ES2357627T3 - Células madre adultas inmortalizadas en forma condicional a largo plazo y métodos para hacer y utilizar tales células. - Google Patents

Abstract

Una célula madre adulta inmortalizada en forma condicional a largo plazo que comprende: a. una proteína recombinante codificada por un protooncogén o un fragmento biológicamente activo u homólogo de la proteína que promueve la supervivencia y proliferación de la célula, o una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la misma, en donde la expresión o la función de la proteína, fragmento u homólogo de la misma es inducible; y b. una proteína recombinante que inhibe la apoptosis de la célula madre, o una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína que inhibe la apoptosis de la célula madre.

Description

Campo de la invención

La presente invención se relaciona en general con células madre adultas inmortalizadas en forma condicional a largo plazo, con métodos para la producción de tales células, y con métodos para utilizar tales células, incluidos métodos terapéuticos y métodos para el descubrimiento de fármacos.

Antecedentes de la invención

La habilidad para manipular la producción de médula ósea de diferentes células sanguíneas se ha convertido en una herramienta importante en el manejo de diferentes enfermedades. Algunas de las mejores terapias nuevas para neoplasias malignas hematológicas se basan en el desarrollo de compuestos que empujan a las células leucémicas a diferenciarse en linajes a los cuales están comprometidos antes del evento de transformación. Uno de tales ejemplos es el caso de la leucemia promielocítica aguda. Después del tratamiento de los pacientes con Trióxido de Arsénico, las células malignas son empujadas a lo largo de la ruta mielomonocítica en que conduce a la remisión de esos tumores. Otro ejemplo se encuentra en la promoción de un injerto exitoso de células madre trasplantadas de médula ósea (células madre hematopoyéticas que se reconstituyen a largo plazo, o lt-HSC) en individuos irradiados. La apariencia de células sanguíneas diferenciadas puede acelerarse por medio de la administración sistémica de citoquinas que se sabe que inducen específicamente el desarrollo de glóbulos rojos (eritropoyetina, o Epo), o el desarrollo de células mieloides (factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos, o GM-CSF). Finalmente, la recolección de lt-HSC de donantes ha sido grandemente simplificada por medio del proceso de “movilización” en donde estas células son inducidas a moverse desde los sitios de la médula ósea donde normalmente residen hasta la sangre periférica por administración sistémica de una citoquina llamada G-CSF. Las células madre pueden recogerse entonces a partir de la sangre periférica obviando el dolor y una recolección complicada de biopsias de la médula ósea. Todos estos procesos confían en la habilidad para programar y controlar el comportamiento biológico de lt-HSC.

Por lo tanto, el trasplante de médula ósea (células madre) es una herramienta terapéutica invaluable para la reconstitución hematológica e inmune de individuos que han sido sometidos a radiación y/o a quimioterapia (por ejemplo pacientes con cáncer, o que han sido expuestos a altos niveles de radiación), y es también una modalidad crítica para el tratamiento de la deficiencia inmunológica y de neoplasias malignas. Además, el trasplante de médula ósea sería una terapia muy útil para compartir los efectos negativos del envejecimiento del sistema inmunológico, así como de otras células y tejidos. Se estima que los trasplantes de células madre podrían beneficiar a más de

35.000 niños y adultos por año.

El principio operativo detrás de un trasplante de médula ósea es el reemplazo de lt-HSC que originan todos los tipos de células sanguíneas. Recientes estudios indican que el trasplante de médula ósea puede tener valor en el tratamiento de enfermedades cardíacas. Aunque el fundamento de esta afección es desconocido, este, y otros hallazgos, plantean la posibilidad de que las células madre (lt-HSC) puedan ser reprogramadas para dar lugar a otros tejidos. Si esto es cierto, las lt-HSC pueden ser muy útiles y proporcionar una alternativa para la terapia controversial con células madre embrionarias.

Los principales obstáculos que enfrenta la aplicación clínica del trasplante de médula ósea en primer lugar tienen que ver con la identificación de un donante de médula apropiadamente histocompatible. Esto usualmente se logra utilizando los registros que han llenado más de 6 millones de donantes potenciales. El donante seleccionado debe experimentar una prueba agotadora de movilización inducida de células madre en la sangre, seguida por 4 - 5 días de leucoféresis para aislar las lt-HSC raras. El trasplante de estas células debe ser seguido por un cuidadoso monitoreo y tratamiento del receptor para minimizar las reacciones injerto versus huésped provocadas por linfocitos pasajeros.

