KR20110076900A - 나트륨-양성자 교환체 리간드 효율의 측정 방법 - Google Patents

나트륨-양성자 교환체 리간드 효율의 측정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이온 채널 리간드의 효율의 측정 방법으로서, 상기 방법이 이온 채널 발현 세포를 동물의 혈장(i) 및 상기 이온 채널 리간드(ii)와 접촉시키는 단계(a) 및 상기 세포에 대한 상기 이온 채널 리간드의 효과를 측정하는 단계(b)를 포함하는 방법에 관한 것이다.

Description

나트륨-양성자 교환체 리간드 효율의 측정 방법 {Methods for determining sodium-proton-exchanger ligand efficiency}
본 발명은 이온 채널 리간드의 효율의 측정 방법에 관한 것이다.
막 수송체의 Na+/H+ 교환체 또는 나트륨-양성자 교환체(Sodium-Proton-Exchanger)(NHE) 계열은 세포외로부터 세포내로의 Na+ 구배(extra-to-intracellular Na+ gradient)를 사용하여 세포들로부터의 H+ 유출을 유도한다. 이들 그룹의 수송체(또는 이온 채널)에 의해 수행되는 필수 기능 중에서도, 세포 용적 및 pH의 조절, 세포 증식에서의 허용 역할 및 Na+의 상피 통과 수송이 있다. 포유동물 NHE는 하나의 세포내 양성자를 하나의 세포외 나트륨으로 교환하는 기능을 하는 통합 막 단백질이다. NHE는, 이온 유동(ion flux)에 개입함으로써, 세포내 pH 및 세포 용적을 조절하고 세포의 성장 또는 기능 상태의 변화를 개시하는 작용을 한다. 생리학적 역할 이외에도, NHE는 사람 병리학에서 중요한 역할을 한다. NHE에 의한 수송은 심근경색증 동안 및 심근경색증 이후에 사람 심근에 야기된 손상에서 중요한 역할을 하며, 이는 암세포의 발암성 형질전환에서 중요한 역할을 하는 것으로 간주된다. 따라서, NHE는 수년간 심혈관 및 발암 연구에서 표적이었으며, 수천 개의 화합물들이 NHE 억제 및 선택성에 대하여 스크리닝되어 왔다.
NHE 길항제 효능을 측정하는 표준 방법은 문헌[참조: Schwark et al., 1998, Pflugers Arch., 336(5):797-800, and Wiemann et al., 1999, Pflugers Arch., 436(3):255-262]에 기재된 시험관내 검정이다. 선택된 NHE에 대한 리간드의 IC50을 측정한 후, 기타 NHE들에 대한 선택성을 동일한 검정으로 측정할 수 있다. 일반적으로, 선택성이 양호한 효능있는 리간드를, 약동학에 의한 추가의 조사, 리간드의 생체내 입증 등을 위해 선택하였다. 그러나, 몇몇 매우 효능있는 화합물은 생체내 연구에서 단지 약간의 효과만을 나타냈다. 그 이유는, 높은 단백질 결합, 낮은 생체이용률, 또는 혈장에서의 화합물의 유효 농도를 감소시키는 다른 효과일 수 있다. 시간과 자원을 절약하기 위해, 약물 개발 과정에서 매우 초기에 이러한 화합물을 배제하는 것이 바람직하다.
몇몇 화합물의 시험관내 IC50과 약리학적 효능(효율) 사이의 불일치로 인해, 체내에서 다른 이온 채널의 NHE 리간드(들) 효율을 측정하거나 모의 실험하기 위한 방법을 개발할 필요성이 있다.
따라서, 본 발명의 제1 목적은 이온 채널 리간드의 효율의 측정 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 본 시험은 시간 효율적이고 비용 효율적이어야 한다. 본 출원의 문맥에서, 용어 이온 채널은 수동 이온 채널뿐만 아니라 능동 이온 채널(이온 수송체)을 포함하는 것으로 이해된다.
놀랍게도, 이온 채널 리간드, 특히 NHE 길항제의 효율이, 이온 채널 발현 세포를 동물의 혈장 및 당해 이온 채널 리간드와 접촉시킴으로써 측정될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본 시험에서, 상기 세포에 대한 상기 이온 채널 리간드의 효과를 측정할 수 있으며, 본 효과는 상기 리간드의 생체내 효율을 반영한다.
따라서, 제1 양태에서 본 발명은 이온 채널 리간드의 효율의 측정 방법으로서,
a) 이온 채널 발현 세포를
i) 동물의 혈장 및
ii) 상기 이온 채널 리간드와
접촉시키는 단계 및
b) 상기 세포에 대한 상기 이온 채널 리간드의 효과를 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
간단히 요약하면, 상기 방법은 다음과 같이 수행될 수 있다: 적합한 상기 이온 채널 발현 세포를 적합한 조건에서 유지(예를 들면, 배양)시키고, 이를 동물의 혈장 및 상기 이온 채널 리간드와 접촉시킨다. 성분 둘 다를 동시에 또는 함께 첨가할 수 있다. 상기 세포에 대한 효과를 허용하는 충분한 시간 후, 상기 세포에 대한 효과를 측정한다. 상기 접촉 이후 또는 이와 동시에, 효과(신호)가 관찰되며, 효과의 검출은 상기 세포에 대한 상기 이온 채널 리간드의 효과를 나타낸다.
본 발명의 맥락에서의 용어 "이온 채널 리간드의 효율"은 이온 채널 리간드의 약리학적 효능에 관한 것이다. 혈장의 부재하의 시험관내 검정과 대조적으로, 혈장의 존재하에 수행되는 본 발명의 방법은 단백질 결합의 양, 상기 이용 가능한 리간드의 흡수, 분포, 대사 및 배출의 정도 및 비율 및/또는 혈장에서 화합물의 유효 농도를 감소시키는 다른 효과를 설명한다. 상기 리간드를 동물에 투여하고 혈장을 당해 동물로부터 채취하는 경우, 상기 방법은 또한 상기 리간드의 흡수, 분포, 대사 및 배출의 정도 및 비율을 설명한다. 이러한 효과는 약물의 물리적 특성(소수성, pKa, 용해도), 약물 제형, 섭취 또는 금식 상태에서의 투여, 일주기 특성, 및/또는 다른 약물, 음식물 또는 내생성 물질(예를 들면, 효소)과의 상호작용에 좌우될 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 따라서, 용어 "이온 채널 리간드의 효율"은 상기 이온 채널에 대한 상기 리간드의 결합 및 다운스트림 신호 전달의 유도에 관한 것일 뿐만 아니라, 혈장 및/또는 살아있는 동물에서의 리간드의 상기 효과를 설명한다. 이에 의해, 예를 들면, 시험관내 치료에 적합한 약물 후보를 더욱 편리하게 동정하고 생체내 효율이 낮은 화합물을 배제시킬 수 있다.
상기 세포에 대한 상기 리간드의 효과는, 형태, 생존 능력 또는 세포내 화합물의 조성에 대한 변화를 비제한적으로 포함하는, 세포에 대한 임의의 효과일 수 있다. 이러한 효과는, 이온 채널에 대한 리간드의 결합, 이온의 유동, 각각의 이온의 표적(예를 들면, 세포내 표적)에 대한 결합, 세포 화합물(예를 들면, 2차 전령)(예를 들면, cAMP, cGMP, Ca2 +, IP3, 디아실글리세롤 등)의 양 측정, 세포내 단백질, 예를 들면(단백질 키나아제 A, 단백질 키나아제 C 또는 MAP 키나아제)의 활성화 상태 측정, mRNA 또는 단백질의 양 측정, 임의의 변형된 세포 기능[예를 들면, 아폽토시스 또는 세포 원형 정지(cell circle arrest)의 유도] 등을 포함하는, 이온 채널의 신호 전달의 임의의 수준에 있을 수 있다.
