn”)は10ulである)の検出の限界を伴い、sst−IVT反応は、配列特異的用量反応を示す。非鋳型鎖の添加は、有意な範囲のターゲット濃度〜10倍に信号強度を増やすが、検出の限界に影響はない(図5)。このように、アッセイ内で到達する信号強度によって、sst−IVTをT7プロモータの非鋳型鎖を添加して、あるいは添加せずに特異的アプリケーションの要求に応じて行うことができる。
2.1 mRNAの計数:メッセージ発生量の決定
本発明の方法は、迅速な遺伝子発現プロファイリング用のフォーマットの実現、すなわち、一組の指定されたメッセージ(典型的には、その他のメッセージのあるところで)のそれぞれの発生量の同時検出を可能にする。これは、治療薬又は病原菌のような外部刺激に応じて、1組の特異遺伝子発現パターンのモニタリング又はプロファイリングを伴うアプリケーションについて、特に興味深い。
1.RTプライマ/T7/セレクタ構造を用いるcDNA合成(逆転写による)
2.使用されない構造の除去−一つのモードにおいては、cDNAの捕捉による
3.個々のcDNAに対応するセレクタ配列の線形増幅
4.逆転写/ハイブリダイゼーションによるRNA生成物のオンチップ検出
代替的に、ステップ3と4を組み合わせてもよい。:
3.以下に詳細に述べるように、微小粒子の「共集合」アレイを用いた同時増幅/検出
設計の柔軟性 − mRNAに沿ってどこにでもプライマ配列を配置できることによって、米国特許出願第10/974,036号に述べられているように、オンチップ検出により検出される生成物のサイズを制限するために、ここに開示したsst−IVT反応は、mRNAの5’末端近くに、又は、従来の遺伝子発現法で要求されるように3’末端近くにプライマを配置する必要がなくなり、従って設計の柔軟性が改善される。更に、元のターゲット配列における類似度にかかわらず、配列内で異なる転写物を生成することにより多重分析の特異性が実質的に強化されている。
多重対立遺伝子を計数するために、対立遺伝子特異的逆転写、又は対立遺伝子特異的核酸連結をsst−IVTと結合して、例えば類似した遺伝子の存在下で、指定された遺伝子の発現パターンを選択的に決定し、対立遺伝子の多型性を検出できる(Syvanen A.C.,2005)。
対立遺伝子特異的逆転写は、次の4つのステップを具えるアッセイプロトコルにおいてIVTと結合される(図3):
1.T7/セレクタ及び逆転写によるcDNA合成を伴う、対立遺伝子特異的逆転写プライマのアニーリング(DNA分析の場合:DNAポリメラーゼを用いたプライマ伸長);
2.未使用プライマの除去(ここに述べた利用可能な方法の1つを使用);
3.セレクタ配列の転写;
4.逆転写又はハイブリダイゼーションによる結果として生ずるRNAのオンチップ検出
RNA鋳型を用いた対立遺伝子特異的核酸連結(米国特許第5,686,243号、米国特許出願第US 2003/0082584 A1号)をIVTと結合し、次の4つのステップを具えるプロトコルにおいて、対立遺伝子特異の線形増幅を確実に行う(図4):
1.設計された対象の変異部位に隣接する、2つのオリゴヌクレオチドプローブ−1つは「プロモータ」、もう一つは「セレクタ」−のmRNA鋳型へのアニーリング;
2.無傷のプロモータ−セレクタ構造を生成するプローブの連結;
3.セレクタ配列の転写
4.逆転写又はハイブリダイゼーションによる結果として生ずるRNAのオンチップ生成
本発明の方法は、gDNAの分析やPCRにより生成される単位複製配列に容易に適用される。好ましい実施例においては、プライマ−プロモータ−セレクタ構造は、対象のDNA部分配列に対向して方向付けられる。次いで、単鎖DNAへの構造のアニーリングを可能にする条件(例えば、加熱によるdsDNAターゲットの変性)下で、3’末端で又は3’末端近傍で合致する時に、この構造がDNAポリメラーゼ触媒反応液中で伸長される(図3)。
染色体及び遺伝子の複数コピーの存在は、いくつかの障害、例えばダウン症(Dutta S.,2005)及び脊髄性筋萎縮症(SMA)(Ogino S.,2004)や、いくつかの癌の類型:乳がん(Seo,M.Y.ら,2004)、皮膚がん(Sellers,W.R.2005)及びその他のがんと関連することが知られている。遺伝子のコピー数によって、特定の薬での治療、例えば、ゲフィチニブでの肺がん治療(Hirsch F.R.2005)に対する患者の反応を予測することができる。このように、迅速で便利な分析フォーマットは、日常の臨床上の処理を行う上で所望されている。