La elucidación a nivel molecular del deterioro en el desarrollo del linaje hematopoyético ha sido históricamente complicada por la baja frecuencia de poblaciones celulares relevantes, lo que impide el análisis bioquímico de respuestas de señalización y corriente abajo. En realidad, éste ha sido un factor limitante principal en todos los estudios de hematopoyesis. Además, la limitada disponibilidad de células madre hematopoyéticas de largo plazo (las LT-HSC) ha sido también un obstáculo importante en el tratamiento de muchos tipos de cánceres así como de varias clases de inmunodeficiencias en humanos. De acuerdo al mejor conocimiento de los presentes inventores, actualmente no se encuentra disponible ninguna línea celular que surja espontáneamente que se parezca a las lt-HSC y que pueda diferenciarse en linajes normales in vitro, o que pueda reconstituir ratones irradiados en forma letal

o humanos irradiados por debajo del nivel letal, ni conocen que se halla descrito ningún método para generar deliberadamente tales líneas celulares. Además, no existen actualmente tecnologías viables para expandir continuamente las lt-HSC, de tal manera que estas células deben ser obtenidas a partir de un donante cada vez que se las necesite.

Existe también una extrema necesidad por modalidades adicionales para tratar neoplasias malignas hematológicas e inmunodeficiencias, y nuevas citoquinas para incrementar la producción de lt-HSC trasplantadas. Además, no existe actualmente una plataforma adecuada para identificación de objetivos y descubrimiento de fármacos. Los elementos faltantes son las líneas celulares que representan diferentes etapas de desarrollo en linajes hematopoyéticos. En forma óptima, tales células deben retener la habilidad para experimentar una diferenciación adicional en un linaje específico. Tales líneas de células son esenciales para la identificación de productos génicos, y por lo tanto de nuevos objetivos convertibles en fármacos, involucrados en la regulación del desarrollo celular, proliferación y supervivencia. Además, tales líneas celulares son esenciales para la selección de moléculas pequeñas y bibliotecas de ARNsh para estudios de pérdida de la función, así como bibliotecas de ADNc para obtener beneficios de los estudios de la función, en la búsqueda de nuevos fármacos.

Las barreras para el descubrimiento actual de nuevos fármacos en esta área incluyen: (a) aislamiento de un número suficiente de células de una etapa particular de desarrollo; (b) propagación de las células in vitro durante un período de tiempo suficiente; y (c) la habilidad para utilizar oncogenes condicionales para la búsqueda de fármacos que pudieran afectar leucémicas, y no las HSC normales o las progenitoras.

Por lo tanto, existe una gran necesidad en el arte por un método para generar líneas de células lt-HSC que puedan expandirse en forma extensa, ser congeladas, y utilizarlas nuevamente cada vez que se requiera, sin necesidad de recortarlas del donante.

Resumen de la invención

Una modalidad de la presente invención se relaciona con un método para producir células madre adultas inmortalizadas en forma condicional. El método incluye las etapas de: (a) obtener una población expandida de células madre adultas; (b) transfectar las células madre con una molécula de ácido nucleico que contengan un protooncogén o un fragmento biológicamente activo u homólogo del mismo que promueva la supervivencia y proliferación de las células, en donde él protooncogén sea inducible; (c) transfectar las células madre con una molécula de ácido nucleico que contengan una proteína que inhiba la apoptosis de las células; y (d) expandir las células transfectadas en presencia de una combinación de factores de crecimiento de células madre bajo condiciones por medidas cuales el protooncogén sea activo, para producir células madre adultas inmortalizadas en forma condicional. En un aspecto de esta modalidad, la molécula de ácido nucleico de (b) y/o (c) está contenida en un vector de integración. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico de (b) y/o (c) es transfectada dentro de las células utilizando un virus o un vector viral seleccionado de: vectores retrovirales, vectores lentivirales, parvovirus, virus vacuna, coronavirus, calicivirus, virus del papiloma, flavivirus, ortomixovirus, ortomixovirus, togavirus, picornavirus, vectores adenovirales, herpesvirus atenuados y modificados. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico de (b) y/o (c) es transfectada dentro de las células utilizando electroporación directa. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico o (b) y/o (c) está contenida en un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína sensible a un fármaco. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico o (b) y/o (c) está contenida en un vector que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de reconocimiento de sustrato para una recombinasa que flanquea la molécula de ácido nucleico de (b) o (c).

En un aspecto, esta modalidad incluye las etapas adicionales de: (e) remover las condiciones de (d) por medio de las cuales se activa el protooncogén, y (f) cultivar las células de (e) en medio que contiene factores de crecimientoque inducen diferenciación de las células. Éste método puede incluir adicionalmente: (g) añadir a las células de (f), las condiciones de (d) por medio de las cuales se activa el protooncogén, para producir células inmortalizadas en forma condicional en una etapa intermedia de la diferenciación celular.

Otra modalidad de la presente invención se relaciona con un método para producir células madre adultas inmortalizadas en forma condicional, que comprende: (a) obtener una población expandida de células madre adultas; (b) cultivar las células madre en presencia de: (1) una combinación de factores de crecimiento de células madre; (2) una primera proteína de fusión Tat, en donde Tat se fusiona con una proteína codificada por un protooncogén o fragmento biológicamente activo u homólogo del mismo que promueve la supervivencia y proliferación de la célula; y (3) una segunda proteína de fusión Tat, en donde Tat se fusiona a una proteína que inhibe la apoptosis en las células madre.