이러한 방법은 상기 이온 채널 리간드의 생체내 효율을 측정하거나 모의실험하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법의 적용 범위의 예로는 다음이 포함된다:
첫째, 이온 채널 리간드로 투여된 동물로부터 유래한 혈장 샘플에서 이온 채널 리간드의 유효 농도를 측정할 수 있다(예를 들면, 실시예 2 참조). 상기 리간드를 동물에 투여하는 경우, 리간드의 투여량과 비교하여 낮은 리간드 혈장 농도는 불량한 생체이용률(예를 들면, 낮은 혈장 반감기로 인함)로서 해석될 수 있다.
둘째, 혈장, 예를 들면, 사람 혈장에서 상기 이온 채널 리간드의 효과를 측정할 수 있다(예를 들면, 실시예 2 참조). (당업계에 공지된 바와 같이) 혈장 부재하에 측정된 IC50과 비교하여, 상기 리간드의 혈장 결합 및 생체내 이용률에 대한 결론을 도출할 수 있다. 혈장에서 IC50 및 효율의 차이가 매우 큰 화합물을 보다 초기에 폐기하여, 약물 개발시의 비용을 절약할 수 있다. 현재, 이러한 화합물은 생체내 실험 후에만 거부될 수 있다.
이온 채널은, 원형질막을 가로지르는 이온의 유동의 확립 및 조절을 보조하는 단백질, 일반적으로 세공 형성 단백질이다. 이는 통합 단백질(integral protein) 또는 보다 통상적으로는 수개의 단백질의 조립체이다. 이러한 다중 소단위 조립체는, 원형질막을 통해 물로 채워진 세공의 주위에 조밀하게 충전된 동일 또는 동종 단백질들의 원형 배열을 일반적으로 수반한다. 몇몇 채널이 단지 전하에만 기초하여 이온의 통과를 허용하는 반면, 전형적인 채널 세공은 이의 가장 좁은 지점에서의 단지 1개 또는 2개의 원자의 넓이이다. 이는 나트륨 또는 칼륨과 같은 이온들의 특정 종을 안내하여, 이들을 원형질막을 통해 운반한다. 몇몇 이온 채널에서, 상기 세공의 통과는 "게이트"에 의해 통제되며, 상기 게이트는 상기 이온 채널의 변화에 따라 화학적 또는 전기적 신호, 온도 또는 기계력에 의해 개방되거나 폐쇄될 수 있다.
일반적으로, 이온 채널은 게이트에 따라 특정되며, 상기 이온들의 종은 이러한 게이트 및 다수의 세공을 통과한다.
게이팅(gating)에 따라 분류하면, 채널들은 2개 종류, 즉 전압-게이트 이온 채널(원형질막을 가로지르는 전압 구배에 따라 활성화/불활성화) 및 리간드-게이트 이온 채널(상기 채널에 대한 리간드의 결합에 따라 활성화/불활성화)로 나누어진다.
전압-게이트 채널의 예로는 전압-게이트 나트륨 채널, 전압-게이트 칼슘 채널, 전압-게이트 칼륨 채널, 몇몇 일시적 수용체 전위 채널(transient receptor potential channel), 과다 분극-활성화 사이클릭 뉴클레오티드-게이트 채널 및 전압-게이트 양성자 채널이 포함된다. 리간드-게이트 채널의 예로는 칼륨 채널, 예를 들면, 내향 정류기 칼륨 채널, 칼슘-활성화 칼륨 채널 및 2개의 세공-도메인 칼륨 채널, 채널 로돕신과 같은 광-게이트 채널 및 사이클릭 뉴클레오티드-게이트 채널이 포함된다. 채널을 통과하는 이온에 따라 분류하는 경우, 이온 채널은 일반적으로 다음과 같이 분류된다:
클로라이드 채널, 칼륨 채널, 예를 들면, 전압-게이트 칼륨 채널, 칼슘-활성화 칼륨 채널, 내향 정류기 칼륨 채널 및 2개의 세공-도메인 칼륨 채널, 나트륨 채널, 칼슘 채널, 양성자 채널, 예를 들면, 전압-게이트 양성자 채널 및 일반적인 이온 채널(비교적 비특이적이거나, 대부분의 일시적 수용체 전위 채널을 포함하는 이온이다)이다.
몇몇 이온 채널은 중탄산나트륨-공동수송체(cotransporter) 및 나트륨-양성자 교환체(NHE)와 같이 세포내 pH에 영향을 미친다. 이온 채널의 활성은 목적하는 이온 채널에 결합하는 천연 또는 비천연 발생 리간드에 의해 영향을 받을 수 있다. 이들의 널리 공지된 예로는 나트륨 이온 채널을 차단하는 테트로도톡신, 삭시톡신, 리도카인 및 노보카인 뿐만 아니라, 칼륨 채널을 차단하는 덴드로톡신, 이베리오톡신 및 헤테로포다톡신이 포함된다.
이에 따르면, 이온 채널 리간드는 이온 채널에 특이적으로 결합하는 임의의 화학물질이다. 본 발명에 따른 "이온 채널에 특이적으로 결합함"이란 해리 상수(KD)가 10-4mol/ℓ, 바람직하게는 10-5mol/ℓ를 초과하지 않도록 결합함을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 해리 상수(KD)는, 예를 들면, 수학식 1에 따라 당업자에게 널리 공지된 경쟁 결합 실험으로 측정될 수 있다.
Figure pct00001
상기 수학식 1에서,
Figure pct00002
및
Figure pct00003
은 각각 목적하는 이온 채널 리간드의 농도 및 당해 이온 채널에 대한 검출가능한(예를 들면, 표지된) 이온 채널 리간드(예를 들면, 방사리간드(radioligand))의 농도를 나타내고,
Figure pct00004
및
Figure pct00005
은 각각 목적하는 이온 채널 리간드와 검출가능한 리간드의 해리 상수를 나타내고,
Figure pct00006
은 상기 이온 채널 리간드의 특정 농도에서의 결합율(0 내지 100%)이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 동정 대상 리간드는 작용제 또는 길항제이다. 작용제는 상기 이온 채널에 결합하여, (예를 들면, 형태 변화를 유도함으로써) 이를 활성화시킨다. 길항제 또는 차단제도 또한 이온 채널에 결합하여, 이를 불활성화시킨다. 상기 이온 채널의 상태(활성 또는 불활성)가 상기 리간드에 의해 변하는 경우, 활성화 및 불활성화는 검출가능한 신호를 야기할 수 있다. 바람직하게는, 상기 리간드는 목적하는 이온 채널을 불활성화시키는 길항제이다. 본 발명의 방법에 의해 확인되는 리간드는 이온 채널 관련 장애(dysfunction) 또는 질병의 치료 및 예방에 유용한 잠재적 약물로서 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 이온 채널은 나트륨-양성자 교환체(NHE) 또는 중탄산나트륨-공동수송체이다. 세포에서 기능하는 효소와 같은 단백질의 구조는 pH에 의해 크게 영향을 받기 때문에, 단백질 기능에 대한 최적 pH가 존재한다. 이러한 이유로 인해, 세포내 pH의 유지 및 조절은, 세포 기능의 항상성을 유지하기 위해 세포에 있어서 매우 중요하다. NHE 및 중탄산나트륨-공동수송체는 세포의 pH 조절에 관여한다. 중탄산나트륨-공동수송체는 세포막의 내부 및 외부에서 Na+의 농도 구배에 의해 작동하며, 하나의 Na+을 하나 이상의 HCO3 - 이온과 함께 세포 내로 이동시킨다. 중탄산나트륨-공동수송체가 세포막에 존재하고 중탄산나트륨-공동수송체에 의해 세포 내로 이동된 HCO3 -가 세포질의 H+를 중화시키기 때문에, 이는 세포내 pH의 조절에 중요한 역할을 한다.
