JP5448455B2

JP5448455B2 - 新規３’−，７−置換インジルビンおよびそれらの適用

Info

Publication number: JP5448455B2
Application number: JP2008546691A
Authority: JP
Inventors: ロランマイヤー; カリマベタイエブ; アレクシオスレアンドロススカルトソウニス; プロコピオスマグラティス; ハシントボイス; ジュディリバ
Original assignee: Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Current assignee: Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Priority date: 2005-12-23
Filing date: 2006-12-21
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2026-12-21
Also published as: US8552053B2; JP2009523125A; CA2633069A1; WO2007099402A2; WO2007099402A3; US20100331327A1; EP1963264A2

Description

本発明は、新規３’−，７−置換インジルビンおよびそれらの、特に、抗腫瘍剤としての適用に関する。

インジルビンは４種の異なる天然源から抽出され得る：インジゴ−産出植物、Tyrean purple−産出軟体類、種々の組み換え型細菌株およびヒトを含む種々の哺乳類からの尿（Meijerらの総説，２００６）。インジルビンは、慢性骨髄性白血病等の複数の疾患を治療するために用いられる伝統的な漢方（Danggui Longhui Wan）の活性成分として報告された。

サイクリン依存性キナーゼ類（cyclin-dependent kinases：ＣＤＫｓ）、グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ−３（glycogen synthase kinase-3：ＧＳＫ−３）、グリコーゲン・ホスホリラーゼｂを阻害し、ダイオキシン受容体として知られる芳香族炭化水素受容体（Aryl Hydrocarbon Receptor：ＡｈＲ）に結合および活性化することが発見された時にインジルビンおよび誘導類似体（インジルビンと総称する）における興味が非常に大きくなった。

インジルビンは、ＣＤＫ２、ＣＤＫ２／サイクリンＡ、ＣＤＫ５／ｐ２５、ＰｆＰＫ５、Plasmodium falciparum（熱帯熱マラリア原虫）ＣＤＫ１ホモログ、ＧＳＫ−３βおよびグリコーゲン・ホスホリラーゼｂと共結晶化される。

インジルビンは、明確な抗増殖および細胞死誘導作用を示す。これらの作用がＣＤＫ類の阻害から生じることを示唆する証拠があるが、ＡｈＲとの相互作用およびそれに続くｐ２７^ｋｉｐｌの誘導も、インジルビンの細胞作用に寄与し得る。

さらに、いくつかインジルビンは、最近、転写因子ＳＴＡＴ３の活性を妨げることが示された。これは、おそらく、そのｓｒｃ依存性チロシンリン酸化の阻害によるものである。これは、survivin、Ｍｃｌ−１等の生存因子のダウンレギュレーションおよびこれに続く細胞死誘導につながる。

本発明者らは、３’−，７−置換インジルビンは、インジルビンの種々の古典的キナーゼターゲットについての弱いまたは微々たる阻害活性にも拘わらず、驚くべきことに、多様なヒト腫瘍において細胞死を誘導することを見出した。

そこで、本発明の目的は、新規なインジルビンである３’−，７−置換インジルビンを提供することにある。

本発明の別の目的は、このようなインジルビン誘導体、特に水溶性インジルビンの合成方法を提供することである。

さらに別の目的は、前記インジルビン誘導体を含有する、多様な腫瘍の治療に特に有用な医薬組成物を提供することである。

これはまた、このような誘導体を用いることによる腫瘍の治療方法を提供する別の目的である。

本発明は、より詳細には、式（Ｉ）：

（式中、Ｒは、Ｎ−ＯＨ、Ｎ−Ｏ−アルキルまたはＮ−Ｏ−ＣＯ−アルキル、ＮＯ−（Ｒ_ａ）_ｎ１−Het、Ｎ−Ｏ−（Ｙ）_ｎ１−ＮＲ_ａＲ_ｂ、Ｎ−Ｏ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ_ｂ，Ｒ_ｃ）基を示し、Hetは脂肪族窒素ヘテロ環を示し、Ｙは置換されてもよい−ＣＨ_２−基であり、ｎ１は１〜３であり、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択されるハロゲン原子であり、ＺはＨまたはＣＨ_３である）
の３’−，７−置換インジルビンおよびその塩に関する。

驚くべきことに、前記インジルビンは、種々の機構を介して細胞死を誘導する。

実際に、これらのインジルビン誘導体は、カスパーゼ依存性および／またはカスパーゼ非依存性機構を通じて作用して、多様なヒト腫瘍において強い細胞死誘導特性を示す。

カスパーゼ非依存性の方法で細胞死を誘導する第一の系統では、Ｒは、より特定的にはＯＨを示す。

カスパーゼ依存性およびカスパーゼ非依存性の混合型作用機構を呈する第二の系統では、Ｒは、Ｎ−Ｏ−アルキル基、特に、Ｎ−Ｏ−Ｃ１−Ｃ３アルキル基、より好ましくはＮ−Ｏ−ＣＨ_３基を示す。

第三の系統では、インジルビンは、主に古典的なカスパーゼ依存性機構を通じて作用する。この系統では、Ｒは、ＮＯ−（Ｒ_ａ）_ｎ１−Het、Ｎ−Ｏ−（Ｙ）_ｎ１−ＮＲ_ａＲ_ｂ、Ｎ−Ｏ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ_ｂ，Ｒ_ｃ）（Ｒ_ａ、ｎ１、Het、Ｒ_ｂおよびＲ_ｃは上記に定義された通りである）の置換基およびその塩を示す。特に、Ｒは、表２に規定されるようなＡ、Ａｓ、Ｂ、Ｂｓ、Ｃ、Ｃｓ、Ｄ、Ｄｓ、Ｅ、Ｅｓ、Ｇ、Ｇｓ、ＦまたはＨである。

前記系統の好ましい誘導体では、ＸはＢｒを示し、ＺはＨである。

本発明はまた、下記の７−置換インジルビン−３’−オキシム誘導体を製造する方法に関する。

７−ハロゲノ−インジルビンの合成は、主として、スキーム１に示されるように、適切に置換されたイサチン誘導体の３−アセトキシインドールとの二量化反応に基づいていた。

所望のイサチンは、対応する市販の７−ハロゲノ−アニリンIa-dを出発物質として用いる二工程の手順を通じて合成された。

第一の工程では、適切なアニリン誘導体は、抱水クロラールおよび塩酸ヒドロキシルアミンと反応させられて、対応するイソニトロソアセトアニリドIIa-dを与えた。

第二の工程では、中間体のイソニトロソアセトアニリドは、酸条件下、特に、濃硫酸中で加熱されて、７−ハロゲノイサチン（IIIa-d）を与えた。

７−ハロゲノ−Ｎ−メチルイサチン（IVa-d）は、それぞれ、ジメチル硫酸およびＮａ_２ＣＯ_３による処理によってIIIa-dから調製された。

置換イサチンである７−ハロゲノイサチン（IIIa-d）または７−ハロゲノ−Ｎ−メチルイサチン（IVa-d）は、アルカリ媒体中で３−アセトキシインドールと反応させられて、一般的には良好な収率で、対応するビスインドールを選択的にＺ体で与えた（実施例中の誘導体７、１５、２３、３１、１１、１９、２７および３５を参照）。

オキシム（実施例中の誘導体８、１６、２４、３２、１２、２０、２８および３６を参照）は、適切なインジルビン誘導体（実施例中の誘導体７、１５、２３、３１、１１、１９、２７および３５）からの、還流下のピリジン等の有機溶媒中の塩酸ヒドロキシルアミンによる典型的な手順の後に、選択的に（２’Ｚ、３’Ｅ）体で調製された。

類似の典型的な手順は、メトキシアミン塩酸塩を用いるメトキシム（実施例中の誘導体９、１７、２５、３３、１３、２１、２９および３７）の調製に追随された。

アセトキシム（実施例中の誘導体１０、１８、２６、３４、１４、２２、３０および３８等）は、オキシムから、ピリジン等の有機溶媒中の無水酢酸により調製された。反応温度は、二アセチル化を避けるために注意して０℃に維持された。

３’置換オキシムである７ＢＩＯおよびＭｅ７ＢＩＯの合成は、３’−［Ｏ−（２−ブロモエチル）オキシム］中間体（実施例中の５７または５８等）を適切なアミン：ピロリジン、モルホリン、ピペラジン、イミダゾール、ジメチルアミンおよびジエチルアミンと反応させることに基づいていた。

前記中間体５７および５８は、７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯを１，２−ジブロモエタンとＤＭＦおよびＥｔ_３Ｎ中室温で反応させることによって調製された。

さらに、カルバマート（実施例中の６３、６４等）は、７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯまたは類似体をＮ，Ｎ−ジエチルカルバミルクロリドと反応させることによって調製された。

工程a-jにおける適した試薬および条件は以下の通りである：
（ａ）抱水クロラール，Ｎａ_２ＳＯ_４，Ｈ_２ＮＯＨ・ＨＣｌ，Ｈ_２Ｏ，Ｈ^＋；（ｂ）Ｈ_２ＳＯ_４；（ｃ）（ＣＨ_３）_２ＳＯ_４，Ｎａ_２ＣＯ_３，ＤＭＦ；（ｄ）３−アセトキシインドール，Ｎａ_２ＣＯ_３／ＭｅＯＨ２５℃；（ｅ）Ｈ_２ＮＯＣＨ_３・ＨＣｌ，Ｐｙ，１２０℃；（ｆ）Ｈ_２ＮＯＣＨ_３・ＨＣｌ，Ｐｙ，１２０℃；（ｇ）Ａｃ_２Ｏ，Ｐｙ，０℃；（ｈ）ジブロモエタン，トリエチルアミン，無水ＤＭＦ，２５℃；（ｉ）無水ＤＭＦ，２５℃，アミン；（ｊ）Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバミルクロリド，トリエチルアミン，無水ＤＭＦ，２５℃。

以下に与えられる実施例によって例示されるように、上記の開示された本発明の７−置換インジルビン−３’−オキシム誘導体は、有益な生物学的特性を有する。神経芽腫細胞の生存およびヒトの腫瘍細胞系についてのそれらの作用は特に有利であり、インビボで確認され、このことは、抗腫瘍剤としてのそれらの高い重要性を証明する。さらに、それらは、高い接種性（inocuity）を有する。

前記誘導体は、その結果、薬物の有効成分として特に適している
本発明は、それ故に、上記に規定された少なくとも１種の３’−，７−置換インジルビン誘導体の有効量を、製薬的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物にも関する。

前記医薬組成物は、経口で、注射可能に、非経口ルートで、治療されるべき患者に適した個々の用量で投与されるように配合される。

前記組成物は、アポトーシス抵抗機構を発生させたヒトの腫瘍を治療するために特に有用である。それらは、結腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、神経芽腫、肝癌または白血病を治療するために特に有効である。

本発明はまた、アポトーシス抵抗機構を生じたヒト腫瘍の治療方法であって、必要とする患者に上記に規定されたような組成物の有効量を投与する工程を包含する方法に関する。

本発明の他の特徴および利点は、図１〜１５を参照しながら以下に与えられる。

（材料および方法）
（化学）
（一般的な化学実験手順）
全化学品は、Aldrich Chemical Co.から購入された。ＮＭＲスペクトルは、Bruker DRX 400により記録された；化学シフトは、ＴＭＳから低磁場のｐｐｍで表される。^１Ｈ−^１Ｈおよび^１Ｈ−^１３ＣＮＭＲ実験は、標準Brukerマイクロプログラムを用いて行われた。ＣＩ−ＭＳスペクトルは、Finnigan GCQ Plus イオン−トラップ質量分析計により、ＣＩイオン化試薬としてＣＨ_４を用いて測定された。カラムクロマトグラフィーは、フラッシュシリカゲル60 Merck（４０〜６３μｍ）を用いて、３００ｍｂａｒの過剰圧力で行われた。全ての化合物は、満足な燃焼分析を与えた（計算値の±０．４％の範囲内のＣ，Ｈ，Ｎ）。

（インジルビン合成の一般的な手順）
５−ブロモインジルビン（５ＢＩ）、７−ブロモインジルビン（７ＢＩ）、７−クロロインジルビン（７ＣＩ）、７−ヨードインジルビン（７ＩＩ）、７−フルオロインジルビン（７ＦＩ）および７−ブロモ−１−メチルインジルビン（Ｍｅ７ＢＩ）は、それぞれ、５−ブロモイサチン、７−ブロモイサチン、７−クロロイサチン、７−ヨードイサチン、７−フルオロイサチン、７−ブロモ−１−メチルイサチンと、３−アセトキシインドールとから調製された。

５−ブロモインジルビン−３’−オキシム（５ＢＩＯ）、７−ブロモインジルビン−３’−オキシム（７ＢＩＯ）、７−クロロインジルビン−３’−オキシム（７ＣＩＯ）、７−ヨードインジルビン−３’−オキシム（７ＩＩＯ）、７−フルオロインジルビン−３’−オキシム（７ＦＩＯ）および１−メチル−７−ブロモインジルビン−３’−オキシム（Ｍｅ７ＢＩＯ）は、対応するインジルビンと塩酸ヒドロキシルアミンとから調製された。ＩＯおよび６ＢＩＯは、以前に記載されたようにして合成された（Leclerc et al, 2001; Polychonopoulos et al, 2004）。

（インジルビン−オキシム５ＢＩＯ、７ＢＩＯ、７ＣＩＯ、７ＩＩＯ、７ＦＩＯおよびＭｅ７ＢＩＯの調製のための一般的な手順）
適切なインジルビン誘導体５ＢＩ、７ＢＩ、７ＣＩ、７ＩＩ、７ＦＩまたはＭｅ７ＢＩ（１ｍｍｏｌ）が、ピリジン（１０ｍＬ）中に溶解させられた。マグネティックスターラにより攪拌しながら、塩酸ヒドロキシルアミン（１０当量）が加えられ、混合物は、還流下（１２０℃）に１．５時間にわたって加熱された。次いで、減圧下に溶媒が留去され、残渣は、水およびシクロヘキサンにより洗浄され、定量的に対応する３’−オキシムを得た。

