KR20120060201A - 기능적으로 분화된 체세포의 연장된 자기재생을 유도하는 방법 - Google Patents

기능적으로 분화된 체세포의 연장된 자기재생을 유도하는 방법 Download PDF

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KR20120060201A
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Michael Sieweke
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인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔)
위니베르시테 데 라 메디테란 엑스마르세이유 2
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Abstract

본 발명은 체세포들 내에서 Myc족 유전자 및 Klf족 유전자의 발현을 활성화시키거나 또는 상기 체세포들을 Myc족 단백질 및 Klf족 단백질들과 접촉시키는 단계를 포함하는 기능적으로 분화된 체세포들의 증식을 유도하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

기능적으로 분화된 체세포의 연장된 자기재생을 유도하는 방법{A METHOD FOR INDUCING EXTENDED SELF-RENEWAL OF FUNCTIONALLY DIFFERENTIATED SOMATIC CELLS}
본 발명은 체세포들 내에서 Myc족 유전자(Myc family gene) 및 Klf족 유전자(Klf family gene)의 발현을 활성화시키거나 또는 상기 세포들을 Myc족 단백질(Myc family protein) 및 Klf족 단백질(Klf family protein)과 접촉시키는 단계를 포함하는, 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 유도하는 방법에 관한 것이다.
줄기세포, 특히 만능줄기세포(예를 들어, 배아줄기세포, 보다 최근에는 유도만능줄기세)가 자기재생하고 다중 특이적 세포 유형들로 분화하는 능력을 갖기 때문에, 수년간 재생의학 분야에서의 기술들은 이들 세포들에 관심이 집중되어 있다. 심장 조직 및 신경 조직 등과 같은 대부분의 조직들 또는 기관들은 근본적으로 기능적으로 분화된 체세포들로 이루어져 있고, 그리고 이들의 제한된 자기재생 능력으로 인해 단독으로 재생될 수 없거나 또는 적어도 효율적으로 재생될 수 없기 때문에, 재생의학의 개념에는 표적 조직 및/또는 표적 기관을 회복시키고 재생시키는 것을 목표로 대상 세포들을 이식하는 것이 포함된다.
실제로, 후생동물 유기체에서 최종 분화는 일반적으로 세포주기 종결(cell cycle exit)에 밀접하게 연결되어 있는 반면, 만능줄기세포들의 미분화된 상태는 무제한의 자기재생에 연관된다. 최종적으로 분화된 세포들의 비-증식성 상태는 특히 원기왕성하고 종종 과다한 메카니즘들에 의해 확인되고, 완전히 성숙한 세포들이 상기 주기에 재진입할 수 있는 드문 예외의 경우, 증식은 일시적으로 잔류하며, 일반적으로 탈분화(de-differentiation)를 수반한다. 분화된 세포들에 대해 무엇이 그의 직접적인 전구체들의 증식을 자극하는 고도한 미토겐 시그널(mitogen signal)에 대한 내화성(refractory)을 부여하는지에 대해서는 알려지지 않은 채 남아 있다. 예를 들어, 이들 성숙한 세포들이 사이토카인을 감지하는 지속적 능력에도 불구하고, 골수-단핵구 전구체(myelo-monocytic progenitors)의 M-CSF에 대한 증식 반응은 마크로파지들로의 분화에 따라 소실된다. 따라서, 골수의 전구세포들은 반-고체 M-CSF 포함 매질에서 콜로니를 형성하는 반면, 혈액 단핵구 및 조직 마크로파지들은 그러하지 아니하다.
그러나, 국제특허출원 제WO2008/084069호는 상기 세포들 내에서 MafB 및 c-Maf의 발현 또는 활성을 저해함으로써 장기간의 배양에서 단핵구들 및 마크로파지들을 생성하고, 유지하고, 확장하고; 그리고 M-CSF와 같은 하나 이상의 사이토카인의 존재하에서 세포들을 확장하는 방법에 대해 최근에 개시하고 있다.
이제, 본 발명자들은 이러한 방법이 c-Myc 및 Klf4의 제어된 활성에 의존적인 메카니즘에 기초하고 있으며, 놀랍게도 문헌 [Rowland et al. 2006] 및 문헌 [Adhikary et al. 2005]에 기술된 바와 같이 c-Myc 및 Klf4가 모두 발암유전자(oncogenes)라는 사실에도 불구하고 이에 따라 수득된 장기간 증식하는 세포들이 발암성이 아니라는 것이 입증되었다는 점을 강조한다.
본 발명의 요약
따라서, 본 발명의 제1의 관점은 체세포들 내에서 Myc족 유전자 및 Klf족 유전자의 발현을 활성화시키는 단계를 포함하는 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제2의 관점은 체세포들을 Myc족 단백질 및 Klf족 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제3의 관점은 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 유도하는 방법에 사용하기 위한, Myc족 구성원(Myc family member; 유전자 또는 단백질) 및 Klf족 구성원(Klf family member; 유전자 또는 단백질)의 조합에 관한 것이다.
본 발명은 또한 Myc족 구성원(유전자 또는 단백질) 및 Klf족 구성원(유전자 또는 단백질)을 포함하는 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 유도하는 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 유도하기 위한 Myc족 유전자 또는 단백질 및 Klf족 유전자 또는 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의하여 수득될 수 있는 기능적으로 분화된 체세포의 집단(population) 및 이러한 집단과 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명
따라서, 본 발명자들은 만능(pluri-potent) 또는 다분화능(multi-potent) 줄기세포 중간체들을 통하지 않고, 그리고 체세포들 내에서의 c-Myc 및 Klf4의 발현을 활성화시킴으로써 상기 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 유도함으로써 악성의 형질전환(malignant transformation) 없이, 기능적으로 분화된 체세포들을 대량으로 수득하는 것이 가능하다는 것을 입증하였다. 실제로, 본 발명자들은 상기 기능적으로 분화된 체세포들이 장기간의 배양에서 증식될 수 있지만, 또한 비-발암성, 특히 마우스로 이식한 후 비-발암성이라는 것을 입증하였다.
따라서, 본 발명의 제1의 관점은 체세포들 내에서 Myc족 유전자 및 Klf족 유전자의 발현을 활성화시키는 단계를 포함하는 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정의 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 상기 방법은 체세포들 내에서 Myc족 유전자 및 Klf족 유전자의 발현을 활성화시키는 단계를 포함하는 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 시험관 내에서 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "Myc족 유전자(Myc family gene)"는 c-Myc, N-Myc, L-Myc 및 S-Myc로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 유전자를 의미한다. 이러한 유전자들은 당해 기술분야에서의 이들의 일반적인 의미를 가지며, 참고문헌 [Adhikary et al. 2005]에 기술되어 있다. 상기 Myc족 유전자는 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있으나, 통상적으로는 포유류(예를 들어, 인간 및 비-인간의 영장류, 또는 설치류)의 Myc족 유전자들이다. 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 또한 골수구종증 암유전자(myelocytomatosis oncogene)라고도 불리우는 c-Myc이다. Myc족 유전자들의 아미노산 시퀀스들 및 뉴클레오티드 시퀀스들은 각각 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 공지된 것이며, NCBI 젠뱅크(NCBI Genbank)에서 공개적으로 획득가능하다. 예를 들어, 자연적으로 발생하는 인간 c-Myc 유전자는 젠뱅크 입수 번호(Genbank Accession Number) NM_002467로 나타나는 뉴클레오티드 시퀀스를 가지며, 자연적으로 발생하는 인간 단백질은 젠뱅크 입수 번호 NP_002458로 나타나는 아미노산 시퀀스를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "Klf족 유전자(Klf family gene)"는 Klf1, Klf2, Klf3, Klf4, Klf5, Klf6, Klf8, Klf9, Klf10, Klf11, Klf12, Klf13, Klf14, Klf15, Klf16 및 Klf17로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 유전자를 의미한다. 이러한 유전자들은 당해 기술분야에서의 이들의 일반적인 의미를 갖는다. 상기 Klf족 유전자는 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있으나, 통상적으로는 포유류(예를 들어, 인간 및 비-인간의 영장류, 또는 설치류)의 Klf족 유전자들이다. 특정의 구체예에 있어서, 상기 Klf족 유전자는 크루펠형 인자 4(Kruppel-like factor 4)라고도 불리우는 Klf4이다. Klf족 유전자들의 아미노산 시퀀스들 및 뉴클레오티드 시퀀스들은 각각 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 공지된 것이며, NCBI 젠뱅크에서 공공연히 획득가능하다. 예를 들어, 자연적으로 발생하는 인간 Klf4 유전자는 젠뱅크 입수 번호 NM_004235로 나타나는 뉴클레오티드 시퀀스를 가지며, 자연적으로 발생하는 인간 단백질은 젠뱅크 입수 번호 NP_004226으로 나타나는 아미노산 시퀀스를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 특정 유전자들(예를 들어, c-Myc 또는 Klf4 유전자들)에 대한 참조에는, 본래의(내인성) 폴리뉴클레오티드 시퀀스, 특히 인간의 유전자 또는 그의 임의의 대립(allelic) 또는 다형성(polymorphic) 변이체 뿐만 아니라 다른 종들에서 발견되는 이종상동성(orthologous) 시퀀스를 갖는 핵산이 포함될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체들은 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자 코드(genetic code)의 고유의 퇴하로 인하여, 실질적으로 동일하거나 또는 기능적으로 등가의 아미노산 시퀀스를 인코딩하는 다른 DNA 시퀀스들이 생산될 수 있으며, 이들 시퀀스들은 주어진 폴리펩티드를 클로닝하고 발현하는 데 사용될 수 있다.
