JP5453435B2 - ナトリウム−プロトン−交換体リガンド効率の測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、イオンチャネルリガンドの効率の測定方法に関する。

膜輸送体のＮａ⁺／Ｈ⁺交換体又はナトリウム−プロトン−交換体（ＮＨＥ）ファミリーは、細胞からのＨ⁺流出を駆動するために細胞外から細胞内へのＮａ⁺勾配を利用する。これらのグループの輸送体（又はイオンチャネル）によって実施される必須機能のなかには、細胞体積及びｐＨの調節、細胞増殖及びＮａ⁺の経上皮輸送における許容的役割がある。哺乳動物のＮＨＥは、1つの細胞外ナトリウムイオンについて１つの細胞内プロトンを交換する働きをする内在性膜タンパク質である。ＮＨＥは、イオン流量（ion fluxes）に関与することによって細胞内ｐＨ及び細胞体積を調節し、そして細胞の成長又は機能的状態に変化を起こすのに役立つ。ＮＨＥは、その生理学的役割を除いてヒトの病理において重要な役割を果たしている。ＮＨＥによる輸送は、心筋梗塞中及びその後にヒト心筋に生じる損傷において重要な役割を果たしており、そしてがん細胞の発がん性形質転換における重要な工程に相当すると考えられる。従って、ＮＨＥは、長年、心臓血管の発がん研究における標的であり、そして何千もの化合物がＮＨＥ阻害及び選択性のためにスクリーニングされてきた。

ＮＨＥアンタゴニストの効力を測定する標準方法は、Schwark及び共同研究者（非特許文献１）並びにWiemann及び共同研究者（非特許文献２）によって記載されたインビトロアッセイである。選択されたＮＨＥにおいてリガンドのＩＣ₅₀を測定した後、他のＮＨＥに対する選択性を、同じアッセイで測定することができる。一般に、良好な選択性を有する強力なリガンドが、薬物動態、リガンドのインビボ試験などによるさらなる研究のために選ばれた。しかしながら、いくつかのきわめて強力な化合物は、インビボ研究においてわずかな効果しか示さなかった。その理由は、高いタンパク質結合、低い生物学的利用能又は血漿中の化合物の有効濃度を低下させる他の効果である可能性がある。時間及び資源を節約するため、薬物開発プロセスのきわめて早期にそれらの化合物を排除することが望ましい。いくつかの化合物のインビトロＩＣ₅₀と薬理学的効力（効率）との間に不一致があったため、体内でのＮＨＥリガンド又は他のイオンチャネルのリガンドの効率を測定する又はシミュレーションする方法を開発する必要があった。

Schwark et al., 1998, Pfluegers Arch., 336(5)：797-800 Wiemann et al., 1999, Pfluegers Arch., 436(3)：255-262

従って、イオンチャネルリガンド効率の測定方法を提供することは、本発明の第１の目的であった。好ましくは、この試験は、時間及び費用効果が高くなければならない。本明細書に関して、イオンチャネルという用語は、受動的イオンチャネルだけでなく能動的イオンチャネル（イオン輸送体）も含むことが理解される。

驚くべきことに、イオンチャネルリガンド、特にＮＨＥアンタゴニストの効率は、イオンチャネルを発現する細胞を動物の血漿及びイオンチャネルリガンドと接触させることによって測定できることがわかった。この試験では、細胞におけるイオンチャネルリガンドの効果を測定することが可能であり、その際、この効果は、リガンドのインビボ効率を反映している。

従って、第１の態様において、本発明は、
ａ）イオンチャネルを発現する細胞を
ｉ）動物の血漿、及び
ｉｉ）イオンチャネルリガンド
と接触させる工程；及び
ｂ）細胞に対するイオンチャネルリガンドの効果を測定する工程：
を含む、イオンチャネルリガンドの効率の測定方法を提供する。

簡潔には、方法は以下のように実施することができる：当該イオンチャネルを発現する適切な細胞を適切な条件下で維持（例えば培養）し、そして動物の血漿及びイオンチャネルリガンドと接触させる（インキュベートする）。両成分は、同時に又は並行して加えてもよい。細胞における効果を考慮するのに十分な時間の後、細胞における効果を測定する。接触させた後に又は同時に、効果（シグナル）を観察し、その際、効果の検出は、細胞におけるイオンチャネルリガンドの効果を表している。

本発明に関する「イオンチャネルリガンドの効率」という用語は、イオンチャネルリガンドの薬理学的効力のことである。血漿がない場合のインビトロアッセイと対照的に、血漿存在下で実施される本発明の方法は、タンパク質結合の量、吸収の程度及び速度、リガンド有用性の分布、代謝及び排泄及び／又は血漿中の化合物の有効濃度を低下させる他の効果を説明している。また、リガンドを動物に投与し、そして動物から血漿を採取したときには、方法は、吸収の程度及び速度、リガンドの分布、代謝及び排泄を説明している。これらの効果は、薬物の物理的性質（疎水性、ｐＫａ、溶解度）、薬物製剤、給餌又は絶食状態での投与、日周期の特徴及び／又は他の薬物、食物又は内因性物質（例えば酵素）との相互作用において左右されうるが、それらに制限されるわけではない。従って、「イオンチャネルリガンドの効率」という用語は、イオンチャネルへのリガンドの結合、そして下流シグナル伝達の誘発だけでなく、また血漿及び／又は生存動物におけるリガンドの上記効果のことをいう。これにより、例えばインビボ療法に適切な薬物候補物質をより都合よく同定する及び／又は低いインビボ効率を有する化合物を排除することが可能となる。

細胞に対するリガンドの効果は、形態変化、細胞内化合物の生存能力又は組成を含むがそれらに制限されない細胞におけるあらゆる効果であってもよい。効果は、イオンチャネルに対するリガンドの結合を含むイオンチャネルのシグナル伝達、イオンの流量、細胞内標的のような標的に対するそれぞれのイオンの結合、セカンドメッセンジャー（例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ²⁺、ＩＰ₃、ジアシルグリセロールなど）のような細胞の化合物の量の測定、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ又はＭＡＰキナーゼのような細胞内タンパク質の活性化状態の測定、ｍＲＮＡ又はタンパク質の量の測定、細胞機能のなんらかの変化（例えばアポトーシス又は細胞周期停止の誘発）などの任意のレベルであることができる。

この方法は、インビボでのイオンチャネルのリガンド効率を測定する又はシミュレーションするために使用することができる。方法の適用範囲の例としては、以下を含む：最初に、イオンチャネルリガンドを投与した動物から得た血漿サンプル中のイオンチャネルリガンドの有効濃度を測定する（例えば、実施例２参照）。リガンドを動物に投与する場合、投与したリガンドの量と比べてリガンド血漿中濃度が低いのは、生物学的利用能が劣っていると解釈することができる（例えば血漿半減期が低いため）。

第二に、ヒト血漿のような血漿中のイオンチャネルリガンドの効果を測定することができる（例えば、実施例２参照）。（当分野で知られているような）血漿を含まないアッセイ（plasma-free assay）で測定されたＩＣ₅₀との比較では、リガンドの血漿結合及びインビボ有用性に対する結論を導くことができる。ＩＣ₅₀における差及び血漿中の効率がきわめて高い化合物は、より早期に排除することができるため、薬物開発における費用節約の可能性がある。今のところ、これらの化合物は、インビボ実験の後でしか排除することができない。