５−ブロモインジルビン−３’−オキシム（５ＢＩＯ）
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J σε Hz) 13.70 (1H, s, NOH), 11.83 (1H, s, N’-H), 10.87 (1H, s, N-H), 8.76 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-4), 8.27 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4’), 7.44 (2H, m, H-6’, 7’), 7.28 (1H, dd, J = 8.2, 2.0 Hz, H-6), 7.06 (1H, td, J = 7.9, 2.0 Hz, H-5’), 6.85 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-7); CI-MS m/z 356, 358 (M+H)⁺
７−ブロモインジルビン−３’−オキシム（７ＢＩＯ）
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J σε Hz) 13.68 (1H, brs, NOH) 11.90 (1H, s, N’-H), 10.91 (1H, s, N-H), 8.67 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4), 8.23 (1H, d, J = 7.8, H-4’), 7.42 (2H, m, H-6’, 7’), 7.29 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-6), 7.06 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-5’), 6.90 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-5); CI-MS m/z 356, 358 (M+H)⁺
７−クロロインジルビン−３’−オキシム（７ＣＩＯ）
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J σε Hz) 13.70 (1H, brs, NOH) 11.86 (1H, s, N’-H), 11.09 (1H, s, N-H), 8.62 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.23 (1H, d, J = 7.6, H-4’), 7.44 (2H, m, H-6’, 7’), 7.17 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.06 (1H, t, J = 7.6 Hz, H-5’), 6.96 (1H, t, J = 7.8 Hz, H- 5); CI-MS m/z 312, 314 (M+H)⁺
７−ヨードインジルビン−３’−オキシム（７ＩＩＯ）
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 13.65 (1H, brs, NOH) 11.87 (1H, s, N’-H), 10.63 (1H, s, N-H), 8.68 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4), 8.23 (1H, d, J = 7.2, H-4’), 7.47 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-6), 7.43 (2H, m, H-6’, 7’), 7.06 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-5’), 6.76 (1H, t, J = 7.8 Hz, H- 5); CI-MS m/z 404 (M+H)⁺
７−フルオロインジルビン−３’−オキシム（７ＦＩＯ）
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J σε Hz) 13.61 (1H, brs, NOH) 11.85 (1H, s, N’-H), 11.19 (1H, s, N-H), 8.44 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4), 8.19 (1H, d, J = 7.5, H-4’), 7.39 (2H, m, H-6’, 7’), 7.00 (2H, m, H-5’, 6), 6.90 (1H, m, H-5); CI-MS m/z 296 (M+H)⁺
１−メチル−７−ブロモインジルビン−３’−オキシム（Ｍｅ７ＢＩＯ）
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J σε Hz) 13.70 (1H, brs, NOH), 12.00 (1H, s, N'-H), 8.81 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.23 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4'), 7.43 (2H, m, H-6', 7'), 7.34 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.07 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-5'), 6.93 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-5), 3.68 (3H, s, N-CH₃); CI-MS m/z 370, 372 (M+H)⁺
（イサチンIIIa-dおよびIVa-dの調製の一般的な手順）
抱水クロラール（５．０ｇ）およびＮａ_２ＳＯ_４（３５．０ｇ）が、３００ｍＬビーカー中の水（７０ｍＬ）に溶解させられ、３５℃に温められた。適切な市販アニリン誘導体Ia-d（２７．６ｍｍｏｌ）の温かい水溶液（２０ｍＬ）および濃ＨＣｌの水溶液（３ｍＬ）が加えられ（硫酸アミンの白色沈殿物が形成され）、その後に、塩酸ヒドロキシルアミン（６．１ｇ）の温かい水溶液（２７．５ｍＬ）が加えられた。混合物は手動で攪拌され、ホットプレート（７５−７０℃で形成される厚いペースト）上で、８０〜９０℃に２時間にわたって加熱され、次いで、１時間にわたって冷却させられ、この時間までに温度は５０℃落ち、ろ過された。薄いクリーム色の生成物が水（１００ｍＬ）と共に攪拌することによって洗浄され、ろ過された。４０℃での終夜乾燥により、対応するイソニトロソアセトアニリドIIa-dを得た。

硫酸（１００ｍＬ）が、３Ｌビーカー中でホットプレート上で６０℃に加熱され、次いで、取り出された。無水イソニトロソアセトアニリドIIa-dが、温度が６５℃を超えないように３０分を超えて攪拌しながら分けて加えられた。次いで、混合物は、１５分間にわたって８０℃に加熱され、７０℃に冷却させられ、氷冷された。溶液は、粉砕された氷（５００ｍＬ）上に注がれ、１時間にわたって放置され、その後、オレンジ−赤色の沈殿物がろ過された。生成物は、水（１００ｍＬ）と共に攪拌することによって洗浄され、ろ過されて、対応するイサチンを得た：収率：IIIa：５７％、IIIb：５０％、IIIc：６５％、IIId：５０％。

７−フルオロ−Ｎ−メチルイサチン（IVa）。IIIa（３８０ｍｇ，２．３０ｍｍｏｌ）の無水アセトン溶液（６０ｍＬ）に、Ｎａ_２ＣＯ_３（無水）（３．５ｇ）および硫酸ジメチル（０．４ｍＬ）がＡｒ下に加えられ、反応混合物は、６０℃に２０時間にわたって加熱された。次いで、混合物はろ過され、ろ液は、高真空ポンプを用いて注意深く溶媒留去された（４０℃未満）。固体残渣は、ＣＨ_２Ｃｌ_２を用いたフラッシュクロマトグラフィーに付され、IVaを得た（２８８ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ，７０％）。

７−クロロ−Ｎ−メチルイサチン（IVb）。この化合物は、７−クロロイサチン（IIIb）からIVaの手順に類似する手順によって調製された（収率７６％）。

７−ブロモ−Ｎ−メチルイサチン（IVc）。この化合物は、７−ブロモイサチン（IIIc）からIVaの手順に類似した手順によって調製された：収率９０％。

７−ヨード−Ｎ−メチルイサチン（IVd）。この化合物は、７−ヨードイサチン（IIId）からIVaの手順に類似した手順によって調製された：収率８５％。

（２’Ｚ）−７−フルオロインジルビン（７）
メタノール（２５ｍＬ）が、窒素下に２０分間にわたって激しく攪拌され、次いで、７−フルオロイサチン（IIIa）（１５０ｍｇ，０．９１ｍｍｏｌ）および３−アセトキシインドール（１０６ｍｇ，０．６１ｍｍｏｌ）が加えられ、５分間にわたり攪拌が続けられた。無水Ｎａ_２ＣＯ_３（１５５ｍｇ）が加えられ、３時間にわたって攪拌が続けられた。暗色沈殿物がろ過され、メタノール水溶液（１：１，２０ｍＬ）により洗浄され、７を選択的にＺ体で得た（１３０ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ，７７％）。

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.37 (1H, s, N’-H), 11.12 (1H, s, N-H), 8.58 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-4), 7.64 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4’), 7.57 (1H, t, J = 7.5 Hz H-6’), 7.42 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-7’), 7.15 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5), 7.02 (2H, m, H-5’, 6); CI-MS m/z 281 (M+H)⁺. 元素分析(C₁₆H₉N₂O₂F) C, H, N.
（２’Ｚ）−７−クロロインジルビン（１５）。この化合物は、７−クロロイサチン（IIIb）から７の手順に類似した手順によって調製された：収率８０％
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.29 (1H, s, N’-H), 11.16 (1H, s, N-H), 8.72 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4), 7.66 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4’), 7.59 (1H, t, J = 7.8 Hz H-6’), 7.43 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-7’), 7.30 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-6), 7.05 (2H, m, H-5,5’); CI-MS m/z 297, 299 (M+H)⁺. 元素分析. (C₁₆H₉N₂O₂Cl) C, H, N.
（２’Ｚ）−７−ブロモインジルビン（２３）。この化合物は、７−ブロモイサチン（IIIc）から７の手順に類似した手順によって調製された：収率８５％；
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.18 (2H, br s, N-H), 8.77 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 7.67 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4’), 7.59 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-6’), 7.44 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.43 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-7’), 7.04 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-5’), 6.98 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-5); CI-MS m/z 341, 343 (M+H)⁺. 元素分析(C₁₆H₉N₂O₂Br) C, H, N.
（２’Ｚ）−７−ヨードインジルビン（３１）。この化合物は、７−ヨードイサチン（IIId）から７の手順に類似した手順によって調製された：収率９０％；
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 8.77 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4), 7.64 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4’), 7.59 (2H, m, H-6,6’), 7.41 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-7’), 7.04 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-5’), 6.84 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-5); CI-MS m/z 389 (M+H)⁺. 元素分析 (C₁₆H₉N₂O₂I) C, H, N.
（２’Ｚ）−７−フルオロ−１−メチルインジルビン（１１）。この化合物は、７−フルオロ−Ｎ−メチルイサチン（IVa）および３−アセトキシインドールから、７の手順に類似した手順によって調製された：収率７８％；
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.22 (1H, s, N’-H), 8.66 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 7.67 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-4’), 7.60 (1H, t, J = 7.7 Hz, H-6’), 7.44 (1H, d, J = 7.4, Hz, H-7’), 7.22 (1H, t, J = 10.0 Hz, H-5), 7.07 (2H, m, H-5’, 6), 3.46 (3H, s, N-CH₃); CI-MS m/z 295 (M+H)⁺. 元素分析 (C₁₇H₁₁FN₂O₂) C, H, N.
（２’Ｚ）−７−クロロ−１−メチルインジルビン（１９）。この化合物は、７−クロロ−Ｎ−メチルイサチン（IVb）および３−アセトキシインドールから、７の手順に類似した手順によって調製された：収率９５％；
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 10.50 (1H, s, N’-H), 8.85 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4), 7.67 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-4’), 7.60 (1H, t, J = 7.4 Hz, H-6’), 7.44 (1H, d, J = 7.4, Hz, H-7’), 7.32 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-6), 7.08 (2H, m, H-5, 5’), 3.62 (3H, s, N-CH₃); CI-MS m/z 311, 313 (M+H)⁺. 元素分析. (C₁₇H₁₁ClN₂O₂) C, H, N.
（２’Ｚ）−７−ブロモ−１−メチルインジルビン（２７）。この化合物は、７−ブロモ−Ｎ−メチルイサチン（IVc）および３−アセトキシインドールから、７の手順に類似した手順によって調製された：収率８３％；
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 8.88 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 7.66 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4’), 7.60 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-6’), 7.47 (1H, d, J = 7.5, Hz, H-7’), 7.38 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.04 (2H, m, H- 5, 5’), 3.61 (3H, s, N-CH₃); CI-MS m/z 355, 357 (M+H)⁺. Anal. (C₁₇H₁₁BrN₂O₂) C, H, N.
（２’Ｚ）−７−ヨード−１−メチルインジルビン（３５）。この化合物は、７−ヨード−Ｎ−メチルイサチン（IVd）および３−アセトキシインドールから、７の手順に類似した手順によって調製された：収率８７％；
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.26 (1H, s, N’-H), 8.93 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-4), 7.74 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-4’), 7.66 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-6), 7.60 (1H, t, J = 7.4, Hz, H-6’), 7.44 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-7’), 7.05 (1H, t, J = 7.4, Hz, H-5’), 6.86 (1H, t, J = 7.7, Hz, H-5), 3.65 (3H, s, N-CH₃); CI-MS m/z 403 (M+H)⁺. 元素分析 (C₁₇H₁₁N₂O₂I) C, H, N.
（オキシム８、１６、２４、３２および１２、２０、２８、３６の調製の一般的な手順）
適切なインジルビン誘導体７、１５、２３、３１および１１、１９、２７、３５（１ｍｍｏｌ）が、ピリジン（１０ｍＬ）に溶解させられた。マグネティックスターラで攪拌しながら、塩酸ヒドロキシルアミン（１０当量）が加えられ、混合物は、還流下（１２０℃）に１．５時間にわたって加熱された。次いで、減圧下に溶媒が留去され、残渣は、水により洗浄され、定量的に、対応する３’−オキシムを（２’Ｚ，３’Ｅ）体で選択的に得た。

（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−フルオロインジルビン−３’−オキシム（８）のデータ。

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 13.61 (1H, brs, NOH) 11.85 (1H, s, N’-H), 11.19 (1H, s, N-H), 8.44 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4), 8.19 (1H, d, J = 7.5, H-4’), 7.39 (2H, m, H-6’, 7’), 7.00 (2H, m, H-5’, 6), 6.90 (1H, m, H-5); CI-MS m/z 296 (M+H)⁺. 元素分析 (C₁₆H₁₀N₃O₂F) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−クロロインジルビン−３’−オキシム（１６）のデータ。

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 13.70 (1H, brs, NOH) 11.86 (1H, s, N’-H), 11.09 (1H, s, N-H), 8.62 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.23 (1H, d, J = 7.6, H-4’), 7.44 (2H, m, H-6’, 7’), 7.17 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.06 (1H, t, J = 7.6 Hz, H-5’), 6.96 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-5); CI-MS m/z 312, 314 (M+H)⁺. 元素分析 (C₁₆H₁₀N₃O₂Cl) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−オキシム（２４）のデータ。

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 13.68 (1H, brs, NOH) 11.90 (1H, s, N’-H), 10.91 (1H, s, N-H), 8.67 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4), 8.23 (1H, d, J = 7.8, H-4’), 7.42 (2H, m, H-6’, 7’), 7.29 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-6), 7.06 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-5’), 6.90 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-5); CI-MS m/z 356, 358 (M+H)⁺. 元素分析 (C₁₆H₁₀N₃O₂Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ヨードインジルビン−３’−オキシム（３２）のデータ。

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 13.65 (1H, brs, NOH) 11.87 (1H, s, N’-H), 10.63 (1H, s, N-H), 8.68 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4), 8.23 (1H, d, J = 7.2, H-4’), 7.47 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-6), 7.43 (2H, m, H-6’, 7’), 7.06 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-5’), 6.76 (1H, t, J = 7.8 Hz, H- 5); CI-MS m/z 404 (M+H)⁺. 元素分析 (C₁₆H₁₀N₃O₂I) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−フルオロ−１−メチルインジルビン−３’−オキシム（１２）のデータ。

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 13.72 (1H, brs, NOH), 11.90 (1H, s, N’-H), 8.56 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-4), 8.23 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-4’), 7.44 (2H, m, H-6’, 7’), 7.07 (1H, m, H-5’, 6), 6.97 (1H, m, H-5), 3.60 (3H, s, N-CH₃); CI-MS m/z 310 (M+H)⁺. 元素分析 (C₁₇H₁₂N₃O₂F) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−クロロ−１−メチルインジルビン−３’−オキシム（２０）のデータ。

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 13.79 (1H, brs, NOH), 11.97 (1H, s, N’-H), 8.76 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4), 8.23 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-4’), 7.45 (2H, m, H-6’, 7’), 7.18 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-6), 7.07 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-5’), 6.99 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-5), 3.67 (3H, s, N-CH₃); CI-MS m/z 326, 328 (M+H)⁺. 元素分析 (C₁₇H₁₂N₃O₂Cl) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモ−１−メチルインジルビン−３’−オキシム（２８）のデータ。

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 12.00 (1H, s, N’-H), 8.81 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.23 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4’), 7.43 (2H, m, H-6’, 7’), 7.34 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.07 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-5’), 6.93 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-5), 3.68 (3H, s, N-CH₃); CI-MS m/z 370, 372 (M+H)⁺. 元素分析(C₁₇H₁₂N₃O₂Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ヨード−１−メチルインジルビン−３’−オキシム（３６）のデータ。