숙련된 자에게 인식될 수 있는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드들은 단일-가닥(암호화(coding) 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있으며, DNA(게놈성, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. 부가의 암호화(coding) 또는 비-암호화(non-coding) 시퀀스들이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있으나, 존재하여야 하는 것은 아니며, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자들 및/또는 지지물질들에 결합될 수 있으나, 결합되어야 하는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "DNA" 및 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 특정 종들의 총 게놈 DNA가 부재하는 단리된 DNA 분자를 나타낸다. 따라서, 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 분절(DNA segment)은 하나 이상의 암호화 시퀀스들을 포함하는 DNA 분절을 나타내지만, DNA 분절이 수득되는 종의 총 게놈 DNA로부터 실질적으로 단리되거나 정제된 DNA 분절을 의미한다. 용어 "DNA 분절" 및 "폴리뉴클레오티드"는 DNA 분절들 및 이러한 분절들의 보다 작은 단편들 및 재조합 벡터들을 포함하며, 예를 들면 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 파지, 바이러스 등이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 특정 유전자들(예를 들어, c-Myc 또는 Klf4 단백질)에 대한 참조에는, 본래의 아미노산 시퀀스 뿐만 아니라 그의 기원(origin) 및 제조 방법과 무관하게 변종들 및 변성된 형태들을 갖는 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 본래의 아미노산 시퀀스를 갖는 단백질은 천연(예를 들어, 자연적으로 발생하는 c-Myc 또는 Klf4)으로부터 수득되는 것과 동일한 아미노산 시퀀스를 갖는 단백질이다. 이러한 본래의 시퀀스 단백질들은 천연으로부터 단리될 수 있거나 또는 표준 재조합 및/또는 합성 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. 본래의 시퀀스 단백질들은 특히 자연적으로 발생하는 절단되거나(truncated) 또는 가용성인 형태들, 자연적으로 발생하는 변종 형태들, 자연적으로 발생하는 대립 변종들 및 번역 후 변형을 포함하는 형태들을 포함한다. 본래의 시퀀스 단백질은 글리코실화 또는 포스포릴화, 유비퀴틴화, 수모화(sumoylation) 또는 다른 변성들과 같은 번역 후 변형에 후속하는 단백질들을 포함한다.
변종들은 유사한 아미노산 시퀀스를 가지며, 본래의 단백질의 하나 이상의 활성을 어느 정도까지 보유하고 있는 본래의 시퀀스 단백질과 기능적 등가물인 단백질을 의미한다. 변종들은 또한 활성을 보유하는 단편들을 포함한다. 변종들은 또한 본래의 시퀀스에 대해 실질적으로 동일한(예를 들어, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99%의 시퀀스 동일성) 단백질들을 포함한다. 이러한 변종들은 결실, 삽입 및/또는 치환 등과 같은 아미노산 변이를 갖는 단백질들을 포함한다. "결실"은 연관된 단백질 내에서의 하나 이상의 아미노산 잔기들의 부재를 의미한다. 용어 "삽입"은 연관된 단백질 내에서의 하나 이상의 아미노산들의 부가를 의미한다. "치환"은 폴리펩티드 내에서의 하나 이상의 아미노산 잔기들의 다른 아미노산 잔기로의 대체를 의미한다. 통상적으로, 이러한 변이들은 변종 단백질의 활성이 실질적으로 본래의 시퀀스 단백질과 유사하도록 속성 면에 있어서 보존적이다. 치환의 경우, 다른 아미노산을 대체하는 아미노산은 일반적으로 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성들을 갖는다. 비록 삽입의 위치에 따라 보다 많은 아미노산들이 삽입되거나 제거될 수 있음에도 불구하고, 삽입 및 결실들은 통상적으로 1 내지 5개의 아미노산들의 범위 이내이다.
특정의 구체예에 있어서, 본 발명은 체세포들 내에서 Myc족 유전자 및 Klf4 유전자의 발현을 활성화시키는 단계를 포함하는 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 유도하는 방법에 관한 것이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 c-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf2이다.
또다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 c-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf5이다.
또다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 N-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf4이다.
또다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 N-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf2이다.
또다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 N-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf5이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "기능적으로 분화된 체세포들"은 특정의 기능에 대해 특화된 세포들(예를 들어, 림프구, 신경세포 또는 근세포)을 의미한다. 대부분의 조직들 또는 기관들은 축퇴되지 않거나 또는 적어도 효과적으로 축퇴되지 않는다는 것에 더욱 주목하여야 한다. 실제로, 이러한 조직들 또는 기관들은 유기체가 생존해있는 동안 그들 자체의 동일한 복제본들을 만드는 것(자기재생)이 불가능한 분화된 세포들로 구성된다. 따라서, 본 발명의 특정의 구체예들에 있어서, 관심대상인 기능적으로 분화된 세포들은 그들 스스로 효율적으로 자기재생을 할 수 없거나 또는 성체 조직 줄기세포 또는 전구세포로부터의 대체가 매우 희박하거나 효율적이지 못한 세포들이다. 본 발명의 기능적으로 분화된 체세포들은 통상적으로 예를 들어 인간, 영장류, 말, 소, 낙타, 양, 개, 고양이, 래트, 마우스와 같은 포유동물 기원으로부터 얻어진다.
예를 들어, 상기 기능적으로 분화된 체세포들은 표피세포(epidermal cells), 상피세포(epithelial cells), 각질세포(keratinocytes), 신경세포(운동신경세포(motorneurons), 도파민작동성 신경세포(dopaminergic neurons)와 같은 특이적 신경전달물질(neurotransmitter)들을 포함함), 신경교질세포(glia cells), 망막세포(retinal cells), 각막의 수정체 세포(lens cells of cornea), 내이의 모세포(hair cells of the inner ear), 연골세포(chondrocytes), 연골아세포(chondroblasts), 내분비 췌장세포(췌장베타세포(pancreatic beta cells)를 포함함), 간세포(hepatocytes), 내피세포(endothelial cells), 조혈세포(적혈구, 림프구(B, T 및 NK 림프구들을 포함), 단핵구, 마크로파지, 수지상 세포들을 포함함), 심근세포(cardiomyocytes), 골격근세포(skeletal myocytes) 및 다른 근세포 등과 같은 근세포, 조골세포(osteoblasts) 및 용골세포(osteoclasts)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 이들 예시들은 제한을 위한 것이라기 보다는 설명을 위한 것이다.
하나의 구체예에 있어서, 상기 기능적으로 분화된 체세포들은 조혈세포이다.
특정의 구체예에 있어서, 상기 기능적으로 분화된 체세포들은 단핵구, 마크로파지 또는 수지상 세포이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 기능적으로 분화된 체세포들은 B 림프구 및 T 림프구이다.
또다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 기능적으로 분화된 체세포들은 혈소판이다.
또다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 기능적으로 분화된 체세포들은 적혈구이다.
또다른 구체예에 있어서, 상기 기능적으로 분화된 체세포들은 심근세포, 간세포 및 지방세포(adipocytes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
발현이 활성화되는 Klf족 유전자는 관련된 기능적으로 분화된 체세포에 따라 선택될 수 있음에 주목하여야 한다. 실제로, 주어진 기능적으로 분화된 체세포들은 문헌 [Pearson et al. 2008]에 기술된 바와 같이 Klf 유전자들과 관련하여 특이적 발현을 나타낸다.