イオンチャネルは、形質膜を横切るイオンの流れを確立し、制御するのを助ける、一般的な孔形成におけるタンパク質である。それは、内在性タンパク質又は、より典型的にはいくつかのタンパク質のアセンブリーである。このようなマルチサブユニットアセンブリーは、通常、形質膜を貫いて、水で満たされた孔を囲んで密接に充填された同一又は相同性のタンパク質の環状配置を含む。いくつかのチャネルでは、もっぱら荷電されたイオンの通過しか許容されないが、典型的なチャネル孔は、その最も狭い地点でちょうど原子１又は２個の大きさである。それは、ナトリウム又はカリウムのような特異的な種類のイオンを導き、膜を通してそれらを運ぶ。いくつかのイオンチャネルでは、孔の通過は、種々のイオンチャネルに応じて、化学的若しくは電気的シグナル、温度、又は機械的な力によって開口又は閉鎖されうる「ゲート」によって決定される。

通常、イオンチャネルは、ゲーティング、それらのゲートを通して通過するイオンの種類及び多くの孔によって特定される。

ゲーティングによって分類する場合、チャネルは、２つの種類、電位依存性イオンチャネル（活性化／不活化は、膜を横切る電位勾配に左右される）及びリガンド依存性イオンチャネル（活性化／不活化は、チャネルに対するリガンドの結合に左右される）に分けられる。

電位依存性チャンネルの例としては、電位依存性ナトリウムチャネル、電位依存性カルシウムチャネル、電位依存性カリウムチャネル、いくつかの一過性受容体電位チャネル（transient receptor potential channels）、過分極活性化環式ヌクレオチド依存性チャネル及び電位依存性プロトンチャネルが含まれる。リガンド依存性チャネルの例としては、カリウムチャネル、例えば内向き整流カリウムチャネル、カルシウム活性化カリウムチャネル及び二孔ドメインカリウムチャネル（two-pore-domain potassium channels）、チャネルロドプシンのような光依存性（light-gated）チャネル及び環式ヌクレオチド依存性チャネルが含まれる。チャネルを通して通過するイオンによって分類する場合、イオンチャネルは、一般に以下のように分類される：
クロライドチャネル、カリウムチャネル、例えば電位依存性カリウムチャネル、カルシウム活性化カリウムチャネル、内向き整流カリウムチャネル及び二孔ドメインカリウムチャネル、ナトリウムチャネル、カルシウムチャネル、プロトンチャネル、例えば電位依存性プロトンチャネル、そして一般的なイオンチャネルは、比較的非特異的であるか、又はほとんどのイオンは一過性受容体電位チャネルを含む。

いくつかのイオンチャネルは、ナトリウム重炭酸共輸送体（Sodium Bicarbonate Cotransporter）及びナトリウムプロトン交換体（ＮＨＥ）のように、細胞内ｐＨに影響を及ぼす。イオンチャネルの活性は、当該イオンチャネルに結合する、自然に分泌される又は自然に分泌されないリガンドによって影響を受けることがある。それらのよく知られた例としては、ナトリウムイオンチャネルを遮断するテトロドトキシン、サキシトキシン、リドカイン及びノボカイン並びにカリウムチャネルを遮断するデンドロトキシン、イベリオトキシン及びヘテロポダトキシン（heteropodatoxin）が含まれる。

これによれば、イオンチャネルリガンドは、イオンチャネルに特異的に結合するなんらかの化学物質である。本発明による「イオンチャネルに対する特異的な結合」には、１０〜４ｍｏｌ／ｌを超えない、好ましくは１０〜５ｍｏｌ／ｌを超えない解離定数ＫＤを有する結合が含まれるが、それらに制限されるわけではない。解離定数ＫＤは、例えば、当業者によく知られたような競合結合実験において、以下の式に従って測定することができ：
Ｂ［Ｌ］＝［Ｌ］／｛［Ｌ］＋Ｋ_DL（１ ＋［Ｌ^*］／Ｋ_DL ^*｝、
ここにおいて、［Ｌ］及び［Ｌ^*］は、それぞれ当該イオンチャネルリガンドの濃度及び検出可能な（例えば、標識化された）イオンチャネルリガンド、例えばイオンチャネルの放射性リガンドの濃度を表す。Ｋ_DL及びＫ_DL ^*は、それぞれ、当該イオンチャネルリガンド及び検出可能なリガンドの解離定数であり、そしてＢ［Ｌ］（０％から１００％まで）は、イオンチャネルリガンドの特定の濃度における結合である。

本発明の好ましい実施態様において、同定されるリガンドは、アゴニスト又はアンタゴニストである。アゴニストは、イオンチャネルに結合し、そして（例えば、立体配置的変化を誘発することによって）それを活性化する。また、アンタゴニスト又は遮断剤もイオンチャネルに結合し、そしてそれを不活性化する。イオンチャネルの状態（活性又は不活性）がリガンドによって変化する場合、活性化及び不活化により検出可能なシグナルを導くことができる。好ましくは、リガンドは、当該イオンチャネルを不活性化するアンタゴニストである。本発明の方法による特徴的なリガンドは、イオンチャネル関連の障害又は疾患の治療及び予防に有用な可能性のある薬物として使用することができる。

本発明の好ましい実施態様において、イオンチャネルは、ナトリウム−プロトン−交換体（ＮＨＥ）又はナトリウム−重炭酸−共輸送体（Sodium-Bicarbonate-Cotransporter）である。細胞において機能する酵素のようなタンパク質の構造は、ｐＨによって大いに影響を受けるため、タンパク質機能にとっては最適ｐＨがある。そのため、細胞内ｐＨの維持及び調節は、細胞機能の恒常性を維持するために細胞にとって極めて重要である。ＮＨＥ及びナトリウム−重炭酸−共輸送体は、細胞のｐＨの調節に関与している。ナトリウム−重炭酸−共輸送体は、細胞膜の内側及び外側のＮａ⁺の濃度勾配によって駆動され、そして１つ又はそれ以上のＨＣＯ₃ ^-イオンと共に１つのＮａ⁺を細胞中に取り込む。ナトリウム−重炭酸−共輸送体は、細胞膜中に存在し、そしてナトリウム−重炭酸−共輸送体によって細胞中に取り込まれたＨＣＯ₃ ^-は、細胞質中でＨ⁺を中和し、細胞内ｐＨの調節に重要な役割を果たす。

また、ＮＨＥは、細胞内ｐＨの調節において重要な役割を果たす。これまで、哺乳動物ＮＨＥファミリーでは９つのアイソフォーム（ＮＨＥ１〜ＮＨＥ９）が同定されている。アイソフォームは、約２５〜７０％の配列同一性を共有しており、約７４０００〜９３０００の範囲の相対分子質量が算出されている。交換体の構造分析は、それらが類似した膜トポロジーを有しており、１２の膜貫通領域からなるアミノ末端膜ドメイン及びより異なるカルボキシ末端細胞質ドメインを有することを示唆している。

Ｎａ⁺／Ｈ⁺交換活性の欠損した腫瘍細胞は、腫瘍の成長に失敗するか又は免疫欠損マウスに移植した際、著しく遅延した成長を示すため、ＮＨＥが腫瘍成長にとって重要であることは、長く知られている。現在明らかなのは、ＮＨＥ1が多くのタイプの形質転換及び／又は悪性細胞においてｐＨ勾配の逆転を生じる結果、細胞内環境がアルカリ性となり、細胞外環境が酸性となることである。この『悪性アシドーシス』は、発がん性形質転換における重要な工程を示すと考えられており、そして形質転換された表現型の発現及び維持に必要である。