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 13.70 (1H, brs, NOH), 12.00 (1H, s, N'-H), 8.85 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-4), 8.24 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4'), 7.60 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-6), 7.43 (2H, m, H-6', 7'), 7.06 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-5'), 6.77 (1H, t, J = 7.7 Hz, H-5), 3.70 (3H, s, N-CH₃); CI-MS m/z 418 (M+H)⁺. 元素分析(C₁₇H₁₂N₃O₂I) C, H, N.
（アセトキシム１０、１８、２６、３４および１４、２２、３０、３８の調製の一般的な手順）
適切なインジルビン−３’−オキシム誘導体８、１６、２４、３２および１２、２０、２８、３６（０．２ｍｍｏｌ）が、ピリジン（１０ｍＬ）に溶解させられた。Ａｃ_２Ｏ（０．５ｍＬ）が加えられ、混合物は、３０分間にわたって０℃で攪拌された。次いで、水（１ｍＬ）が加えられ、減圧下に溶媒が留去された。残渣は、水により洗浄されて、定量的に対応する３’−アセトキシムを選択的に（２’Ｚ，３’Ｅ）体で得た。

（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−フルオロインジルビン−３’−アセトキシム（１０）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.68 (1H, s, N’-H), 11.33 (1H, s, N-H), 8.92 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.25 (1H, d, J = 7.7, H-4’), 7.51 (2H, m, H-6’, 7’), 7.01 (2H, m, H-5’, 6), 6.96 (1H, m, H-5), 2.47 (3H, s, OCOCH ₃); CI-MS m/z 338 (M+H)⁺. 元素分析 (C₁₈H₁₂N₃O₃F) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−クロロインジルビン−３’−アセトキシム（１８）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.70 (1H, s, N’-H), 11.23 (1H, s, N-H), 9.07 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 8.25 (1H, d, J = 7.6, H-4’), 7.52 (2H, m, H-6’, 7’), 7.24 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 7.11 (1H, t, J = 7.6 Hz, H-5’), 6.97 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5), 2.47 (3H, s, OCOCH ₃); CI-MS m/z 354, 356 (M+H)⁺.元素分析(C₁₈H₁₂N₃O₃Cl) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム（２６）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.73 (1H, s, N’-H), 11.11 (1H, s, N-H), 9.12 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4), 8.27 (1H, d, J = 7.9, H-4’), 7.53 (2H, m, H-6’, 7’), 7.37 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-6), 7.11 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-5’), 6.92 (1H, t, J = 7.5 Hz, H- 5), 2.48 (3H, s, OCOCH ₃); CI-MS m/z 398, 400 (M+H)⁺. 元素分析(C₁₈H₁₂N₃O₃Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ヨードインジルビン−３’−アセトキシム（３４）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.71 (1H, s, N’-H), 10.78 (1H, s, N-H), 9.12 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.25 (1H, d, J = 7.5, H-4’), 7.52 (3H, m, H-6, 6’, 7’), 7.10 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-5’), 6.77 (1H, t, J = 7.9 Hz, H- 5), 2.47 (3H, s, OCOCH ₃); CI-MS m/z 446 (M+H)⁺. 元素分析. (C₁₈H₁₂N₃O₃I) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−フルオロ−１−メチルインジルビン−３’−アセトキシム（１４）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.76 (1H, s, N’-H), 9.00 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 8.26 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-4’), 7.53 (2H, m, H-6’, 7’), 7.12 (2H, m, H-5’, 6), 7.00 (1H, m, H-5), 3.50 (3H, s, N-CH₃), 2.47 (3H, s, OCOCH ₃); CI-MS m/z 352 (M+H)⁺. 元素分析(C₁₉H₁₄N₃O₃F) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−クロロ−１−メチルインジルビン−３’−アセトキシム（２２）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.83 (1H, s, N’-H), 9.20 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 8.27 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4’), 7.52 (2H, m, H-6’, 7’), 7.26 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 7.12 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-5’), 7.01 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5), 3.66 (3H, s, N-CH₃), 2.47 (3H, s, OCOCH ₃); CI-MS m/z 368, 370 (M+H)⁺.元素分析(C₁₉H₁₄N₃O₃Cl) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモ−１−メチルインジルビン−３’−アセトキシム（３０）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.83 (1H, s, N’-H), 9.24 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.26 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4’), 7.54 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-7’), 7.51 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-6’), 7.41 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.12 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-5’), 6.94 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-5), 3.67 (3H, s, N-CH₃), 2.47 (3H, s, OCOCH ₃); CI-MS m/z 412, 414 (M+H)⁺. 元素分析(C₁₉H₁₄N₃O₃Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ヨード−１−メチルインジルビン−３’−アセトキシム（３８）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.81 (1H, s, N’-H), 9.26 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4), 8.25 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4’), 7.68 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-6), 7.52 (2H, m, H-6’, 7’), 7.11 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-5’), 6.78 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-5), 3.68 (3H, s, N-CH₃), 2.47 (3H, s, OCOCH ₃); CI-MS m/z 460 (M+H)⁺. 元素分析(C₁₉H₁₄N₃O₃I) C, H, N.
（メトキシム９、１７、２５、３３および１３、２１、２９、３７の調製の一般的な手順）
適切なインジルビン誘導体７、１５、２３、３１および１１、１９、２７、３５（１ｍｍｏｌ）が、ピリジン（１０ｍＬ）に溶解させられた。マグネティックスターラで攪拌しながら、メトイルアミン塩酸塩（１０当量）が加えられ、混合物は、還流下（１２０℃）に１．５時間にわたって加熱された。次いで、減圧下に溶媒が留去され、残渣は、水により洗浄され、定量的に対応する３’−メトキシムを選択的に（２’Ｚ，３’Ｅ）体で得た。

（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−フルオロインジルビン−３’−メトキシム（９）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.79 (1H, s, N’-H), 11.24 (1H, s, N-H), 8.46 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4), 8.12 (1H, d, J = 7.6, H-4’), 7.44 (2H, m, H-6’, 7’), 7.05 (3H, m, H-5, 5’, 6), 4.39 (3H, s, OCH ₃); CI-MS m/z 310 (M+H)⁺. 元素分析 (C₁₇H₁₂N₃O₂F) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−クロロインジルビン−３’−メトキシム（１７）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.82 (1H, s, N’-H), 11.24 (1H, s, N-H), 8.60 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.12 (1H, d, J = 7.9, H-4’), 7.46 (2H, m, H-6’, 7’), 7.20 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.05 (2H, m, H-5, 5’), 4.40 (3H, s, OCH ₃); CI-MS m/z 326, 328 (M+H)⁺.元素分析(C₁₇H₁₂N₃O₂Cl) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−メトキシム（２５）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.84 (1H, s, N’-H), 11.02 (1H, s, N-H), 8.65 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.13 (1H, d, J = 7.9, H-4’), 7.46 (2H, m, H-6’, 7’), 7.34 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.06 (1H, m, H-5’), 6.97 (1H, t, J = 7.9, H-5), 4.41 (3H, s, OCH ₃); CI-MS m/z 370, 372 (M+H)⁺. 元素分析 (C₁₇H₁₂N₃O₂Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ヨードインジルビン−３’−メトキシム（３３）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.82 (1H, s, N’-H), 10.69 (1H, s, N-H), 8.66 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4), 8.12 (1H, d, J = 7.7, H-4’), 7.50 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-6), 7.45 (2H, m, H-6’, 7’), 7.06 (1H, m, H-5’), 6.82 (1H, t, J = 7.8, H-5), 4.39 (3H, s, OCH ₃); CI-MS m/z 418 (M+H)⁺. 元素分析(C₁₇H₁₂N₃O₂I) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−フルオロ−１−メチルインジルビン−３’−メトキシム（１３）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.83 (1H, s, N’-H), 8.52 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-4), 8.10 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-4’), 7.44 (2H, m, H-6’, 7’), 7.06 (3H, m, H-5, 5’, 6), 4.39 (3H, s, OCH ₃), 3.48 (3H, s, N-CH₃); CI-MS m/z 324 (M+H)⁺. 元素分析(C₁₈H₁₄N₃O₂F) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−クロロ−１−メチルインジルビン−３’−メトキシム（２１）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.91 (1H, s, N’-H), 8.72 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4), 8.11 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4’), 7.46 (2H, m, H-6’, 7’), 7.21 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-6), 7.05 (2H, m, H-5, 5’), 4.40 (3H, s, OCH ₃), 3.66 (3H, s, N-CH₃); CI-MS m/z 340, 342 (M+H)⁺.元素分析 (C₁₈H₁₄N₃O₂Cl) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモ−１−メチルインジルビン−３’−メトキシム（２９）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.94 (1H, s, N’-H), 8.80 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.13 (1H, d, J = 7.1 Hz, H-4’), 7.47 (2H, m, H-6’, 7’), 7.38 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.07 (1H, m, H-5’), 7.00 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-5), 4.40 (3H, s, OCH ₃), 3.68 (3H, s, N-CH₃); CI-MS m/z 384, 386 (M+H)⁺. 元素分析 (C₁₈H₁₄N₃O₂Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ヨード−１−メチルインジルビン−３’−メトキシム（３７）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.92 (1H, s, N’-H), 8.81 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-4), 8.12 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-4’), 7.64 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-6), 7.50 (2H, m, H-6’, 7’), 7.06 (1H, m, H-5’), 6.83 (1H, t, J = 7.7 Hz, H-5), 4.39 (3H, s, OCH ₃), 3.68 (3H, s, N-CH₃); CI-MS m/z 432 (M+H)⁺. 元素分析(C₁₈H₁₄N₃O₂I) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ブロモエチル）−オキシム］（５７）
５ｍＬの無水ＤＭＦ中の７ＢＩＯ（２４）（１００ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、１２０μＬのトリエチルアミン（２．９当量）および７２μＬの１，２−ジブロモエタン（２．８当量）が加えられ、反応混合物はＡｒ下に室温で４８時間にわたって攪拌された。次いで、減圧下に溶媒が留去され、残渣は、水により洗浄され、５０℃で乾燥させられ、９５％の収率で対応する３’−置換オキシム５７を得た。

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.81 (1H, s, N’-H), 11.02 (1H, s, N-H), 8.59 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 8.22 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4’), 7.47 (2H, m, Hz, H-6’, 7’), 7.33 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 7.08 (1H, m, H-5’), 6.95 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5), 4.93 (2H, t, J = 5.4 Hz, H-1”), 3.98 (2H, t, J = 5.4 Hz, H-2”); CI-MS m/z 463, 465, 467 (M+H)⁺. 元素分析 (C₁₈H₁₃N₃O₂Br₂) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−１−メチル−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ブロモエチル）−オキシム］（５８）
この化合物は、Ｍｅ７ＢＩＯ（２７）から、５７の手順に類似した手順によって調製された。

¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.92 (1H, s, N’-H), 8.74 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-4), 8.22 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4’), 7.47 (2H, m, H-6’, 7’), 7.38 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-6), 7.09 (1H, m, H-5’), 6.98 (1H, t, J = 8.1 Hz, H-5), 4.94 (2H, t, J = 5.3 Hz, H-1”), 3.98 (2H, t, J = 5.3 Hz, H-2”), 3.68 (3H, s, N-CH₃); CI-MS m/z 477, 479, 481 (M+H)⁺. 元素分析 (C₁₉H₁₅N₃O₂Br₂) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバミル）−オキシム］（６３）
７ＢＩＯ（２４）（２５ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（３ｍＬ）に、１４μＬのトリエチルアミン（１．５当量）および１３μＬの塩化Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバミル（１．５当量）が加えられ、反応混合物は、Ａｒ下に室温で４８時間にわたって攪拌された。次いで、減圧下に溶媒が留去され、残渣は、水により洗浄され、５０℃で乾燥させられ、定量的に対応する３’−置換オキシムを得た。

¹H NMR (C₅D₅N, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 12.70 (1H, s, N’-H), 12.29 (1H, s, N-H), 10.04 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-4), 8.18 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-6), 7.49 (2H, m, H-4’, 6’), 7.34 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-5’), 7.22 (1H, overlapped, H-7’), 7.14 (1H, t, J = 7.6 Hz, H-5), 3.46 (4H, brs, N(CH ₂CH₃)₂), 1.19 (6H, t, J = 6.5 Hz, N(CH₂CH ₃)₂); CI-MS m/z 455, 457 (M+H)⁺. 元素分析(C₂₁H₁₉N₄O₃Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−１−メチル−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバミル）−オキシム］（６４）のデータ
この化合物は、Ｍｅ７ＢＩＯ（２７）から、６３の手順に類似する手順によって調製された。

¹H NMR (C₅D₅N, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 12.32 (1H, s, N’-H), 10.10 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-4), 8.18 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-6), 7.46 (2H, m, H-4’, 6’), 7.30 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-5’), 7.16 (2H, overlapped, H-5, 7’), 3.66 (3H, s, N-CH₃), 3.46 (4H, brs, N(CH ₂CH₃)₂), 1.19 (6H, t, J = 6.8 Hz, N(CH₂CH ₃)₂); CI-MS m/z 469, 471 (M+H)⁺. 元素分析(C₂₂H₂₁N₄O₃Br) C, H, N.
（７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯの３’−置換オキシム（３９−６２）の調製の一般的な手順）
７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ブロモエチル）−オキシム］（５７）または１−メチル−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ブロモエチル）−オキシム］（５８）（２５ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）が３ｍＬの無水ＤＭＦに溶解させられた。対応するアミン（ピロリジン、モルホリン、イミダゾール、ピペラジン、ジメチルアミンおよびジエチルアミン）（３０当量）が加えられ、反応混合物は、Ａｒ下に室温で４８時間にわたって攪拌された。次いで、減圧下に溶媒が留去され、残渣は水により洗浄され、５０℃で乾燥させられて、対応する３’−置換オキシムを７５〜９０％の収率で得た。上記化合物の塩酸塩の調製のために、１０ｍｇの各化合物が５ｍＬの無水テトラヒドロフランに溶解させられた。次いで、塩酸のジエチルエーテル溶液が、ゆっくりと加えられ、形成された沈殿物がろ過され、ジクロロメタンにより洗浄され、５０℃で乾燥させられて、対応する塩酸塩を得た。