통상적으로, 상기 기능적으로 분화된 체세포들이 심근세포인 경우, 발현이 활성화되는 Klf족 유전자는 Klf2, Klf5, Klf6, Klf10, Klf13 및 Klf15로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
특정의 구체예에 있어서, 상기 기능적으로 분화된 체세포들이 심근세포인 경우, Klf족 유전자는 문헌 [Haldar et al. 2007]에 기술된 바와 같이 Klf5, Klf10, Klf13 및 Klf15로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
통상적으로, 상기 체세포들이 골격근세포인 경우, 발현이 활성화되는 상기 Klf족 유전자는 Klf6, Klf13 및 Klf15로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
통상적으로, 상기 체세포들이 지방세포들인 경우, 발현이 활성화되는 상기 Klf족 유전자는 Klf2, Klf5 및 Klf15로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
통상적으로, 상기 체세포들이 신경세포인 경우, 발현이 활성화되는 상기 Klf족 유전자는 Klf6, Klf7 및 Klf9로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
통상적으로 상기 체세포들이 조골세포들인 경우, 상기 Klf족 유전자는 Klf10일 수 있다.
통상적으로, 상기 체세포들이 적혈구인 경우, 발현이 활성화되는 상기 Klf족 유전자는 Klf1, Klf2, Klf6 및 Klf11로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 될 수 있다.
통상적으로, 상기 체세포들이 T 림프구들인 경우, 그를 위한 발현이 활성화되는 상기 Klf족 유전자는 Klf2, Klf4 및 Klf13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
통상적으로, 상기 체세포들이 간세포들인 경우, 상기 Klf족 유전자는 Klf6일 수 있다.
통상적으로, 상기 체세포들이 내피세포들인 경우, 상기 Klf족 유전자는 Klf5가 될 수 있다.
통상적으로, 상기 체세포들이 각질세포들인 경우, 상기 Klf족 유전자는 Klf4일 수 있다.
이러한 Klf 구성원들의 선택은 현재 발행된 문헌들에 기초하는 것이며, 제한을 위한 것이라기보다는 설명을 위한 것으로 보아야만 한다는 것에 더욱 주목하여야 한다.
하나의 구체예에 따르면, Myc족 유전자 및 Klf족 유전자를 인코딩하는 유전물질은 통합 벡터(integrating vector) 또는 비-통합 벡터(non-integrating vector) 등과 같은 벡터를 사용하여 체세포로의 형질주입(transfection) 또는 형질도입(transduction)에 의하여 도입될 수 있다. 도입 이후, Myc족 유전자 및 Klf족 유전자를 인코딩하는 DNA 분절(들)은 염색체외적(예를 들어, 에피좀 플라스미드(episomal plasmid) 상)으로 위치되거나 또는 안정적으로 세포 염색체(들) 내로 통합될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 그에 결합된 다른 핵산을 숙주세포 내로 전달할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 이러한 벡터들은 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등과 같은 조절 요소(regulatory elements)들을 포함하여 대상체에의 투여에 의하여 상기 폴리펩티드의 발현을 야기하거나 직접적인 발현을 할 수 있도록 한다. 프로모터 영역은 암호화 시퀀스에 대하여 상동이거나 비상동일 수 있으며, 생체 내 사용을 위한 것을 포함하여 임의의 적절한 숙주세포 내에서 유비쿼터스적(ubiquitous), 구성상(constitutive)의, 제어되거나 및/또는 조직특이적인 발현을 위하여 제공된다. 프로모터들의 예에는 세균성 프로모터(T7, pTAC, Trp 프로모터 등), 바이러스성 프로모터(LTR, TK, CMV-IE 등), 포유류 유전자 프로모터(알부민, PGK 등) 등이 포함된다. 상기 벡터는 Myc족 유전자 또는 Klf족 유전자 또는 이들 둘 다를 암호화하는 단일 DNA 분절을 포함할 수 있다. 상기 벡터들은 하나 또는 여러 복제의 기원들을 더 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 벡터는 선택가능한 마커를 인코딩하여 상기 벡터를 취하고 발현시키는 세포들을 동정할 수 있다. 일례로서, 벡터가 세포들에게 항생물질 내성을 부여하는 경우, 항생물질이 배양 배지에 첨가되어 상기 벡터의 세포들 내로의 성공적인 도입을 동정할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "바이러스 벡터"는 핵산 분자 및/또는 펩티드 또는 다른 분자를 표적 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있는 변성된 바이러스 입자를 의미한다.
바이러스 벡터의 예에는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파르보바이러스(parvovirus; 예를 들어, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated viruses) 또는 AAV 벡터들), 코로나바이러스(coronavirus), 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus; 예를 들어, 인플루엔자 바이러스) 등과 같은 음성가닥 RNA 바이러스(negative strand RNA viruses), 랩도바이러스(rhabdovirus; 예를 들어, 광견병(rabies) 및 수포성구내염바이러스(vesicular stomatitis virus)), 파라믹소바이러스(paramyxovirus; 예를 들어, 홍역(measles) 및 센다이(Sendai)), 피코르나바이러스(picornavirus) 및 알파바이러스(alphavirus) 등과 같은 양성가닥 RNA 바이러스(positive strand RNA viruses) 및 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 1형 및 2형 단순포진바이러스(Herpes Simple virus types 1 and 2), 엡스타인-바 바이러스, 거대세포바이러스(cytomegalovirus)) 및 폭스바이러스(예를 들어, 백시니아(vaccinia), 계두(fowlpox) 및 카나리아두창(canarypox)을 포함하는 이중-가닥 DNA 바이러스(double-stranded DNA viruses)들이 포함된다. 다른 바이러스들에는 예를 들어 노르웍바이러스(Norwalk virus), 토가바이러스(togavirus), 플라비바이러스(flavivirus), 레오바이러스(reoviruses), 파포바바이러스(papovavirus), 헤파드나바이러스(hepadnavirus) 및 간염바이러스(hepatitis virus)들이 포함된다. 레트로바이러스들의 예에는 조류백혈병-육종(avian leukosis-sarcoma), 포유류 C-형, B-형 바이러스(mammalian C-type, B-type viruses), D-형 바이러스, HTLV-BLV군, 렌티바이러스(lentivirus), 스푸마바이러스(spumavirus)들이 포함된다.
이러한 재조합 바이러스들은 세포 형질주입 포장(transfecting packaging cells)에 의하거나 또는 헬퍼 플라스미드 또는 바이러스에 의한 일시적 형질주입(transient transfection)에 의하는 것과 같은 당해 기술분야에 공지된 기술들에 의하여 생산될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 상기 벡터들은 치료요법에서 사용하기 위한 그들의 안정성을 증가시키기 위하여 그리고 관심대상인 적절한 발현 요소들 및 유전자들을 포함하도록 해당 기술분야에서 인식된 기술들을 사용하여 구축되고 가공될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 발현 벡터들을 구축하기에 적절한 기술들은 당해 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에게는 잘 알려진 것이며, 본 명세서에 전체로서 참조로 포함되는 문헌 [Sambrook J, et al, "Molecular cloning: a laboratory manual"(3rd ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001)]과 같은 문헌들에서 발견될 수 있다.
따라서, 하나의 특정한 구체예에 있어서, Myc족 유전자를 인코딩하는 벡터 및/또는 Myc족 유전자가 사용된다.
하나의 특정한 구체예에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이다.
하나의 특정한 구체예에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터들은 상기 벡터들을 세포와 접촉시키기 전에 비리온 내로 포장하는 것에 의하여 형질도입된다.
이러한 구체예에 따르면, 상기 바이러스 벡터는 바람직하게는 렌티바이러스 벡터이다.
다른 구체예에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.
또다른 구체예에 있어서, 상기 벡터는 비-바이러스 벡터이다.
또다른 구체예에 있어서, 상기 비-바이러스 벡터는 에피솜 벡터(episomal vector)이다.
또다른 구체예에 있어서, 상기 에피솜 벡터는 플라스미드이다.
본 명세서에서의 "비-바이러스성"에 대한 참조들은 상기 벡터가 감염성 바이러스를 인코딩할 수 없다는 것을 나타낸다. 따라서, 비록 이러한 벡터가 하나 이상의 바이러스로부터 수득되는 구조상 요소들을 포함할 수 있더라도, 상기 비-바이러스 벡터는 감염성 또는 복제-가능(replication-competent) 바이러스를 생기게 하는데 충분한 바이러스 게놈의 전부 또는 일부를 인코딩하지 않는 벡터를 의미한다.
전이유전자(transgenes; 즉, Myc족 유전자 및 Klf족 유전자)는 둘 다 단일 벡터(바이러스성 또는 비-바이러스성) 상에 제공될 수 있다는 것 또한 주목하여야 한다.