Otra modalidad de la presente invención se relaciona con un método para producir células madre adultas inmortalizadas en forma condicional, que comprende: (a) obtener una población expandida de células madre adultas; (b) cultivar las células madre en presencia de: (1) una combinación de factores de crecimiento de células madre; (2) una proteína codificada por un protooncogén o un fragmento biológicamente activo u homólogo del mismo que promueva la supervivencia y proliferación de las células; y (3) una proteína que inhiba la apoptosis en las células madre. Las proteínas de (2) y (3) se suministran dentro de las células madre utilizando cualquier sistema adecuado de suministro, incluyendo, pero sin limitarse a, fusión Tat, tecnología de aptámeros, o tecnología CHARIOTTM.

Aún otra modalidad de la presente invención se relaciona con un método para producir células madre adultas inmortalizadas en forma condicional, que comprende: (a) obtener una población expandida de células madre adultas; (b) suministrar dentro de las células una proteína codificada por un protooncogén o un fragmento biológicamente activo u homólogo del mismo que promueva la supervivencia y proliferación de las células, o una molécula de ácido nucleico que codifique las mismas, en donde el protooncogén sea inducible; (c) inhibir la apoptosis en las células madre por medio del suministro de las células de una proteína que inhiba la apoptosis de la célula, una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína que inhibe la apoptosis de la célula, o una molécula de ácido nucleico o proteína que inhiba una proteína proapoptótica en las células; y (d) expandir las células en presencia de una combinación de factores de crecimiento de células madre bajo condiciones por medio de las cuales se activa el protooncogén, para producir células madre adultas inmortalizadas en forma condicional.

En cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, se puede seleccionar el protooncogén de, pero sin limitarse a: MYC-ER e ICN-1-ER. En cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, la proteína que inhibe la apoptosis se puede seleccionar de, pero sin limitarse a un miembro de la familia Bcl-2 que inhibe apoptosis, tal como Bcl-2, Bcl-X, Bcl-w, BclXL, Mcl-1, Dad-1, o hTERT. Cuando el protooncogén es MYC-ER o ICN-1-ER, las condiciones bajo las cuales se activa el protooncogén pueden incluir la presencia de Tamoxifeno o un agonista del mismo. En un aspecto se transfectan las células con o se suministran (como una proteína) MYC-ER y Bcl-2; MYCER y hTERT; ICN-1-ER y Bcl-2; ICN-1-ER y hTERT; o MYC-ER e ICN-1-ER.

En cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, la etapa de expansión se puede realizar en un medio que incluye, pero no se limite a, (1) interleuquina-6 (IL-6), IL-3 y el factor de célula madre (SFC); (2) un medio libre de suero que contiene factor de células madre (SCF), trombopoyetina (TPO), Factor de Crecimiento 2 tipo insulina (IGF2) y Factor de Crecimiento 1 de fibroblastos (FGF-1).

En cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, las células madre adultas pueden incluir, pero sin limitarse a: células madre hematopoyéticas, células madre intestinales, células madre osteoblásticas, células madre mesenquimales, células madre neurales, células madre epiteliales, células madre progenitoras de miocito cardíaco, células madre de piel, células madre de músculo esquelético, y células madre de hígado. En un aspecto, se seleccionan las células madre mesenquimales de las células madre mesenquimales de pulmón y células estromales de médula ósea. En un aspecto, las células madre epiteliales se seleccionan del grupo que consiste de células madre epiteliales de pulmón, células madre epiteliales de mama, células madre epiteliales vasculares y células madre epiteliales intestinales. En un aspecto, las células madre de piel se seleccionan del grupo que consiste de células madre epidérmicas y células madre foliculares (células madre de folículo capilar). En un aspecto, las células neurales se seleccionan de las células madre dopaminérgicas neuronales y células madre neuronales motoras. En un aspecto, las células madre son de sangre del cordón criopreservada o fresca. En un aspecto, las células madre son células progenitoras hematopoyéticas obtenidas a partir de la sangre periférica de pacientes tratados con el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) o normales.

En cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, el método puede incluir adicionalmente modificar genéticamente las células madre para corregir un defecto genético en las células, modificar genéticamente las células madre para silenciar la expresión de un gen, y/o modificar genéticamente las células madre para sobreexpresar un gen.

En cualquiera de las modalidades descritas anteriormente, el método puede incluir adicionalmente el almacenamiento de células. En un aspecto, el método incluye además recuperar las células del almacenamiento y cultivarlas.

Otra modalidad de la presente invención se relaciona con células producidas por medio de cualquiera de los métodos descritos anteriormente o en cualquier otra parte aquí.