さらに、ＮＨＥ、特にＮＨＥ１は、いくつかの疾患の生理に関与しており、多くの研究が心疾患及びがんにおけるＮＨＥ１の役割に焦点を合わせている。ＮＨＥ１は、正常条件下で、心筋において細胞外ナトリウムとの交換により過剰な細胞内酸を除去する。増加した細胞内ナトリウムは、Ｎａ⁺／Ｋ⁺ＡＴＰアーゼ及びＮａ⁺／Ｃａ²⁺交換体を含む調節性膜タンパク質（regulatory membrane proteins）によって除去される。心筋では、心筋梗塞中及びその後にヒト心筋に生じるプロトン産生増加を伴う問題が生じる。

ＮＨＥ１アイソフォームは、交換体の『ハウスキーピング（housekeeping）』アイソフォームであり、そして実質的にすべての組織の形質膜において偏在的に発現される。それは、心筋の形質膜中に見いだされる一次ＮＨＥアイソフォーム（primary NHE isoform）である。また、ＮＨＥ２〜ＮＨＥ５アイソフォームは、形質膜に局在化しているが、より限定された組織分布を有する。ＮＨＥ２及びＮＨＥ３は、主に上皮の頂端膜にあり、そして腎臓及び腸において高度に発現される。これに対して、ＮＨＥ４は、胃において最も豊富にあるが、腸、腎臓、脳、子宮及び骨格筋でも発現され、一方、ＮＨＥ５は主に脳で発現される（しかし、また脾臓、睾丸及び骨格筋を含む他の非上皮性組織において低いレベルで存在することがある）。アイソフォームＮＨＥ６〜ＮＨＥ９は、偏在的に発現され、そして細胞内区画中に存在する。これらの細胞小器官の膜ＮＨＥは、管腔のｐＨ及び細胞内区画のカチオン濃度を調節すると考えられている。ＮＨＥ６発現は、心臓、脳及び骨格筋において最も高く、早期再利用エンドソームに局在化している。ＮＨＥ７アイソフォームは、トランスゴルジ網状構造体に主に局在化しており、そしてＨ⁺と引き換えにＮａ⁺又はＫ⁺のいずれかの流入に介在するという点で他のＮＨＥアイソフォームと異なる。最も高いＮＨＥ８発現は、骨格筋及び腎臓において見いだされ、このアイソフォームは、主に中間〜トランスゴルジ区画に局在化している。最近同定されたＮＨＥ９アイソフォームは、後期再利用エンドソームに局在化することが見いだされた。

ＮＨＥは、利尿化合物アミロリド及びその類似体、並びにベンゾイルグアニジン誘導体による阻害の標的である。異なるＮＨＥアイソフォームの比較は、それらがこれらの阻害剤に種々の親和性を有することを示しており、類似の実験条件下で以下の順序の感受性を有する：ＮＨＥ１≧ＮＨＥ２＞ＮＨＥ５＞ＮＨＥ３＞ＮＨＥ４。ＮＨＥ１は阻害に対して最も感受性のアイソフォームであり、そして心筋の形質膜中に存在する最も重要なアイソフォームであるため、これらの阻害剤の選択的性質は、治療上活用することができる。

本発明の好ましい実施態様において、イオンチャネルは、ＮＨＥ、例えばＮＨＥ１、ＮＨＥ２、ＮＨ３、ＮＨＥ４、ＮＨＥ５、ＮＨＥ６、ＮＨＥ７、ＮＨＥ８又はＮＨＥ９、好ましくはＮＨＥ１、ＮＨＥ２、ＮＨＥ３又はＮＨＥ５、特にＮＨＥ１又はＮＨＥ３、特にＮＨＥ１である。

ＮＨＥ１アイソフォームは、ＮＨＥファミリーのうちで最良の特徴を有するアイソフォームである。ＮＨＥ１は、膜ドメインを表す残基１〜５００個及び細胞質尾部を表す残基５０１〜８１５個を有する長さ８１５個のアミノ酸である。ＮＨＥ１の膜ドメインは、イオン輸送に必要かつ十分であるのに対して、細胞質ゾルドメインは、交換体の活性の調節に関与している。交換体を介したイオン流量は、膜貫通Ｎａ⁺勾配によって駆動され、そして直接的な代謝エネルギー入力を必要としないと考えられる。

上に詳述したように、イオンチャネルリガンドは、好ましくはアゴニスト又はアンタゴニストである。しかし、ＮＨＥの臨床的重要性が大切であるため、リガンドは、好ましくはＮＨＥアゴニスト、より好ましくはＮＨＥアンタゴニストである。当該イオンチャネルがリガンドの不在下で不活性である場合、アゴニストの存在下でアンタゴニストの効果をモニターする必要がありうる。この場合、アンタゴニストの効果は、アゴニスト活性化イオンチャネルの不活化である。

本発明によれば、細胞は、リガンド及び血漿と共にインキュベートされる。細胞は、当該イオンチャネルを発現する任意の適切な細胞であることができる。当該イオンチャネルリガンドを発現する細胞は、イオンチャネルを自然に発現する細胞であってもよい。別法として、イオンチャネルを発現するために細胞を遺伝子操作してもよい。

細胞は、当業者に知られているように単離し（場合により遺伝子操作し）、維持し、そして培養することができる。温度及びガス混合物の他に、細胞培養系で最も一般的に変更される要因は、成長培地である。成長培地の処方は、とりわけｐＨ、グルコース濃度、成長因子及び他の栄養成分の存在で変わることがある。補充培地に用いられる成長因子は、子ウシ血清のような動物血液から得ることが多い。遺伝子操作された細胞は、当業者に知られているようにイオンチャネルの完全長コード配列を挿入することによって得ることができる。当業者は、イオンチャネルタンパク質の核酸配列コーディングを取り出す方法、及び分子生物学の標準技術を用いてこのような核酸配列を単離する又は製造する方法を知っている。これは、例えば、制限酵素を用いて、既存の配列の使用及び組み合わせによって実施することができる。核酸は、イオンチャネルの配列の発現に備えるため、さらなる要素、例えば、プロモーター並びに転写開始及び停止シグナル並びに翻訳開始及び停止シグナルと組み合わせてもよい。得られた核酸配列は、例えばキャリヤー（carrier）としてウイルスを用いて、又は例えばエレクトロポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション及びトランスフェクション剤の使用を含むトランスフェクションによって細胞に導入することができる。