예를 들어, 하나의 강한 구성전사프로모터(constitutive transcriptional promoter)가 상기 두 전이유전자들에 대한 전사제어를 제공할 수 있으며, 이는 발현카셋트로서 제공될 수 있다. 벡터상의 분리발현카셋트들은 별도의 강한 구성프로모터의 전사제어하에 놓여질 수 있으며, 이는 동일한 프로모터의 사본들이거나 또는 별개의 프로모터들일 수 있다. 다양한 비상동 프로모터들이 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 상기 전이유전자들의 원하는 발현 수준 등과 같이 전이유전자들에 따라 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 핵산 분자 및 비-바이러스성 유전자 전달 비히클을 포함하는 유전자 전달 시스템의 사용을 포함한다. 비-바이러스성 유전자 전달 비히클의 예에는 리포좀 및 폴리에틸렌이민, 시클로덱스트린, 히스티딘/리신(HK) 중합체 등이 포함된다.
본 발명의 두 번째 관점은 체세포들을 Myc족 단백질 및 Klf족 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 유도하는 방법에 관한 것이다.
하나의 구체예에 있어서, Myc족 단백질 및 Klf족 단백질 또는 이들의 변종들은 생체 외에서, 배양물 내 또는 대상체로부터 제거된 세포들에서, 또는 생체 내에서, 단백질의 세포 전달을 위해 공지된 임의의 과정에 의하여 표적 세포로 도입될 수 있다.
특정의 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 방법은 체세포들을 Myc족 단백질 및 Klf족 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 시험관 내에서 유도하는 방법이다.
특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 단백질은 c-Myc이고 상기 Klf족 단백질은 Klf4이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 c-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf2이다.
또다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 c-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf5이다.
또다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 N-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf4이다.
또다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 N-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf2이다.
또다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 N-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf5이다.
앞서 언급한 바와 같이, 그를 위한 발현이 활성화되는 상기 Klf족 유전자는 연관된 기능적으로 분화된 체세포에 따라 선택될 수 있다.
단백질의 전달은 그에 의하여 단백질이 세포 원형질막을 통과하는 과정이다. 통상적으로, 세포내로 단백질을 도입하는 방법에는 단백질 약물 전달을 위한 미량주사법(micro-injection), 전기천공법 및 나노입자법(nanoparticles)이 포함된다.
세포들 내로 단백질 전달을 매개하는 다수의 단백질전달물질(protein-transduction domains; PTDs)이 또한 개발되었다. 이들 PTDs 또는 신호펩티드 시퀀스(signal peptide sequences)들은 15 내지 30개의 아미노산들의 자연적으로 발생하는 폴리펩티드들이며, 이들은 일반적으로 상기 세포들 내에서 단백질 분비를 매개한다. 이들은 양으로 하전된 아미노 말단, 중앙의 소수성 코어(hydrophobic core) 및 신호펩티다아제에 의해 인지되는 카르복실 말단 절단부위로 구성된다. 이러한 막-전달 펩티드의 예에는 트로이안 펩티드(Trojan peptides), 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-1 전사활성자(transcriptional activator; TAT) 단백질 또는 그의 기능적 도메인 펩티드 및 드로소필리아 항상성 전사 인자(Drosophilia homeotic transcription factor) 안테나페디아(Antennapedia; Antp) 및 단순포진바이러스(herpes simplex virus) DNA-결합 단백질, VP22 등과 같은 수송 단백질로부터 유도되는 단백질전달물질들을 포함하는 다른 펩티드들이 포함된다. 일부 상용적으로 획득가능한 펩티드들, 예를 들어 페네트라틴 1(penetratin 1), Pep-1(미합중국 캘리포니아주 액티브 모티프 인코포레이티드(Active Motif Inc.)의 채리어트 시약(Chariot reagent)) 및 HIV GP41 단편(519-541)들이 단백질 전달을 위하여 사용될 수 있다.
최근, 관심대상인 단백질과 착화되고 단백질의 세포들 내로 전달을 촉진할 수 있는 지질 리포좀 등의 사용이 또한 입증되었다. 바이오포터(BioPORTER; 젠 테라피 시스템즈(Gene Therapy Systems)) 또는 프로벡틴(ProVectin; 미합중국 캘리포니아주 샌디애고의 임제넥스(Imgenex)) 등과 같은 상용적으로 획득가능한 제품들이 사용될 수 있다.
상기 방법들은 본 발명의 관점을 제한하는 것은 아니고, 당해 기술분야의 숙련된 자는 생체 내 또는 시험관 내에서 세포들에 단백질을 전달하기 위한 임의의 다른 공지된 적절한 방법들을 용이하게 사용할 수 있다는 점이 이해되어야 한다.
선택적으로, Myc족 단백질 및 Klf족 단백질 활성을 모방하는 생물학적 또는 화학적 화합물들이 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 유도하는 데 사용될 수 있다. 특정의 구체예에 있어서, 이러한 생물학적 또는 화학적 화합물들은 c-Myc 및 Klf4 단백질 활성을 모방한다.
따라서, 본 발명은 또한 체세포들을 Myc족 단백질을 모방하는 생물학적 또는 화학적 화합물 및 Klf족 단백질을 모방하는 생물학적 또는 화학적 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정의 구체예에 있어서, 상기 방법은 체세포들을 Myc족 단백질을 모방하는 생물학적 또는 화학적 화합물 및 Klf족 단백질을 모방하는 생물학적 또는 화학적 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 시험관 내에서 유도하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 파울론 구조 분류(paullones structural class)에 속하는 화학적 화합물이 문헌 [Lyssiotis et al. 2010]에 기술된 바와 같이 Klf4를 대체하여 사용될 수 있다.
하나의 구체예에 있어서, 파울론 구조 분류에 속하는 이러한 화학적 화합물들은 국제특허출원 제WO99/65910호에 기술되었으며, 이는 하기의 구조식을 갖는다:
Figure pct00001
여기서, A는 단일 또는 이중결합에 의해 우측에 결합된 산소 또는 황이고; R2는 수소, 아릴, 저급 지방족 치환체, 특히 알킬 및 저급 알킬에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고; R4 내지 R7은 독립적으로 알콕시, 아미노, 아실, 지방족 치환체, 특히 알킬, 알케닐 및 알키닐 치환체, 지방족 알코올, 특히 알킬알코올, 지방족 니트릴, 특히 알킬니트릴, 시아노, 니트로, 카르복실, 할로겐, 수소, 히드록실, 이미노 및 α, β 불포화 케톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고; R8 내지 R11은 독립적으로 지방족 치환체, 특히 알킬, 알케닐 및 알키닐 치환체, 특히 저급 지방족 치환체, 지방족 알코올, 특히 알킬알코올, 알콕시, 아실, 시아노, 니트로, 에폭시, 할로알킬기, 할로겐, 수소 및 히드록실로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고; R12는 지방족기, 특히 저급 알킬기, 지방족 알코올, 특히 알킬알코올, 카르복실산 및 수소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
특정의 구체예에 있어서, 파울론 구조 분류에 속하는 상기 화학적 화합물은 하기의 구조식을 갖는 켄파울론(kenpaullone) 또는 9-브로모-7,12-디히드로-인돌로[3,2-d][1]벤즈아제핀-6(5H)-온이다:
Figure pct00002
선택적으로, 또한 문헌 [Lyssiotis et al. 2010]에 기술된 바와 같은 플라본 및 라이세르가미드(lysergamide)와 같은 다른 화학적 구조 화합물들이 Klf4의 대체로 사용될 수 있다.
따라서, 다른 구체예에 있어서, 플라본 구조 분류에 속하는 화학적 화합물이 Klf4의 대체로 사용될 수 있다.
특정의 구체예에 있어서, 상기 플라본 구조 분류에 속하는 상기 화학적 화합물은 하기의 구조식을 갖는 7-히드록시플라본이다:
Figure pct00003
또다른 구체예에 있어서, 라이세르가미드 구조 분류에 속하는 화학적 화합물이 Klf4의 대체로 사용될 수 있다.
특정의 구체예에 있어서, 상기 라이세르가미드 구조 분류에 속하는 상기 화학적 화합물은 하기의 구조식을 갖는 라이세르긴산에틸아미드(lysergic acid ethylamide)이다:
Figure pct00004
또다른 구체예에 있어서, Wnt 신호경로(Wnt pathway signaling)를 활성화시키는 생물학적 또는 화학적 화합물이 c-Myc의 대체로 사용될 수 있다.
따라서, 하나의 구체예에 있어서, 상기 Wnt 신호경로를 활성화시키는 상기 화학적 화합물은 Wnt 작용물질(agonist)이 될 수 있다.