NHE도 또한 세포내 pH의 조절에 중요한 역할을 한다. 현재까지, 9개의 이소형태(isoform)(NHE1 내지 NHE9)가 포유동물의 NHE 계열 내에서 확인되었다. 상기 이소형태는 약 25 내지 70%의 서열 동일성을 가지며, 산출된 상대 분자 질량이 약 74000 내지 93000이다. 상기 교환체의 구조 분석에 의하면, 이들은 유사한 막 위상을 가지며, 아미노 말단 막 도메인이 12개의 막 횡단 분절 및 보다 다양한 카복시 말단 세포질 도메인으로 이루어져 있다.
Na+/H+ 교환 활성이 결핍된 종양 세포를 면역 제거된 마우스에 이식하는 경우에 종양이 성장하지 못하거나 고도로 지연 성장하기 때문에, NHE는 종양 성장에 중요한 것으로 오랫동안 공지되어 왔다. NHE1은 다수 타입의 형질전환 세포 및/또는 악성 세포에서 pH 구배를 역전시켜 세포내 환경을 알칼리성으로 되게 하고, 세포외 환경을 산성으로 되게 한다. 이러한 "악성 산증"은 종양성 형질전환에서 중요한 역할을 하는 것으로 간주되며, 형질전환 표현형의 진행 및 유지에 필요하다.
추가로, NHE, 특히 NHE1은 중증 질환의 생리학에 연루되어 왔으며, 대다수의 연구는 심장 질환 및 암에서의 NHE1의 역할에 집중되었다. 심근에서, 정상적인 조건 하에, NHE1은 과량의 세포내 산을 세포외 나트륨과의 교환으로 제거한다. 증가된 세포내 나트륨은, Na+/K+ ATPase 및 Na+/Ca2 + 교환체를 포함한 조절 막 단백질에 의해 제거된다. 심근경색증 동안 및 이후에 사람 심근에서 양성자의 생성이 증가하는 문제가 심근에서 발생한다.
NHE1 이소형태는 교환체의 "하우스키핑(housekeeping)" 이소형태이며, 사실상 모든 조직의 원형질막에서 아주 흔하게 발현된다. 이는 심근의 원형질막에서 발견된 최초 NHE 이소형태이다. NHE2 내지 NHE5 이소형태도 또한 원형질막에 국한되어 있으나, 보다 제한된 조직 분포를 갖는다. NHE2 및 NHE3은 상피의 첨단막에 주로 위치하며, 신장 및 장에서 고도로 발현된다. 이와 대조적으로, NHE4는 위에서 가장 풍부하지만, 장, 신장, 뇌, 자궁 및 골격근에서도 발현되는 반면, NHE5는 뇌(그러나, 비장, 고환 및 골격근을 포함한 다른 비상피 조직에서 저수준으로 존재할 수도 있다)에서 주로 발현된다. 이소형태 NHE6 내지 NHE9는 아주 흔히 발현되며, 세포내 구획에 존재한다. 이러한 소기관 막의 NHE는 세포내 구획의 관강내 pH 및 양이온 농도를 조절하는 것으로 추정된다. NH6 발현은 심장, 뇌 및 골격근에서 최대이며, 초기 재순환 엔도솜에 위치한다. NHE7 이소형태는 후기 골지 네트워크(trans Golgi network)에 주로 위치하며, Na+ 또는 K+의 유입을 H+와 교환으로 매개하는 점에서 다른 NHE 이소형태와 상이하다. 최대 NHE8 발현은 골격근 및 신장에서 발견되며, 이러한 이소형태는 중기(mid) 골지 구획 내지 후기(trans) 골지 구획에 주로 존재한다. 최근에 확인된 NHE9 이소형태는 후기 재순환 엔도솜에 위치하는 것으로 밝혀졌다.
NHE는 이뇨성 화합물 아밀로라이드 및 이의 유사체에 의해, 및 벤조일구아니딘 유도체에 의해 억제되는 표적이다. 상이한 NHE 이소형태의 비교에 의하면, 유사한 실험 조건하에 다음의 민감도 순서로 이러한 억제제에 대한 다양한 친화도가 나타난다: NHE1≥ NHE2> NHE5> NHE3> NHE4. NHE1은 억제에 가장 민감한 이소형태이고 심근의 원형질막에 존재하는 가장 중요한 이소형태인 것으로 보이기 때문에, 이러한 억제제의 선택 특성은 치료적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 이온 채널은 NHE, 예를 들면, NHE1, NHE2, NHE3, NHE4, NHE5, NHE6, NHE7, NHE8 또는 NHE9, 바람직하게는 NHE1, NHE2, NHE3 또는 NHE5, 특히 NHE1 또는 NHE3, 특히 NHE1이다.
NHE1 이소형태는 NHE 계열 중에서 가장 특성화된 이소형태이다. NHE1은 815개의 아미노산 길이, 막 도메인을 나타내는 잔기 1 내지 500 및 세포질 꼬리를 나타내는 잔기 501 내지 815를 갖는다. NHE1의 막 도메인은 이온 수송에 필요하며 충분한 반면, 세포질 도메인은 교환체의 활성 조절에 관여한다. 교환체를 통한 이온 유동은 막 관통 Na+ 구배에 의해 작동하며, 직접 대사 에너지 투입을 필요로 하지 않는 것으로 보인다.
상술한 바와 같이, 이온 채널 리간드는 바람직하게는 작용제 또는 길항제이다. 그러나, NHE의 임상적 중요성으로 인해, 상기 리간드는 바람직하게는 NHE 작용제, 보다 바람직하게는 NHE 길항제이다. 목적하는 이온 채널이 리간드의 부재하에 불활성인 경우, 작용제의 부재하에 길항제의 효과를 모니터링하는 것이 필요할 수 있다. 이러한 경우, 길항제의 효과는 작용제 활성화 이온 채널의 불활성화이다.
본 발명에 따르면, 세포를 리간드 및 혈장과 함께 항온배양한다. 상기 세포는 목적하는 임의의 적합한 이온 채널 발현 세포일 수 있다. 목적하는 이온 채널 리간드 발현 세포는 이온 채널을 자연적으로 발현하는 세포일 수 있다. 또는, 이온 채널을 발현하도록, 세포가 유전자 변형될 수 있다.
상기 세포는 당업자에게 공지된 바와 같이 격리(임의로 유전자 변형), 유지 및 배양될 수 있다. 온도 및 기체 혼합물 외에는, 세포 배양 시스템에서 가장 흔하게 가변적인 인자는 성장 배지이다. 성장 배지의 제조법은 다른 것들 중에서도 pH, 글루코오스 농도, 성장 인자 및 다른 영양 성분들의 존재가 가변적일 수 있다. 보충 배지에 사용되는 성장 인자는 송아지 혈청과 같은 동물 혈액으로부터 종종 유도된다. 유전자 변형 세포는 당업자에게 공지된 바와 같이 이온 채널의 전장 암호화 서열을 삽입함으로써 수득할 수 있다. 당업자는 이온 채널 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 유도하는 방법 및 분자 생물학의 표준 기술을 사용하여 이러한 핵산 서열을 고립시키거나 제조하는 방법을 알고 있다. 이는, 예를 들면, 제한 효소를 사용하여 기존 서열을 사용 및 조합함으로써 수행될 수 있다. 상기 핵산은, 이온 채널 서열을 발현하기 위해, 추가의 요소, 예를 들면, 프로모터, 전사 개시 및 정지 신호, 및 번역 개시 및 정지 신호와 조합될 수 있다. 생성된 핵산 서열은, 예를 들면, 바이러스를 캐리어로서 사용하여, 또는 예를 들면 전기천공, 열 충격, 자기감염(magnetofection), 핵감염(nucleofection)을 포함하는 형질감염에 의해, 및 형질감염제의 사용에 의해 세포에 도입될 수 있다.