場合により、細胞は組織の一部であってもよいが、しかしながら、本発明の方法は、生体外の方法である。本発明の好ましい実施態様において、
細胞は、細胞株（それらの多くは、十分に特徴づけられており、そして一定の状態及び便利な処理の準備がされている）、特に哺乳動物細胞株、より詳しくはヒト又はマウス細胞株、特にマウスＬＴＫ−細胞株ＬＡＰ１（Franchi et al., 1986, Proc Natl Acad Sci
U S A. 83(24): 9388-9392）からである。適切な細胞株の例としては、ＨＥＫ ２９３、７４５−Ａ、Ａ−４３１、ＢｘＰＣ３、Ｃ５Ｎ、Ｃａｃｏ−２、Ｃａｐａｎ−１、ＣＣ５３１、ＣＦＰＡＣ、ＣＨＯ、ＣＨＯ Ｋ１、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＣＶ−１、ＥＡＨＹ、ＥＡＨＹ ９２６、Ｆ９８、ＧＨ３、Ｈ−２９５ Ｒ、Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ、ＨＡＣＡＴ、ＨＡＣＡＴ Ａ１３１、ＨＥＫ、ＨＥＬ、ＨｅＬａ、Ｈｅｐ Ｇ２、High Five、Ｈｓ７６６Ｔ、ＨＴ２９、ＨＵＶ−ＥＣ Ｒ２４、ＨＵＶ−ＥＣＣ、ＩＥＣ １７、ＩＥＣ １８、Jurkat、Ｋ ５６２、ＫＡＲＰＡＳ−２９９、Ｌ ９２９、ＬＩＮ １７５、ＭＡｔ−ＬＹＬＵ、ＭＣＦ−７、ＭＮＥＬ、ＭＲＣ−５、ＭＴ４、Ｎ６４、ＮＣＴＣ ２５４４、ＮＤＣＫ ＩＩ、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＮＴ２／Ｄ１、Ｐ１９、ＳＦ９、ＳＫ−ＵＴ−１、ＳＴ、ＳＷ ４８０、ＳＷＵ−２ ＯＳ、Ｕ−３７３、Ｕ−９３７及びＹ−１が含まれるが、これらに制限されるわけではない。他の適切な細胞は、当業者に知られているものである。

好ましい細胞株は、ＨＥＫ ２９３細胞（初代ヒト胎児腎臓）、３Ｔ３細胞（マウス胚線維芽細胞）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル細胞株）、ＨｅＬａ細胞（ヒト類上皮子宮頸がん）、ＪＵＲＫＡＴ細胞（ヒトＴ細胞白血病）、ＢＨＫ ２１細胞（ハムスター正常腎臓、線維芽細胞）、及びＭＣＦ−７細胞（ヒト乳房がん）、特にマウスＬＴＫ−細胞株ＬＡＰ１である。

本発明の方法では、細胞（上に定義された通り）を動物の血漿と共にインキュベートする。動物は、脊椎動物、特に哺乳動物、特にラット、マウス、ウサギ、モルモット又はネコであってもよく、それらは、実験室での安全で便利な処理の準備がされている。

また、ヒト薬剤にとって最も意義深い結果を得るためには、血漿をヒトから得ることができる。このために、ヒト供血者から静脈穿刺によって静脈血を得ることができ、その際、本発明の方法では、通常、小さなサンプル、例えば血液のサンプル５ｍｌ〜２５ｍｌのみで十分である（実施例参照）。血液は、最も一般的には腹側前腕（肘を折り曲げる内側）の肘正中皮静脈から得る。この静脈は、皮膚の表面近くにあり、大きな神経分布がない。先進工業国におけるほとんどの血液採取は、プラスチックハブ、皮下注射針及び真空管からなる真空管系を用いて行われる。

本発明の方法によれば、イオンチャネルリガンドの効率が測定される。効率は、血漿の存在下で細胞におけるイオンチャネルリガンドの効果を測定することによって決定される。上に詳述したように、細胞におけるリガンドの効果は、イオンチャネルに対するリガンドの結合、標的に対するそれぞれのイオンの結合、セカンドメッセンジャーのような細胞の化合物の量の測定、ｍＲＮＡ又はタンパク質の量の測定、なんらかの変化をした細胞機能（例えばアポトーシス又は細胞周期停止の誘発）などを含むシグナル伝達の各レベルで評価することができる。標的に対するリガンドの結合を測定する方法は、当業者によく知られており、そして本明細書に定義されたものを含む。また、ｍＲＮＡ又はタンパク質の量を測定する方法は、当業者によく知られている。細胞機能の変化を観察する方法は、細胞機能のタイプに大きく左右され、そして熟練従事者にもよく知られている。

細胞におけるイオンチャネルリガンドの効果の測定方法は、不均一又は均一アッセイを含んでもよい。本明細書に使用されるように、不均一アッセイは、１つ又はそれ以上の洗浄工程を含むアッセイであるのに対して、均一アッセイでは、このような洗浄工程は必要ない。試薬及び化合物を混合して測定するだけである。また、本発明の方法は、イオンチャネル下流シグナルに特異的な抗体を含んでもよい。アッセイは、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＤＥＬＦＩＡ（解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ（dissociation enhanced lanthanide fluoro immuno assay））、ＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ）、フラッシュプレートアッセイ、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイ、ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイ、ＦＰ（蛍光偏光）アッセイ、ＡＬＰＨＡ（増幅ルミネセンス近接ホモジニアスアッセイ（amplified luminescent proximity homogenous assay））、ＥＦＣ（酵素断片相補（enzyme fragment complementation））アッセイ、ツーハイブリッドアッセイ（two hybrid assay）又は免疫共沈降アッセイであってもよい。

本発明の別の実施態様において、効率の検出方法は、１つ又はそれ以上のセカンドメッセンジャー、例えばｃＡＭＰ又はリン脂質、好ましくはフォスファチジルイノシトール−リン酸の測定を含んでもよい。測定は、１つ又はそれ以上のセカンドメッセンジャーの濃度の測定を含んでもよい。１つ又はそれ以上のセカンドメッセンジャーの濃度を測定するための手段及び方法は、当業者によく知られており、そして例えば標識前駆体、好ましくは標識セカンドメッセンジャー前駆体（例えば［³²Ｐ］ＡＴＰ又は［³Ｈ］イノシトール）を必要とするようなものがあり、例えばカラムクロマトグラフィ又は質量分析による精製が含まれる。リン脂質の変化は、通常、特にカルシウムチャネルと関係がある。

当該イオンチャネル、例えばＮＨＥ又はナトリウム−重炭酸−共輸送体がｐＨ値に影響を及ぼす場合、本発明の方法によって測定される効果は、ｐＨ値の変化、好ましくは細胞内ｐＨ値の変化である。

本発明の好ましい実施態様において、当該イオンチャネルにおけるイオンチャネルリガンド、例えばＮＨＥ又はナトリウム−重炭酸−共輸送体の効果は、蛍光によって測定される。

蛍光は、光子の分子吸収がより長い波長を有する別の光子の発光を誘発する光学現象である。吸収された光子と放出された光子との間のエネルギー差は、分子振動又は熱になる。通常、吸収された光子は、紫外線範囲にあり、放出された光は可視領域にあるが、これは、特定のフルオロフォアの吸光度曲線及びストークスシフトに左右される。蛍光用途の数は、生物医学的生物学的及び関連科学において増大している。また、これらの領域の分析方法も発達しているが、ＦＬＩＭ、ＦＬＩ、ＦＬＩＰ、ＣＡＬＩ、ＦＬＩＥ、ＦＲＥＴ、ＦＲＡＰ、ＦＣＳ、ＰＦＲＡＰ、ｓｍＦＲＥＴ、ＦＩＯＮＡ、ＦＲＩＰＳ、ＳＨＲＥＫ、ＳＨＲＩＭＰ、ＴＩＲＦといったような頭字語の形態で不適切な命名が増加している。これらの技術のほとんどは、蛍光顕微鏡を利用する。これらの顕微鏡では、高輝度光源、通常、水銀又はキセノンランプ、ＬＥＤ又はレーザーを使用して観察下のサンプルにおいて蛍光を刺激する。次いで、光学フィルターにより、放出された蛍光から励起光を分離し、目視により、又は（ＣＣＤ）カメラ若しくは他の光検出器（光電子増倍管、分光写真器、など）を用いて検出する。