Aún otra modalidad de la presente invención se relaciona con un método para proporcionar células madre adultas, o células diferenciadas de las mismas, a un individuo que comprende: (a) proveen una fuente de células madre adultas inmortalizadas en forma condicional producidas por medio de cualquier método descrito anteriormente o en cualquier otra parte aquí; (b) remover las condiciones bajo las cuales las células madre de (a) son inmortalizadas en forma condicional; y (c) administrar las células madre o las células diferenciadas de las mismas al individuo. En un aspecto, las células fueron previamente obtenidas del individuo en (c). En un aspecto, las células fueron obtenidas a partir de existencias previamente congeladas dichas células. En un aspecto, las células fueron obtenidas en forma fresca del individuo e inmortalizadas en forma condicional por medio de cualquier momento descrito anteriormente o en alguna otra parte aquí. En un aspecto, el individuo tiene cáncer. En otro aspecto, el individuo tiene leucemia. En otro aspecto, el individuo tiene un trastorno de inmunodeficiencia. En otro aspecto, el individuo tiene un trastorno anémico. En otro aspecto, el individuo es sometido a cirugía reconstructiva. El otro aspecto, el individuo es sometido a cirugía cosmética electiva. En otro aspecto, el individuo es sometido a cirugía de trasplante. En un aspecto, el individuo requiere de células madre, o de células diferenciadas de las mismas, seleccionadas de: células madre hematopoyéticas, células madre intestinales, células madre osteoblásticas, células madre mesenquimales, células madre neurales, células madre epiteliales, células madre progenitoras de miocitos cardíacos, células madre de piel, células madre de músculo esquelético, y células madre de hígado. En otro aspecto, el individuo requiere una función celular inmune mejorada. En otro aspecto, el individuo tiene un defecto genético que es corregido por las células madre.

Aún otra modalidad de la presente invención se relaciona con un método para identificar compuestos que regulan el compromiso del linaje y/o la diferenciación y desarrollo de las células, que comprende: (a) poner en contacto células madre adultas producidas por medio de cualquier método descrito anteriormente o en cualquier otra parte aquí; y (b) detectar al menos una característica genotípica o fenotípica en las células madre de (a), comparado con las células madre en ausencia del compuesto, en donde la detección de una diferencia en la característica en presencia del compuesto indica que el compuesto afecta la característica en la célula madre.

Otra modalidad de la presente invención se relaciona con un método para estudiar el compromiso del linaje y/o de la diferenciación y el desarrollo celular, que comprende evaluar las células madre adultas producidas por cualquier método descrito anteriormente o en cualquier otra parte aquí, o células diferenciadas de las mismas, para detectar al menos una característica genotípica o fenotípica de las células.

Aún otra modalidad de la presente invención se relaciona con el uso de las células producidas por cualquiera de los métodos descritos anteriormente o en cualquier otra parte aquí en un medicamento para tratar una condición o enfermedad en la cual es benéfico el trasplante de células madre.

Otra modalidad en la presente invención se relaciona con un modelo de ratón de leucemia mieloide aguda (AML), que contiene un ratón producido por medio de un método que comprende: (a) irradiar en forma letal un ratón; (b) transferir células madre inmortalizadas en forma condicional a largo plazo producidas por cualquiera de los métodos descritos anteriormente o en cualquier parte aquí y células completas de la médula ósea de un ratón Rag-/- dentro del ratón; y (c) inyectar dosis periódicas de Tamoxifeno o un agonista del mismo en el ratón hasta que el ratón desarrolle signos clínicos de AML. En un aspecto, se transfectan las células con, o se les suministra (como proteína) MYC-ER y Bcl-2.

Otra modalidad de la invención se relaciona con células tumorales obtenidas del modelo de ratón de AML descrito anteriormente.

Aún otra modalidad de la invención se relaciona con el uso del modelo de ratón de AML para ensayos clínicos previos de candidatos de fármacos específicos para proteínas humanas; para identificar, desarrollar, y/o analizar un compuesto para uso en el diagnóstico, estudio, o tratamiento de AML; o para identificar, desarrollar, y/o analizar un objetivo para uso en el diagnóstico, estudio, o tratamiento de AML.

Breve descripción de los dibujos de la invención

La Fig. 1 es una gráfica que muestra curvas de mortalidad después del trasplante de médula ósea de células transducidas y activación de la función MYC con 40HT, in vivo.

La Fig. 2 es un gráfico de dispersión que muestra las características de dispersión y los niveles de expresión de GFP de la HSC derivadas de ratones adultos y jóvenes, seguido de transducción in vivo. Las gráficas de puntos representan los datos de citometría de flujo para las características de dispersión laterales (SSC) y hacia adelante (FSC) de las HSC después de tres días en cultivo con IL-3, IL-6 y SCF. Estos dos criterios se correlacionan con el tamaño de la célula (FSC) y la granularidad (SSC).

La Fig. 3 es un gráfico de dispersión que muestra la comparación fenotípica de líneas de células derivadas de receptores irradiados reconstituidos utilizando BCL-2, MYC-ER y células madre hematopoyéticas transducidas con EGFP de ratones transgénicos 3 - 83 μδ jóvenes y viejos (> 60% del repertorio de ID). Se muestra el fenotipo de clones representativos 3 (jóvenes) y 3 (viejos) meses después del inicio del cultivo.