임의로, 상기 세포는 조직의 일부일 수 있으나, 본 발명의 방법은 생체외 방법이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 세포는 세포주(다수의 세포주는 잘 확인되어 있으며, 일정한 조건과 편리한 취급성을 제공한다), 특히 포유동물 세포주, 더욱 특히 사람 또는 마우스 세포주, 특히 마우스 LTK-세포주 LAP1[참조: Franchi et al., 1986, Proc Natl Acad Sci USA. 83(24):9388-9392]로부터 유래한다. 적합한 세포주의 예로는 HEK 293, 745-A, A-431, BxPC3, C5N, Caco-2, Capan-1, CC531, CFPAC, CHO, CHO K1, COS-1, COS-7, CV-1, EAHY, EAHY 926, F98, GH3, H-295 R, H-4-II-E, HACAT, HACAT A131, HEK, HEL, HeLa, Hep G2, High Five, Hs 766T, HT29, HUV-EC R24, HUV-EC-C, IEC 17, IEC 18, Jurkat, K 562, KARPAS-299, L 929, LIN 175, MAt-LYLU, MCF-7, MNEL, MRC-5, MT4, N64, NCTC 2544, NDCK II, Neuro 2A, NIH 3T3, NT2/D1, P19, SF9, SK-UT-1, ST, SW 480, SWU-2 OS, U-373, U-937 및 Y-1이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 다른 적합한 세포는 당업자에게 공지되어 있다.
바람직한 세포주는 EK 293 세포(일차 사람 배아 신장), 3T3 세포(쥐과 배아 섬유모세포), CHO 세포(중국 햄스터 난소), COS-7 세포(아프리카 사바나 원숭이(African green monkey) 세포주), HeLa 세포(사람 상피모양 자궁경부 암종), JURKAT 세포(사람 T 세포 백혈병), BHK 21 세포(햄스터 정상 신장, 섬유모세포) 및 MCF-7 세포(사람 유방암), 특히 마우스 LTK-세포주 LAP1이다.
본 발명의 방법 내에서, (상술한 바와 같은) 세포는 동물의 혈장과 함께 항온배양된다. 상기 동물은 척추동물, 특히 포유동물, 특히 래트, 마우스, 래빗, 기니아 피그 또는 고양이일 수 있으며, 이들은 실험실에서 안전성 및 간편한 취급성을 제공한다.
사람 의약에 가장 중요한 결과를 제공하기 위해, 혈장도 또한 사람으로부터 유래할 수 있다. 이 경우, 정맥혈은 사람 제공자로부터 정맥천자에 의해 수득될 수 있는데, 일반적으로 혈액의 소량 샘플, 예를 들면, 5 내지 25ml의 샘플만이 본 발명의 방법에 적절하다(실시예 참조). 혈액은 앞쪽 아래팔의 팔오금 중간 정맥(팔꿈치 접힘부의 내부 면)으로부터 가장 흔히 수득된다. 이러한 정맥은 피부의 표면에 가까이 위치하고, 큰 신경 공급이 없다. 산업화 국가에서 대부분의 혈액 수집은 플라스틱 허브, 피하주사용 바늘 및 진공 튜브로 이루어진 진공흡입 튜브 시스템으로 이루어진다.
본 발명의 방법에 따르면, 이온 채널 리간드의 효율을 측정한다. 효율은 혈장의 존재하에 세포에 대한 이온 채널 리간드의 효과를 측정하여 측정된다. 상술한 바와 같이, 상기 세포에 대한 리간의 효과는 리간드에 대한 이온 채널의 결합, 각각의 이온과 표적의 결합, 세포 화합물, 예를 들면, 2차 전령의 양 측정, mRNA 또는 단백질의 양 측정, 임의의 변형 세포 기능(예를 들면, 아폽토시스 또는 세포 원형 정지의 유도) 등을 포함한 신호 전달의 각각의 수준에서 평가될 수 있다. 리간드와 표적의 결합 측정 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 본원에 정의된 것을 포함한다. mRNA 또는 단백질의 양의 측정 방법도 또한 당업자에게 널리 공지되어 있다. 변형된 세포 기능의 관찰 방법은 세포 기능의 유형에 크게 좌우되며, 또한 숙련의에게 널리 공지되어 있다.
세포에 대한 이온 채널 리간드의 효과 측정 방법은 비균질 또는 균질 검정을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 비균질 검정은 하나 이상의 세척 단계를 포함하는 검정인 반면, 균질 검정에서는 이러한 세척 단계가 필요하지 않다. 시약 및 화합물은 단지 혼합되고 측정된다. 본 발명의 방법은 또한 이온 채널 다운스트림 신호에 대하여 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 검정은 ELISA(효소 연결된 면역 흡착 검정), DELFIA(해리 증대된 란탄족 플루오로 면역 검정), SPA(섬광 근접 검정), 플래쉬플레이트 검정, FRET(형광 공명 에너지 전이) 검정, TR-FRET(시간차 형광 공명 에너지 전이) 검정, FP(형광 편광) 검정, ALPHA(증폭 발광 근접 균질 검정), EFC(효소 단편 상보성) 검정, 2종의 하이브리드 검정 또는 공동면역침전 검정일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 효율 검출 방법은 하나 이상의 2차 전령, 예를 들면, cAMP 또는 인지질(들), 바람직하게는 포스파티딜-이노시톨-포스페이트의 측정을 수반할 수 있다. 상기 검정은 하나 이상의 2차 전령의 농도의 측정을 포함할 수 있다. 하나 이상의 2차 전령의 농도 측정 수단 및 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들면, 표지된 전구체, 바람직하게는 표지된 2차 전령 전구체(예를 들면, [32P]ATP 또는 [3H]이노시톨)를 수반하고, 예를 들면, 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제 또는 질량 분석법을 포함한다. 인지질의 변화는 일반적으로 칼슘 채널과 특히 관련된다.
목적하는 이온 채널, 예를 들면, NHE 또는 중탄산나트륨-공동수송체가 pH 값에 영향을 미치는 경우, 본 발명의 방법에 의해 측정된 효과는 pH 값의 변화, 바람직하게는 세포내 pH 값의 변화이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 목적하는 이온 채널, 예를 들면, NHE 또는 중탄산나트륨-공동수송체에 대한 이온 채널 리간드의 효과는 형광에 의해 측정된다.
형광은 광자의 분자 흡수가 더욱 긴 파장의 또 다른 양자의 방출을 촉발하는 광학 현상이다. 흡수 양자와 방출 양자 사이의 에너지 차이는 결국 분자 진동 또는 열로 된다. 일반적으로, 흡수 양자는 자외선 범위에 있으며, 방출 광은 가시광선 범위에 있지만, 이는 특정 형광단의 흡광도 곡선 및 스토크스 이동(Stroke shift)에 좌우된다. 형광 적용의 수는 생의학, 생물학 및 관련 과학에서 성장하고 있다. 이들 분야에서 분석 방법도 또한, 비록 더욱 더 유감스럽게도 명명법이 FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP 및 TIRF와 같은 약어의 형태로 되지만, 성장하고 있다. 이러한 기법의 대부분은 형광 현미경에 좌우된다. 이러한 현미경은 고강도 광원, 일반적으로 수은 또는 크세논 램프, LED 또는 레이저를 사용하여, 관찰하에 샘플에서 형광을 여기시킨다. 이어서, 광학 필터에 의해 여기 광을 방출 형광으로부터 분리시켜, 눈에 의해, 또는 (CCD) 카메라 또는 기타 광 검출기(광전자증배관, 분광사진기 등)에 의해 검출한다.