突然変異又は多型性を表すDNA配列中の変異部位は、ここに述べた対立遺伝子特異的分析方法を用いて分析することができ、DNAポリメラーゼ触媒伸長用の特異的プライマを使用する。同様にして、上述した、RNA分析用の核酸連結媒介分析方法は、DNA分析に容易に適用され、核酸連結のための鋳型として単鎖DNAを用いている。従来の核酸連結媒介対立遺伝子とSNPs識別(Schouten JP.,2002)との主な違いは、核酸連結に続いて構造を増幅するために、PCRの代わりにIVT反応を適用することである。RNA分析と同様に、核酸連結媒介方法は、オリゴヌクレオチドプローブとプライマを除去する必要をなくすという有意な利点を有し、従って、均質のアッセイフォーマットの実現を容易にする。このことは本発明の方法を、ウィルス性病原体の検出と同定を含む、病原体のスクリーニングに適用するとき、特に、以下に詳述するように、続く増幅と検出を伴うウイルス性RNAの濃縮と併用するときに、特に望ましい。
4.1 生成物の同時検出を伴うIVT:共集合ビードアレイ
ここに述べたものは、RNA生成物を生成するためのgDNA、cDNA又はRNAの線形増幅と、平行検出フォーマット、好ましくはランダムコード化アレイ検出(READTM)を用いたこれらの生成物の同時検出とを組み合わせる方法である。
比較的単純なプロトコルによると、更なるステップ、特に、標準プロトコルによるmRNAの磁性粒子への捕捉(米国特許第5,759,820号)とsst−IVT及び多重検出の統合が可能である。核酸連結媒介のRNA分析(ここでは特にウイルス性ゲノムRNAの検出、参照)について図18に示すように、プロモータ−セレクタ構造の2つの要素により、捕捉されたmRNA(又はウイルス性RNA)鎖の合致する部分配列をアニーリングすることが可能であり、核酸連結に続いて、コード化されたビーズ上での増幅及び同時検出が、未使用プロモータを除去する必要なく、上述した共集合のアレイフォーマットに類似した方法で行われる。実際に、核酸連結、sst−IVT及びRT媒介のプローブ伸長は、同一バッファにて行うことができる。
長さ64と62ntであり、それぞれがIL−2RとIL−4IのmRNA用のRTプライミング配列、並びに、T7プロモータ鋳型鎖、及び独特のセレクタ配列をそれぞれ具える2つの異なる構造は、T7プロモータの非鋳型鎖の添加して、あるいはすることなく、ss−IVTの鋳型として用いた。このアプローチの潜在的な感受性を解明するために、これらのプライマの濃度を、100−0.1fmol/10μl rxnの範囲で変化させた。37℃での2時間のインキュベーションの間に(MEGAshortscriptTMT7キット(Ambion,品番1354)により)得られたRNAを、オンチップの逆転写に用いて、次いで、IL−2R及びIL−4Iセレクタに合致する捕捉配列で機能化したコード化ビーズ上で結果信号を検出した(図5)。IL−2R ssDNAについてのIVT反応の時間経過は、37℃で、2、4、6、及び18時間のインキュベーション時間で同様であった。
アッセイにおける第1のステップは、cDNA合成である。長さ64ntのRT/T7/Sel配列からなるRTプライマの構造を、長さ500ntまでのcDNAを生成できるように設計した。用いた試薬は次の通りであった:
カナマイシンmRNA − 正の対照(Promega,品番C1381)
SuperscriptTM III First−Strand Synthesis System(Invitrogen,品番18080−051)
MEGAshortscriptTM T7 キット(Ambion,品番1354)
Cy3 labeled dCTP(Amersham,品番PA53021)
BAS BeadChipTM(BioArray Solutions,Ltd)
PCR精製キット(Qiagen,品番28104)
全ての反応物はサーモサイクラ内で処理した。