La Fig. 4 es un gráfico de dispersión que muestra la diferenciación espontanea de la línea LT-HSC envejecida (ABM46) in vitro después el retiro del Tamoxifeno (se analizan células madre y la expresión del marcador del linaje B por medio de citometría de flujo).

La Fig. 5 es un gráfico de dispersión que muestra el análisis de compartimientos de células hematopoyéticas derivados de líneas LT-HSC de 6 semanas después de transferencia adoptiva en receptores jóvenes irradiados. Se presentan los datos de tres ratones en esta figura, un ratón recibió la línea ABM42 de HSC envejecidas, y dos ratones recibieron la línea ABM46 de HSC envejecidas.

La Fig. 6 es un gráfico de dispersión que muestra el desarrollo del comportamiento de las células B está comprometido en ratones reconstituidos con las líneas de células ABM42 y ABM46. En esta figura se presentan los datos de tres ratones, un ratón recibió la línea ABM42 de HSC envejecidas, dos ratones recibieron la línea ABM46 de HSC envejecidas.

La Fig. 7 es un gráfico de dispersión que muestra el desarrollo de células T en ratones que fueron reconstituidos con líneas de células ABM42 y ABM46. En esta figura se presentan los datos de tres ratones, un ratón recibió la línea ABM42 de HSC envejecidas, dos ratones recibieron la línea ABM46 de HSC envejecidas.

La Fig. 8 es un gráfico de dispersión y un gráfico que muestran la comparación fenotípica de líneas de células derivadas de las HSC obtenidas de ratones C57/BL6 jóvenes que fueron transducidas en forma retroviral con BCL-2 y MCY-ER y mantenidas en cultivo continuo in vitro durante > 90 días. Los paneles representan los resultados de loa análisis de citometría de flujo para a expresión de los marcadores de expresión viral (GFP y Thy1.1), así como cuatro marcadores requeridos para definir las HSC de largo plazo en ratones, Sca-1, c-kit, CD34 yFlk-2. Las cuatro líneas de células contenían subpoblaciones que retuvieron el fenotipo de las lt-HSC (Sca-1+, c-kit+, CD34-, flk-2-).

La Fig. 9 es un gráfico de dispersión y un gráfico que muestran la comparación fenotípica de líneas de células derivadas de las HSC obtenidas de ratones C57/BL6 jóvenes que fueron transducidas en forma retroviral con diferentes combinaciones de oncogenes y mantenidas en cultivo continuo in vitro durante > 90 días (pMIG-MYC y pMIT-Bcl-2 (paneles superiores), pMIG-MYC.ER y pMIG-hTERT (paneles medios), o pMIG-ICN.1.ER y pMIT-Bcl-2 (paneles inferiores)).

La Fig. 10 es un gráfico de dispersión y un gráfico que muestran la comparación fenotípica de líneas de células derivadas de las HSC obtenidas de ratones C57/BL6 jóvenes que fueron transducidas en forma retroviral con diferentes combinaciones de oncogenes y mantenidas en cultivo continuo in vitro durante > 90 días (pMIG- ICN.1.ER y pMIT-Bcl-2 (paneles superiores), pMIG-ICN.1 y pMIT-Bcl-2 (paneles de la segunda fila), o pMIG-ICN.1 y pMIG-Bcl2 (paneles de la tercera fila), o pMIG-hTERT y pMIT-Bcl-2 (paneles inferiores)).

La Fig. 11 es un gráfico de dispersión y un gráfico que muestran la comparación fenotípica de líneas de células derivadas de las HSC obtenidas de ratones C57/BL6 jóvenes que fueron transducidas en forma retroviral con diferentes combinaciones de oncogenes y mantenidas en cultivo continuo in vitro durante > 90 días (pMIG-MYC y pNUG-ICN.1 (paneles superiores), pMIG-MYC.ER y pMIG-ICN.1 (paneles medios), o pMIG-ICN.1.ER y pMIG-MYC (paneles inferiores)).

La Fig. 12 es un gráfico de dispersión que muestra la reconstitución in vivo de compartimientos de células T y células B de líneas de células derivadas de las HSC obtenidas a partir de ratones C57/BL6 jóvenes que fueron transducidos en forma retroviral con diferentes combinaciones de oncogenes y mantenidas en cultivo continuo in vitro durante > 90 días.

La Fig. 13 es un dibujo esquemático que muestra el uso de secuencias para reconocimiento de sustrato (de RSS) para recombinasas con el propósito de garantizar la excisión de ADN recombinante de células madre inmortalizadas en forma condicional a largo plazo de la invención antes de trasplantarlas.