특정의 구체예에 있어서, 상기 Wnt 작용물질은 문헌 [Marson et al. 2009] 및 국제특허출원 제WO2009/032194호에 기술된 바와 같은 단백질 Wnt3a이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Wnt 작용물질은 하기의 구조식을 갖는 문헌 [Wang et al. 2009] 및 국제특허출원 제WO2010/056907호에 기술된 바와 같은 5-티오펜피리미딘 분류에 속하는 화학적 화합물이다:
Figure pct00005
여기서, R1은 수소, 탄소수 1 내지 6의 알킬로부터 선택되는 것이고; R2는 탄소수 1 내지 6의 알킬 및 X1NR4R5로부터 선택되는 것이고; 여기에서 X1은 탄소수 1 내지 4의 알킬렌이고; R4 및 R5는 독립적으로 수소 및 탄소수 1 내지 4의 알킬로부터 선택되는 것이거나; 또는 R4 및 R5는 함께 이들 둘이 부착되는 질소 및 선택적으로 O, S 및 N으로부터 선택되는 다른 헤테로원자들과 함께 1 내지 2개의 헤테로원자들을 포함하는 6원 헤테로고리를 형성하거나; 또는 R1 및 R2는 함께 이들 둘이 부착되는 질소 및 선택적으로 O, S 및 N으로부터 선택되는 다른 헤테로원자들과 함께 1 내지 2개의 헤테로원자들을 포함하는 6원 헤테로고리를 형성하고; 여기서 R1 및 R2 또는 R4 및 R5로부터 형성되는 상기 헤테로고리는 선택적으로 탄소수 1 내지 4의 알킬로 치환될 수 있고; R3은 수소, 할로겐, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 할로겐 치환된 탄소수 1 내지 4의 알킬, 탄소수 1 내지 4의 알콕시 및 할로겐 치환된 탄소수 1 내지 4의 알콕시로부터 선택되는 것이다.
특정의 구체예에 있어서, 5-티오펜피리미딘 분류에 속하는 상기 화학적 화합물은 하기의 구조식을 갖는 2-클로로-N-(2-모르폴리노에틸)-4-(4-(티오펜-2-일)피리미딘-2-일아미노)벤즈아미드이다:
Figure pct00006
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Wnt 작용물질은 문헌 [Wang et al. 2009]에 기술된 바와 같은 아미노피리딘 분류에 속하는 화학적 화합물이다.
또다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Wnt 작용물질은 문헌 [Wang et al. 2009]에 기술된 바와 같은 인디루빈 구조 분류(indirubin structural class)에 속하는 화학적 화합물이다.
따라서, 상기 인디루빈 분류에 속하는 이러한 화학적 화합물은 국제특허출원 제WO2005/041954호에 기술된 것이다. 이러한 화합물들은 상기 인디루빈 분자의 탄소 6번 위치에서 할로겐으로 치환된 인디루빈 분자를 포함한다.
특정의 구체예에 있어서, 상기 인디루빈 구조 분류에 속하는 상기 화합물은 하기의 구조식을 갖는 6-브로모인디루빈-3'-옥심("BIO")이다:
Figure pct00007
사용될 수 있는 다른 치환된 인디루빈들은 국제특허출원 제WO2007/099402호에 기술된 바와 같은 3'-,7-치환 인디루빈 또는 국제특허출원 제WO2010/013168호에 기술된 바와 같은 3'-,6-치환 인디루빈이다.
다른 구체예에 있어서, 상기 Wnt 신호경로를 활성화시키는 화학적 화합물은 글리코겐 신타아제 키나아제 3(GSK3; glycogen synthase kinase) 억제제일 수 있다.
GSK3 억제제에 대한 참조들은 하나 이상의 GSK3 효소들의 억제를 의미한다. 상기 GSK3 효소들의 족들은 당해 기술분야에서 잘 알려진 것이다. 특정의 구체예들에 있어서, GSK3-β가 억제된다. GSK3α 억제제들이 또한 적절하며, 일반적으로 본 발명에서 사용되기 위한 억제제들은 둘 다를 억제한다. 다양한 GSK3 억제제들이 공지되어 있으며, 그 예들로는 억제제 CHIR 98014, AR-AO144-18, TDZD-8, SB216763 및 SB415286이 있다. 다른 억제제들이 공지되어 있으며, 본 발명에서 유용하다. 또한, GSK3-β의 활성 부위의 구조가 특정되어 있으며, 특이적 및 비-특이적 억제제들에 작용하는 핵심 잔기(key residues)들이 동정되었다(문헌 Bertrand et al. 2003). 이러한 구조적 특정화는 별도의 GSK 억제제들이 쉽게 동정되도록 하는 것을 허용한다.
특정의 구체예에 있어서, 상기 GSK3 억제제는 하기의 구조식을 갖는 6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸아미노)니코티노니트릴(CHIR99021)이다:
Figure pct00008
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 GSK3 억제제는 문헌 [Zhang et al. 2007]에 기술된 바와 같은 2,6,9-삼치환 퓨린이다.
특정의 구체예에 있어서, 상기 2,6,9-삼치환 퓨린은 하기의 구조식을 갖는 (S)-2-(9-(비페닐-4-일메틸)-2-(2,3-디히드로-1H-인덴-5-일옥시)-9H-퓨린-6-일아미노)-3-페닐프로판-1-올(QS11)이다:
Figure pct00009
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 GSK3 억제제는 문헌 [Zhong et al. 2009]에 기술된 바와 같은 벤조[e]이소인돌-1,3-디온이다.
특정의 구체예에 있어서, 상기 벤조[e]이소인돌-1,3-디온은 하기의 구조식을 갖는 5-에틸-7,8-디메톡시-1H-피롤로[3,4-c]-이소퀴놀린-1,3-(2H)-디온(3F8)이다:
Figure pct00010
선택적으로, Myc족 유전자 및 Klf족 유전자의 발현을 활성화시키는 생물학적 또는 화학적 화합물들은 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 유도하기 위하여 사용될 수 있다. 특정의 구체예에 있어서, 이러한 생물학적 또는 화학적 화합물들은 c-Myc 및 Klf4 유전자들의 발현을 유도한다.
따라서, 신호전달자 및 전사의 활성자 3(STAT3: signal transducer and activator of transcription 3)의 의 활성자가 문헌 [Hall et al. 2009]에 기술된 바와 같은 Klf4 발현을 강화시키기 위하여 사용될 수 있다. STAT3의 활성자의 하나의 예는 사이토카인 류케미아 억제인자(LIF; leukaemia inhibitory factor)이다.
본 발명의 다른 관점은 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 유도하기 위한 Myc족 구성원(유전자 또는 단백질) 및 Klf족 구성원(유전자 또는 단백질)의 용도에 관한 것이다.
특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 구성원은 c-Myc이고 상기 Klf족 구성원은 Klf4이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 c-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf2이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 c-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf5이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 N-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf4이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 N-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf2이다.
또다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 N-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf5이다.
앞서 언급한 바와 같이, 그를 위하여 상기 발현이 활성화되는 상기 Klf족 유전자는 연관된 기능적으로 분화된 체세포들에 따라 선택될 수 있다.
본 발명의 또다른 관점은 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재상을 유도하기 위한 방법에서 사용되기 위한 Myc족 구성원(유전자 또는 단백질)과 Klf족 구성원(유전자 또는 단백질)의 조합에 관한 것이다.
특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 구성원은 c-Myc이고 상기 Klf족 구성원은 Klf4이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 c-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf2이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 c-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf5이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 N-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf4이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 N-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf2이다.
또다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 N-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf5이다.
앞서 언급한 바와 같이, 그를 위하여 상기 발현이 활성화되는 상기 Klf족 유전자는 연관된 기능적으로 분화된 체세포들에 따라 선택될 수 있다.
본 발명의 또다른 관점은 기능적으로 분화된 체세포들의 연장된 자기재생을 유도하기 위한 방법에서 사용하기 위한 Myc족 구성원(유전자 또는 단백질) 및 Klf족 구성원(유전자 또는 단백질)을 포함하는 키트에 관한 것이다.
특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 구성원은 c-Myc이고 상기 Klf족 구성원은 Klf4이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 c-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf2이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 c-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf5이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 N-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf4이다.
다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 N-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf2이다.
또다른 특정의 구체예에 있어서, 상기 Myc족 유전자는 N-Myc이고 상기 Klf족 유전자는 Klf5이다.
앞서 언급한 바와 같이, 그를 위하여 상기 발현이 활성화되는 상기 Klf족 유전자는 연관된 기능적으로 분화된 체세포들에 따라 선택될 수 있다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 상기 방법들에 따라 수득가능한 기능적으로 분화된 체세포들의 집단에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 상기 방법들에 따라 수득된 기능적으로 분화된 체세포들의 집단에 관한 것이다.
본 발명의 방법들에 따라 수득된 기능적으로 분화된 체세포들은 시험관 내에서 용이하게 그리고 효과적으로 생산될 수 있다. 시험관 내에서 기능적으로 분화된 체세포들을 다수 수득할 수 있는 능력은 치료분야에서 새로운 기회를 열어준다. 앞서 언급한 바와 같이, c-Myc 및 Klf들 둘 다 발암유전자라는 사실에도 불구하고, 상기 시험관 내 기능적으로 분화된 체세포들은 이식 이후 6개월까지 분석된 바에 따라 마우스에서 발암성이 아님을 더욱 주의하여야 한다.