（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ピロリジン−１−イル−エチル）−オキシム］（３９）のデータ
収率: 90%; ¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.82 (1H, s, N’-H), 11.00 (1H, s, N-H), 8.64 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 8.15 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-4'), 7.45 (2H, m, H-6', 7'), 7.33 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 7.07 (1H, ddd, J = 7.7, 5.5, 3.1 Hz, H-5'), 6.94 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5), 4.70 (2H, t, J = 5.9 Hz, H-1"), 2.98 (2H, t, J = 5.9 Hz, H-2"), 2.56 (4H, m, H-2''', 5'''), 1.68 (4H, m, H-3''', 4'''); CI-MS m/z 453, 455 (M+H)⁺. 元素分析 (C₂₂H₂₁N₄O₂Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ピロリジン−１−イル−エチル）−オキシム］塩酸塩（４０）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.84 (1H, s, N’-H), 11.06 (1H, s, N-H), 10.31 (1H, brs, N’’’-H), 8.58 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.24 (1H, d, J = 8.3 Hz, H-4'), 7.49 (2H, m, H-6', 7'), 7.37 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.09 (1H, ddd, J = 8.3, 4.4, 1.3 Hz, H-5'), 6.99 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-5), 4.97 (2H, brs, H-1"), 3.77 (2H, brs, H-2"), 3.64 (2H, m, H-2'''a, 5'''a), 3.12 (2H, m, 2'''b, 5'''b), 2.00 (2H, m, H-3'''a, 4'''a), 1.86 (2H, m, H-3'''b, 4'''b); 元素分析 (C₂₂H₂₂N₄O₂BrCl) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−１−メチル−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ピロリジン−１−イル−エチル）−オキシム］（４１）のデータ
収率: 90%; ¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.93 (1H, s, N’-H), 8.80 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.16 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4’), 7.46 (2H, m, H-6’, 7’), 7.37 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.07 (1H, ddd, J = 8.0, 5.5, 3.1 Hz, H-5'), 6.97 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-5), 4.71 (2H, t, J = 5.9 Hz, H-1"), 3.68 (3H, s, N-CH₃), 2.98 (2H, t, J = 5.9 Hz, H-2"), 2.56 (4H, m, H-2''', 5'''), 1.68 (4H, m, H-3''', 4'''); CI-MS m/z 467, 469 (M+H)⁺. 元素分析. (C₂₃H₂₃N₄O₂Br) C, H, N
（２’Ｚ，３’Ｅ）−１−メチル−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ピロリジン−１−イル−エチル）−オキシム］塩酸塩（４２）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.94 (1H, s, N’-H), 10.05 (1H, brs, N’’’-H), 8.73 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4), 8.24 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4’), 7.49 (2H, m, H-6', 7'), 7.40 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-6), 7.09 (1H, ddd, J = 7.8, 4.1, 1.7 Hz, H-5'), 7.01 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-5), 4.96 (2H, m, H-1"), 3.68 (3H, s, N-CH₃), 3.64 (2H, m, H-2'''a, 5'''a), 3.14 (2H, m, 2'''b, 5'''b), 2.00 (2H, m, H-3'''a, 4'''a), 1.85 (2H, m, H-3'''b, 4'''b); 元素分析. (C₂₃H₂₄N₄O₂BrCl) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−モルホリン−１−イル−エチル）−オキシム］（４３）のデータ
収率: 85%; ¹H NMR (C₅D₅N, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 12.68 (1H, s, N’-H), 12.40 (1H, s, N-H), 9.02 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-4), 8.42 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-6), 7.54 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-4'), 7.42 (1H, t, J = 7.7 Hz, H-6'), 7.18 (2H, overlapped, H-5', H-7'), 7.10 (1H, t, J = 7.7 Hz, H-5), 4.80 (2H, t, J = 5.9 Hz, H-1"), 3.76 (4H, t, J = 4.2 Hz, H-3''', 5'''), 2.94 (2H, t, J = 5.9 Hz, H-2"), 2.60 (4H, t, J = 4.2 Hz, H-2''', 6'''); CI-MS m/z 469, 471 (M+H)⁺. 元素分析. (C₂₂H₂₁N₄O₃Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−モルホリン−１−イル−エチル）−オキシム］塩酸塩（４４）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.82 (1H, s, N’-H), 11.04 (1H, s, N-H), 10.71 (1H, brs, N’’’-H), 8.58 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.23 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-4'), 7.47 (2H, m, H-6', 7'), 7.35 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.08 (1H, ddd, J = 7.7, 5.8, 2.3 Hz, H-5'), 6.99 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-5), 5.02 (2H, m, H-1"), 3.95 (2H, m, H-3'''a, 5'''a), 3.74 (4H, overlapped, H-2", 3'''b, 5'''b), 3.57 (2H, m, H-2'''a, 6'''a), 3.25 (2H, overlapped, 2'''b, 6'''b); 元素分析. (C₂₂H₂₂N₄O₃BrCl) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−１−メチル−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−モルホリン−１−イル−エチル］−オキシム］（４５）のデータ
収率: 85%; ¹H NMR (C₅D₅N, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 12.40 (1H, s, N’-H), 9.11 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4), 8.42 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-6), 7.49 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-4’), 7.40 (1H, m, H-6’, 7’), 7.10 (1H, m, H-5, 5’), 4.81 (2H, t, J = 5.9 Hz, H-1”), 3.76 (4H, t, J = 4.5 Hz, H-3’’’, 5’’’), 3.70 (3H, s, N-CH₃), 2.94 (2H, t, J = 5.9 Hz, H-2”), 2.60 (4H, t, J = 4.5 Hz, H-2’’’, 6’’’); CI-MS m/z 483, 485 (M+H)⁺. 元素分析. (C₂₃H₂₃N₄O₃Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−１−メチル−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−モルホリン−１−イル−エチル）−オキシム］塩酸塩（４６）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.94 (1H, s, N’-H), 10.52 (1H, brs, N’’’-H), 8.73 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 8.23 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-4’), 7.49 (2H, m, H-6', 7'), 7.40 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 7.09 (1H, ddd, J = 7.7, 4.1, 1.0 Hz, H-5'), 7.01 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5), 5.02 (2H, m, H-1"), 3.98 (2H, m, H-3'''a, 5'''a), 3.72 (4H, overlapped, H-2", 3'''b, 5'''b), 3.68 (3H, s, N-CH₃), 3.55 (2H, m, H-2'''a, 6'''a), 3.26 (2H, overlapped, 2'''b, 6'''b); 元素分析. (C₂₃H₂₄N₄O₃BrCl) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−オキシム］（４７）のデータ
収率: 75%; ¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.79 (1H, s, N’-H), 10.99 (1H, s, N-H), 8.51 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 7.99 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-4’), 7.67 (1H, s, H-2'''), 7.44 (2H, m, H-6', 7'), 7.33 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 7.27 (1H, s, H-4'''), 7.02 (1H, ddd, J = 8.0, 5.5, 3.1 Hz, H-5'), 6.96 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5), 6.87 (1H, s, H-5'''), 4.90 (2H, t, J = 4.2 Hz, H-1"), 4.54 (2H, t, J = 4.2 Hz, H-2"); CI-MS m/z 450, 452 (M+H)⁺. 元素分析. (C₂₁H₁₆N₅O₂Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−オキシム］塩酸塩（４８）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.79 (1H, s, N’-H), 11.02 (1H, s, N-H), 9.19 (1H, s, H-2’’’), 8.40 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 7.95 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4’), 7.86 (1H, s, H-5’’’), 7.62 (1H, s, H-4’’’), 7.44 (2H, m, H-6’, 7’), 7.35 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 6.94-7.04 (2H, overlapped, H-5, 5’), 5.04 (2H, t, J = 4.6 Hz, H-1”), 4.77 (2H, t, J = 4.6 Hz, H-2”); 元素分析. (C₂₁H₁₇N₅O₂BrCl) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−１−メチル−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−オキシム］（４９）のデータ
収率: 76%; ¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.89 (1H, s, N’-H), 8.65 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 7.99 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-4’), 7.69 (1H, s, H-2’’’), 7.45 (2H, m, H-6’, 7’), 7.37 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 7.26 (1H, s, H-4’’’), 6.97-7.05 (2H, overlapped, H-5’, 5), 6.86 (1H, s, H-5’’’), 4.90 (2H, t, J = 4.8 Hz, H-1”), 4.54 (2H, t, J = 4.8 Hz, H-2”), 3.67 (3H, s, N-CH₃); CI-MS m/z 464, 466 (M+H)⁺. 元素分析. (C₂₂H₁₈N₅O₂Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−１−メチル−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−オキシム］塩酸塩（５０）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.90 (1H, s, N’-H), 9.11 (1H, s, H-2’’’), 8.55 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 7.96 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-4’), 7.83 (1H, s, H-5’’’), 7.58 (1H, s, H-4’’’), 7.46 (2H, m, H-6’, 7’), 7.40 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 6.97-7.05 (2H, overlapped, H-5, 5’), 5.04 (2H, t, J = 4.6 Hz, H-1”), 4.75 (2H, t, J = 4.6 Hz, H-2”), 3.67 (3H, s, N-CH₃); 元素分析. (C₂₂H₁₉N₅O₂BrCl) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ピペラジン−１−イル−エチル）−オキシム］（５１）のデータ
収率: 84%; ¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.82 (1H, s, N’-H), 11.00 (1H, s, N-H), 8.63 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 8.17 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4’), 7.45 (2H, m, H-6’, 7’), 7.33 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 7.06 (1H, ddd, J = 7.8, 5.1, 3.1 Hz, H-5’), 6.94 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5), 4.71 (2H, t, J = 5.6 Hz, H-1”), 2.87 (2H, t, J = 5.6 Hz, H-2”), 2.68 (4H, t, J = 4.6 Hz, H-2’’’, 6’’’), 2.44 (4H, brs, H-3’’’, 5’’’); CI-MS m/z 468, 470 (M+H)⁺. 元素分析. (C₂₂H₂₂N₅O₂Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ピペラジン−１−イル−エチル）−オキシム］二塩酸塩（５２）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.82 (1H, s, N’-H), 11.05 (1H, s, N-H), 9.32 (2H, br, ピペラジン N⁺-H), 8.59 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 8.25 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4’), 7.48 (2H, m, H-6’, 7’), 7.35 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 7.06 (1H, ddd, J = 7.5, 4.1, 1.4 Hz, H-5’), 6.99 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5), 4.98 (2H, m, H-1”), 3.70 (2H, m, H-2”), 8H, overlapped, H-2’’’, 3’’’, 5’’’, 6’’’; 元素分析. (C₂₂H₂₄N₅O₂BrCl₂) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ジメチルアミノエチル）−オキシム］（５３）のデータ
収率: 90%;¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.82 (1H, s, N’-H), 11.00 (1H, s, N-H), 8.65 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 8.15 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4’), 7.46 (2H, m, H-6’, 7’), 7.33 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 7.07 (1H, ddd, J = 7.8, 5.1, 3.4 Hz, H-5’), 6.94 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5), 4.70 (2H, t, J = 5.9 Hz, H-1”), 2.81 (2H, t, J = 5.9 Hz, H-2”), 2.26 (6H, s, N’’’(CH₃)₂); CI-MS m/z 433, 435 (M+H)⁺. 元素分析. (C₂₀H₂₅N₄O₂Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ジメチルアミノエチル）−オキシム］塩酸塩（５４）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.83 (1H, s, N’-H), 11.04 (1H, s, N-H), 9.74 (1H, brs, N’’’-H), 8.58 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 8.23 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-4’), 7.48 (2H, m, H-6’, 7’), 7.36 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 7.07 (1H, ddd, J = 7.7, 5.0, 3.3 Hz, H-5’), 6.97 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5), 4.94 (2H, t, J = 5.9 Hz, H-1”), 3.64 (2H, t, J = 5.9 Hz, H-2”), 2.85 (6H, s, N’’’(CH₃)₂); 元素分析. (C₂₀H₂₆N₄O₂BrCl) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−１−メチル−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ジメチルアミノエチル）−オキシム（５５）のデータ
収率: 90%;¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.94 (1H, s, N’-H), 8.80 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.16 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4’), 7.47 (2H, m, H-6’, 7’), 7.38 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.08 (1H, ddd, J = 7.8, 5.5, 2.6 Hz, H-5’), 6.97 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-5), 4.70 (2H, t, J = 5.8 Hz, H-1”), 3.68 (3H, s, N-CH₃), 2.81 (2H, t, J = 5.8 Hz, H-2”), 2.26 (6H, s, N’’’(CH₃)₂); CI-MS m/z 447, 449 (M+H)⁺. 元素分析. (C₂₁H₂₇N₄O₂Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−１−メチル−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ジメチルアミノエチル）−オキシム塩酸塩（５６）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.94 (1H, s, N’-H), 10.07 (1H, brs, N’’’-H), 8.73 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-4), 8.25 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-4’), 7.49 (2H, m, H-6’, 7’), 7.40 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-6), 7.09 (1H, ddd, J = 7.7, 5.5, 3.5 Hz, H-5’), 7.02 (1H, t, J = 8.1 Hz, H-5), 5.00 (2H, t, J = 5.8 Hz, H-1”) 3.68 (3H, s, N-CH₃), 3.64 (2H, t, J = 5.8 Hz, H-2”), 2.85 (6H, s, N’’’(CH₃)₂); 元素分析. (C₂₁H₂₈N₄O₂BrCl) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）−オキシム］（５９）のデータ
収率: 89%;¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.83 (1H, s, N’-H), 11.00 (1H, s, N-H), 8.66 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.17 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4’), 7.45 (2H, m, H-6’, 7’), 7.33 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.06 (1H, ddd, J = 7.8, 5.5, 3.4 Hz, H-5’), 6.93 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-5), 4.66 (2H, t, J = 6.1 Hz, H-1”), 2.95 (2H, t, J = 6.1 Hz, H-2”), 2.59 (4H, q, J = 7.1 Hz, N’’’(CH ₂CH₃)₂), 0.98 (6H, t, J = 7.1 Hz, N’’’(CH₂CH ₃)₂); CI-MS m/z 461, 463 (M+H)⁺. 元素分析. (C₂₂H₂₉N₄O₂Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）−オキシム］塩酸塩（６０）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.82 (1H, s, N’-H), 11.03 (1H, s, N-H), 10.52 (1H, brs, N’’’-H), 8.58 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 8.23 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4’), 7.48 (2H, m, H-6’, 7’), 7.35 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 7.07 (1H, ddd, J = 7.9, 5.4, 2.9 Hz, H-5’), 7.00 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5), 5.03 (2H, t, J = 6.1 Hz, H-1”), 3.68 (2H, t, J = 6.1 Hz, H-2”), 3.25 (4H, m, N’’’(CH ₂CH₃)₂), 1.22 (6H, t, J = 7.1 Hz, N’’’(CH₂CH ₃)₂); 元素分析. (C₂₁H₂₈N₄O₂BrCl) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−１−メチル−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）−オキシム］（６１）のデータ
収率: 88%;¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.94 (1H, s, N’-H), 8.80 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-4), 8.17 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4’), 7.46 (2H, m, H-6’, 7’), 7.37 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 7.07 (1H, ddd, J = 7.8, 5.1, 3.1 Hz, H-5’), 6.95 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-5), 4.65 (2H, t, J = 6.1 Hz, H-1”), 3.67 (3H, s, N-CH₃), 2.94 (2H, t, J = 6.1 Hz, H-2”), 2.58 (4H, q, J = 7.1 Hz, N’’’(CH ₂CH₃)₂), 0.98 (6H, t, J = 7.1 Hz, N’’’(CH₂CH ₃)₂); CI-MS m/z 475, 477 (M+H)⁺. 元素分析. (C₂₃H₃₁N₄O₂Br) C, H, N.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−１−メチル−７−ブロモインジルビン−３’−［Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）−オキシム］塩酸塩（６２）のデータ
¹H NMR (DMSO, 400 MHz, δ ppm, J in Hz) 11.93 (1H, s, N’-H), 9.95 (1H, brs, N’’’-H), 8.72 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 8.22 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4’), 7.49 (2H, m, H-6’, 7’), 7.41 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 7.08 (1H, ddd, J = 7.8, 4.0, 1.5 Hz, H-5’), 7.02 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-5), 5.00 (2H, t, J = 6.1 Hz, H-1”), 3.68 (5H, m, N-CH₃, H-2”), 3.26 (4H, m, N’’’(CH₂CH₃)₂), 1.21 (6H, t, J = 7.3 Hz, N’’’(CH₂CH₃)₂); 元素分析. (C₂₂H₃₀N₄O₂BrCl) C, H, N.
（プロテインキナーゼアッセイ）
（生化学試薬）
オルトバナジン酸ナトリウム、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、Ｍｏｐｓ、β−グリセロホスファート、フェニルホスファート、フッ化ナトリウム、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン−アガロース、グルタチオン、ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin：ＢＳＡ）、ニトロフェニルホスファート、ロイペプチン、アプロチニン、ペプスタチン、ダイズトリプシンインヒビター、ベンズアミジン、ヒストンＨ１（タイプIII-S）は、Sigma Chemicalsから得られた。［γ−^３３Ｐ］−ＡＴＰは、Amershamから得られた。ＧＳ−１ペプチド（YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQSpEDEEE）は、Peptide Synthesis Unit, Institute of Biomolecular Sciences, University of Southampton, Southampton SO16 7PX, U.K.によって合成された。