通常、当該シグナルの効果（ここでは、イオンチャネルリガンドの効果）を検出するために、蛍光色素又はマーカー又は標識が用いられる。蛍光色素には、フルオロフォアが含まれる。フルオロフォアは、発色団と類似して、分子を蛍光性にする分子の成分である。それは、特定の波長のエネルギーを吸収し、そして異なる（しかし、同様に特定の）波長でエネルギーを再放出する分子中の機能性基である。放出されたエネルギーの量及び波長は、フルオロフォア及びフルオロフォアの化学環境の両方に左右される。フルオレセインの反応性誘導体、フルオレッセインイソチオシアネートは、さまざまな用途のための新しい蛍光分子を作るために他の（非蛍光性分子）に化学的に結合された最も一般的なフルオロフォアの１つである。これまでに一般的な他のフルオロフォアは、ローダミン、クマリン及びシアニンの誘導体である。蛍光色素の例としては、７−アミノ−アクチノマイシンＤ、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ、ＡｎａＳｐｅｃ、オーラミンＯ、オーラミン−ローダミン染色剤、ベンザンスロン、９,１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン、５,１２−ビス（フェニルエチニル）ナフタセン、ＣＦＤＡ−ＳＥ、ＣＦＳＥ、カルセイン、カルボキシフルオレセイン、１−クロロ−９,１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン、２−クロロ−９,１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン、クマリン、シアニン、ＤＡＰＩ、Ｄｉｏｃ６、ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ、臭化エチジウム、フルオレセイン、Ｆｕｒａ−２、Ｆｕｒａ−２−アセトキシメチルエステル、緑色蛍光タンパク質、Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ、ヘキスト染色、インディアンイエロー、Ｉｎｄｏ−１、ルシフェリン、ペリレン、フィコビリン、フィコエリトリン、フィコエリトロビリン、ヨウ化プロピジウム、ピラニン、ローダミン、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ルブレン、ルテニウム(ＩＩ)トリス（バソフェナントロリンジスルホナート）、ＳＹＢＲグリーン、スチルベン、スルホローダミン１０１、ＴＳＱ、テキサスレッド、ウンベリフェロン、黄色蛍光タンパク質又はＢＣＥＣＦが含まれるが、これらに制限されるわけではない。

好ましい実施態様によれば、ＢＣＥＣＦが用いられる。ＢＣＥＣＦ（２',７'−ビス−（カルボキシエチル）−５（６）−カルボキシフルオレセイン、Ｃ２７Ｈ２０Ｏ１１）、Ｍ＝５２０，４５ｇ／ｍｏｌＣＡＳ−Ｎｒ．８５１３８−４９−４，貯蔵：２〜８℃，光から保護する）。ＢＣＥＣＦは、細胞内での停留が強化されたためリンパ球におけるｐＨ測定の特徴が改善されたカルボキシフルオレセインの類同代理物（analogon）である。無傷細胞へ有効に取り込むため、ＢＣＥＣＦは、アセトキシメチルエステルＢＣＥＣＦ／ＡＭの形態で使用することができ、これは細胞内で切断されてより不透過性のＢＣＥＣＦを形成する。ＢＣＥＣＦの７０ｎＭ溶液にとって励起性（excitability）の最大は、５００ｎｍである。ＢＣＥＣＦの蛍光強度は、いくつかの薬剤、例えば：グリセロール、サッカロース、ポリエチレングリコール又はポリビニルピロリドンによって影響を及ぼすことができる。ＢＣＥＣＦの適切な濃度は、５μＭ（最終濃度）である。

本発明に関して、蛍光色素は、イオンチャネルにおけるイオンチャネルリガンドの効果に感受性である。効果は、チャネル自体における直接効果（例えば、立体配置的変化、結合性における変化など）又は当該イオンチャネル下流のシグナル伝達経路における変化、特に当該イオンチャネルによって輸送されるイオンの細胞内濃度における変化であってもよい。イオンは、例えば、Ｈ⁺、ＨＣＯ₃ ^-、Ｋ⁺、Ｎａ⁺、Ｃｌ^-又はＣａ²⁺であってもよい。適切なｐＨ依存性蛍光マーカー（Ｈ⁺及びＨＣＯ₃ ^-用）としては、Ｈ⁺選択的蛍光クロモイオノフォア（chromoionophore）ＥＴＨ ５２９４、Ｓ ＮＡＦＬ、ＳＮＡＲＦ、ＨＰＴＳ、フルオレセイン、カルボフルオレセイン、ＢＣＥＣＦ（２',７'−ビス（２−カルボキシエチル）５（及び６）カルボキシフルオレセイン）及びＢＣＰＣＦ（２',７'−ビス（２−カルボキシプロピル）−５（及び６）カルボキシフルオレセイン）含まれるが、これらに制限されるわけではない。カルシウムイオンは、エクオリン（単離すべき最初の発光タンパク質）、Ａｌｅｘａ−４８８若しくはフォティナ（photina）で標識化されたカルモジュリン（Axxam SpA, Milan, Italy）、Ｆｌｕｏ４（グリシン、Ｎ−［４−［６−［（アセチルオキシ）メトキシ］−２,７−ジフルオロ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル］−２−［２−［２−［ビス［２−［（アセチルオキシ）メトキシ］−２−オキソエチル］アミノ］−５−メチルフェノキシ］エトキシ］フェニル］−［２−［（アセチルオキシ）メトキシ］−２−オキソエチル］−、（アセチルオキシ）メチルエステル、Ｃ５１Ｈ５０Ｆ２Ｎ２Ｏ２３）、Ｍ＝１０９６．９５ｇ／ｍｏｌＣＡＳＮｒ．２７３２２１−６７−３、貯蔵：２〜８℃，光から保護する）又はＦｕｒａ２（５−オキサゾールカルボン酸、２−（６−（ビス（２−（（アセチルオキシ）メトキシ）−２−オキソエチル）アミノ）−５−（２−（２−（ビス（２−（（アセチルオキシ）メトキシ）−２−オキソエチル）アミノ）−５−メチルフェノキシ）エトキシ）−２−ベンゾフラニル）−（アセチルオキシ）メチルエステル、Ｃ４４Ｈ４７Ｎ３Ｏ２４）、Ｍ＝１００１．８６ｇ／ｍｏｌＣＡＳ−Ｎｒ．１０８９６４−３２−５、貯蔵：−２０℃，光から保護する）を用いて検出してもよい。ナトリウム及びカリウムイオンの検出には、イオノフォアＸ及びイオノフォアＢＭＥ−４４を使用してもよい。

このような方法は、以下のように実施してもよく、その際、以下は説明のためのものでしかない。当業者は、１つ又はそれ以上の工程を異なるやり方で実施してもよいことを理解している（例えば、本発明のこの説明に詳述した通り）：
細胞は、生体外培養のため組織から単離して入手してもよい。例えば、組織の断片を成長培地中に置き、そして増殖した細胞を培養用に利用することができる。この方法は、外植片培養（explant culture）として知られている。別法として、細胞株（例えば、樹立又は不死化細胞株）を用いてもよい。特定の細胞タイプの代表的な樹立細胞株が多数ある（また、上記参照）。

細胞は、適切な培地（例えば、血清及び抗生物質を含む商業的に入手可能な培地）中で培養してもよい。細胞は、通常、適切な雰囲気（例えば５％ＣＯ₂）、相対湿度（例えば９０％）及び温度（例えば３７℃で）で培養される。高処理スクリーニング及び／又は便利な細胞処理のため、９６ウェルプレート、２４ウェルプレートなどのようなマルチウェルプレートで細胞を培養していてもよい。