더욱이, 본 발명의 기능적으로 분화된 체세포들은 더욱 유전적으로 가공되어 상기 체세포들이 대상의 치료학적 핵산을 발현하도록 하며, 이는 관심대상인 단백질을 인코딩한다. 관심대상인 적절한 유전자에는 성장인자들이 포함된다.
예를 들어, 본 발명의 세포들은 대상체로 유전적으로 가공된 세포들의 이식에 의하여 이로운 유전자 생성물들을 생성하도록 유전적으로 가공될 수 있다. 이러한 유전자 생성물들에는 항-염증 인자, 예를 들어 항-TNF, 항-IL-1, 항-IL-6, 항-IL-2 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더욱이 유전적 질병을 앓는 환자로부터의 증폭된, 기능적으로 분화된 체세포들이 질병 증후군(disease symptoms)들을 치료하거나 또는 완화하는데 유용한 약물들을 동정하기 위한 약제학적 스크리닝용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 기능적으로 분화된 체세포들은 또한 상기 세포들이 재이식되기 이전에 유전적 결함을 바로잡도록 유전적으로 더욱 가공될 수 있다.
선택적으로, 마크로파지 등과 같은 본 발명의 기능적으로 분화된 체세포들은 표적 세포에서의 유전적 결함을 바로잡도록 하거나 또는 치료학적 화합물들을 산출하도록 다른 기능적으로 분화된 체세포들과 융합될 수 있다.
실제로, 마크로파지가 심근세포(cardiac muscle cells) 또는 간세포와 융합되는 것으로 나타났으며, 문헌들 [Camargo et al., 2003; Camargo et al., 2004 및 Willenbring et al., 2004]에 기술된 바와 같이 이들 세포들 내에서의 유전적 결함을 바로잡을 수 있다. 예를 들어, 마크로파지 등과 같은 본 발명의 세포들은 이에 따라 유전적 장애에서 돌연변이된 유전자들의 정상 또는 과활성(hyperactive)의 변종들의 다중 또는 단일의 사본들을 발현하도록 또한 가공될 수 있다. 예에는 간 내에서의 효소 결핍증(enzyme deficiencies) 또는 뒤시엔느 근위축증(Duchenne muscular dystrophy)에서의 디스트로핀(dystrophin)들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명은 또한 이식 이후 생체 내에서 표적 세포와 융합하는 증폭된, 기능적으로 분화된 체세포들, 특히 마크로파지의 용도에 관한 것이다.
특정의 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 상기 융합된 세포는 뒤시엔느 근위축증을 앓는 환자로부터 수득된 마크로파지의 융합으로부터 발생되고, 이식 이후 동일한 환자로부터의 골격근 세포(skeletal muscle cells)들과 함께 유전적으로 변성되어 야생형(WT) 디스트로핀을 발현하도록 하는 세포이다.
따라서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 조합하여 앞서 정의한 바와 같은 기능적으로 분화된 체세포들을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정의 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 방법들은 기능적으로 분화된 체세포들의 실질적으로 균질한 집단을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 균질한 집단(substantially homogeneous population)"은 세포들의 총 수의 대부분(예를 들어, 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 더 바람직하게는 적어도 약 95%)이 관심대상인 완전분화된 체세포들의 특이적 특성들을 갖는 세포들의 집단을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제"는 본 발명의 상기 기능적으로 분화된 체세포들의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않고, 투여되는 농도에서 숙주에 과도하게 독성이지 않은 담체 매질을 의미한다. 적절한 약학적으로 수요가능한 담체들 또는 부형제들의 예들에는 물, 염수(예를 들어, 링거액), 알코올, 오일, 젤라틴, 탄수화물(예를 들어, 락토오즈, 아밀라제 또는 녹말), 지방산에스테르, 히드록시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤린이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 약학 조성물들은 액체, 반-액체(예를 들어, 젤) 또는 고체(예를 들어, 매트릭스, 격자, 스캐폴드 등)로 제형화될 수 있다. 원하는 경우, 상기 약학 조성물은 멸균될 수 있다.
특정의 구체예들에 있어서, 약학 조성물은 하나 이상의 생물학적으로 활성인 물질 또는 생활성 인자를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적으로 활성인 물질 또는 생활성 인자"는 본 발명의 약학 조성물 내에서의 그의 존재가 상기 조성물을 받아들이는(수용하는) 대상체에 이로운 임의의 분자 또는 화합물을 의미한다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 인식될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실제에서 사용하기에 적절한 생물학적으로 활성인 물질들 또는 생활성 인자들은 다양한 족들의 생활성 분자들 및 화합물들에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 유용한 생물학적으로 활성인 물질 또는 생활성 인자는 항염증제, 항세포사멸제(anti-apoptotic agents), 면역억제제 또는 면역조절제, 항산화제, 성장인자 및 약물들로부터 선택될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 기능적으로 분화된 체세포들의 상기 집단은 또한 다른 용도들을 갖는다. 이들 용도들에는 상처 또는 병적 측면을 모델링하고 그리고 화합물들을 스크리닝하기 위한 용도들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 기능적으로 분화된 체세포들의 상기 집단은 또한 다양한 시험관 내 및 생체 내 시험들에서 사용될 수 있다. 특히, 그러나 비제한적으로 방법으로, 이들은 약제학적 후보 화합물들 등과 같은 화합물들의 독성의 평가에서의 용도를 발견한다.
본 발명을 이하의 실시예들에 의하여 더욱 설명할 것이다. 그러나, 이들 실시예들은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안될 것이다.
실시예 1: MAF - DKO 마크로파지와 야생형( WT ) 마크로파지의 자기재생
하기에 보고된 결과들은 본 명세서에서 그 전체로서 참조로 인용되는 과학 기사(Aziz et al. 2009)에 제공되었다.
재료 및 방법:
마우스: 죽어가는 또는 갓 태어난 MafB 및 c-Maf 결핍 마우스들, 본 발명자들은 문헌 Aziz et al. 2006에 기술된 바와 같이 연령 및 성별을 매칭한 Ly5.1 수용체들을 야생형 또는 Maf-DKO E14.5 Ly5.2 태아 간세포들로 재구축함으로써, Maf-DKO 조혈계(hematopoietic system)를 갖는 마우스들을 생성하였다.
세포들 및 배지: Maf-DKO 마크로파지들을 L-929 세포 조건화된 IMDM/0.5%FCS 배지(LCM)를 포함하는 10 내지 50ng/㎖ rM-CSF(프리프로텍(Preprotec)) 또는 20% M-CSF로 보충된 DMEM/10%FCS(인비트로겐(Invitrogen)) 내에서 2일마다 부분적인 배지 교환을 하면서 4일마다 통과시켰다. 100ng/㎖ rM-CSF, IL-3 또는 GM-CSF(프리프로텍)로 보충된 메쏘컬트-3234(Methocult-3234; 스템셀 테크놀로지스(Stem Cell Technologies)) 또는 완전 사이토카인 믹스(complete cytokine mix)를 포함하는 메쏘컬트-3434를 이용하여, 콜로니 분석을 수행하였다. 헤파린처리된(heparinized) 미세모세혈(microcapillary blood) 수집 및 적혈구 용해(BD) 이후 림포라이트 맘마리안®(Lympholyte Mammlian®; 테부-바이오텍(TeBU-Biotech))을 사용하여 밀도구배 원심분리(density gradient centrifugation)에 의해 백혈구들을 풍부화(enriched)시켰다. F4/80 오토맥스™(autoMACS™)에 의하여 간세포 현탁액들로부터 쿠퍼세포(kupffer cells)들을 풍부화시켰다. 문헌 [Aziz et al. 2006]에 기술된 바와 같이 PBS/0.2%BSA/2mM EDTA 내에서 FACS 항체 염색을 수행하였다. 아치사 조사된(sub-lethally irradiated)(450Gy) Ly5.1 수용체에 정맥내 주사(IV injection)하기 이전에 Maf-DKO 마크로파지(107 세포/㎖)들을 2.5μM CFSE로 표지화시켰다.