（バッファ）
「均一化バッファ（Homogenization Buffer）」：６０ｍＭのβ−グリセロホスファート、１５ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスファート、２５ｍＭのＭｏｐｓ（ｐＨ７．２）、１５ｍＭのＥＧＴＡ、１５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのフェニルホスファート、ロイペプチン１０μｇ／ｍＬ、アプロチニン１０μｇ／ｍＬ、ダイズトリプシンインヒビター１０μｇ／ｍＬおよび１００μＭのベンズアミジン。

「バッファＡ」：１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、２５ｍＭのTris-HCl（ｐＨ７．５）、ヘパリン５０μｇ／ｍＬ。

「バッファＣ」：均一化バッファであるが、５ｍＭのＥＧＴＡを含み、ＮａＦおよびプロテアーゼインヒビターを含まない。

（キナーゼの調製およびアッセイ）
キナーゼの活性は、バッファＡまたはＣ中、３０℃、１５μＭの最終ＡＴＰ濃度でアッセイされた。空試験値は差し引かれ、活性は１０分のインキュベーションにわたって組み込まれたホスファートのｐｍｏｌとして計算された。活性は、通常、最大活性（すなわち、インヒビターの不存在下）の百分率（％）で表される。コントロールは、適当な希釈剤であるジメチルスルホキシドを用いて行われた。

「ＣＤＫ１／サイクリンＢ」は、均一化バッファ中に、Ｍ期のヒトデ（Marthasterias glacialis）の卵母細胞から抽出され、p9^CKShs1−セファロース・ビーズによるアフィニティ・クロマトグラフィーによって精製され、そこから、それは、以前に記載されたようなフリーなp9^CKShs1によって溶出させられた（Meijer et al., 1997）。キナーゼ活性は、バッファＣ（ヒストンＨ１１ｍｇ／ｍＬのを有する）中、１５μＭの［γ−^３３Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１０ｍＣｉ／ｍＬ）の存在下に、３０μＬの最終容積でアッセイされた。３０℃での３０分のインキュベーションの後に、２５μＬ分割量の上澄がWhatman P81ホスホセルロースペーパーの２．５×３ｃｍ部分上にスポットされ、２０秒後に、フィルタは、１０ｍＬのリン酸／Ｌ（水）の溶液中で５回（各回、少なくとも５分間にわたって）洗浄された。湿ったフィルタは、１ｍＬのＡＣＳ（Amersham）シンチレーション流体の存在下に計数された。

「ＣＤＫ５／ｐ２５」は、組換え型哺乳類ＣＤＫ５と、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質として大腸菌において発現されたｐ２５との等量を混合することによって再構成され、グルタチオン−アガロースによるアフィニティークロマトグラフィーによって精製された（ｐ２５は、ｐ３５の切断型バージョン（３５ｋＤａＣＤＫ５アクティベータ）である）。その活性は、ヒストンＨ１により、バッファＣ中で、ＣＤＫ１／サイクリンＢについて記載されたようにしてアッセイされた。

「ＧＳＫ−３α／β」は、ブタ大脳から、固定axinによるアフィニティクロマトグラフィーによって精製された（Meijer et al., 2003）。それは、１ｍｇＢＳＡ／ｍＬ１０ｍＭＤＴＴ中の１／１００希釈の後に、５μＬの４μＭＧＳ−１ペプチド基質により、バッファＡ中で、１５μＭの［γ−^３３Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１０ｍＣｉ／ｍＬ）の存在下に、３０μＬの最終容積でアッセイされた。３０℃での３０分のインキュベーションの後、２５μＬの分割量の上澄が、上記のように処理された。

「ProQuinaseプロテインキナーゼアッセイ」全プロテインキナーゼは、Ｓｆ９昆虫細胞において、ヒト組換え型ＧＳＴ融合タンパク質またはＨｉｓターゲット型タンパク質として、バキュロウイルス発現系によって発現された。キナーゼは、ＧＳＨ−アガロース（Sigma）またはＮｉ−ＮＴＨ−アガロース（Qiagen）のいずれかを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製された。各キナーゼの純度および同一性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシー染色およびウェスタンブロット分析によってチェックされた。組換え型酵素をアッセイするために登録商標のプロテインキナーゼアッセイ（³³PanQinase（登録商標）ActivityAssay）が用いられた。全キナーゼアッセイは、Perkin Elmer/NEN (ボストン, MA, 米国)からの９６ウェルのFlashPlates（登録商標）において、５０μＬの反応容積中で、BeckmanCoulter/Sagianロボットシステムを用いて行われた。反応混液は、以下の４段階の順序でピペットにより定液量が取られた：（i）２０μＬのアッセイバッファ、（ii）５μＬのＡＴＰ溶液（Ｈ_２Ｏ中）、（iii）５μＬの試験化合物（１０％ＤＭＳＯ中）および（iv）１０μＬの基質／１０μＬの酵素溶液（事前混合される）。全キナーゼ（ＰＫＣを除く、下記参照）についてのアッセイは、６０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮＡＯＨ（ｐＨ７．５）、３ｍＭのＭｇＣｌ_２、３ｍＭのＭｎＣｌ_２、３μＭのオルトバナジン酸Ｎａ、１．２ｍＭのＤＴＴ、５０μｇ／ｍＬのＰＥＧ_{２００００}、１μＭの［γ−^３３Ｐ］−ＡＴＰ（ウェル当たり約５×１０^５ｃｐｍ）を含有していた。最終的なＤＭＳＯ濃度は、全アッセイにおいて１％であった。ＰＫＣアッセイは、６０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．２５ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１．３２ｍＭのＣａＣｌ_２、５μｇ／ｍＬのホスファチジルセリン、１μｇ／ｍＬの１，２−ジオレイル−グリセロール、１．２ｍＭのＤＴＴ、５０μｇ／ｍＬのＰＥＧ_{２００００}、１μＭの［γ−^３３Ｐ］−ＡＴＰ（ウェル当たり約５×１０^０５ｃｐｍ）を含んでいた。反応混液は、３０℃で８０分間にわたってインキュベートされた。反応は、５０μＬの２％（ｖ／ｖ）Ｈ_３ＰＯ_４により停止させられ、プレートは吸引され、２００μＬのＨ_２Ｏまたは２００μＬの０．９％（ｖ／ｖ）ＮａＣｌにより２回洗浄された。^３３Ｐ_ｉの組込は、マイクロプレートシンチレーションカウンタ（Microbeta, Wallac）により測定された。各濃度について得られた残存活性（％）により、化合物のＩＣ_５０値は、WindowsのPrism 3.03（Graphpad, サンディエゴ, CA, 米国）を用いて計算された。用いられたモデルは、１００％に固定されたパラメータ「top」および０％に固定された「bottom」を有する「Ｓ字状応答（可変の傾き）」である。

（細胞生物学）
（化学品および抗体）
ビスベンズイミド（ヘキスト３３３４２）およびヨウ化プロピジウムは、Sigma Chemicalsから得られた。ＡｃＤＥＶＤａｆｃおよびＱ−ＶＤ−ＯＰｈは、MPbiomedicals（Vannes, フランス）から購入された。ＭＴＳ試薬を含むCell Titer 96（登録商標）キットは、Promega（Madison，ＷＩ，米国）から購入された。２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）は、Steve Safe博士から得られた（Veterinary Physiology and Pharmacology, Texas A&M University, College Station, TX77843, 米国）。プロテアーゼインヒビター混液は、Rocheからであった。ＩＦＮ−αは、Tocris （Bristol, UK）.からのＲおよびＤ系およびall-trans-レチノイン酸（ＲＡ）から得られた。特に明記しない限り、列挙されていない試薬もSigmaからである。

p21 ^WAF1/CIP1およびアクチンに対するモノクローナル抗体は、Oncogeneから得られた。p27 ^KIP1および p53に対する抗体は、Santa Cruz Biotechnologyから購入された。シトクロムＣに対するモノクローナル抗体およびＢｃｌ−ＸＬに対するウサギポリクローナルは、BD Biosciencesによって提供された。抗Ｂｃｌ−２（クローン１２４）モノクローナル抗体は、ＤＡＫＯから購入された。抗PhosphoTyr705−ＳＴＡＴ３および抗ＳＴＡＴ３抗体は、Cell Signallingからであった。抗チューブリン抗体はSigmaからであった。

（細胞系および培養条件）
マウスの５Ｌヘパトーム細胞系（ＡｈＲ＋／＋）およびＢＰ８（ＡｈＲ−／−サブクローン）は、Ｍ．Goettlicher博士から得られた（Forschungszentrum Karlsruhe, Institute of Genetics, 76021 Karlsruhe, ドイツ）。それらは、２ｍＭのＬ−グルタミン（Eurobio）、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）およびゲンタマイシン（Gibco BRL）が補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Biowhittaker）において、３７℃で７％ＣＯ_２の雰囲気下に培養された。インジルビンまたはＴＣＤＤ処理は、５０〜６０％コンフルエント培養組織上で、示された時間および濃度において行われた。コントロール実験は、適当な希釈剤であるＤＭＳＯを用いて行われた。

ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＩＭＲ−５およびＩＭＲ−３２ヒト神経芽腫細胞系は、ＤＭＥＭ培地（Biowhittakerから）およびEurobio（Courtaboeuf, フランス）からの２ｍＭのＬ−グルタミン、または２ｍＭのＬ−グルタミン（Invitrogen, Barcelona, スペイン）が既に補充されたＤＭＥＭ、および、抗生物質および１０％容積のＦＣＳ（Invitrogen, Cergy Pontoise, フランスまたは Barcelona, スペイン）において生育させられた。ｐｃＤＮＡ３／Ｂｃｌ−２、ｐｃＤＮＡ３／Ｂｃｌ−ＸＬおよび空のｐｃＤＮＡ３ベクターにより恒久的にトランスフェクトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系は、それらのトランスフェクションされていない相当物と同様に生育させられた。しかしながら、ジェネティシン（Ｇ−４１８）の選択は、終端実験の前に生育培養において維持された（Ribas and Boix, 2004）。分化を誘導するために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、コラーゲン被覆プレート上で培養され、１０μＭのＲＡにより５日間にわたって処理された。

ＨＬ−６０およびJurkat細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地において、１０％ＦＣＳおよびInvitrogen（バルセロナ, スペイン）からの抗生物質と共に生育させられた。

ＨＣＴ１１６ヒト腺癌細胞系は、Vogelstein博士から得られた（The Howard Hughes Medical Institute, Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins School of Medicine, ボルチモア, MD 21231, 米国）。ＨＣＴ１１６細胞は、抗生物質および１０％ＦＣＳが補充されたMcCoy’s 5A（Biowhittaker）において培養された。一般的な培養条件は、５％ＣＯ_２の雰囲気および３７℃の温度であった。培養皿および他のプラスチック製使い捨てツールは、Corning（Corning, NY, 米国）によって供給された。インジルビン処理は、指数関数的に生育する培地組織上で、示された時間および濃度において行われた。コントロール実験も、適当な希釈剤であるＤＭＳＯを用いて行われた。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ホルモン非依存性乳癌に由来する）は、１０％ＦＣＳが補充されたＤＭＥＭにおいて培養された。実験のために、これらの細胞は、２４ウェルのボックスまたは３５ｍｍのペトリ皿に適切な密度（細胞生育実験のためにウェル当たり４×１０^４細胞；細胞周期分析のために皿当たり１０^５細胞）で播種され、示されるようにインジルビンに露出された。

（細胞増殖および細胞周期の分析）
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色が、以下のように行われた。第１に、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が培養プレートから収集され、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline，ｐＨ７．４）により１回洗浄された。第２に、１−２×１０^５細胞が、１５分間にわたって、２５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム、１０μｇ／ｍＬのＲＮアーゼＡおよび０．１％のTriton-X-100中でインキュベートされた。フローサイトメトリーの読み出しは、Coulter Cientifica, SA (マドリード, スペイン)からのEPICS（登録商標） XL装置によって得られた。データは、WinMDI (Joe Trotterからの無料ソフトウェア)によって処理されて、モノパラメトリックなＤＮＡヒストグラムが得られた。最後に、これらのヒストグラムは、Multi-Cycleソフトウェアにより分析された。

（細胞死および細胞生存の評価）
核形態に基づく細胞死の特徴付けが、０．０５μｇ／ｍＬのビスベンズイミドおよび２５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムによる二重染色によって評価された。細胞の生存度は、ＭＴＳ法によって決定された。両手順は、過去に詳細に記載されている（Ribas and Boix, 2004）。ＤＮＡラダリングの評価のために、細胞ＤＮＡが抽出され、１．５％アガロースゲルにおいて電気泳動にかけられ、アポトーシスの典型であるヌクレオソーム間のフラグメント化が明示された。

（カスパーゼアッセイ）
カスパーゼ活性の測定は、培養培地へのＡｃＤＥＶＤａｆｃ合成基質の直接的な付与、界面活性剤融解および３７℃でのインキュベーションの後に、ＡｃＤＥＶＤａｆｃ合成基質から放出された蛍光を測定することに基づいている。この方法は、９６マルチウェルプレートに適用されるために考案される。それは、カスパーゼ活性の速度論的な測定および複数の薬物の同時の特徴付けを可能にする（Ribas et al., 2005）。