일반적으로, 형광 염료 또는 마커 또는 라벨은 목적하는 신호의 효과(여기서는 이온 채널 리간드의 효과)를 검출하기 위해 사용된다. 상기 형광 염료는 형광단을 포함한다. 발색단과 유사한 형광단은 분자를 형광이 되게 하는 분자의 성분이다. 이는, 특정 파장의 에너지를 흡수하고 상이한(그러나 마찬가지의 특정) 파장에서 에너지를 재방출하는 분자의 작용기이다. 방출되는 에너지의 양과 파장은 형광단과 상기 형광단의 화학적 환경 둘 다에 좌우된다. 플루오레세인의 반응성 유도체인 플루오레세인 이소티오시아네이트는, 다양한 분야를 위한 신규한 형광 분자를 형성하는 다른 비형광 분자에 화학적으로 부착된 가장 흔한 형광단들 중의 하나이었다. 역사적으로 흔한 기타 형광단은 로다민, 쿠마린 및 시아닌의 유도체이다. 형광 염료의 예로는 7-아미노-악티노마이신 D, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 옐로우, Alexa Fluor, AnaSpec, 오라민 O, 오라민-로다민 염색, 벤즈안트론, 9,10-비스(페닐에티닐)안트라센, 5,12-비스(페닐에티닐)나프타센, CFDA-SE, CFSE, 칼세인, 카복시플루오레세인, 1-클로로-9,10-비스(페닐에티닐)안트라센, 2-클로로-9,10-비스(페닐에티닐)안트라센, 쿠마린, 시아닌, DAPI, Dioc6, DyLight Fluor, 에티디움 브로마이드, 플루오레세인, Fura-2, Fura-2-아세톡시메틸에스테르, 녹색 형광 단백질, Hilyte Fluor, Hoechst 염색, 인디언 옐로우, 인도-1, 루시페린, 페릴렌, 피코빌린, 피코에리트린, 피코에리트로빌린, 프로피디움 요오다이드, 피라닌, 로다민, RiboGreen, 루브렌, 루테늄(II) 트리스(바소페난트롤린 디설포네이트), SYBR Green, 스틸벤, 설포로다민 101, TSQ, Texas Red, 움벨리페론, 황색 형광 단백질 또는 BCECF이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
바람직한 양태에 따르면, BCECF{2',7'-비스(카복시에틸)-5(6)-카복시플루오레세인, C27H20O11, M= 520,45g/mol, CAS-Nr.: 85138-49-4, 보관: 2 내지 8℃, 광으로부터 보호됨}를 사용한다. BCECF는 세포 내부에서 이의 보유 증대로 인해 림프구에서 pH 측정을 위한 특성이 개선된 카복시플루오레세인의 아날로곤(analogon)이다. 온전한 세포로의 효율적인 흡수를 위해, BCECF는 아세톡시메틸에스테르 BCECF/AM의 형태로 사용될 수 있으며, 이는 세포 내부에서 개열(cleavage)되어 더욱 불투과성 BCECF를 형성한다. BCECF의 70nM 용액에 대한 최대 여기도(excitability)는 500nm에 위치해 있다. BCECF의 형광 강도는 몇몇 제제, 예를 들면, 글리세롤, 사카로오스, 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리비닐피롤리돈에 의해 영향을 받을 수 있다. BCECF의 적합한 농도는 5μM(최종 농도)이다.
본 발명의 맥락에서, 상기 형광 염료는 이온 채널에 대한 이온 채널 리간드의 효과에 대해 민감하다. 상기 효과는 채널 자체에 대한 직접 효과(예를 들면, 형태 변화, 결합 특성의 변화 등) 또는 목적하는 이온 채널 다운스트림의 신호 경로의 변화, 특히 목적하는 이온 채널에 의해 수송된 이온의 세포내 농도의 변화이다. 상기 이온은, 예를 들면, H+, HCO3 -, K+, Na+, Cl- 또는 Ca2 +일 수 있다. 적합한 pH 의존성 형광 마커(H+ 및 HCO3 -의 경우)로는 H+-선택적인 형광 발색이온운반체(chromoionophore) ETH 5294, S NAFL, SNARF, HPTS, 플루오레세인, 카보플루오레세인, BCECF{2',7'-비스(2-카복시에틸)-5(및 6)-카복시플루오레세인} 및 BCPCF{(2',7'-비스(2-카복시프로필)-5(및 6)-카복시플루오레세인}가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 칼슘 이온은, 에쿼린(격리된 제1 발광단백질), Alexa-488 또는 포티나(photina)로 표지된 칼모듈린(이탈리아 밀란에 소재하는 Axxam SpA), Fluo4{글리신, N-[4-[6-[(아세틸옥시)메톡시]-2,7-디플루오로-3-옥소-3H-크산텐-9-일]-2-[2-[2-[비스[2-[(아세틸옥시)메톡시]-2-옥소에틸]아미노]-5-메틸페녹시]에톡시]페닐]-N-[2-[(아세틸옥시)메톡시]-2-옥소에틸]-, (아세틸옥시)메틸 에스테르, C51H50F2N2O23, M= 1096.95g/mol, CAS-Nr.: 273221-67-3, 보관: 2 내지 8℃, 광으로부터 보호됨} 또는 Fura2{5-옥사졸카복실산, 2-(6-(비스(2-((아세틸옥시)메톡시)-2-옥소에틸)아미노)-5-(2-(2-(비스(2-((아세틸옥시)메톡시)-2-옥소에틸)아미노)-5-메틸페녹시)에톡시)-2-벤조푸라닐)-(아세틸옥시)메틸 에스테르, C44H47N3O24, M= 1001.86g/mol, CAS-Nr.: 108964-32-5, 보관: -20℃, 광으로부터 보호됨}를 사용하여 검출될 수 있다. 나트륨 및 칼륨 이온 검출의 경우, 이온운반체(ionophore) X 및 이온운반체 BME-44를 사용할 수 있다.
이러한 방법은 다음과 같이 수행될 수 있으며, 다음은 단지 예시적인 목적만을 위한 것이다. 당업자는 하나 이상의 단계가 상이한 방식으로 (예를 들면 본 발명의 상세한 설명에서 설명된 바와 같이) 수행될 수 있음을 이해할 것이다:
세포는 생체외 배양을 위해 조직으로부터 격리함으로써 수득될 수 있다. 예를 들면, 조직의 조각들을 성장 배지에 넣고, 성장하는 세포를 배양에 이용할 수 있다. 이러한 방법은 절편 배양(explant culture)으로 알려져 있다. 또는, 세포주(예를 들면, 확립 세포주 또는 무한증식 세포주)를 사용할 수 있다. 특정 세포 유형을 대표하는 다수의 잘 확립된 세포주가 존재한다(또한 상기 참조).
세포는 적합한 배지(예를 들면, 혈청 및 항생제를 포함한 시판용 배지)에서 배양될 수 있다. 세포는 일반적으로 적합한 대기(예를 들면, 5% CO2), 상대 습도(예를 들면, 90%) 및 온도(예를 들면, 37℃)에서 배양한다. 고처리량 스크리닝 및/또는 간편한 취급을 위해, 세포를 96 웰 플레이트, 24 웰 플레이트 등과 같은 다중 웰 플레이트에서 배양할 수 있다.
상술한 바와 같이, 세포내 pH 변화는 형광 마커를 사용하여 측정할 수 있다. 적합한 마커로는 SNARF-1, BCECF 및 CMFDA가 포함된다. 여기 및 방출은 카복시 SNARF-1의 경우 Exc 485nm, Em 590nm이고, BCECF의 경우 Exc 500nm, Em 538nm이고, CMFDA의 경우 Exc 485nm, Em 538nm이다. 여기 및 방출 대역폭은 각각 20nm 및 25nm일 수 있다. 세포내 pH의 측정에 적합한 장치는, 예를 들면, FLUOstar 97 형광계 다중 웰 플레이트 판독기(미국 노스캐롤라이나주 더럼에 소재하는 BMG LabTechnologies, Inc) 또는 실시예에 기재된 장치이다.