분석: 37℃에서 세포 배양물 또는 전혈의 5μM BrdU에 의한 표지화 1시간 후, 비알디유-유세포분석기®(BrdU-flowcytometry®(BD))에 의해 세포 주기 분석을 수행하였다. 문헌 [Aziz et al. 2006]에 기술된 바와 같이 또는 GFP-발현 살모넬라(Salmonella) NPCC1202323에 의해, 식세포작용(phagocytosis) 및 NO 분석을 수행하였다. 카리오맥스®콜세미드®(KaryoMAX®Colcemid®) 용액(인비트로겐) 및 중기 크로모좀 스프레드(metaphase chromosome spreads)의 DAPI 염색에 의해, 카리오타입 분석(karyotype analysis)을 수행하였다. RNA를 단리시키고, 문헌 [Aziz et al. 2006]에 기술된 바와 같이 정량적 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행하였다. 파라포름알데히드 고정 동결 조직들을 항-F4/80(스크로텍(Scrotec); MCA497A647) 또는 항-Moma-1(BMA; T-2021)/스트렙타비딘-알렉사546(인비트로겐; S11225) 항체들로 염색시키고, Zeiss LSM510 공초점 현미경으로 분석하였다. 항-c-Myc(N-262; 산타크루즈-764(SantaCruz-764), 항-Klf4(H-180; 산타크루즈-20691) 및 항-β-튜블린-I(시그마(Sigma); T-7816) 항체들을 사용하여, 문헌 [Aziz et al. 2006]에 기술된 바와 같이 면역블롯을 수행하였다. 기술된 바와 같이(문헌 Aziz et al. 2006), PBS/0.2%BSA/2mM EDTA 내에서 FACS 항체 염색을 수행하였다. FACS캘리버(FACSCalibur), FACS칸토(FACSCanto) 또는 LSRII 상에서 세포들을 분석하였으며, FACS아리아(FACSAria) 상에서 디바™(DIVA™)(벡톤 디킨슨(Becton-Dickinson)) 또는 플로우조™(FlowJo™) 소프트웨어를 사용하여 분류하였다.
shRNA 바이러스: 'RNAi-Codex' 소프트웨어(http://codex.cshl.edu/scripts/newmain.pl)을 사용하여 shRNA 시퀀스들을 결정하였으며, LMP-GFP 바이러스(문헌 Paddison et al., 2004에 기술된 바와 같은 오픈 바이오시스템즈(Open Biosystems) 내로 클론시켰다. 피닉스이(PhoenixE) 세포들(www.stanford.edu/group/nolan)에 의해 생성된 바이러스에 의해, Maf-DKO 마크로파지 또는 NIH3T3을 감염시켰다. 모든 에러바(error bars)들은 평균의 표준 오차(SEM; standard error of the mean)를 나타낸다.
결과:
4개의 전사인자 Oct-4, Sox-2, KLF4 및 c-Myc에 의하여 분화된 세포들을 줄기세포들 내로 재프로그래밍시켰으며, 이들 중 후자의 2개는 ES 세포 자기재생에 있어서의 그들의 역할에 기초하여 연장된 증식 능력을 부여하는 것으로 제안되었다. KLF4 및 c-Myc는 또한 각각 단구성 분화 및 증식을 매개할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 Maf-DKO 마크로파지들의 입증된 연장된 증식 능력에서의 그들의 역할을 조사하였다(국제특허공개 제WO2008/084069호 참조). 본 발명자들은 야생형 대조군에 비하여 Maf-DKO 마크로파지들이 KLF4 및 c-Myc 둘 다의 발현의 강한 상향-조절(up-regulation)을 나타내지만, 만능 인자(pluripotency factors)들 Sox2, Oct3/4 또는 나노그(nanog)들은 그러하지 않다는 것을 관찰하였다. KLF4 및 c-Myc가 M-CSF 결핍 세포(starved cells)들 내에서의 M-CSF 자극의 2시간 이내에 강하게 발현되고, 72시간의 관측시간 동안 유의적으로 높은 발현 수준을 유지하였다.
c-Myc 및 KLF4는 문헌 [Rowland et al. 2006] 및 문헌 [Adhikary et al. 2005]에 기술된 바와 같은 특정의 문맥 내에서 둘 다 발암유전자로서 작용할 수 있다. Maf-DKO 단핵구들을 과발현하는 c-Myc 및 KLF4의 연장된 증식능이 발암성의 형질전환과 연관되는지 여부를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 생체 내에서의 MafB/cMaf 결핍의 장기간 효과들을 분석하였다. 흥미롭게도, Maf-DKO 조혈계를 갖는 골수 키메라(bone marrow chimeras)들은 재구성 이후 1년 동안에 걸쳐 백혈병 또는 골수-증식성 질병(myelo-proliferative disease)의 징후를 나타내지 않았다. 더욱이, Maf-DKO 마크로파지들은 장기간의 생체 외 확장을 통해 정상적인 수의 염색체들을 유지하였으며, 주입 경로에 무관하게 그리고 생체 내에서의 세포들의 분화능력에도 불구하고, 선천성의(syngeneic) 또는 면역-악화된(immuno-compromised) 누드마우스로의 이식에 따라 종양들을 발생시키지 않았다. 그에 비해, 동일한 조건하에서, 뮤린 마크로파지 세포주 J774.1은 수일 이내에 거대한 종양들을 유도하였으며, 4주 내에 100%의 치사율을 야기하였다. 종양들을 형성하기보다는, 이식된 Maf-DKO 마크로파지들은 다중 조직들 내에서 정상적인 마크로파지 위치로 회귀하는 것으로 나타났다. 따라서, Maf-DKO 세포들은 골수, 복막, 비장의 적비수(red pulp)와 대역(marginal zone)의 마크로파지들에 기여하고, 간의 쿠퍼세포에 기여하였다. 이러한 결과들은, 확장된 Maf-DKO 단핵구들이 형질전환되지 않았지만 생체 내에서 생체항상성 제어(homeostatic control)를 받고 정상 조직 구조로 통합되는 마크로파지들을 발생하게 할 수 있음을 나타낸다.
이들 변화들의 기능적 결과를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 RNA 및 단백질 수준에서 내생의 그리고 형질주입된 표적 유전자의 발현 모두를 특이적으로 감소시킬 수 있는 KLF4 또는 c-Myc에 대한 shRNA 레트로바이러스 벡터들을 제조하였다. shRNA 시퀀스들을 코딩하지 않거나 또는 제어하기 위한 GFP-발현 레트로바이러스에 의해 형질주입된 Maf-DKO 마크로파지들은, 감염되지 않은 세포들과 동일한 크기 및 모폴러지의 메쏘컬트 분석에서 GFP+ 콜로니들을 생성하였다. 대조적으로, KLF4 또는 c-Myc shRNA를 발현하는 GFP-레트로바이러스에 의해 감염된 세포들은, 일련의 재-도말(re-plating)을 통해 증식될 수 없는 20개 미만의 세포들의 작은 GFP+ 세포 클러스터들만을 생성하였다. 동일한 도말로부터의 비-감염된 GFP- 콜로니의 내부 대조군은, 동일한 조건하에서 동일한 모폴러지, 빈도 및 재-도말 거동(re-plating behavior)을 나타내었다. 더욱이, 본 발명자들은 c-Myc 및 KLF4의 레트로바이러스 과발현이 야생형 마크로파지에서의 연장된 자기재생 능력을 유도하기에 충분하지만 발암성의 형질전환은 유도하지 않았다는 점을 관찰하였다. 반면, c-Myc만으로 감염된 마크로파지 클론은 이식된 누드마우스에서 거대한 종양들을 유도하였으며, 상기 수용체들의 빠른 사망을 유발하였으며, c-Myc/KLF4 감염된 마크로파지 클론은 MafB/c-Maf 결핍 마크로파지 클론들과 유사하게 그러하지 않았다. 이러한 결과들은 KLF-4 및 c-Myc 모두의 발현 증가가 마크로파지들의 연장된 증식 능력을 가능하게 하는 필요충분조건이라는 점을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 결과들은 기능성의 손상 또는 발암성의 형질전환 없이 충분히 분화된 세포들의 장기간의 확장이 가능하다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, 이는 체세포들을 만능줄기세포들(iPS)로 재프로그램할 수 있는 전사인자의 그룹에 속하는 c-Myc 및 KLF4를 요구한다. 비록 만능에 대해 요구되지는 않으나 c-Myc 및 KLF4들은 연장된 증식을 매개하도록 제안되었으며, 이는 ES 세포 자기재생에 중요하다. 문헌 [Rowland et al. 2006] 및 문헌 [Adhikary et al. 2005]에 기술된 바와 같이 c-Myc 및 KLF4가 개별적으로 발암유전자들로서 작용할 수 있다고 가정한다면, Maf-DKO 마크로파지들의 비-발암성(non-tumorigenicity)은 흥미롭다. 특히, c-Myc는 악성적으로 마크로파지들을 형질전환할 수 있고, iPS 유도 마우스에서 종양들을 유도할 수 있다. 그러나, c-Myc만을 발현하는 마크로파지들과는 대조적으로 c-Myc 및 KLF-4 둘 다를 발현하는 마크로파지들이 발암성이 아니었던 것으로 관측된 바와 같이, KLF4의 공-발현은 c-Myc의 발암 잠재능을 억제하는 것으로 나타난다. 그러나, Maf-DKO 내의 c-Myc 및 KLF4의 제어되고 합동의 상향-조절은 세포 주기 제어에서의 상기 인자들의 부분적 길항 활성의 미세-조정된 평형(fine-tuned counter-balance)을 보장함으로써 악성종양을 방지할 수 있다. 본 발명의 결과들은, c-Myc 및 KLF4의 조절된 활성화에 의존하는 메카니즘에 의해 만능 또는 다능의 줄기세포 중간체들을 통하지 않고 완전분화된 세포들의 연장된 증폭이 달성될 수 있음을 나타낸다. 이러한 발견들은 조직 재생에서의 세포치료법에 대한 전망을 열 수 있다.