（電気泳動およびウェスタンブロッティング）
細胞抽出物の全体は、１００ｍＭのTris/HCl（ｐＨ６．８）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２％のＳＤＳを含有するバッファにおいて得られた。３分間にわたる加熱変性後に、タンパク質は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（０．７ｍｍ厚のゲル）（ｐ２７^Ｋｉｐ１）、または、ＭＯＰＳＳＤＳ（ｐ５３、ｐ２１^Ｃｉｐ１，アクチン）またはタンパク質サイズに依存するＭＥＳＳＤＳ（シトクロムＣ）泳動バッファを有する１０％ＮｕＰＡＧＥプレキャストBis-Trisポリアクリルアミド・ミニゲル電気泳動システム（Invitrogen）によって分離された。タンパク質は、０．４５μｍのニトロセルロースフィルタ（Schleicher and Schuell）に移された。これらは、Tris-Buffered Saline-Tween-20中の５％低脂肪ミルクにより遮断され、１時間にわたって抗体（抗ｐ２７^ＫＩＰ１：１：１０００；抗アクチン：１：１０００；抗Ｂｃｌ−２，１．２０００：抗Ｂｃｌ−ＸＬ，１：５０００；抗チューブリン，１：４０００；抗ＳＴＡＴ３：１：１０００）と共に、または、終夜４℃で（抗ｐ５３：１：１０００；ｐ２１^Ｃｉｐ１：１：１０００；シトクロムＣ：１：１０００；抗アクチン：１：５０００（ＳＴＡＴ３実験）、抗ホスホTyr705−ＳＴＡＴ３：１：１０００）と共にインキュベートされ、Enhanced Chemiluminescence（ECL, Amersham）によって分析された。

ｐ５３およびｐ２１^Ｃｉｐ１の発現を研究するために、細胞は、３０分間にわたって４℃で、プロテアーゼインヒビター混液（Roche）が補充されたＲＩＰＡバッファ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０、０．５％のデオキシコラート、０．１％のＳＤＳおよび５０ｍＭのTris-HCl（ｐＨ８．０））中に溶解させられた。遠心分離（１０分間の１２０００ｇ）の後、タンパク質濃度が、Bradfordタンパク質アッセイ（Bio-Rad）によって上澄において測定された。ミトコンドリアからのシトクロムＣ放出を研究するために、０．０５％のジギトニン細胞質抽出が行われた（Ribas and Boix, 2004）。

ＳＴＡＴ３研究において、細胞は、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、２５ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のTriton X-100、１０％のグリセロール、２ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、６．４ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルホスファートおよびプロテアーゼインヒビター混液（Roche）に溶解させられた。７３μｇの全タンパク質は、１０％のＮｕＰＡＧＥ上にＭＯＰＳＳＤＳ泳動バッファと共に溶解させられた。

（結果）
（キナーゼのＡＴＰバインディングポケットにおける７−ＢＩＯの分子モデリング）
インジルビンのＧＳＫ−３およびＰｆＰＫ５のキナーゼとの共結晶構造に基づいて、７ＢＩＯがＧＳＫ−３およびＰｆＰＫ５にモデリングされた。

図１に示されるように、立体障害が、７−ＢＩＯがＣＤＫおよびＧＳＫ−３等の他のインジルビンの古典的キナーゼターゲットと相互作用することを防止するだろう。

（キナーゼについての本発明のインジルビンの作用）
種々の７−ハロゲノ置換インジルビン（化合物７−３８）に関する、３種のプロテインキナーゼおよび神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存について結果が以降の表１に与えられる
７位が置換されていないインジルビンにより得られた結果も、比較目的のために与えられる（化合物１−６）。

次いで、分子は、３種のキナーゼであるＣＤＫ１／サイクリンＢ、ＣＤＫ５／ｐ２５およびＧＳＫ−３α／βに関して試験された。

ＩＣ_５０値は、用量−応答曲線から計算され、μＭで記録された。化合物はまた、２５μＭで、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するそれらの作用について試験された。

細胞の生存は、ＭＴＳ還元（reduction）アッセイによって推定され、未処理細胞中の生存の百分率（％）で表される（３つの無関係の測定の平均±標準誤差（ｓ．ｅ．）；２回の無関係の実験を代表する）（≦１５％生存については黒色で、≦５０％生存については灰色で強調される）。

全Ｎ１メチル化インジルビンについて活性の完全な欠如が確認された。７位にある原子のサイズが大きくなる場合（Ｈ＞Ｆ＞Ｃｌ＞Ｂｒ＞Ｉ）に、弱く、かつ、徐々に減少する阻害活性が７−ハロゲノ−インジルビン−３’−オキシムにより観察され（化合物２、８、１６、２４、３２の比較）、これは、この７位における増加する障害を示唆する。

第２の系列のインジルビンにおいて、３’置換基は、７−ブロモ−インジルビンを足場（Ｎ１において±メチル）にして変動させられた（化合物３９−６８）。

結果は、表２に与えられる。

ＧＳＫ−３についての化合物４３を除いて、これらの化合物のいずれも、３種の試験されたキナーゼのいずれかに関して何らの有意な活性を示さなかった。

（培養株中の細胞死についての３’−，７−置換インジルビンの作用）
２５μＭの最終濃度で、２４時間または４８時間の露出後の神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系の生存に関して各インジルビンの作用が試験された。細胞の生存は、ＭＴＳ還元アッセイによって推定された。

実験は、比較のため５ＢＩＯおよび６ＢＩＯによっても行われた。

ＩＣ_５０値は、用量−応答曲線から計算され、μＭで記録された（３通りに行われた２つの無関係の測定の平均±標準誤差）（ＩＣ_５０＜１０μＭについては灰色で強調される）。

また、細胞死は、各インジルビン（２５μＭ）の付与後４８時間に、ＬＤＨ放出アッセイを用いて推定された。

結果は、細胞死の百分率（％）として表される（＞８５％の細胞死については黒色で、＞５０％の細胞死については灰色で強調される）。

複数の化合物は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存率に関する明らかな作用を示した。

完全な用量−応答曲線がこれらの活性な化合物について行われ、ＩＣ_５０値が計算された。結果は、表３に与えられ、図２によって例示される。

ＭＴＳ還元が細胞死とは異なる条件下に時々観察されるので、独立した細胞死の評価手順（乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出アッセイ）が用いられた。このアッセイにより、ＣＤＫおよびＧＳＫ−３についてのそれらの全体的な作用の欠失にかかわらず、本発明のインジルビンによる細胞死の誘導が確認された。

（細胞系の生存についての３’置換−７−ブロモインジルビンの作用）
１１の他の細胞系、すなわち、ＨＴ−２９およびＨＣＴ１１６（結腸癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）、Ａ５４９（肺癌）、ＰＣ３（前立腺癌）、５ＬおよびＢＰ８（肝癌）、Ｆ１およびＨｕｈ７（肝癌）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（神経芽腫）およびＨＥＫ２９３（胚腎臓）についての３’−，７−ブロモインジルビンの作用が以下に記録される。ＳＨ−ＳＹ５Ｙと同様に、これらの細胞系は、細胞死の用量依存性誘導を示し（表４）、このことは、細胞タイプまたは分化段階特異的な作用よりもむしろ細胞の生存についてのこれらの化合物の作用の普遍性を示唆する。５Ｌ（ＡｈＲ＋／＋）およびＢＰ８（ＡｈＲ−／−）の類似した感受性により、ＡｈＲは３’−７−ブロモインジルビン誘導細胞死において主要な役割を果たさないことが示唆される。

細胞の生存は、各インジルビンの付与の４８時間後に、ＭＴＳ還元アッセイを用いて推定された。実験は、比較のために５ＢＩＯおよび６ＢＩＯによっても行われた。ＩＣ_５０値は、用量−応答曲線から計算され、μＭで記録された（３通り行われた測定の平均±標準誤差）（ＩＣ_５０＜１０μＭについては灰色で、ＩＣ_５０＜１μＭについては黒色で強調される）。

ＳＨ−ＳＹ５Ｙと同様に、これらの１１の細胞系は、細胞死の用量依存性誘導を示した。結果は、表４に与えられる。

結果は、細胞タイプまたは分化段階に特異的な作用よりもむしろ細胞の生存についてのこれらの化合物の作用の普遍性を示す。

（３’−，７−置換インジルビンは、アポトーシス性および非アポトーシス性の細胞死を誘導する）
カスパーゼ活性化を誘導も必要ともしないので、７ＢＩＯによって誘導される細胞死は、本来、アポトーシスとは異なることが本発明者らにより示された。インジルビンの選択によって誘導される細胞死についての一般的なエフェクタカスパーゼインヒビターＱ−ＶＤ−ＯＰｈ（Caserta et al., 2003）（２０μＭの最終濃度）の作用が試験されて、本発明の３’−，７−置換インジルビンがカスパーゼ活性化を誘導または必要とするかどうかが調査された。

ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、種々の濃度のインジルビン似体により、２０μＭのＱ−ＶＤ−ＯＰｈ（広範なスペクトルのカスパーゼのインヒビター）の存在下または不存在下に処理された。

細胞の生存は、各インジルビンの付与の４８時間後に、ＭＴＳ還元アッセイを用いて推定された。

ＩＣ_５０値は、用量−応答曲線から計算され、μＭで記録され（２つの無関係の測定の平均±標準偏差）たが、試験された最も高い濃度での細胞死はなかった。

結果は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈが用量−応答曲線についての作用を有しない場合には強調されず、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈが細胞死を部分的に保護する場合には灰色で強調され、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈが完全な保護を提供する場合には黒色で強調される。

結果は表５に与えられ、図２によって例示される。

結果は、３’−置換７−ブロモインジルビンは、３つのカテゴリーに分類されることを示す。

第１のカテゴリーにおいて、いくつかのインジルビンは、カスパーゼインヒビターの存在に対して完全に非感受性であり、このことは、カスパーゼ非依存性機構を示唆している。７ＢＩＯはこのカテゴリーに分類される。

それの５−ブロモ−（５ＢＩＯ）および６−ブロモ−異性体およびインジルビン−３’−オキシムとは対照的に、７ＢＩＯは、ＣＤＫおよびＧＳＫ−３に向けてわずかな阻害活性のみを有する（表６）。本発明者らは、８５のキナーゼProQinase選択性パネルにおいてＩＯ、５ＢＩＯ、６ＢＩＯおよび７ＢＩＯの選択性を調査した（表７）。この研究方法により、最初に、Aurora Ａ−Ｃ、ＦＬＴ３、ＲＥＴは、ＩＯ、５ＢＩＯおよび６ＢＩＯの新しいターゲットを構成することが示された。ＶＥＧＦ−Ｒは、インジルビンのターゲットとして記載された（Jautelat et al., 2005）。選択性パネルにより、３種の他のインジルビンと比較して、７ＢＩＯは劣ったキナーゼインヒビターであることが示された。

予想外にも、７ＢＩＯは、アポトーシスとは別に急速な細胞死過程を誘発する。７ＢＩＯは、大きな濃縮核の出現を誘導するが、これは、クロマチン凝集および核断片化等のアポトーシスの古典的な特徴を伴わない。７ＢＩＯ誘導型の細胞死には、シトクロムＣ放出も何らの測定可能なエフェクターカスパーゼの活性化も不随して起こらない。さらに、それは、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（広スペクトルのカスパーゼインヒビター）の存在によって変えられない。７ＢＩＯ誘導型細胞死の間にＡｈＲもｐ５３も必要とされない。それ故に、以前に記載されたインジルビンとは対照的に、７ＢＩＯは、おそらくネクローシスまたはオートファジーを通じた非アポトーシス性の細胞死の活性化を誘発する。

第２のカテゴリーにおいて、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈは、用量−応答曲線を右にシフトさせ、それ故に、ＩＣ_５０はより高い値に向かう。これは、カスパーゼ依存性およびカスパーゼ非依存性の混合型の活性機構を示唆する。

第３のカテゴリーにおいて、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈの存在は、本質的に、細胞死から細胞を保護し、これは、これらのインジルビンが、大抵、古典的なカスパーゼ依存性の機構を通じて作用すること示唆する。興味深いことに、これは、大部分の活性インジルビンにより観察される。

この最後のカテゴリーにおいて、小さい割合の細胞（２０％）は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈの存在にもかかわらず死ぬ。

（インジルビンによる細胞死の誘導）
４種のインジルビンＩＯ、５ＢＩＯ、６ＢＩＯ、７ＢＩＯが、ＭＴＳ還元アッセイにより測定されるような神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるそれらの細胞死の誘導能に関して比較された（図３Ａ）。ＭＴＳ還元は、時折、細胞死とは異なる条件下に観察されるので、無関係の細胞死アッセイである乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出アッセイが用いられた（図３Ｂ）。用量−応答曲線により、７ＢＩＯは、細胞の生存率を減少させるのに要求される濃度（ＭＴＳ還元）（図３Ａ）または細胞死（ＬＤＨ放出）（図３Ｂ）に関して最も強力な化合物であることが示された。種々のハロゲンがインジルビン−３’−オキシムの７位に導入された（図４、表６）。７ＦＩＯは、等効力の７ＢＩＯおよび７ＣＩＯと比較して細胞に対して活性がより乏しい。７ＩＩＯが最も強力な化合物であった（図４Ａ）。これらの結果は、インビトロ・キナーゼアッセイで得られた結果と相関しなかった（表６）。Ｍｅ７ＢＩＯにいたるＮ１上のメチル化は、７ＢＩＯの細胞死誘導能を完全に破壊した（図４Ｂ）。７ＢＩＯは、より劣ったキナーゼインヒビターであるがそれでも強力な細胞死誘導剤であるので、この化合物の作用がより詳細に調査された。

７ＢＩＯによる細胞死の誘導がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の特異的な特性ではないことを確認するために、乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１も用いられた（図５）。７ＢＩＯへの４８時間の露出は、直接的に計数することによって証明されるように、細胞増殖の用量依存性の阻害を誘導した。この作用は、７ＢＩＯの除去によってほとんど可逆的ではなかった（図５Ａ）。細胞周期の分布に対する７ＢＩＯの作用（図５Ｂ）が次に分析された。他のインジルビンについて以前に記載されたようにＧ２／Ｍにおける蓄積およびＧ０／Ｇ１の減少への傾向が観察された。

（７ＢＩＯによる細胞死の誘導はＡｈＲを必要としない）
インジルビンはＡｈＲと相互作用する。この相互作用は、インジルビンの細胞作用に寄与し得る。しかしながら、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞はＡｈＲを欠くようである。７ＢＩＯの細胞死の作用へのＡｈＲの寄与を評価するために、２種の肝癌細胞系である５Ｌ（ＡｈＲ＋／＋）およびそのＡｈＲ欠損サブクローンＢＰ８（ＡｈＲ−／−）が用いられた。最初に確認されたのは、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）（ダイオキシン）と同様に、７ＢＩＯおよびＭｅ７ＢＩＯの両方が、ＩＯおよび６ＢＩＯおよびそれらのメチル化相当物ＭｅＩＯおよびＭｅ６ＢＩＯについて以前に報告されたようにＣＤＫ阻害タンパク質ｐ２７^Ｋｉｐ１のＡｈＲ依存性の発現（図６Ａ）を強力に増大させるということであった。それ故に、Ｐ２７^Ｋｉｐ１発現の誘導（図６Ａ）と細胞死の誘導（図４Ｂ）との間に相関関係は観察されない。ＡｈＲ−／−およびＡｈＲ＋／＋細胞の細胞周期の分布に対する７ＢＩＯおよびＭｅ７ＢＩＯの作用が次に分析された。他のインジルビンについて報告されるように、７ＢＩＯおよびＭｅ７ＢＩＯの両方がＧ０／Ｇ１において顕著なＡｈＲ依存性蓄積を誘導した（図６Ｂ）。最後に、細胞死誘導は、増加する７ＢＩＯ濃度への露出の後に両方の細胞系において推定された。用量−応答曲線は、基本的に同一であった（図６Ｃ）。要約すると、これらの結果により、ＡｈＲは、７ＢＩＯの細胞死誘導特性に必要とされないことが示された。