한 가지 양태에 따르면, 형광 염료 BCECF{2',7'-비스(카복시에틸)-5(6)-카복시플루오레세인, C27H20O11, M= 520,45g/mol, CAS-Nr.: 85138-49-4, 보관: 2 내지 8℃, 광으로부터 보호됨}를 사용한다. BCECF는 세포 내부에서 이의 보유 증가로 인해 림프구에서 pH 측정을 위한 특성이 개선된 카복시플루오레세인의 아날로곤이다. 온전한 세포로의 효율적인 흡수를 위해, BCECF는 아세톡시메틸에스테르 BCECF/AM의 형태로 사용될 수 있으며, 이는 세포 내부에서 개열되어 더욱 불투과성인 BCECF를 형성한다. BCECF의 70nM 용액에 대한 최대 여기도는 500nm에 위치해 있다. BCECF의 형광 강도는 몇몇 제제, 예를 들면, 글리세롤, 사카로오스, 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리비닐피롤리돈에 의해 영향을 받을 수 있다. BCECF의 적합한 농도는 5μM(최종 농도)이다.
다음은 세포내 pH 측정을 위한 세포의 제조를 위한 하나의 예시적인 방법이다: 세포를, 예를 들면, 90% 컨플루언스(confluence)까지 성장시키고, 예를 들면, 트립신으로 수확하고, 예를 들면, 10% 우태아 혈청을 함유하는 배양 배지로 즉시 퀀칭하고, 펠렛화하고, 이어서 1회 세정할 수 있다. 펠렛화된 세포를 새로운 배지에 재현탁시켜 회수하고(예를 들면, 37℃에서 1시간 동안 5% CO2하에), 예를 들면 중탄산염 무함유 완충액(예를 들면, 130mM NaCl, 4.7mM KCl, 1.2mM MgSO4, 1.2mM KH2PO4, 11.7mM D-글루코오스, 1.3mM CaCl2, 10mM HEPES, pH 7.4)으로, 예를 들면 2회 세정하고, 이어서 상기 마커(염료)에 의해 부하한다. 또 다른 양태에 따르면, 상기 세포는 염료 부하 전에 트립신 처리되지 않는다.
염료 부하는, 예를 들면, 다음과 같이 수행될 수 있다: 세포를, 1%(중량/용적) Pluronic F-127(미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 Sigma Chemicals)을 함유하는 중탄산염 무함유 Krebs-Hepes 완충액(pH 7.4) 중에서 실온에서 30분 동안 5μM 5(및 -6)-카복시 SNARF-1/AM(미국 오리건주 유진에 소재하는 Molecular Probe)으로 항온배양하였다. 세포를 완충액 중에서 실온에서 45분 동안, 예를 들면, 1μM 2-7-비스(2-카복시에틸)-5(및 -6)-카복시플루오레세인(BCECF/AM)(Molecular Probe)으로 부하할 수 있다. 세포를 완충액에서 37℃에서 45분 동안 5μM CellTracker Green CMFDA(5-클로로메틸플루오레세인 디아세테이트)(Molecular Probe)로 부하할 수 있다. 적절하고 널리 공지되어 있는 프로토콜에 따라, 하나 이상의 다른 상기 염료로 유사하게 부하할 수 있다.
부하 후, 세포를, 예를 들면 완충액으로 1회 이상(예를 들면 2회) 세정하고, 새로운 배지 중에 재현탁시킬 수 있으며, 5% CO2 하에 37℃에서 1시간 이상 동안 또는 그 이상 (예를 들면, 밤새) 회복(recovery)시켰다. 염료 부하 및 회복 시간 후, 상기 세포를 적절한 완충액, 예를 들면, 중탄산염 무함유 Krebs-Hepes 완충액(pH 7.4 또는 6.0)으로 1회 이상(예를 들면, 3회) 세정하고, 2.5 × 106 세포/mL의 최종 농도로 재현탁시키고 4℃에서 유지할 수 있다.
상기 세포를 불투명한 백색 96 웰 플레이트(또는 임의의 기타 적합한 플레이트, 예를 들면, 투명한 바닥의 흑색 플레이트)에 희석하고 균일하게(대략 35,000 세포/웰) 분포시켰다. 혈장 및 완충액 단독 또는 리간드 함유 완충액을 별개의 웰에 순차적으로 주입하고, 형광 강도를 적절한(예를 들면, 20초) 간격으로 기록할 수 있다. 몇 개(예를 들면, 5개)의 기저선 판독을 각각의 주입 전에 적절한 간격(예를 들면, 20초 간격)으로 수행할 수 있다.
각각의 실험 말기에, 공지된 이온 채널 리간드(예를 들면, H+/K+ 교환체에 대하여 니제리신)에 의한 동일 위치의(in situ) 보정 절차를 사용하여 형광 강도를 pH 값과 관련시킬 수 있다. 이는, 예를 들면, 높은 K+ 완충액(20μM 니제리신의 존재하에 140mM KCl, 1.2mM MgSO4, 1.2mM KH2PO4, 11.7mM D-글루코오스, 1.3mM CaCl2, 10mM HEPES, pH 6.0 내지 8.0)을 탈분극시키는데 세포들을 상이한 pH 완충액들에 노출시킴으로써 K+/H+ 교환체 이온운반체가 [K+]o= [K+]i 및 pHo= pHi로 설정되므로, 수행될 수 있다. 세포 밀도의 작은 변화 및 보정과 실험 사이의 조명 강도의 불안정을 교정하기 위해, 각각의 실험 말기에 세포를 0.1% Triton X-100으로 투과시키고 KOH를 사용하여 pH를 11로 조정함으로써, CMFDA 농도를 측정하였다.
추가로, 염료를 누출시킨 후, 기증물을 누출된 세포내 염료로부터 분리하였다. 이를 위해, 상이한 시간 간격들에서, 세포를, 예를 들면 30초 동안 스핀다운시킬 수 있다. 이어서, 각각의 상청액 및 재현탁된 세포 용해물(lysate)의 형광 강도를 측정할 수 있다. 상청액 용액의 형광 강도는 세포로부터의 염료 누출을 반영하고, 상청액과 세포 용해물 둘 다를 합한 형광 강도를 사용하여 염료의 총량을 정의할 수 있다. 대조군(염료 없음)의 형광 강도를 각각의 분획으로부터 공제할 수 있으며, 누출을 형광 강도(상청액/전체) 대 시간의 비율로서 기록할 수 있다.
추가의 예시적인 방법을 실시예에서 설명한다.
또는, 세포막을 가로지르는 이온 유동의 검출을 위해 이온 민감성 미세전극(이온 선택적 이온운반체, 예를 들면, 나트륨 이온운반체 비스(12-크라운-4), 칼륨 선택적 이온운반체 비스(벤조-15-크라운-5), 칼슘 선택적 이온운반체 HDOPP-Ca) 또는 이온 민감성 효소(예를 들면, 칼륨 의존성 우레아 아미도리아제, 피루베이트 키나아제(미국 특허 제5,501,958호 및 제5,334,507호) 또는 글리세롤 데하이드로게나아제(미국 특허 제5,719,036호))를 사용할 수 있다. 추가로, pH 민감성 방법은 약산 또는 염기의 분배, 31P-NMR 분광법 및 pH 민감성 녹색 형광 단백질[GFP]을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 방법은 고처리량 스크리닝에 적합화되어 있다. 이러한 방법에서, 다수의 화합물을, 전세포 검정으로 목적하는 이온 채널에 대하여 스크리닝할 수 있다. 통상적으로, 자동화된 로봇 스테이션 기반 기술을 사용하는 96 웰 플레이트에서 또는 고밀도 어레이("칩") 포멧에서 이러한 스크리닝을 수행한다.
본 발명의 방법의 한 가지 양태에서, 상기 이온 채널 리간드, 예를 들면, NHE 리간드를 혈장과 함께 세포에 투여한다. 이는 상기 리간드를 (사람이 아닌) 동물에 투여함으로써 달성될 수 있다. 상기 리간드를 비경구(정맥내, 동맥내, 근육내, 심장내, 피하, 피내, 경막내, 복강내), 장관(예를 들면, 경구 또는 직장), 국소(예를 들면, 피부 표면, 흡입, 비강 또는 질내) 등을 포함하는 임의의 적합한 경로로 투여할 수 있다. 음식물을 통한 투여가 바람직하다.