실시예 2: 야생형 B림프구들의 자기재생
재료 및 방법:
세포 및 배지: 정상의 야생형 C57/B16 마우스의 골수를 2일 동안 IMDM, 4% FBS, 50ng/㎖ SCF, 50ng/㎖ Flt3, 10ng/㎖ IL6, 10ng/㎖ IL7 및 140μ 베타-메르캅토에탄올에서 자극시켰으며, 형질주입된 pNXe 포장 세포주의 상청액에 의한 공배양에 의해 공(empty), c-Myc 단독, KLF4 단독 또는 두 c-Myc 및 KLF4 발현 레트로바이러스로 감염시킨 후, IL-7 포함 메쏘컬트-3630(Methocult-3630; 스템셀 테크놀로지스) 내에서 125,000 세포/㎖로 도말시켰다. 분화의 8일 후, 세포들을 반고체 배지로부터 세척하였으며, IL-7 포함 메쏘컬트-3630 내에서 ㎖ 당 100,000 세포들로 재도말시켰으며, 연속적으로 다양한 세포 농도들에서 재도말시켜 생성되는 콜로니들의 카운팅을 용이하게 하였다. 각 경우에, 카운팅 및 재도말은 배양 8일 후에 수행하였다.
분석: 4번째의 재도말 이후, 모든 세포들을 PBS에서 반복되는 세척에 의하여 반고체 배지로부터 세척해냈다. 기술된 바와 같이(문헌 Aziz et al., 2006), PBS/0.2%BSA/2mM EDTA에서 FACS 항체 염색을 수행하였다. FACS캘리버, FACS칸토 또는 LSRII 상에서 세포들을 분석하였으며, FACS아리아 상에서 디바™(벡톤 디킨슨) 또는 플로우조™ 소프트웨어를 사용하여 분류하였다.
결과:
KLF4 및 c-Myc가 또한 다른 세포 형태들에서 자기재생을 유도할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 KLF4 및 c-Myc를 야생형 B-세포에서 레트로바이러스적으로 발현시켰다. 실제로, 본 발명자들은 c-Myc 및 KLF4가 적어도 4회(4 rounds) 동안 B-세포들의 연속적인 재-도말 능력을 가능하게 하였으며, 반면에 대조군 바이러스 감염된 세포들은 재도말될 수 없다는 것을 관측하였다. 마크로파지들과 유사하게 c-Myc 단독 감염된 B-세포들은 또한 초기에는 콜로니들을 생성하였으나, 3회 이후에는 재도말될 수 없었으며, 이는 아마도 c-Myc가 세포자살을 유도하기 때문으로 여겨지며, 이는 다시 c-Myc 및 KLF4의 결합된 작용이 자기재생을 가능하게 하는데 필요한 것임을 나타낸다.
실시예 3: 적혈구 세포(erytroid cell)의 자기재생
재료 및 방법:
ROSA26-rtTA 이형접합자 골수(heterozygous bone marrow)의 MACS 결핍된 계대의 음성 세포(MACS depleted lineage negative cells)들을 IMDM, 4% FBS, 50ng/㎖ SCF, 50ng/㎖ Flt3, 10ng/㎖ IL11, 10ng/㎖ IL7 및 140μ 베타-메르캅토에탄올 내에서 유지시켰다. 계속해서 상기 세포들을 둥근 바닥의 96-웰 플레이트 내에 50,000 세포들의 밀도로 접종시켰다. 이들을 4㎍/㎖ 폴리브렌의 존재하에서 24시간 동안 MOI 40에서 Klf4 또는 c-Myc를 발현하는 독시사이클린-유발성 벡터를 운반하는 농축된 렌티바이러스로 감염시켰다. 적아세포(erythroblasts)들을 검출하기 위하여, 1㎍/㎖의 독시사이클린 및 50ng/㎖의 rEPO(시그마)의 존재하에서 이중으로 메쏘컬트 엠3231(Methocult M3231)에서 콜로니 분석을 수행하였다.
결과:
다른 세포 유형들 내에서 KLF4 및 c-Myc가 또한 자기재생을 유도할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 또한 ROSA26 위치에서 rTA-녹크인(knockin)을 위한 골수 이형접합자의 조혈세포들을 Klf4 또는 c-Myc를 발현하는 독시사이클린-유발성의 벡터 또는 대조 벡터를 운반하는 것을 포함하는 유도가능 KLF4 및 c-Myc로 감염시켰다. 예비 데이터는 또한 결합된 c-Myc 및 KLF4 발현이 또한 적혈구 세포들의 확장의 증가를 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
참고문헌:
본 출원 전반에 걸쳐서, 여러 참조문헌들이 본 발명이 속하는 기술 분야의 상태를 기술하고 있다. 이들 문헌들의 이러한 기술들은 본 발명의 개시내용에 참조로 인용된다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013

Claims (25)

  1. 체세포 내에서 Myc족 유전자 및 Klf족 유전자의 발현을 활성화시키는 단계를 포함하는, 기능적으로 분화된 체세포의 연장된 자기재생을 유도하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    Myc족 유전자를 인코딩하는 벡터 및/또는 Myc족 유전자가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제5항에 있어서,
    상기 벡터가 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제6항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제7항에 있어서,
    상기 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 체세포를 Myc족 단백질 및 Klf족 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 기능적으로 분화된 체세포의 자기재생을 연장하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Myc족 유전자 또는 단백질이 c-Myc인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Klf족 유전자 또는 단백질이 Klf4인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Myc족 유전자 또는 단백질이 c-Myc이고, 상기 Klf족 유전자 또는 단백질이 Klf4인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기능적으로 분화된 체세포가 표피세포, 상피세포, 각질세포, 신경세포, 신경교질세포, 연골세포, 췌장 내분비 세포, 간세포, 내피세포, 조혈세포(적혈구, 림프구, 단핵구, 마크로파지 및 수지상 세포를 포함함), 심근세포 및 다른 근세포, 조골세포 및 용골세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 또는 제7항에 있어서,
    상기 체세포를 Myc족 단백질 및 Klf족 단백질 활성을 모방하는 생물학적 또는 화학적 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 생물학적 또는 화학적 화합물이 c-Myc 및 Klf4 단백질 활성을 모방하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    Klf4 단백질 활성을 모방하는 상기 화학적 화합물이 파울론 구조 분류에 속하는 화학적 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    c-Myc 단백질 활성을 모방하는 상기 생물학적 또는 화학적 화합물이 Wnt 신호경로를 활성화시키는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    Wnt 신호경로를 활성화시키는 상기 화학적 화합물이 5-티오펜피리미딘 분류에 속하는 화학적 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    Myc족 유전자 및 Klf족 유전자의 발현을 활성화시키는 생물학적 또는 화학적 화합물이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 생물학적 또는 화학적 화합물이 c-Myc 및 Klf4의 발현을 활성화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    c-Myc 및 Klf4의 발현을 활성화시키는 상기 생물학적 또는 화학적 화합물이 STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3)의 활성자인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 기능적으로 분화된 체세포의 연장된 자기재생을 유도하는 방법에 사용하기 위한, Myc족 구성원(유전자 또는 단백질) 및 Klf족 구성원(유전자 또는 단백질)의 조합물.
  21. 기능적으로 분화된 체세포의 연장된 자기재생을 유도하는 방법에 사용하기 위한, Myc족 구성원(유전자 또는 단백질) 및 Klf족 구성원(유전자 또는 단백질)을 포함하는 키트.
  22. 기능적으로 분화된 체세포의 연장된 자기재생을 유도하기 위한, Myc족 유전자 또는 단백질 및 Klf족 유전자 또는 단백질의 용도.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 Myc족 유전자 또는 단백질이 c-Myc이고 상기 Klf족 유전자 또는 단백질이 Klf4인 것을 특징으로 하는 용도.
  24. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한, 기능적으로 분화된 체세포의 집단.
  25. 제24항에 따른 기능적으로 분화된 체세포의 집단 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
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