上に詳述したように、細胞内ｐＨ変化は、蛍光マーカーを用いて測定してもよい。適切なマーカーとしては、ＳＮＡＲＦ−１、ＢＣＥＣＦ及びＣＭＦＤＡが含まれる。励起及び発光は、カルボキシＳＮＡＲＦ−１についてはＥｘｃ４８５、Ｅｍ５９０ｎｍ；ＢＣＥＣＦについてはＥｘｃ５００、Ｅｍ５３８ｎｍ；そしてＣＭＦＤＡについてはＥｘｃ４８５、Ｅｍ５３８ｎｍである。励起及び発光帯域幅は、それぞれ２０ｎｍ及び２５ｎｍであろう。細胞内ｐＨの測定に適したデバイスは、例えばＦＬＵＯｓｔａｒ９７蛍光光度計マルチウェルプレートリーダー（BMG LabTechnologies, Inc, Durham, NC）又は実施例に記載されたデバイスである。

一実施態様によれば、蛍光色素ＢＣＥＣＦ（２',７'−ビス−（カルボキシエチル）−５（６）−カルボキシフルオレセイン、Ｃ２７Ｈ２０Ｏ１１）、Ｍ＝５２０,４５ｇ／ｍｏｌＣＡＳＮｒ．８５１３８−４９−４、貯蔵：２〜８℃，光から保護する）が用いられる。ＢＣＥＣＦは、細胞内部のその高められた停留のためリンパ球におけるｐＨ測定について改善された特徴を有するカルボキシフルオレセインの類同代理物である。無傷細胞へ有効に取り込むため、ＢＣＥＣＦは、アセトキシメチルエステルＢＣＥＣＦ／ＡＭの形態で用いることができ、それは細胞内で切断されてより不透過性のＢＣＥＣＦを形成する。ＢＣＥＣＦの７０ｎＭ溶液にとっての励起性の最大は、５００ｎｍにある。ＢＣＥＣＦの蛍光強度は、いくつかの薬剤、例えば：グリセロール、サッカロース、ポリエチレングリコール又はポリビニルピロリドンによって影響を与えることができる。ＢＣＥＣＦの適切な濃度は、５μＭ（最終濃度）である。

以下は、細胞内ｐＨ測定用の細胞を調製するための１つの典型的な手法である：細胞を、例えば９０％集密まで成長させ、例えばトリプシンを用いて収穫し、そして例えば１０％ウシ胎児血清を含む培地で直ちにクエンチし、ペレット化し（pelleted）、次いで１回すすぐ。ペレット化した細胞を新たな培地中で再懸濁し、回収させて（例えば５％ＣＯ₂下、３７℃で１時間）、例えば重炭酸を含まない緩衝液（bicarbonate-free buffer）（例えば１３０ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ₄、１．２ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、１１．７ｍＭ Ｄ−グルコース、１．３ｍＭＣａＣｌ₂、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で例えば２回すすぎ、次いで上記のマーカー（色素）を装填する。別の実施態様によれば、色素−装填前に、細胞にトリプシン処理をしない。

色素装填は、例えば以下のように実施してもよい：１％（質量／体積）プルロニックＦ−１２７（Sigma Chemicals, St Louis, MO）を含み、重炭酸を含まないKrebs-Hepes緩衝液（ｐＨ７．４）中、５μＭ ５−（及び−６）−カルボキシＳＮＡＲＦ−１／ＡＭ（Molecular Probes, Eugene, OR）と共に室温で３０分間、細胞をインキュベートする。例えば、緩衝液中、室温で４５分間、１μＭ ２−7−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（及び−６）−カルボキシフルオレセイン（ＢＣＥＣＦ／ＡＭ）（Molecular Probes）を用いて細胞を装填することができる。緩衝液中、３７℃で４５分間、５μＭ CellTracker Green ＣＭＦＤＡ（５−クロロメチルフルオレセイン二酢酸塩）（Molecular Probes）を用いて細胞を装填することができる。１つ又はそれ以上の他の上で特定された他の色素の装填は、適切なよく知られたプロトコールに従って同様に実施することができる。

装填後、例えば、細胞を緩衝液で１回又はそれ以上（例えば２回）すすぎ、そして新たな培地中で再懸濁し、そして３７℃で５％ＣＯ₂下、１時間又はそれ以上（例えば一夜）回収させることができる。色素装填及び回収時間後、細胞を適切な緩衝液、例えば重炭酸を含まないKrebs-Hepes緩衝液（ｐＨ７．４又は６．０）で１回又はそれ以上（例えば３回）ですすぎ、２．５×１０⁶細胞／ｍＬの最終濃度に再懸濁し、そして４℃に保持することができる。

細胞を希釈し、そして乳白色９６−ウエルプレート（又は他のいずれかの適切なプレート、例えば透明な底面を有する黒色のもの）に均一に（約３５０００細胞／ウェル）分配することができる。血漿及び緩衝液のみ又はリガンドを含む緩衝液を個々のウェルに順に注射し、そして適切な（例えば約２０秒）間隔で蛍光強度を記録することができる。各注射前に適切な間隔（例えば２０秒間隔）で、いくつかの（例えば５）ベースラインの記録をとることができる。

各実験終了後、知られているイオンチャネルリガンド（例えばＨ⁺／Ｋ⁺交換体についてはナイジェリシン）を用いた現場検量法（in situ calibration procedure）を用いて蛍
光強度をｐＨ値に関連付けてもよい。これは、例えば、脱分極性高Ｋ＋緩衝液（１４０ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ₄、１．２ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、１１．７ｍＭ Ｄ−グルコース、１．３ｍＭ ＣａＣｌ₂、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、２０μＭナイジェリシンの存在下）中の異なるｐＨ緩衝液に細胞を曝露することによってＫ⁺／Ｈ⁺交換体イオノフォアを［Ｋ⁺］ｏ＝［Ｋ⁺］ｉ及びｐＨｏ＝ｐＨｉに設定して実施してもよい。検量と実験との間の細胞密度における小さな変動及び照度の不安定性を補正するため、各実験終了後、０．１％トライトンＸ−１００を用いて細胞を透過させ、そしてＫＯＨを用いてｐＨを１１に調整することによってＣＭＦＤＡ濃度を測定した。

さらに、漏出した及び細胞内色素からの寄与を分離することによって色素漏出を追跡調査することができる。このために、細胞を異なる時間間隔で、例えば３０秒間遠沈させてもよい。次いで、各上澄み及び再懸濁された細胞溶解物溶液の蛍光強度を測定してもよい。上澄み溶液の蛍光強度は、細胞から色素漏出を反映しており、そして上澄み及び細胞溶解物の両方から合わせた蛍光強度は、色素の総量を定義するために用いることができる。対照（色素なし）の蛍光強度を各画分から減算してもよく、そして漏出は、蛍光強度（上澄み／全体）対時間の比率として報告してもよい。

さらなる典型的な方法は、実施例に記載する。

別法として、イオン感受性微小電極（ナトリウム−イオノフォアビス（１２−クラウン−４のようなイオン選択性イオノフォアを含む）、カリウム選択的イオノフォアビス（ベンゾ−１５−クラウン−５）、カルシウム選択的イオノフォアＨＤＯＰＰ−Ｃａ）又はイオン感受性酵素（例えばカリウム依存性尿素アミドリアーゼ、ピルビン酸キナーゼ（米国特許第５，５０１，９５８号及び同第５，３３４，５０７号）又はグリセロールデヒドロゲナーゼ（米国特許第５，７１９，０３６号）は、細胞膜を横切るイオン流量の検出に用いることができる。さらなるｐＨ感受性方法としては、弱酸又は塩基の分布、³¹Ｐ−ＮＭＲ分光法及びｐＨ感受性緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］が含まれる。