La Fig. 14 es una gráfica que muestra la detección de células del linaje NK y eritroideo diferenciadas de las células madre inmortalizadas en forma condicional a largo plazo de la invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención provee una solución para el problema de ser capaz de generar, mantener y manipular líneas de células madre derivadas de células madre adultas a largo plazo, y particularmente, células madre hematopoyéticas a largo plazo (las lt-HSC), que pueden dar lugar a todos los linajes de células que normalmente surgirían de tales células cuando se las coloca bajo condiciones apropiadas. La presente invención se relaciona en general con métodos para producir células madre adultas a largo plazo, inmortalizadas en forma condicional, con las células madre producidas por tales métodos, y con los métodos para utilizar tales células madre. Más específicamente, utilizando células madre hematopoyéticas a largo plazo como ejemplo de una población de células madre, los presentes inventores han establecido un poderoso método para producir células madre que están inmortalizadas en forma condicional (por ejemplo, inmortalizadas en forma reversible o inmortalizadas bajo condiciones especificadas que sean reversibles cuando tales condiciones son eliminadas), siendo capaces tales células madre de diferenciarse del linajes de células normales in vitro e in vivo, y siendo capaces de reconstituir sujetos que requieran de tales células. En realidad, la presente invención puede eliminar la necesidad de un donante de médula ósea, ya que la invención proporciona la habilidad para recolectar células madre de un paciente antes de un procedimiento (por ejemplo, quimioterapia, radiación, etc.), para aumentar tales células, y retornarlas al paciente. Además, tales células madre pueden ser aumentadas en forma extensiva, almacenadas (por ejemplo, congeladas), y luego recuperadas y aumentadas nuevamente, manipuladas, y/o utilizadas repetidamente según se requiera o se desee. Tales células madre pueden ser manipuladas, por ejemplo, para corregir un defecto genético o para proporcionar un beneficio a un individuo (terapéutico o preventivo), o diferenciarlas en un tipo de célula deseada. Finalmente, tales células pueden ser utilizadas en una variedad de ensayos para la identificación de nuevos objetivos involucrados en la regulación del desarrollo, proliferación y supervivencia de células, y la identificación y desarrollo de fármacos utilizados en mejorar o tratar enfermedades y condiciones que se beneficiarían de la regulación del desarrollo, proliferación y/o supervivencia de las células.

Los presentes inventores han desarrollado tecnología que permite la inmortalización condicional de células madre adultas a largo plazo, ejemplificadas aquí por las células madre hematopoyéticas a largo plazo (lt-HSC). Las líneas de células resultantes se pueden aumentar (propagar) indefinidamente y exponencialmente in vitro yo criopreservadas (almacenadas), y tener la habilidad para rescatar ratones irradiados en forma letal y para reconstituir todos los linajes de células sanguíneas en tales animales. Además, los inventores han sido capaces de generar células sanguíneas diferenciadas in vitro extinguiendo la función del oncogén de transformación. Tales células y los métodos para producirlas como se describe aquí permitirán la generación de células madre humanas que pueden ser trasplantadas que transportan ADN no recombinante, y por lo tanto no plantean riesgo a largo plazo para el receptor. Estas lt-HSC inmortalizadas en forma condicional de la invención pueden ser estabilizadas en sus fenotipos maduros y se pueden establecer líneas de células en las cuales el fenotipo maduro se preserva después de la reactivación del oncogén. Por ejemplo, los inventores han sido capaces de desarrollar células CD4+, T αβ+, así como líneas de células dendríticas.

Aplicada en la práctica clínica, esta tecnología tiene las siguientes ventajas sobre el trasplante de médula ósea:

1.

Se requieren muy pocas lt-HSC para establecer clones;

2.

Los clones representan una fuente renovable que pueden ser almacenados indefinidamente y acceder a ellos rápidamente;

3.

El costo de esta terapia debe ser mucho menor que el trasplante de médula ósea convencional;

4.

El uso de clones de lt-HSC debería mitigar la amenaza de la enfermedad huésped versus injerto, y los costos asociados;

5.

La tecnología puede, al menos en algunos casos, mitigar la necesidad de un donante de médula ósea.

Además, la presente invención proporciona el uso de las células madre adultas transformadas en forma condicional a largo plazo, tal como las células lt-HSC, para generar células que representan linajes diferenciados (por ejemplo, linajes hematopoyéticos diferenciados, incluidas las etapas intermedias de desarrollo de linajes hematopoyéticos). Por ejemplo, además de innumerables aplicaciones terapéuticas y preventivas, estas líneas de células permitirán la identificación de nuevos compuestos que puedan inducir la diferenciación de células malignas, detener su crecimiento, o inducir apoptosis. Estas células también permitirán seleccionar nuevas citoquinas y factores de crecimiento que dirijan la diferenciación de células madre en una ruta particular. Tales líneas de células simplemente no existen y serán esenciales para el descubrimiento de fármacos.