상기 리간드를 혈장에 존재하도록 하기에 충분한 시간 후, 혈장을 동물로부터 채취한다. 본 발명의 방법을 수행하기 위해, 리간드를 포함한 상기 혈장을 세포에 첨가하고, 세포에 대한 리간드의 효과를 측정한다. 상기 효과의 측정은 혈장에서의 리간드의 농도 측정을 포함할 수 있다(실시예 2 참조). 동물에 투여된 리간드의 양을 혈장에 존재하는 리간드의 양과 비교하는 경우, 예를 들면, 리간드의 흡착, 분포, 대사 및 배출의 정도 및 속도에 대한 결론을 상기 비교로부터 도출할 수 있다.
본 발명에 따르면, 이온 채널 리간드의 효과의 측정 방법이, 리간드의 혈장 농도의 측정을 위해 사용될 수 있다. 이는 미지의 리간드 농도를 갖는 혈장의 효과를 표준, 예를 들면, 표준 곡선과 비교하여 수행할 수 있다(예를 들면, 실시예 2 참고).
본 발명의 방법은 이온 채널 장애와 관련된 질환의 예방 및/또는 치료, 특히 심혈관 질환 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약제를 스크리닝하기 위해 사용할 수 있다. 스크리닝 목적을 위해 사용되는 경우, 시험된 리간드는 공지의 이온 채널 리간드 또는 물질일 수 있으며, 이의 기능은 아직 알려져 있지 않거나 이온 채널과 아직 관련되어 있지 않다. 따라서, 상기 방법은 신규한 이온 채널 리간드의 확인에 사용될 수 있다. 또는, 본 발명의 방법을 사용하여 공지의 이온 채널 리간드를 상기 리간드의 효율에 대해 시험할 수 있다. 상기 효율은, 리간드의 활성에 대한 혈장의 효과를 평가하고 리간드의 생체내 활성을 추정하기 위해, 혈장 무함유 시스템(예를 들면, 결합 친화도) 중에서의 리간드 활동과 비교할 수 있다.
상기 리간드는 화학적 화합물 라이브러리의 형태로 제공될 수 있다. 화학적 화합물 라이브러리는 복수의 화학적 화합물을 포함하며, 화학적으로 합성된 분자 및 천연 생성물을 포함한 다수의 공급원 중의 임의 것으로부터 조립되어 왔거나, 조합 화학 기술에 의해 생성되어 왔다. 이들은 특히 고처리량 스크리닝에 적합하다. 이들은 특정 구조의 화학적 화합물들 또는 식물과 같은 특정 생물의 화합물들로 이루어질 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 화학적 화합물 라이브러리는 바람직하게는 작은 분자들을 포함하는 라이브러리이다.
다음에서, 본 발명을 도 및 실시예로 설명하며, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
도 1은 래트 혈장에서의 효율 산출치(EC50= 115nM)의 카리포라이드(cariporide) 보정 곡선을 도시한다.
도 2는 래트 혈장에서의 효율 산출치(EC50= 662nM)의 신규한 화합물 X에 대한 보정 곡선을 도시한다.
도 3은 NHE1 시험관내 검정을 사용한 카리포라이드 및 화합물 X의 혈장 농도 추정치를 나타낸다.
실시예
실시예 1: 동물 혈장 샘플에서의 NHE 길항제의 유효 농도를 측정하기 위한 검정의 확립
0.3% 카리포라이드(NHE 억제제)를 함유한 표준 래빗 음식물(chow)을 먹인 뉴질랜드 암컷 래빗(2.5 내지 3.5kg)으로부터 혈장 샘플을 수득하였다. 1주일 후 카리포라이드의 혈장 농도의 측정을 위해 이개 동맥(auricular artery)으로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 카리포라이드의 혈장 농도를 하기에 기재된 바와 같이 측정하였다:
NHE-유전자(SLC9A1)[참조: Franchi A. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1986 Dec; 83(24):9388-92]를 pMamneo-벡터에 클로닝하고 LAP1(마우스 LTK-세포주) 세포에 도입하였다. 안정한 세포주들이 형질감염된 세포들로부터 생성되었다.
사람 NHE1(hNHE1)을 안정적으로 발현하는 LAP1(마우스 LTK-세포주) 세포들을 투명한 바닥의 흑색 96 웰 마이크로플레이트(Costar®, 미국 뉴욕주 코닝에 소재하는 Corning Inc.) 상에 25,000 세포/웰/100㎕ 배지(Iscove 배지, 10% FCS, 2mM L-글루타민, l00μ/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50㎍/ml 젠타마이신, 400㎍/ml G418)의 밀도로 접종하였다. 세포들을 37℃, 5% CO2 및 90% 상대습도에서 밤새 항온배양하였다. 측정 전에 상기 배지를 폐기하고, 100㎕/웰 염료 완충액(20mM HEPES, KOH로 조정한 pH 7.4, 20mM NH4Cl, 115mM 콜린 클로라이드, 1mM MgCl2, 1mM CaCl2, 5mM KCl, 5mM 글루코오스, 5μM BCECF)을 첨가하였다. 37℃에서 20분 동안 항온배양한 후, 상기 세포들을 Na+ 무함유 세척 완충액(5mM HEPES, KOH로 조정한 pH 7.4, 133.8mM 콜린 클로라이드, 4.7mM KCl, 1.25mM CaCl2, 1.25mM MgCl2, 0.97mM K2HPO4, 0.23mM KH2P04, 5mM 글루코오스)로 3회 세척하고, 웰당 세척 완충액 90㎕를 남겼다. pH 회복을 FLIPR(형광검출 이미징 플레이트 판독기(Fluorometric Imaging Plate Reader), 미국 캘리포니아 서니베일에 소재하는 Molecular Devices; 레이저 파워 0.3W, 조리개 4, 측정 간격 2초, 측정 시간 120초)로 측정하였다. 측정 동안, 혈장 용액(길항제 없이 먹이를 준 동물로부터의 90% 동물 혈장, 10% Na+ 완충액: 10mM HEPES, KOH로 조정한 pH 7.4, 133.8mM NaCl, 4.7mM KCl, 1.25mM MgCl2, 1.25mM CaCl2, 0.97mM Na2HPO4, 0.23mM NaH2PO4, 5mM 글루코오스) 90㎕를 웰에 첨가하였다. 상기 완충액 중의 Na+로 인해, NHE1은 세포들 밖으로 H+를 수송하기 시작하여 새포내 pH 및 형광을 증가시킨다. 높은 대조군: 길항제가 없는 혈장 용액. 낮은 대조군: 20μM 카리포라이드(10μM 최종 농도)를 함유하는 혈장 용액. 제조 후 카리포라이드를 혈장에 첨가하였다. 10μM 카리포라이드를 첨가하여 NHE1 활성을 완전히 차단시킨다. 보정을 위해, 상이한 양들의 카리포라이드와 시험 길항제를, 동물 혈장에서의 효율을 측정하기 위해, 제조 후 혈장에 첨가하였다.
NHE1 활성의 보정을 위해, 12번째와 32번째 사이의 형광 증가를 산출하였다. 높은 대조군은 100% NHE1 활성으로 설정되는 반면, 낮은 대조군은 0% NHE1 활성을 측정한다. 상기 샘플의 활성(%)은 대조군들과 비교하여 산출하였다.
Figure pct00007
Figure pct00008
결과: 표 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 실시예는 양호한 결과를 나타냈다. 검정 수행은 배우 양호하였다(z'= 0.74, 표 1 참조). 모든 프로브는, 카리포라이드 농도가 10μM 이상임을 나타내는 NHE1의 완전한 차단을 나타냈다(표 2 및 도 1 참조).