結果として生じたIVT反応液10μlを、SuperscriptIII酵素(200U/μl)を1μl、5倍濃度FSバッファを2μl、0.1MのDTTを1μl、10μMのdNTPs(dCTPなし)を2μl、25μMのCy3−dCTPを1μl、DEPC処理の純水3μlのRT混合液10μlと混合し、生成物20μlを、セレクタ配列用のプローブを含む検出ビーズを用いて、集合させたビードチップの上に置いた。このチップを50℃で15分間インキュベーションし、DEPC処理した純水20μlで3回洗い、写像した。結果を図7に示す。
カラム精製とExoI消化の組合せを用いて、濃度の異なる構造と反応させ、最適なRT構造濃度の範囲を決定する実験を行った。特に、事前にExoI処理をして、あるいはせずに、反応混合物をカラム(Qiagen,品番28104)上に配置した。カラム精製に続いて、2μlの溶出液部分を直接sst−IVT反応に用い、RNA生成物をオンチップRT媒介のプローブ伸長により検出した(図8)。構造1μl(濃度が異なる)、ExoI(New England BioLabs(NEB),品番M0293S)1μl、5倍濃度のFSバッファ2μl(例2を参照)からなる反応混合物10μl中で、37℃で30分間ExoI処理を行い、次いで80℃で20分間ExoIを不活性化した。消化に最適なバッファ条件は、ExoI10倍濃度バッファ(NEB)により提供されるが、FSバッファを用いて、アッセイのExoI処理の実際の条件を再現した。
まず、RNaseH消化の必要性を、RNAに対するアニール化オリゴヌクレオチドの構成が、実際のアッセイにおける構成に似ていると仮定したモデル系で試験した。その構造は、長さ50ntのIL−2R RNAを有し、RNAに対してアニール化するRT構成部分のみを有するRT/T7/Sel構造をアニーリングした結果、得られた。sst−IVT反応に続いて、生成物を逆転写によりオンチップで検出した。別の条件を図10の説明で示す。RNaseH(2U/μlのうちの1μl,Invitrogen,品番18021−014)消化を、37℃で20分間行った。
対照を含めて、この反応は特定の濃度の構造に対して行った。100fmol/μlでの3’−末端をビオチン化したssDNA RT/T7/Sel IL−2Rの1μlを磁性ビーズ(0.2μmのナノ粒子,分子プローブ,品番C−21476)10μlに添加して、15分間インキュベーションして、その後、10mMのTrisHCl pH8で広く洗浄した。最終的な量を、構造濃度10fmol/μlのビーズを有するように、を10μlに調整した(図12、1列目)。IVT混合物(例2を参照)10μlを、固定化構造に添加し、反応混合物を37℃で2時間インキュベーションした。生成物をRT eMAP法により検出した。2列目は洗浄ステップのない同一の構成を表し、3列目は磁性ビーズがない状態の同一実験、すなわち、溶液中のIVT反応を表している。3つのケース全てにおいて、構成濃度は、10fmol/μlに調整した。
あるアプリケーションでは、対象のターゲットを伴う実質的な配列相同性を示す数百又は数千のターゲット集団内での特異なターゲットの検出を要する。これらのアプリケーションは一般的に、ハイブリダイゼーションを介する分析により提供されるもの以上の配列特異性を必要とする。上述した2つの設計を用いて、トウモロコシゼイン遺伝子ファミリ中のmRNA配列の非常に近い相同部分を検出した。2つのトウモロコシ近交系B73とBSSS53において、ゼイン遺伝子のあるmRNA配列は、全945ntの配列上で、95%乃至99%の相同度を示す。これらの配列を検出し、現行の方法でそれぞれの発現レベルを評価する課題は、非常に困難な処理であり、多数のクローンセットを配列することが必要である。
T7プロモータ及び28ntの転写配列(Kan mRNAの5’−末端に等しい)を含み、及び非鋳型(NT)鎖の3’−末端をビオチン化したDNAを、濃度の異なるビードチップへ塗布し、捕捉可能にするために初期の10分のインキュベーションを行って、残留遊離DNAは洗浄によって除去した。同時のIVT/RT反応用の試薬の混合物20μlを、次いでチップ表面上に塗布した。反応混合物は、各75mMのNTPs2μl、T7の10倍濃度反応バッファ2μl、T7の酵素混合物2μl、0.1μMのT7プロモータ用NT部位2μl、10μMのdNTP混合物(dCTP無し)2μl、25μMのCy3 dCTPを1μl、Superscript III酵素(200U/μl)を1μl、及びDEPC処理純水2μlを含んでいた。反応は吸湿チャンバ内でオンチップで行い、37℃で1時間インキュベーション(IVT)して、その後、50℃で15分間のインキュベーション(RT媒介プローブの伸長)を行った。結果と実験スキームを図17と図16にそれぞれ示す。