Más específicamente, en un esfuerzo para superar las limitaciones del arte con relación a la provisión y uso de poblaciones a largo plazo de células madre derivadas de adulto, los presentes inventores han desarrollado nuevos métodos para producir líneas de células transformadas en forma condicional que representan progenitores de células madre hematopoyéticas tempranas. En un ejemplo específico no limitante de la tecnología descrita y ejemplificada aquí, la estrategia involucró la transfección (por ejemplo, por medio de transducción retroviral) de células madre de médula ósea de ratones 3-8 3μδ tratados con 5-fluroacilo (5-FU). Los inventores utilizaron al vector retroviral bisistrónico pMSCV con insertos que codifican proteína Bcl-2 y proteína fluorescente verde (GFP) (como un gran reportero), y MYC-ER y GFP (nuevamente como un gen reportero). Se seleccionó MYC debido a su habilidad para sustituir señales proliferativas y de supervivencia derivadas de citoquina en linfocitos. Por medio de la restricción de la célula objetivo, los inventores hicieron la hipótesis de que se formaría tumores de células madre. En forma muy importante, la función MYC-ER depende del Tamoxifeno en este contexto, permitiendo la terminación de la función MYC y la transformación por medio el retiro del Tamoxifeno del animal o de los cultivos. En células transducidas con MYC-ER, se produce la proteína de fusión, pero es retenida en el citoplasma hasta exponerla al Tamoxifeno. Se seleccionó Bcl-2 debido a su habilidad para inhibir la apoptosis de células que normalmente se presentaría como resultado de la exposición a las señales MYC y más particularmente, cuando se “inactiva” o remueve MYC por medio del retiro del Tamoxifeno de las células. Esta nueva combinación de tipos de genes (es decir, la invención no está limitada a estos genes específicos, como se discute en más detalle más adelante) es parcialmente responsable por la producción exitosa de células madre inmortalizadas en forma condicional de acuerdo con la presente invención, y puede ser fácilmente extendidas a otras combinaciones similares de genes, como se discute en forma detallada más adelante.

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Los receptores de las células madre transducidas descritas más arriba produjeron tumores (en presencia de 40HT), y se recolectan células tumorales de la médula ósea, bazo y nodo linfático y eso las colocó en medio de cultivo con Tamoxifeno y un coctel de factores de crecimiento de células madre. Los presentes inventores han descubierto que, en ausencia de una combinación apropiada de factores de crecimiento de células madre, las células madre producidas por medio del presente método detendrán el crecimiento y la muerte en un corto período de tiempo. Por lo tanto, el uso de un “coctel” de factores de crecimiento de células madre (es decir, combinación de factores de crecimiento apropiados o adecuados para células madre) después de la transfección de las células con la combinación de genes discutida anteriormente es un segundo aspecto importante del método de la presente invención. Este coctel, aunque tiene la característica general de promover y mantener el crecimiento de las células madre, no está limitado a una combinación particular de factores de crecimiento, y se discuten parámetros para la selección de tales factores en forma detallada más adelante.

Las células madre generadas por el método de la presente invención podrían expandirse en el cultivo y eran homogéneamente positivas para, por ejemplo, Sca1, positivas para Endoglin y ckit, y negativas para CD34, Flt3, B220, CD19 y mIgM, que son indicativas del fenotipo de lt-HSC, que está bien caracterizada en el arte. Estas células podrían ser congeladas (criopreservadas, o almacenadas), y luego fácilmente recuperadas y cultivadas después de la congelación. En forma muy importante, las células recuperadas eran homogéneas en fenotipo y exhibían el fenotipo de lt-HSC (por ejemplo, nuevamente; las células uniformemente brillantes GFP eran positivas para Sca1, Endoglin y ckit, y negativas para CD34, Flt3, B220, 19 y mIgM). Este fenotipo corresponde perfectamente con las características publicadas de células madre pluripotentes para repoblación a largo plazo (Reya et al., 2003, Nature

423: 409 - 14) que proporcionan toda la reconstitución a largo plazo en ratones.

Los inventores han desarrollado además este método de tal manera que pueda ser realizado completamente in vitro (es decir, que el procedimiento inicial fue llevado a cabo parcialmente in vivo como se describe más arriba). Los inventores también han demostrado que otras combinaciones de genes que tienen características similares como aquellas descritas anteriormente también resultan en la inmortalización condicional de las lt-HSC. Además, las líneas de células pueden diferenciarse in vitro en linajes y hematopoyéticos por medio de la remoción del Tamoxifeno y proveyendo los factores de crecimiento apropiados, y se diferenciarán in vivo en todos los linajes hematopoyéticos en animales receptores en los cuales está retenido el Tamoxifeno. Además, las células pueden diferenciarse en niveles intermedios de desarrollo que tengan un fenotipo estable y retengan su habilidad para diferenciarse adicionalmente a lo largo de su ruta comprometida después de la aplicación o remoción de la señal apropiada (descrita aquí). Tales células son invaluables para diferentes aplicaciones terapéuticas. Todos estos experimentos están descritos en detalle más adelante y que los Ejemplos.