실시예 2: NHE 길항제의 혈장 수준 측정을 위한 검정
연구용 혈장을 위해 사용되는 동물들을 다음과 같이 전처리하였다:
ㆍ 동물: 수컷 스프라그 돌리 래트(Moellegard)
ㆍ 체중: 320 내지 360g
ㆍ 마취: 티오펜탈 Na(트라파날 100mg/kg 복강내)
ㆍ 호흡: 40용적% CO2
ㆍ 혈액 가스: 32 내지 40mmHg pCO2
80 내지 100mmHg pO2
pH 7.35 내지 7.49
SaO2 > 96%
ㆍ 허혈: LAD의 20분 폐색(좌전하행 관상 동맥)
ㆍ 재관류: 60분
ㆍ 체온: 36.5℃
ㆍ 측정 파라미터: 심근경색증 덩어리
평균 동맥압
심박수
화합물 혈장 수준
ㆍ 혈액 샘플: 단일 프로브, 정맥내 주사 80분 후 (재관류 종료)
또는 단일 프로브, 경구 치료 200분 후 (재관류 종료)
그룹: 0. 비히클 1㎖/kg 정맥내 식염수 (n= 8) 폐색 5분전
I. 카리포라이드 1mg/kg 정맥내 (n= 8) 폐색 5분전
II. 화합물 X 3mg/kg 정맥내 (n= 8) 폐색 5분전
III. 화합물 X 1mg/kg 정맥내 (n= 8) 폐색 5분전
IV. 화합물 X 0.3mg/kg 정맥내 (n= 8) 폐색 5분전
V. 화합물 X 3mg/kg 경구 (n= 8) 폐색 5분전
VI. 화합물 X 10mg/kg 경구 (n= 8) 폐색 5분전
VII. 화합물 X 0.1mg/kg 정맥내 (n= 8) 폐색 5분전
주사한지 85분이 지난 후(그룹 I 내지 IV, VII) 또는 치료한지 200분이 지난 후(그룹 V 및 VI) 그룹 I 내지 VII로부터, 및 처리하지 않은 래트로부터 상이한 양들의 혈장을 제조하였다. 분석을 수행할 때까지, 혈장을 -20℃에서 보관하였다.
NHE1 리간드 효율의 세포 기반 측정의 경우, hNHE1을 안정하게 발현하는 LAP1(마우스 LTK-세포주) 세포(실시예 1 참고)를 투명한 바닥의 흑색 96 웰 마이크로플레이트(Costar®, 미국 뉴욕주 코닝에 소재하는 Corning Inc.) 상에 25,000 세포/웰/100㎕ 배지(Iscove 배지, 10% FCS, 2mM L-글루타민, l00μ/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50㎍/ml 젠타마이신, 400㎍/ml G418)의 밀도로 접종하였다. 세포들을 37℃, 5% CO2 및 90% 상대습도에서 밤새 항온배양하였다. 측정 전에 상기 배지를 폐기하고, 100㎕/웰 염료 완충액(20mM HEPES, KOH로 조정한 pH 7.4, 20mM NH4Cl, 115mM 콜린 클로라이드, 1mM MgCl2, 1mM CaCl2, 5mM KCl, 5mM 글루코오스, 5μM BCECF)을 첨가하였다. 37℃에서 20분 동안 항온배양한 후, 상기 세포들을 Na+ 무함유 세척 완충액(5mM HEPES, KOH로 조정한 pH 7.4, 133.8mM 콜린 클로라이드, 4.7mM KCl, 1.25mM CaCl2, 1.25mM MgCl2, 0.97mM K2HPO4, 0.23mM KH2P04, 5mM 글루코오스)로 3회 세척하고, 웰당 세척 완충액 90㎕를 남겼다. 상기 혈장 프로브를 다음과 같이 제조하였다: 10%(v/v) Na+ 완충액(10mM HEPES, KOH로 조정한 pH 7.4, 133.8mM NaCl, 4.7mM KCl, 1.25mM MgCl2, 1.25mM CaCl2, 0.97mM Na2HPO4, 0.23mM NaH2PO4, 5mM 글루코오스)를 갖는 혈장 용액 90%(v/v)의 래트 혈장에 첨가하였다.
높은 대조군(길항제 무함유 혈장 용액) 및 낮은 대조군(20μM 카리포라이드, 10μM 최종 농도)을 제조하였다. 10%(v/v) Na+ 완충액/90%(v/v) 래트 혈장 중의 카리포라이드 및 화합물 X의 희석 시리즈를 보정 곡선에 사용하여, 래트 혈장 프로브 중의 화합물 농도를 산출하였다(도 1 및 2 참조).
pH 회복을 FLIPR(형광검출 이미징 플레이트 판독기, 미국 캘리포니아 서니베일에 소재하는 Molecular Devices; 레이저 파워 0.3W, 조리개 4, 측정 간격 2초, 측정 시간 120초)로 측정하였다. 측정 동안, 90㎕의 혈장 용액을 웰에 첨가하였다.
NHE1 활성의 산출 동안, 12번째와 32번째 사이의 형광 증가를 산출하였다. 높은 대조군은 100% 활성으로 설정되는 반면, 낮은 대조군은 0% NHE1 활성으로 설정되었다. 상기 샘플들의 활성(%)은 대조군과 비교하여 산출하였다. 화합물 혈장 수준을 보정 곡선에 대하여 산출하였다.
결과: 결과를 표 3에 요약한다. z' 인자는 모든 측정에 대하여 0.75를 초과하였다.
Figure pct00009
카리포라이드 및 화합물 X에 대한 예시적인 보정 곡선은 도 1 및 2에 도시한다.
추가로, 보정 곡선을 사용하여, 프로브 세트 중의 화합물 혈장 수준을 산출하였다. 수학식 2를 사용하여 보정 곡선을 산출하였다.
Figure pct00010
변수를 표 4에 나타낸 바와 같이 설정하였다.
Figure pct00011
Figure pct00012
혈장 화합물 수준의 산출치는 도 3에 나타낸다.
따라서, 본 발명의 NHE1 검정을 사용하여 래트 혈장에서의 NHE1 억제제의 효능을 측정할 수 있다. 또한, 보정 곡선에 따라 이들 화합물의 활성 혈장 농도를 산출할 수 있다. NHE1 억제제는 제조 후 래트 혈장에서 활성이었다. 상기 데이터는 NHE1 억제의 양호한 용량 의존성을 나타낸다.

Claims (14)

  1. 이온 채널 리간드의 효율의 측정 방법으로서, 상기 방법이
    a) 이온 채널 발현 세포를
    i) 동물의 혈장 및
    ii) 상기 이온 채널 리간드와
    접촉시키는 단계 및
    b) 상기 세포에 대한 상기 이온 채널 리간드의 효과를 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이온 채널이 나트륨-양성자 교환체(Sodium-Proton-Exchanger)(NHE) 또는 중탄산나트륨-공동수송체(cotransporter)인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 NHE가 NHE1, NHE2, NHE3 또는 NHE5, 특히 NHE1 또는 NHE3, 특히 NHE1인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 채널 리간드, 특히 상기 NHE 리간드가 작용제 또는 길항제, 특히 NHE 길항제인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 세포주, 특히 포유동물 세포주, 특히 사람 또는 마우스 세포주, 특히 마우스 LTK-세포주 LAP1인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 동물이 척추동물, 특히 포유동물, 특히 래트, 마우스, 래빗, 기니아 피그 또는 고양이인, 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 동물이 사람인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 효과가 pH 값의 변화인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 효과가 세포내 pH 값의 변화인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 효과가 형광에 의해 측정되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 및 제8항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 NHE 리간드가 상기 동물에 투여되고, 상기 동물이 인간 이외의 동물인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 리간드의 혈장 농도를 측정하는데 사용되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 이온 채널 장애와 관련된 질환의 예방 및/또는 치료용 약제를 스크리닝하기 위해 사용되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 심혈관 질환 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약제를 스크리닝하기 위해 사용되는, 방법.
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