Claims (78)
- サンプルにおけるターゲット配列の存在を検出するための構造であって、プライマ部分配列、プロモータ部分配列、及びセレクタ部分配列を含み、前記プライマ部分配列の5’末端が前記プロモータ部分配列の3’末端に連結し、前記プロモータ部分配列の5’末端が前記セレクタ部分配列の3’末端に連結し:
i.前記プライマ部分配列が前記ターゲット配列と相補的であり;
ii.前記プロモータ部分配列が前記セレクタ部分配列の転写を方向付けることが可能であり;
iii.前記セレクタ部分配列及びその相補性部分配列が、前記サンプルに存在する任意の部分配列とアニーリングしないことを特徴とする構造。 - 請求項1に記載の構造において、該プロモータが、前記プライマ部分配列の転写を方向付けしないことを特徴とする構造。
- 請求項1に記載の構造において、該プロモータが、T7若しくはT3又はSP6プロモータ部分配列であることを特徴とする構造。
- 請求項1に記載の構造において、前記プライマ部分配列が鋳型にアニーリングし、伸長しうることを特徴とする構造。
- 請求項1に記載の構造において、当該構造が同定可能な標識を含むことを特徴とする構造。
- 請求項1に記載の構造において、前記セレクタ部分配列が、インビトロ転写用の鋳型として作用することを特徴とする構造。
- サンプルにおける別個のターゲット部分配列の存在を検出するための複数の異なる型のプライマ−プロモータ−セレクタ構造を含むキットであって、各々の構造がプライマ部分配列、プロモータ部分配列、及びセレクタ部分配列を含み、前記プライマ部分配列の5’末端が前記プロモータ部分配列の3’末端に連結し、前記プロモータ部分配列の5’末端が前記セレクタ部分配列の3’末端に連結し:
i.前記プライマ部分配列が前記ターゲット配列と相補的であり;
ii.前記プロモータ部分配列が前記セレクタ部分配列の転写を方向付けることが可能であり;
iii.前記セレクタ部分配列及びその相補性部分配列が、前記サンプルに存在する任意の部分配列とアニーリングしないことを特徴とするキット。 - 請求項7に記載のキットにおいて、該異なる型の構造の各々のプライマ部分配列及びセレクタ部分配列が異なることを特徴とするキット。
- 請求項7に記載のキットにおいて、各々の構造の型のプライマ部分配列が異なり、セレクタ部分配列が同一であることを特徴とするキット。
- 請求項7に記載のキットが、前記転写産物に組み込み可能な標識NTPsを更に含むことを特徴とするキット。
- 請求項10に記載のキットにおいて、前記NTPが光学標識されることを特徴とするキット。
- 請求項7に記載のキットにおいて、該プロモータが、T7若しくはT3又はSP6プロモータ配列であることを特徴とするキット。
- 請求項12に記載のキットが、該T7、T3又はSP6プロモータ部分配列と二本鎖を形成可能な非鋳型T3、T7又はSP6プロモータ部分配列を更に含むことを特徴とするキット。
- 請求項7に記載のキットが、異なる型のオリゴヌクレオチドを付着させるように構成した別個にコード化した一組の微小粒子を更に含むことを特徴とするキット。
- 請求項7に記載のキットが、前記プライマ部分配列が伸長するときに伸長産物に組み込まれるように設計された、一組の標識したddNTP又はdNTPを更に含むことを特徴とするキット。
- 請求項7に記載のキットが、ハプテン標識したddNTP又はdNTPを更に含むことを特徴とするキット。
- 請求項16に記載のキットが、分離を促進するための磁性粒子を更に含むことを特徴とするキット。
- 請求項7に記載のキットが:
(a)前記ターゲット配列の3’側に配置された前記サンプルにおけるターゲット部分配列;又は
(b)前記プライマ部分配列;
とアニーリング可能なオリゴヌクレオチドを更に含むことを特徴とするキット。 - 請求項18に記載のキットにおいて、前記オリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とするキット。