（７ＢＩＯによる細胞死の誘導は、他のインジルビンによるよりはるかに速い）
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞死誘導の時間経過が、次に、２５μＭのＩＯ、５ＢＩＯ、６ＢＩＯ、７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯへの露出後に行われた（図７）。５ＢＩＯおよび６ＢＩＯは、７０％の細胞死を誘導するために３６〜４８時間を必要としたが、このレベルには、７ＢＩＯにより１２時間で達した。ほぼ完全な細胞死は、７ＢＩＯにより２４時間以内に得られた（図７）。このはるかにより速い速度論により、他のインジルビンと比較して細胞死の異なる機構が７ＢＩＯの場合に発生していることが示唆される。あるいは、大部分がアポトーシスを経る間に、部分母集団の細胞が７ＢＩＯに応答するのと同様に、それらは５ＢＩＯおよび６ＢＩＯに応答しているかもしれない。

（７ＢＩＯは、非アポトーシス性の細胞死を誘導する）
７ＢＩＯの作用機構は、最初、蛍光顕微鏡下に、ビスベンズイミドおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色後に種々のインジルビンに露出されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を検査することによって調査された（図８）。最初に、コントロール細胞およびＭｅ７ＢＩＯ処理細胞においてＰＩ染色は観察されなかった（図８Ａ、８Ｆ）。これにより、細胞死がないことが確認された。ＩＯ、５ＢＩＯおよび６ＢＩＯは全て、アポトーシスの典型である核断片化を誘発したが、二次的なネクローシスを伴った（図８Ｂ−８Ｄ）。これらの図は、決して、７ＢＩＯ処理細胞では観察されず、これらでは、対照的に、多数の大きな未フラグメント化濃縮核が示された（図８Ｅ）。このような図は、５ＢＩＯおよび６ＢＩＯにより時折観察されるだけであった（図８Ｃ−８Ｄ）。これらの形態学的結果により、７ＢＩＯは、アポトーシスとは異なる非定型の細胞死を誘発することが示唆される。

この可能性を吟味するために、種々の濃度の種々のインジルビンに露出されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてカスパーゼの活性がアッセイされた（図９）。５ＢＩＯおよび６ＢＩＯ、およびより小さい範囲ではあるがＩＯは、用量−（図９Ａ）および時間−（図９Ｂ）依存性のカスパーゼ活性の活性化を誘発した。際だって対照的に、７ＢＩＯおよびＭｅ７ＢＩＯのいずれも、カスパーゼの活性化を何ら誘導せず、コントロールの未処理細胞のレベルのままであった。さらに、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（一般的なカスパーゼインヒビター）が、７ＢＩＯによって誘導される細胞死について作用を有していなかった（図１０）が、一方で、それは、５ＢＩＯおよび６ＢＩＯ、およびより小さい範囲ではあるがＩＯによって誘導される細胞死のレベルを下げた（図１０Ａ）。７ＢＩＯ誘導細胞死の時間経過は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈによっては影響を受けなかった（図１０Ｂ）。

さらに、７ＢＩＯは、ミトコンドリアからのごくわずかなシトクロムＣの放出を誘発した（図１１）。同一条件下に、ＩＯ、５ＢＩＯおよび６ＢＩＯは、スタウロスポリンおよびエトポシドのような標準的なアポトーシス誘導試薬によって達したレベルと類似したレベルまでのシトクロムＣの放出を誘導した。アポトーシス細胞死の現れとしてのＤＮＡラダリングが次に観察された。Ｒ−ロスコビチンによって引き起こされるラダリングは、記録されたこの化合物のアポトーシスを誘導する能力と一致した（Ribas and Boix, 2004）。５ＢＩＯおよびより小さい範囲ではあるが６ＢＩＯも、ヌクレオソーム間のフラグメント化を誘導し、この強度は、培養組織中のアポトーシス細胞の量に比例していた（図８のビスベンズイミド／ヨウ化プロピジウム染色を参照）。７ＢＩＯ処理細胞において、ラダーは観察されなかったが、しかしながら、大抵の細胞は死んでいた。Ｍｅ７ＢＩＯ、ＩＯおよびＤＭＳＯ処理では、細胞死の誘導はごくわずかであり、ラダリングは検出されなかった。

要約すると、これらの結果により、ＩＯ、５ＢＩＯおよび６ＢＩＯによって誘導される細胞死とは際だって対照的に、７ＢＩＯ誘導細胞死はシトクロムＣ放出を誘導せず、カスパーゼの活性化を誘発も必要ともしないことが示された。それ故に、７ＢＩＯは、ＩＯ、５ＢＩＯおよび６ＢＩＯによって誘導されるアポトーシスとは異なる細胞死経路を誘導するようである。

（７ＢＩＯ誘導型細胞死は、ｐ５３およびｐ２１^Ｃｉｐ１およびＳＴＡＴ３のいずれの脱リン酸化も必要としない）
４種のインジルビンによって誘導される細胞死におけるｐ５３およびｐ２１^Ｃｉｐ１の関与（図１２）が次に調査された。ｐ５３は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において時間依存性の方法で５ＢＩＯによって強く誘導される（図１０Ａ−Ｂ）。ｐ５３の誘導は、６ＢＩＯにより処理された細胞においてのみ少量であり、ＩＯ、７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯにより処理された細胞においてわずかである（図１２Ａ−Ｂ）。予想されるように、同一条件下のｐ２１^Ｃｉｐ１発現の分析により、５ＢＩＯによる時間依存性の誘導が示された（図１２Ｃ）。ｐ２１^Ｃｉｐ１発現は、ｐ５３安定化の後に同一の遅れで起こった（図１０Ｂ）。ＩＯ、５ＢＩＯおよび６ＢＩＯは、ｐ２１^Ｃｉｐ１過剰発現を誘導する時点でざっと等効力であったが、７ＢＩＯおよびＭｅ７ＢＩＯは、ごくわずかな作用を有していた（図１２Ａ）。最後に、本発明者らは、野生型ｐ５３ＨＣＴ−１１５およびｐ５３を欠くＨＣＴ−１１６サブクローンについての７ＢＩＯの作用を試験した（図１２Ｅ）。用量−応答曲線は、基本的に同じであった。要約すると、これらのデータにより、７ＢＩＯ誘導型細胞死は、ｐ５３を誘導しないしその寄与を必要ともしないことが示唆された。

チロシンのリン酸化および続く転写因子ＳＴＡＴ３の活性化は、最近、いくつかのインジルビンによって阻害され、生存因子のダウンレギュレーションおよび続く細胞死の誘導につながることが示された。７ＢＩＯの活性化においてこの機構が関与するかどうかを調べるために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるチロシン７０５−リン酸化ＳＴＡＴ３のレベルについてのＩＯ、５ＢＩＯ、６ＢＩＯおよび７ＢＩＯの作用が調査された（図１３）。陽性コントロールとして、細胞はまた、インターフェロンα（ＩＦＮα）によって刺激された。結果は、チロシン７０５−リン酸化ＳＴＡＴ３ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の基礎レベルがＩＦＮαによる刺激によって達するレベルと比べて非常に低く、それでも、それは、ＩＯ、５ＢＩＯおよび６ＢＩＯによってダウンレギュレートされるが、７ＢＩＯによってはダウンレギュレートされないことを示す。これにより、７ＢＩＯの作用機構は、そもそもチロシンリン酸化ＳＴＡＴ３の不活性化に起因しないことが示唆される。

（７ＢＩＯ誘導型細胞死は、アポトーシスから細胞を保護し得る細胞機構によって阻害されない）
７ＢＩＯによって誘発される細胞死過程をさらに探索するために、アポトーシスに対する抵抗の証明された機構が７ＢＩＯの作用から細胞を保護し得るかをチェックするための実験が行われた。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、細胞培養組織において、レチノイン酸（ＲＡ）によって分化され得、この分化は、オロモウシンまたはロスコビチンと同様にＣＤＫインヒビターによって誘発されるアポトーシスを妨げる（Ribas and Boix, 2004）。同様に、分化は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をスタウロスポリン（ＳＴＳ）（標準的なアポトーシスを誘導するために用いられる確立された試薬）に対して抵抗性にする。図１４に示されるように、分化は、７−ＢＩＯ誘導型細胞死の割合についてごくわずかな作用を有していた。

Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬタンパク質は、それらの抗アポトーシス作用について知られている。さらに、それらの細胞保護作用が、アポトーシスを超えて拡大することが見出された（Kane et al, 1995）。本発明者らは、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬの過剰発現がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ＳＴＳによって誘発されるアポトーシスから保護することを以前に記載した（Yuste et al., 2002）。報告されるように、Ｂｃｌ−ＸＬは、ＳＴＳ誘導型アポトーシスを阻害する時点でＢｃｌ−２を上回った（図１４Ｂ）。しかしながら、並行した時間経過実験において、Ｂｃｌ−ＸＬおよびＢｃｌ−２のいずれの過剰発現も、７ＢＩＯからの重大な保護を何ら提供しなかった（図１４Ｂ）。要約すると、これらの結果は、アポトーシス非依存性に作用する効果的な細胞キラーとしての７ＢＩＯの作用を補強した。

（非アポトーシス性のカスパーゼ非依存性の細胞死は、７ＢＩＯによって誘発される死過程の一般的な特徴である）
７ＢＩＯの作用の普遍性を吟味するために、２種の他のヒト神経芽腫誘導細胞系ＩＭＲ−５およびＩＭＲ−３２並びに２種の血液学的な腫瘍誘導細胞系JurkatおよびＨＬ−６０において７ＢＩＯが試験された。図１５（左欄）に示されるように、７ＢＩＯは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）およびＨＣＴ１１６（直腸癌）細胞タイプについて致死として特徴付けられる同じ範囲の濃度において細胞死を誘導した。ＨＬ−６０細胞（ｐ５３タンパク質において欠損していると知られている）の７ＢＩＯに対する感受性は、上記のｐ５３の関与の欠如と一致する。

ＩＭＲ−５、ＩＭＲ−３２、JurkatおよびＨＬ−６０細胞において７ＢＩＯによって誘発される細胞死過程がさらに特徴付けられた。ビスベンズイミド染色、蛍光および電子顕微鏡法の特徴化により、非アポトーシス性の細胞死が上記のようにＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において生じることが証明された。さらに、２４時間においてエフェクタ・カスパーゼ活性が評価された（図１５、右）。予想されたように、５ＢＩＯは、カスパーゼの活性化を誘発した。ＳＴＳと比較して、５ＢＩＯは、低減したカスパーゼ活性化を示し、これは、（１）５ＢＩＯが誘導する混合型の細胞死および（２）アポトーシス誘導のより同期性に欠ける速度論と一致する。対照的に、７ＢＩＯ処理細胞におけるＤＥＶＤアーゼ活性は、一貫して、コントロールである未処理細胞によって示されるバックグランドより下に落ちた。結論として、７ＢＩＯによって誘発された非アポトーシス性のカスパーゼ非依存性型の細胞死は、化合物の固有の特性である（細胞モデルとは無関係である）ようである。

（参照）
Meijer L, Borgne A, Mulner O, Chong JPJ, Blow JJ, Inagaki N, Inagaki M, Delcros JG and Moulinoux JP. (1997). Eur. J. Biochem., 243, 527-536.
Meijer L, Skaltsounis AL, Magiatis P, Polychonopoulos P, Knockaert M, Leost M, Ryan XP, Vonica CD, Brivanlou A, Dajani R, Tarricone A, Musacchio A, Roe, SM, Pearl L and Greengard P. (2003). Chem. & Biol., 10, 1255-1266.

Ribas J, Boix J. (2004). Exp. Cell Res., 295, 9-24.

Ribas J, Gomez-Arbones X, Boix J. (2005). Eur. J. Pharmacol., 524, 49-52.
Meijer L, Skaltsounis AL, Magiatis P, Polychonopoulos P, Knockaert M, Leost M, Ryan XP, Vonica CD, Brivanlou A, Dajani R, Tarricone A, Musacchio A, Roe, SM, Pearl L and Greengard P. (2003). Chem. & Biol., 10, 1255-1266.
Polychonopoulos P, Magiatis P, Skaltsounis L, Myrianthopoulos V, Mikros E, Tarricone A, Musacchio A, Roe SM, Pearl L, Leost M, Greengard P and Meijer L. (2004). J. Med. Chem., 47, 935-94.