好ましくは、高処理スクリーニング用に方法を適応させる。この方法では、全細胞アッセイにおいて当該イオンチャネルに対して多数の化合物をスクリーニングする。典型的に、これらのスクリーニングは、自動化されたロボットステーションベースの技術を用いて又は高密度アレイ（「チップ」）フォーマットにおいて９６ウェルプレートで実施される。

本発明の方法の一実施態様において、ＮＨＥリガンドのようなイオンチャネルリガンドを血漿と共に細胞に投与する。これは、（人間以外の）動物にリガンドを投与することによって達成してもよい。リガンドは、非経口（例えば静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、皮下、皮内、髄腔内、腹腔内）、腸内（例えば経口又は直腸）、局所（例えば経皮、吸入、鼻内又は膣内）などを含む任意の適切な経路によって投与することができる。食事を介した投与が好ましい。

リガンドを血漿中に存在させるのに十分な時間の後、動物から血漿を採取する。本発明の方法を実施するには、リガンドを含む血漿を細胞に加え、そして細胞におけるリガンドの効果を測定する。効果の測定には、血漿中のリガンド濃度の測定を含めることができる（また、実施例２参照）。動物に投与したリガンドの量を血漿中に存在するそれと比較する場合、例えばリガンドの吸収、分布、代謝及び排泄の範囲及び速度における結論は、比較から導くことができる。

本発明によれば、イオンチャネルリガンドの効果の測定方法は、リガンドの血漿中濃度を測定するために用いることができる。これは、未知のリガンド濃度を有する血漿の効果を、標準、例えば標準曲線と比較することによって実施することができる（例えば、実施例２参照）。

本発明の方法は、イオンチャネル機能障害に関与する疾患を予防及び／又は治療するため、特に心臓血管疾患又はがんを治療及び／又は予防するための薬剤のスクリーニングに用いることができる。スクリーニング目的で使用する場合、試験リガンドは、その機能がまだ知られていない又はイオンチャネルにまだ関連がない、知られているイオンチャネルリガンド又は物質のいずれかでもよい。従って、方法は、新しいイオンチャネルリガンドの同定に用いることができる。別法として、本発明の方法を用いて、知られているイオンチャネルリガンドをその効率について試験することができる。リガンドの活性における血漿の効果を評価するため、そしてリガンドのインビボ活性を評価するためには、効率を血漿を含まない系（plasma-free system）（例えば結合親和性）におけるリガンド作用と比較してもよい。

リガンドは、化学化合物ライブラリーの形態で提供することができる。化学化合物ライブラリーには、複数の化学化合物が含まれており、そして化学合成された分子及び天然生成物を含む複数の供給源のいずれかから構成されているか、又はコンビナトリアル化学技術によって生成されている。それは、高処理スクリーニングに特に適している。それは、特定の構造の化学化合物又は植物のような特定の生物の化合物を含んでもよい。本発明に関して、化学化合物ライブラリーは、小さな分子を含むライブラリーであることが好ましい。

以下において、本発明を、図及び実施例によって説明するが、それらは本発明の範囲を制限しようとするものではない。

ラット血漿中の算出された効率のカリポリド検量線を示すグラフである（ＥＣ₅₀＝１１５ｎＭ）。 新規化合物Ｘについて、ラット血漿中の算出された効率の検量線を示すグラフである（ＥＣ₅₀＝６６２ｎＭ）。 ＮＨＥ１インビトロアッセイを用いたカリポリド及び化合物Ｘの推定血漿中濃度を示すグラフである。

実施例１：動物血漿サンプル中のＮＨＥアンタゴニストの有効濃度を測定するアッセイの確立
血漿サンプルは、０．３％カリポリド（ＮＨＥ阻害剤）入りの標準ウサギ固形飼料で飼養した雄ニュージーランドウサギ（２．５〜３．５ｋｇ）から得た。血液サンプルは、１週間後、カリポリドの血漿中濃度を測定するため耳介動脈から採取した。カリポリドの血漿中濃度の測定は、下記のように行った：
ＮＨＥ−遺伝子（SLC9A1, Franchi A. et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 1986 Dec； 83(24):9388-92.）をpMamneo−ベクターにクローニングし、そしてＬＡＰ１（マウスＬＴＫ−細胞株）細胞に導入した。安定な細胞株は、トランスフェクト細胞から作成した。

ヒトＮＨＥ１（ｈＮＨＥ１）を安定して発現しているＬＡＰ１（マウスＬＴＫ−細胞株）細胞を黒色クリアボトム９６ウェルマイクロプレート（Costar^(R), Corning Inc., Corning, NY）において２５．０００細胞／ウェル／培地（Iscove−培地、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ｌ００ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８）１００μｌの密度で播種した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂及び湿度９０％で一夜インキュベートした。測定前に培地を捨て、そして１００μｌ／ウェルの色素緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ＫＯＨでｐＨ７．４に調整、２０ｍＭ ＮＨ₄Ｃｌ、１１５ｍＭ塩化コリン、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、５μＭ ＢＣＥＣＦ）を加えた。３７℃で２０分間インキュベーションした後、Ｎａ⁺不含洗浄緩衝液（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ＫＯＨでｐＨ７．４に調整、１３３．８ｍＭ塩化コリン、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＣａＣｌ₂、１．２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．９７ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．２３ｍＭ ＫＨ₂Ｐ０₄、５ｍＭグルコース）で細胞を３回洗浄し、ウェル当たり９０μｌの洗浄緩衝液を残した。ｐＨ回復をＦＬＩＰＲ（蛍光測定画像解析用プレートリーダー，Molecular Devices, Sunnyvale, CA；レーザー出力０．３Ｗ、絞り４、測定間隔２秒、測定時間１２０秒）で測定した。測定中、血漿溶液（アンタゴニストあり／なしの飼料を与えられた動物からの動物血漿９０％、Ｎａ⁺緩衝液１０％：１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ＫＯＨでｐＨ７．４に調整、１３３．８ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１．２５ｍＭ ＣａＣｌ₂、０．９７ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．２３ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、５ｍＭグルコース）９０μｌをウェルに加えた。緩衝液ＮＨＥ１中のＮａ⁺が細胞から外へＨ⁺を輸送し始めるため、細胞内ｐＨの上昇及び蛍光の増加をもたらす。高対照（High control）：アンタゴニストなしの血漿溶液。低対照（Low control）：２０μＭカリポリド入りの血漿溶液（最終濃度１０μＭ）。調製後にカリポリドを血漿に加えた。１０μＭカリポリドの添加によりＮＨＥ１活性が完全に遮断される。検量のため、動物の血漿中効率を測定する準備をした後、異なる量のカリポリド及び被験アンタゴニストを血漿に加えた。

ＮＨＥ１活性を算出するため、１２秒目と３２秒目との間の蛍光における増加を算出した。高対照を１００％活性として設定したのに対して、低対照を０％ＮＨＥ１活性とした。サンプルの％活性を対照との比較によって算出した。

結果：
表１及び２に示すように、実施例は良好な結果を示した。アッセイパフォーマンスは、きわめて良好であった（ｚ'＝０．７４、表１）。すべてのプローブは、カリポリド濃度≧１０μＭを示し、ＮＨＥ１が完全に遮断されたことを示した（表２、図１）。