- サンプルにおけるターゲット配列の相対的発生量を決定する方法であって:
a.少なくとも1のプライマ−プロモータ−セレクタ構造をサンプルにおけるターゲット配列に結合するステップであって、該構造がプライマ部分配列、プロモータ部分配列、及びセレクタ部分配列を含み、前記プライマ部分配列の5’末端が前記プロモータ部分配列の3’末端に連結し、前記プロモータ部分配列の5’末端が前記セレクタ部分配列の3’末端に連結し:
i.前記プライマ部分配列が前記ターゲット配列とアニーリングし;
ii.前記プロモータ部分配列が前記セレクタ部分配列の転写を方向付けることが可能であり;
iii.前記セレクタ部分配列及びその相補性部分配列が、前記サンプルに存在する任意の部分配列とアニーリングしないステップと;
b.前記セレクタ部分配列を増幅するステップと;
c.増幅産物の相対量を検出するステップと;
を具えることを特徴とする方法。 - 請求項20に記載の方法において、前記プライマ部分配列及び前記ターゲット配列が増幅しないことを特徴とする方法。
- 請求項20に記載の方法において、前記セレクタ部分配列の増幅がインビトロ転写(IVT)によるものであり、前記増幅産物が、前記セレクタ部分配列に相補的な配列を含むRNAであることを特徴とする方法。
- 請求項20に記載の方法において、前記ターゲット配列がmRNA及びウイルス性RNAを含むRNA、ゲノムDNA、又はPCR産物であることを特徴とする方法。
- 請求項23に記載の方法において、前記ターゲット配列が前記プライマ部分配列とアニーリング可能な形態で存在することを特徴とする方法。
- 請求項23に記載の方法において、前記ターゲット配列が特定遺伝子の対立遺伝子であることを特徴とする方法。
- 請求項23に記載の方法が、ターゲット配列とアニーリングしなかった構造から、前記ターゲット配列とアニーリングした構造を分離するステップを更に具えることを特徴とする方法。
- 請求項23に記載の方法において、前記プライマ−プロモータ−セレクタ構造のプライマ部分を伸長するステップを更に具えることを特徴とする方法。
- 請求項27に記載の方法において、該伸長したプライマを含む構造が、伸長しなかった構造から分離されることを特徴とする方法。
- 請求項26に記載の方法において、該アニーリングと伸長とをしなかった構造又は未反応の転写反応試薬の分離が、サイズ排除又は親和力分離、磁力分離を含む固相分離、酵素処理、又はこれらの任意の組合せによって行われることを特徴とする方法。
- 請求項27に記載の方法において、該伸長が鋳型を媒介した伸長又は鋳型を媒介した核酸連結によって行われることを特徴とする方法。
- 請求項30に記載の方法において、伸長によって、標識したdNTP、ddNTP又は標識したオリゴヌクレオチドが組み込まれることを特徴とする方法。
- 請求項27に記載の方法において、前記伸長構造が固相に捕捉されることを特徴とする方法。
- 請求項32に記載の方法において、前記固相が磁性粒子であることを特徴とする方法。
- 請求項30に記載の方法において、前記伸長及び核酸連結が対立遺伝子に特異であることを特徴とする方法。
- 請求項20に記載の方法において、前記増幅産物の相対量を検出するステップが、コード化した微小粒子上に陳列されたプローブのRT触媒伸長によるものであり、前記増幅産物が伸長用の鋳型として作用することを特徴とする方法。
- 請求項35に記載の方法において、検出が増幅と同時に行われることを特徴とする方法。
- 請求項36に記載の方法において、該同時に行われる増幅及び増幅産物の検出が100nl以下の反応量で生じることを特徴とする方法。
- 請求項22に記載の方法において、前記IVT反応によって、検出可能な光学的特性が該RNA産物に導入されることを特徴とする方法。
- 請求項22に記載の方法において、前記増幅産物の相対量を検出するステップが、コード化した微小粒子に陳列される捕捉プローブと増幅産物をアニーリングすることによるものであることを特徴とする方法。
- ゲノムサンプルにおけるヘテロ接合体の喪失を決定する方法であって:
a.対立遺伝子に特異的であり、遺伝子の正常型対立遺伝子に特異的な第1のプライマ−プロモータ−セレクタ構造と、対立遺伝子に特異的であり、遺伝子の変異型対立遺伝子に特異的な第2のプライマ−プロモータ−セレクタ構造とを用いるステップであって、各々の構造がプライマ部分配列、プロモータ部分配列、及びセレクタ部分配列を含み、前記プライマ部分配列の5’末端が前記プロモータ部分配列の3’末端に連結し、前記プロモータ部分配列の5’末端が前記セレクタ部分配列の3’末端に連結し:
i.前記プロモータ部分配列が前記セレクタ部分配列の転写を方向付けることが可能であり;
ii.前記セレクタ部分配列及びその相補性配列が、該サンプルに存在する任意の部分配列とアニーリングしないステップと;
b.前記構造の前記プライマ部分配列を前記ゲノムサンプルとアニーリングするステップと;
c.該セレクタ配列を増幅するステップと;
d.該増幅した対立遺伝子の相対発生量を示す信号強度を決定し、ヘテロ接合体の喪失があるかどうかを決定するステップと;
を具えることを特徴とする方法。 - 請求項20に記載の方法が、遺伝子発現分析、対立遺伝子の計数、又は対立遺伝子コピー数決定に用いられることを特徴とする方法。
- 遺伝子発現分析のためにmRNAのサンプルに存在する第1のターゲット配列の相対量を決める方法であって、当該方法が:
a.前記ターゲット配列を含むmRNAのサンプルを提供するステップと;
b.プライマ部分配列と、プロモータ部分配列と、セレクタ部分配列とを含む構造を提供するステップであって、前記プライマ部分配列の5’末端が前記プロモータ部分配列の3’末端に連結し、前記プロモータ部分配列の5’末端が前記セレクタ部分配列の3’末端に連結し:
i.前記プロモータ部分配列が前記セレクタ部分配列の転写を方向付けることが可能であり;
ii.前記セレクタ部分配列及びその相補性配列が、前記サンプルに存在する任意の部分配列とアニーリングしないステップと;
c.前記構造の前記プライマ部分配列をサンプルにおける遺伝子材料とアニーリングするステップと;
d.mRNAとアニーリングしない前記構造を除去するステップと;
e.指定期間中に、該セレクタ配列を転写するステップと;
f.該転写によって産生したRNAの量を決定するステップと;
g.前記サンプルにおける前記第1のターゲット配列の相対量を示すために、同一の反応ステップa)ないしf)で産生するが、第2のターゲット配列及び別個セレクタで産生したRNA量に対して、前記RNA量を相関させるステップと;
を具えることを特徴とする方法。 - 請求項42に記載の方法において、前記mRNAが細胞から分離されるか、あるいはゲノムDNA、PCR産物、又は増幅反応物から産生されることを特徴とする方法。
- 請求項42に記載の方法において、該転写プライマ−プロモータ−セレクタ構造が、T3若しくはT7又はSP6プロモータ配列を具えることを特徴とする方法。
- 請求項42に記載の方法において、前記セレクタ部分配列又はその相補性部分配列のいずれも、前記mRNAのサンプルにおいて部分配列と相補性ではないことを特徴とする方法。
- 請求項45に記載の方法において、いくつかの構造が前記mRNAにおけるいくつかの指定された部分配列の量を決定し、各々の構造の特定のセレクタ部分配列が特定のプライマ部分配列に関連づけられることを特徴とする方法。
- 請求項42に記載の方法において、前記転写が前記セレクタ部分配列と相補的な標識したRNA部分配列又は標識しないRNA部分配列を産生することを特徴とする方法。
- 請求項42に記載の方法において、RNAが、微小粒子に陳列されたオリゴヌクレオチドとアニーリングすることによって捕捉されることを特徴とする方法。
- 請求項48に記載の方法において、前記RNAの量が、捕捉した、標識したRNAオリゴヌクレオチドに関連する光学信号を記録することにより決定されることを特徴とする方法。
- 請求項49に記載の方法において、光学信号を産生可能な検出用の部分が、標識したヌクレオチドを用いて、転写時に前記RNAに添加されることを特徴とする方法。
- 請求項50に記載の方法において、前記標識したヌクレオチドが、フルオロフォアを含むことを特徴とする方法。
- 請求項51に記載の方法において、前記標識したヌクレオチドが、フルオロフォアを含む抗体で修飾可能なハプテンを含むことを特徴とする方法。