ＧＳＫ−３βの活性部位にドッキングさせられた７ＢＩＯ（青緑色）および６ＢＩＯ（赤色）の重ね合わせ。リガンドと相互作用するＡｓｐ１３３からＶａｌ１３５までの残基の骨格原子のみが可視であり、タンパク質の残りは、リボンとして示されている。７ＢＩＯの場合、７位の臭素原子とＬｅｕ１３２残基との間の立体障害が起こっており（ＶｄＷ球体の重複によって視覚化されている）、これによって、ＧＳＫ−３βに対する７ＢＩＯの親和性がより低くなっている。７−ブロモ−インジルビンは、カスパーゼ非依存性またはカスパーゼ依存性の細胞死を誘導する。（上側パネル）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、４８時間にわたって、２０μＭのＱ−ＶＤ−ＯＰｈの存在下（黒印）または不存在（白印）下に、増加濃度の３種の７−ブロモ−インジルビン（２４、４２、５３）に露出された。細胞の生存は、ＭＴＳアッセイによって評価され、未処理細胞の百分率として表される。全点は、１実験毎に２つの独立した測定を有する２つの独立した実験の平均±標準誤差（s.e.）である。（Ｂ）エフェクタ・カスパーゼ活性の時間経過が２５μＭの３種の７−ブロモ−インジルビン（２４、４２、５３）により２４時間にわたり処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において測定された。ＤＥＶＤアーゼの活性は、任意の蛍光単位として測定された。全点は、３種の独立した測定の平均±標準誤差である。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存についてのＩＯ、５ＢＩＯ、６ＢＩＯおよび７ＢＩＯの作用。（Ａ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は４８時間にわたって、ＩＯ、５ＢＩＯ、６ＢＩＯまたは７ＢＩＯの濃度にさらされた。細胞の生存は、ＭＴＳ還元アッセイによって推定され、未処理細胞における生存の百分率（％）で表される。１実験毎に３つの無関係の測定値を有する少なくとも４回の無関係の実験の平均±標準誤差。（Ｂ）ＬＤＨ放出の他は類似の実験が行われ、ＢＩＯ用量応答曲線は、ＭＴＳ還元アッセイにより１または１０％ＦＣＳの存在下に行われた。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存についての種々の７−ハロゲノ−インジルビン−３’−オキシム（Ａ）および１−メチル−７−ブロモ−インジルビン−３’−オキシム（Ｂ）の作用。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は４８時間にわたって、増加濃度の７−クロロ−、７−ヨード−、７−ブロモ−または７−フルオロ−インジルビン−３’−オキシム（それぞれ、７ＣＩＯ、７ＩＩＯ、７ＢＩＯ、７ＦＩＯ）（Ａ）または１−メチル−７−ブロモ−インジルビン−３’−オキシム（Ｍｅ７ＢＩＯ）または７ＢＩＯ（Ｂ）に露出された。細胞の生存は、ＭＴＳ還元アッセイによって推定され、未処理細胞における生存の百分率（％）で表される。３つの測定の平均±標準誤差。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における細胞増殖および細胞周期分布についての７ＢＩＯの作用。（Ａ）細胞は、時間０において種々の濃度の７ＢＩＯに露出され、種々の時間において細胞数が測定された。４８時間において、培養培地は７ＢＩＯを欠いた新鮮な培地と交換された。（Ｂ）細胞は、種々の濃度の７ＢＩＯに２４時間にわたって露出され、種々の細胞周期の期におけるそれらの分布は、ＦＡＣＳ分析によって測定された。７ＢＩＯの細胞毒性作用はＡｈＲとは無関係である。（Ａ）肝細胞ＡｈＲ−／−（ＢＰ８）およびＡｈＲ＋／＋（５Ｌ）細胞が、０．１μＭのＴＣＤＤまたは１０μＭの７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯにより２４時間にわたって、または、溶剤ＤＭＳＯにより処理された。ｐ２７^ＫＩＰ１の発現レベルは、特異的な抗体を用いるウェスタンブロッティングによって決定された。ローディング・コントロールとしてアクチンのウェスタンブロッティングが用いられた。（Ｂ）７ＢＩＯおよびＭｅ７ＢＩＯの両方が、Ｇ０／Ｇ１においてＡｈ依存性の蓄積を誘導する。ＤＭＳＯまたは１０μＭの７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯの不存在下（コントロール）または存在下に２４時間にわたって５ＬおよびＢＰ８細胞が培養され、細胞周期の期の分布は、ＦＡＣＳ分析によって測定された。（Ｃ）５ＬおよびＢＰ８細胞系の両方が２４時間にわたって、増加濃度の７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯに露出された。細胞の生存は、ＭＴＴ還元アッセイによって推定され、未処理細胞における生存の百分率（％）で表される。３つの測定値の平均±標準誤差。７ＢＩＯは、他のインジルビンよりもはるかに速く細胞死を誘導する。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、２５μＭのＩＯ、５ＢＩＯ、６ＢＩＯ、７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯにより６、１２、２４、３６または４８時間にわたって処理された。細胞の生存は、ＭＴＳ手順によって評価された。全ての点は、１回の実験当たり少なくとも３つの無関係の測定値を有する２回の無関係の実験の平均±標準誤差である。ＩＯ、５ＢＩＯおよび６ＢＩＯとは対照的に、７ＢＩＯは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において非アポトーシス性の細胞死を誘導する。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、２４時間にわたって、０．１％ＤＭＳＯ（コントロール）（Ａ）、２５μＭのＩＯ（Ｂ）、２５μＭの５ＢＩＯ（Ｃ）、１０μＭの６ＢＩＯ（Ｄ）、１０μＭの７ＢＩＯ（Ｅ）または１０μＭのＭｅ７ＢＩＯ（Ｆ）に露出された。ビスベンズイミドおよびヨウ化プロピジウムによるＤＮＡの二重染色の後、細胞は、蛍光顕微鏡法によって検査された。太い矢印：アポトーシス（核の断片化）；細い矢印：二次的なネクローシス；矢印の頭：濃縮核。スケールバー：２０μｍ。７ＢＩＯは、カスパーゼの活性化を誘導しない。（Ａ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ＩＯ、５ＢＩＯ、６ＢＩＯ、７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯにより２４時間にわたって、示された濃度の範囲内で処理された。コントロールの未処理細胞の値は時間０に置かれる。ＤＥＶＤアーゼの活性は、任意の蛍光単位として測定された。全ての点は、少なくとも３つの無関係の測定値の平均±標準誤差である。（Ｂ）エフェクタ・カスパーゼの活性の時間経過が、２５μＭのＩＯ、５ＢＩＯ、６ＢＩＯ、７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯにより２４時間にわたって処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において測定された。全ての点は、少なくとも３つの無関係の測定値の平均±標準誤差である。７ＢＩＯ誘導型細胞死は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（一般的なカスパーゼ阻害剤）によって防止されない。（Ａ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、２５μＭのＩＯ、５ＢＩＯ、６ＢＩＯ、７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯにより４８時間にわたって、１０μＭのＱ−ＶＤ−ＯＰｈ（広スペクトルのカスパーゼ阻害剤）の存在下（黒棒線）または不存在下（白棒線）に処理された。細胞の生存は、ＭＴＳアッセイによって評価された。全ての点は、１回の実験当たり３つの無関係の測定値を有する４回の無関係の実験の平均±標準誤差である。コントロールのＱ−ＶＤ−ＯＰｈグラフにおいて、２回の無関係の実験のみが行われた。（Ｂ）１０μＭのＱ−ＶＤ−ＯＰｈの不存在下（○）または存在下（●）での７ＢＩＯ誘導型細胞死の時間経過。細胞は、時間０において２５μＭのＢＩＯにさらされ、細胞の生存は、種々の時間点においてＭＴＳアッセイによって推定された。各点は、１回の実験当たり３つの無関係の測定を有する少なくとも３回の無関係の実験の平均±標準誤差である。ＩＯ、５ＢＩＯおよび６ＢＩＯ（７ＢＩＯではなく）は、シトクロムＣ放出およびＤＮＡラダリングを誘導する。（Ａ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、１２．５μＭのＩＯ、５ＢＩＯ、６ＢＩＯ、７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯ、０．２５μＭのスタウロスポリンまたは１２．５μＭのエトポシドにより１０時間にわたって処理された。次いで、細胞は収集され、核ペレットおよび細胞質の上澄みに分画された。細胞質の上澄みは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された後、抗シトクロムＣ抗体を用いるウェスタンブロッティングが行われた。抗体は、内部ローディングマーカーとして用いられる無関係のタンパク質と交差反応する。（Ｂ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ＤＭＳＯ（０．２５％）、２５μＭのＩＯ、５ＢＩＯ、６ＢＩＯ、７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯまたは２５μＭの（Ｒ）−ロスコビチンにより２４時間にわたって処理された。次いで、細胞は収集され、ヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化は、１．５％のアガロースゲル中の電気泳動によって分析された。７ＢＩＯは、ｐ５３発現もｐ２１^ＣＩＰ１発現も誘導せず、必要ともしない。（Ａ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、１２．５μＭのＩＯ、５ＢＩＯ、６ＢＩＯ、７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯ、１μＭのスタロスポリンまたは１２．５μＭのエトポシドにより１２時間にわたって処理された。次いで、細胞は収集され、タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された後、ｐ５３、ｐ２１^ＣＩＰ１またはアクチン（内部ローディングマーカーとして用いられる）に対する抗体を用いるウェスタンブロッティングが行われた。（Ｂ−Ｄ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、１２．５μＭの５ＢＩＯまたは７ＢＩＯまたは１２．５μＭのエトポシドにより種々の時間にわたって処理された。次いで、細胞は収集され、タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された後、ｐ５３（Ｂ）、ｐ２１^ＣＩＰ１（Ｃ）またはアクチン（Ｄ）に対する抗体を用いるウェスタンブロッティングが行われた。（Ｅ）野生型（●）およびｐ５３由来型（○）のＨＣＴ−１１６細胞は、２４時間にわたって、増加濃度の７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯにさらされた。細胞の生存は、ＭＴＳ還元アッセイによって推定され、それは、未処理細胞中の生存の百分率（％）で表された。３つの測定値の平均±標準誤差。７ＢＩＯの作用は、ＳＴＡＴ３チロシンリン酸化のダウンレギュレーションを含まない。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、未処理であるか、または、２５μＭのＩＯ、５ＢＩＯ、６ＢＩＯ、７ＢＩＯまたはＤＭＳＯ担体により４時間にわたって、または、１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−αにより５分間にわたって処理されるかのいずれかである。細胞タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された後、総ＳＴＡＴ３およびチロシンリン酸化ＳＴＡＴ３に対する抗体を用いるウェスタンブロッティングが行われた。抗アクチン抗体によるウェスタンブロッティングは、ローディングマーカーを提供した。ＳＴＳ誘導型アポトーシスとは対照的に、７ＢＩＯ誘導型細胞死は、細胞分化（Ａ）またはＢｃｌ−２／Ｂｃｌ−ＸＬ過剰発現（Ｂ、Ｃ）の防護作用に抵抗性である。（Ａ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、静止状態および分化を誘導するためにＲＡにより５日間処理されるか（白色棒線）、または、増殖を維持される（黒色棒線）かのいずれかである。ＳＴＳ（１μＭ）、７ＢＩＯ（２５μＭ）またはラセミのロスコビチン（５０μＭ）による処理の２４時間の後、細胞の生存能力が、ＭＴＳ手順によって測定された。棒線の値は、少なくとも６つの無関係の測定値の平均±標準誤差である。（Ｂ）ベクターｐｃＤＮＡ３／Ｂｃｌ−ＸＬ（●）、ｐｃＤＮＡ３／Ｂｃｌ−２（○）および空のｐｃＤＮＡ３（■）により永久的に形質導入されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ＳＴＳ（２μＭ）または７ＢＩＯ（２５μＭ）のいずれかにより処理された。細胞の生存能力は、ＭＴＳ手順によって処理の９および２４時間において分析された。時間経過のプロットにおいて、全ての点は、１回の実験当たり６つの無関係の値を有する３回の無関係の実験の平均±標準誤差である。（Ｃ）ｐｃＤＮＡ３／Ｂｃｌ−２（１）、ｐｃＤＮＡ３／Ｂｃｌ−ＸＬ（２）およびｐｃＤＮＡ３／空（３）が形質導入されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のＢｃｌ−ＸＬおよびＢｃｌ−２の含有量が、生存能力測定実験の間にウェスタンブロッティングによって評価された。チューブリンの含有量は、タンパク質充填について制御するために用いられた。７ＢＩＯは、４種の追加的細胞系においてカスパーゼ非依存性の細胞死を誘導する。ＩＭＲ−５、ＩＭＲ−３２、ＨＬ−６０およびJurkat細胞が、増加濃度の７ＢＩＯにより２４時間にわたって厳密に調べられ、細胞生存能力が、ＭＴＳ手順によって測定された（左）。全ての点は、１回の実験当たり６つの無関係の測定値を有する３回の無関係の実験の平均±標準誤差である。同一の細胞系が、２４時間にわたってＳＴＳ（１μＭ）、５ＢＩＯ（２５μＭ）、７ＢＩＯ（２５μＭ）による処理に付されたか、または、未処理で放置され（Ｕ）、エフェクタカスパーゼの活性化（任意の蛍光単位でのＤＥＶＥアーゼの活性）が測定された（右）。棒線の値は、６つの無関係の測定値の平均±標準誤差である。

Claims

式（Ｉ）：

（式中、Ｒは、Ｎ−ＯＨ、Ｎ−Ｏ−アルキルまたはＮ−Ｏ−ＣＯ−アルキルの基を示すか、または、

からなる群において選択される置換基を示し、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉからなる群において選択されるハロゲン原子であり、ＺはＨまたはＣＨ_３である）
の３’−，７−置換インジルビンまたはその塩。
Ｒは、Ｎ−ＯＨを示す、請求項１に記載のインジルビン。
Ｒは、Ｎ−Ｏ−アルキル基を示す、請求項１に記載のインジルビン。
Ｒは、Ｎ−Ｏ−Ｃ１−Ｃ３アルキル基を示す、請求項１に記載のインジルビン。
Ｒは、Ｎ−Ｏ−ＣＨ_３基を示す、請求項１に記載のインジルビン。
Ｒは、

からなる群において選択される置換基を示す、請求項１に記載のインジルビン。
ＸはＢｒを示し、ＺはＨである、請求項１〜６のいずれか１つに記載のインジルビン。
７−置換インジルビン−３’−オキシムの前駆体である対応するビスインドール：

を製造する方法であって、
式IIIa-IIId：

の７−ハロゲノ−イサチン、または
式IVa-IVd：

（上記各式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを示す）
の７−ハロゲノ−Ｎ−メチルイサチン
を３−アセトキシインドールと二量化させる反応を包含する方法。
前記７−ハロゲノ−イサチンは、オルト−ハロゲノ−アニリンを出発物質として用いる２工程の手順を通じて得られ、第１の工程は、式Ia-Id：

（式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを示す）
のオルト−ハロゲノ−アニリンを抱水クロラールおよび塩酸ヒドロキシルアミンと反応させて、対応するイソニトロソアセトアニリドを与える工程を包含し、第２の工程は、酸性条件下に中間のイソニトロソアセトアニリドを加熱して、７−ハロゲノ−イサチンを与える工程を包含し、
７−ハロゲノ−Ｎ−メチルイサチンは、７−ハロゲノ−イサチンから硫酸ジメチルおよびＮａ_２ＣＯ_３による処理によって調製される、請求項８に記載の方法。
置換イサチンである、式IIIa-IIId：

の７−ハロゲノ−イサチンまたは式IVa-IVd：

の７−ハロゲノ−Ｎ−メチルイサチンを３−アセトキシインドールとアルカリ媒体中で反応させて、対応するビスインドール：

（上記各式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを示す）
を与える工程を包含する、請求項８または９に記載の方法。
７−置換インジルビン−３’−オキシム、同メトキシムまたは同アセトキシムを製造する方法であって、
オキシムまたはメトキシムは、請求項８〜１０のいずれか１つに記載の方法で製造されるビスインドールを還流下に有機溶媒中で塩酸ヒドロキシルアミンと、または、塩酸メトキシアミンと反応させることによって、（２’Ｚ，３’Ｅ）体で選択的に調製され、アセトキシムは、前記により調製されたオキシムから、ピリジン中の無水酢酸により調製される、方法。
３’−置換オキシムである７ＢＩＯ：

およびＭｅ７ＢＩＯ：

から、対応する３’−［Ｏ−（２−ブロモエチル）オキシム］中間体を調製する方法であって、上記７ＢＩＯまたはＭｅ７ＢＩＯをアミン存在下に１，２−ブロモエタンと反応させる工程を包含する方法。
請求項１〜７のいずれか１つに記載の少なくとも１種の３’−，７−置換インジルビンの有効量を、製薬的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物。
口腔で、注射可能に、または、非経口ルートで、治療されるべき患者に適した個々の用量で投与されるように配合される、請求項１３に記載の医薬組成物。
アポトーシス抵抗機構を生じたヒト腫瘍の治療のための請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、神経芽腫、肝癌または白血病の治療のための請求項１３または１４に記載の医薬組成物。