実施例２：ＮＨＥアンタゴニストの血漿レベルを測定するアッセイ
研究の血漿に用いる動物を、以下のように前処理した：
・動物：雄スプラーグドーリー（Sprague Dawley）ラット（Moellegard）
・体重：３２０〜３６０ｇ
・麻酔：チオペンタール−ナトリウム（トラパナール１００ｍｇ／ｋｇ i.p.）
・呼吸：４０体積％Ｏ₂
・血液ガス：３２〜４０ｍｍＨｇ ｐＣＯ₂
８０〜１００ｍｍＨｇ ＰＯ₂
ｐＨ７．３５〜７．４９
ＳａＯ₂＞９６％
・虚血：ＬＡＤ（左冠動脈前下行枝）の閉塞２０分間
・再灌流：６０分間
・体温：３６．５℃
・測定パラメーター：心筋梗塞質量
平均動脈圧
心拍数
化合物血漿レベル
・血液サンプル：単一プローブ、静脈注射の８５分後（再灌流の終わり）又は単一プローブ、経口治療の２００分後（再灌流の終わり）

群：０．ビヒクル１ｍｌ／ｋｇ i.v.生理食塩水（ｎ＝８） 閉塞５分前
Ｉ． カリポリド１ｍｇ／ｋｇ ｉ.ｖ.（ｎ＝８） 閉塞５分前
ＩＩ． 化合物Ｘ ３ｍｇ／ｋｇ ｉ.ｖ.（ｎ＝８） 閉塞５分前
ＩＩＩ．化合物Ｘ １ｍｇ／ｋｇ ｉ.ｖ.（ｎ＝８） 閉塞５分前
ＩＶ． 化合物Ｘ ０．３ｍｇ／ｋｇ ｉ.ｖ.（ｎ＝８） 閉塞５分前
Ｖ． 化合物Ｘ ３ｍｇ／ｋｇ ｐ.ｏ.（ｎ＝８） 閉塞５分前
ＶＩ． 化合物Ｘ １０ｍｇ／ｋｇ ｐ.ｏ.（ｎ＝８） 閉塞５分前
ＶＩＩ．化合物Ｘ ０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ.ｖ.（ｎ＝８） 閉塞５分前

注射８５分後（群Ｉ〜ＩＶ、ＶＩＩ）又は処置２００分後（群Ｖ〜ＶＩ）に群Ｉ〜ＶＩＩから、そして非処理ラットから異なる量の血漿を調製した。
分析を行なうまで、血漿を−２０℃で保存した。

ＮＨＥ１リガンド効率の細胞に基づく測定のため、ｈＮＨＥ１を安定して発現するＬＡＰ１（マウスＬＴＫ−細胞株）細胞（実施例１参照）を黒色クリアボトム９６−ウェルマイクロプレート（Costar^(R), Corning Inc., Corning, NY）上に、２５．０００細胞／ウェル／培地（Iscove−培地、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８）１００μｌの密度で播種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ₂及び湿度９０％で一夜インキュベートした。測定前に培地を捨て、そして１００μｌ／ウェルの色素緩衝液
（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ＫＯＨでｐＨ７．４に調整、２０ｍＭ ＮＨ₄Ｃｌ、１１５ｍＭ塩化コリン、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、５μＭ ＢＣＥＣＦ）を加えた。３７℃で２０分間インキュベーションした後、細胞を、Ｎａ⁺不含洗浄緩衝液（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ＫＯＨでｐＨ７．４に調整、１３３．８ｍＭ塩化コリン、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＣａＣｌ₂、１．２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．９７ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．２３ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、５ｍＭグルコース）で３回洗浄し、ウェル当たり９０μｌの洗浄緩衝液を残した。血漿プローブを以下のように調製した：１０％（ｖ／ｖ）のＮａ⁺緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ＫＯＨでｐＨ７．４に調整、１３３．８ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１．２５ｍＭ ＣａＣｌ₂、０．９７ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．２３ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、５ｍＭグルコース）を９０％（ｖ／ｖ）ラット血漿に加えた。

高対照（アンタゴニストなしの血漿溶液）及び低対照（２０μＭカリポリド入りの血漿溶液、最終濃度１０μＭ）を調製した。ラット血漿プローブ中の化合物濃度を算出する検量線のため、１０％（ｖ／ｖ）Ｎａ⁺緩衝液／９０％（ｖ／ｖ）ラット血漿中のカリポリド及び化合物Ｘの希釈系列を用いた（図１及び２）。

ｐＨ回復をＦＬＩＰＲ（蛍光測定画像解析用プレートリーダー，Molecular Devices, Sunnyvale, CA；レーザー出力０．３Ｗ、絞り４、測定間隔２秒、測定時間１２０秒）で測定した。測定中、血漿溶液９０μｌをウェルに加えた。

ＮＨＥ１活性を算出するため、１２秒目と３２秒目との間の蛍光における増加を算出した。高対照を１００％活性として、そして低対照を０％ＮＨＥ１活性として設定した。サンプルの活性（％）を、対照との比較によって算出した。化合物血漿レベルを、検量線との関連で算出した。

結果：
結果を表３にまとめた。ｚ'因子は、すべての測定で０．７５より大きかった。

カリポリド及び化合物Ｘについての典型的な検量線を図１及び２に示す。

さらに、検量線を用いてプローブセット中の化合物血漿レベルを算出した。検量線は、以下の式を用いて算出した：

変数は、表４に示すように設定した：

算出された血漿化合物レベルを図３に示す。

従って、本発明のＮＨＥ１アッセイを用いてラット血漿中のＮＨＥ１阻害剤の有効性を測定することができる。また、検量線により、これらの化合物の活性血漿中濃度を算出することもできる。ＮＨＥ１阻害剤は、調製後、ラット血漿において活性であった。データは、ＮＨＥ１阻害の良好な用量依存性を示している。

Claims (13)

1. イオンチャネルリガンドの効率の生体外での測定方法であって、該イオンチャネルがナトリウム−プロトン−交換体（ＮＨＥ）であり、そして該方法が：
   ａ）イオンチャネルを発現する細胞を
   ｉ）動物の血漿、及び
   ii）イオンチャネルリガンド
   と接触させる工程であって、ここで両方の成分は該細胞に添加される工程；及び
   ｂ）細胞に対するイオンチャネルリガンドの効果を測定する工程：
   又は、
   ａ）イオンチャネルを発現する細胞をイオンチャネルリガンドを投与した動物の血漿と接触させる工程；及び
   ｂ）細胞に対するイオンチャネルリガンドの効果を測定する工程：
   を含む、上記方法。
2. ＮＨＥがＮＨＥ１、ＮＨＥ２、ＮＨＥ３又はＮＨＥ５である、請求項１に記載の方法。
3. イオンチャネルリガンドが、アゴニスト又はアンタゴニストである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 細胞が細胞株の細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 動物が脊椎動物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 動物がヒトである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
7. 効果がｐＨ値の変化である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 効果が細胞内ｐＨ値の変化である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 効果が蛍光によって測定される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. ＮＨＥリガンドが動物に投与され、ここで動物がヒト以外の動物である、請求項１〜５及び７〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 方法がリガンドの血漿中濃度の測定に用いられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 方法がイオンチャネル機能障害を伴う疾患を予防及び／又は治療する薬剤のスクリーニングに用いられる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 方法が心臓血管疾患又はがんを予防及び／又は治療する薬剤のスクリーニングに用いられる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。

Images