- 請求項48に記載の方法において、前記オリゴヌクレオチドが、コード化した微小粒子に陳列されることを特徴とする方法。
- 請求項52に記載の方法において、捕捉に続いて、前記オリゴヌクレオチドが伸長し、標識したdNTP若しくはddNTP又は標識しないdNTP若しくはddNTPが添加されることを特徴とする方法。
- 請求項48、52、又は53のいずれか1項に記載の方法において、前記RNAの相対量が、該捕捉したRNAオリゴヌクレオチドに関連する光学信号の強度を、前記別個の指定された部分配列に関連する光学信号の強度と相関させることにより決定されることを特徴とする方法。
- 請求項42に記載の方法が、前記サンプルにおける同一又は別個のmRNAにある追加の指定された部分配列を、当該追加の指定された各部分配列について同一ステップa)乃至g)を行った後にモニタリングするステップを更に具えることを特徴とする方法。
- 請求項44に記載の方法が、前記T7プロモータ部分配列と二本鎖を形成する別のT7プロモータ部分配列を更に含むことを特徴とする方法。
- 請求項42に記載の方法において、該ステップc)が、結合したハプテンを含むヌクレオチドを有する前記構造を伸長するステップと、該伸長した構造を前記ハプテン用の配位子を保有する微小粒子に捕捉させるステップとを更に具えることを特徴とする方法。
- 請求項58に記載の方法が、アニーリングされないか、あるいは伸長されない構造からの精製に続く、前記伸長構造の捕捉ステップを更に具えることを特徴とする方法。
- 請求項58に記載の方法において、前記ハプテンがビオチン又は抗原部分であり、前記配位子がストレプトアビジン若しくはニュートラアビジン又は抗体であることを特徴とする方法。
- 請求項58に記載の方法において、前記微小粒子が、請求項48に記載の微小粒子を更に含むビードアレイにあることを特徴とする方法。
- DNA又はRNAのサンプルにおけるターゲットの多型部位又は突然変異部位の存在を決定する方法であって:
a.前記多型部位又は突然変異部位を含むRNA又はDNAのサンプルを提供するステップと;
b.該対象の各部位のためにプライマ−プロモータ−セレクタ構造を提供するステップであって、各々の構造がプライマ部分配列、プロモータ部分配列、及びセレクタ部分配列を含み、前記プライマ部分配列の5’末端が前記プロモータ部分配列の3’末端に連結し、前記プロモータ部分配列の5’末端が前記セレクタ部分配列の3’末端に連結し:
i.前記プライマ部分配列が前記ターゲットの多型部位又は突然変異部位をアニーリングし;
ii.前記プロモータ部分配列が前記セレクタ部分配列の転写を方向付けることが可能であり;
iii.前記セレクタ部分配列及びその相補性配列が、前記サンプルに存在する任意の部分配列とアニーリングしないステップと;
c.前記RNA又はDNAの配列領域と相補的なヌクレオチドで伸長構造を産生するために、該3’方向に前記プライマ部分配列を伸長するステップであって、前記ヌクレオチドが前記伸長構造に組み込まれる親和性ハプテンを含み、前記ターゲットの配列のヌクレオチドが前記プライマ部分配列の3’末端と相補的であるステップと;
d.固体担体表面に陳列した配位子に前記親和性ハプテンを結合することにより過剰な未使用の構造から前記伸長構造を分離するステップと;
e.RNAを産生するために、前記固体担体に結合した前記伸長構造の該セレクタ配列を転写するか、あるいは前記固体担体に結合しない前記伸長構造の前記セレクタ配列を転写するステップと;
f.産生したRNAの存在を決定するステップと;
を具えることを特徴とする方法。 - 請求項62に記載の方法において、前記親和性ハプテンがビオチン又は抗原部分であり、前記配位子がストレプトアビジン若しくはニュートラアビジン又は抗体であることを特徴とする方法。
- 請求項62に記載の方法において、前記固体担体が磁性又は常磁性であり、前記固体担体へのハプテンの結合に続き、前記固体担体がその位置を固定するように磁力で引きつけられ、次いで未使用構造が除去されることを特徴とする方法。
- 請求項62に記載の方法において、前記固体担体が親和力カラムの形態であるか、あるいは分離がカラム分離を含むことを特徴とする方法。
- 請求項62に記載の方法において、前記RNAの除去がなされるか、あるいは前記構造の伸長に続いて適所に保持されることを特徴とする方法。
- 請求項65に記載の方法において、前記除去がRNaseHにより触媒された消化によるものであることを特徴とする方法。
- 請求項62に記載の方法において、カラム分離がエキソヌクレアーゼI処理に先行することを特徴とする方法。
- 請求項62に記載の方法において、産生したRNAがコード化した微小粒子に陳列したオリゴヌクレオチドにアニーリングすることによって捕捉し、別個のコード化した微小粒子が別個のオリゴヌクレオチドを陳列することを特徴とする方法。
- 請求項62に記載の方法において、分離に続いて、前記オリゴヌクレオチドが標識した伸長産物を産生するように、標識したdNTP又は標識したddNTPを含む反応において伸長することを特徴とする方法。
- 請求項62に記載の方法において、RNAが標識したNTPの組み込みによって標識されることを特徴とする方法。
- 請求項70又は71に記載の方法において、特異なオリゴヌクレオチドを陳列することが既知の微小粒子からの信号によって、多型又は突然変異の存在が同定されることを特徴とする方法。
- 請求項62に記載の方法において、対象の各々の多型部位/突然変異部位に対して構造対が提供され、第1のセレクタ部分配列を含む前記対の一方のヌクレオチドが3’末端で、該プライマが該正常型の対立遺伝子と相補的であり、第2のセレクタ部分配列を具える前記対の他方のヌクレオチドが3’末端で、前記プライマが変異型の対立遺伝子と相補的であることを特徴とする方法。
- DNA又はRNAのサンプルにおいて多型部位又は突然変異部位の存在を決定する方法であって:
a.前記多型部位又は突然変異部位を含むRNA又はDNAのサンプルを提供するステップと;
b.各々の前記多型部位又は突然変異部位のために:
i.前記多型部位又は突然変異部位に直接的に連結したヌクレオチドに相補的な3’末端のヌクレオチドを含むプライマ部分配列と;
ii.セレクタ部分配列と;
iii.前記セレクタ部分配列の転写に向かうように方向付けることが可能な転写プロモータの部分配列と;
を含む構造を提供するステップと;
c.対象の部位で前記ヌクレオチドと相補的な5’末端を含むオリゴヌクレオチドを提供するステップと;
d.核酸連結産物を産生するために第1のオリゴヌクレオチドと前記構造とを核酸連結するステップと;
e.余分な核酸連結されない構造を除去するステップと;
f.RNAを産生するために、前記核酸連結産物のセレクタ配列を転写するステップと;
g.産生したRNAの存在を決定するステップと;
を具え、前記プライマ部分配列の5’末端が前記プロモータ部分配列の3’末端に連結し、前記プロモータ部分配列の5’末端が前記転写プロモータの部分配列の3’末端に連結することを特徴とする方法。 - 請求項74に記載の方法が、標識したdNTPsを有する前記核酸連結産物を伸長する、ステップ(d)とステップ(e)との間のステップであって、前記標識を配位子によって結合可能な部位を提供するステップと、固体担体表面上に陳列した配位子に該1以上の標識を結合することによって、前記核酸連結産物をターゲットから分離する、ステップ(e)とステップ(f)との間のステップとを更に具えることを特徴とする方法。
- 請求項74に記載の方法が、サンプルにおけるウイルスからmRNAの存在を検出するのに用いられ、磁性捕捉ビーズが対象のmRNAとハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド保有する共集合ビードアレイと、コード化検出ビーズが、ステップa.ないしf.における反応で得られる前記RNAを特徴づけるべくオリゴヌクレオチドを保有することを特徴とする方法。
- 対象が突然変異の遺伝子座及び/又は多型の遺伝子座に対してホモ接合型、ヘテロ接合型、又は正常型であるかどうかを決定する方法であって、請求項62又は74に記載の方法を実施するステップと、当該ステップによって産生される変異型のRNAに対する正常型のRNAの相対数及び比率を決定するステップとを具えることを特徴とする方法。
- 請求項62又は74に記載の方法が、対象におけるヘテロ接合型の喪失を決定するために用いられることを特徴とする方法。
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