Los métodos y las líneas de células de la presente invención proporcionan una única oportunidad no solamente para estudiar en detalle los eventos moleculares, bioquímicos y celulares que están asociados con el cometido de las células madre adultas hacia diferentes linajes de células y para estudiar la diferenciación y el desarrollo de células madre en diferentes linajes de células, sino también proporcionar herramientas terapéuticas únicas y para descubrimiento de fármacos.

Por ejemplo, las líneas de células madre de la presente invención proporcionan una fuente única de células madre que pueden expandirse para uso en una variedad de estrategias preventivas, terapéuticas y de trasplante, incluido el tratamiento del cáncer, y particularmente, el cáncer que es tratado por radiación. En la terapia actual para la leucemia, por ejemplo, el acceso limitado a donantes de médula ósea y los suministros finitos de células madre por parte de tales donantes limita severamente las opciones para reconstitución de un paciente después de la terapia de radiación. La presente invención resuelve este problema proveyendo un medio para generar un suministro renovable y continuamente ampliable de células madre autólogas o de células madre histocompatibles que pueden ser almacenadas y recuperadas según se requiera. Tal tecnología podría en última instancia eliminar la necesidad de donantes de médula ósea completamente. Además, una gran variedad de trastornos de inmunodeficiencia y de trastornos anémicos (por ejemplo, anemia aplástica o anemia hemolítica) también se beneficiarían grandemente de esta tecnología, ya que la presente invención provee la habilidad para repoblar las células hematopoyéticas de un individuo según éste las requiera. Además, el envejecimiento está asociado con diferentes cambios importantes en el comportamiento hematopoyético, incluida la creciente inhabilidad para aumentar una respuesta inmune productiva, entre otros. Las células madre hematopoyéticas de ratones envejecidos han mostrado que contienen un nivel mayor de los ARNm para problemas de reparación del ADN. Esto puede afectar en última instancia su habilidad para autorenovarse, experimentar diferenciación, experimentar proliferación, y sobrevivir en respuesta a citoquinas de la médula ósea. Por lo tanto, un individuo viejo puede beneficiarse también de la presente invención ya que puede proporcionarse un suministro continuo de células hematopoyéticas sanas para corregir o mejorar tales deficiencias.

La tecnología de la presente invención no se limita a células madre de médula ósea, sino que puede aplicarse virtualmente a cualquier tipo de células madre adultas.

En un ejemplo, otra aplicación de la presente invención se relaciona con la generación de células madre del folículo capilar que pueden aumentar y renovarse continuamente. El desarrollo de células madre inmortalizadas en forma condicional a partir de este linaje puede ser utilizado en el contexto de cirugía reconstructiva para víctimas de quemaduras, para cualquier individuo que reciba quimioterapia y/o terapia de radiación que resulte en la pérdida irreversible del desarrollo capilar, así como pacientes después de cualquier procedimiento quirúrgico que afecte al cráneo. Además, es células podrían ser utilizadas para procedimientos electivos que involucren la inducción de crecimiento del cabello en individuos afectados por calvicie de patrón hereditario. En forma similar, la aplicación de la presente invención a células madre de la piel será invaluable para el uso en la cicatrización de heridas y el tratamiento de víctimas de quemaduras, así como cirugía plástica reconstructiva por trauma y otros pacientes, así como cirugías electivas, que incluyen, pero sin limitarse a, cirugía cosmética. Tales células pueden ser adicionalmente manipuladas genéticamente para corregir defectos genéticos innatos o adquiridos en individuos jóvenes y viejos. Alguien capacitado en el arte se dará cuenta que con base en esta divulgación pueden derivarse beneficios por el uso de la presente invención en diferentes otras poblaciones de células madre, incluyendo, pero sin limitarse a, células madre derivadas de pulmón, mama, y epitelio intestinal y células madre derivadas de tejido neural y cardíaco, para mencionar sólo unas pocas. Otros tipos de células madre son referencias aquí en otras partes.

Además, la presente invención proporciona la oportunidad única para un individuo de tener acceso a suministros ampliables de células madre autólogas y células diferenciadas a partir de ellas según se requiera a través de la vida de un individuo. Por ejemplo, a medida que el cuerpo envejece, se sabe que la función inmune y la memoria inmune se deterioran. Sin embargo, el uso de la tecnología suministrada por la presente invención, hará posible repoblar un individuo con nuevas células madre autólogas que sean capaces de diferenciación dentro de todas las células del linaje hematopoyético, proveyéndole así a un individuo viejo un sistema inmunológico “joven”. Además, las células madre generadas por medio del presente método pueden ser almacenadas y utilizadas como parte de protocolos terapéuticos durante el período de vida de un individuo, en caso de que sea necesario (por ejemplo, en el evento de que un individuo desarrolle cáncer o una enfermedad de inmunodeficiencia o que requiera por otra causa células autólogas recientemente generadas, virtualmente de cualquier tipo).

La presente invención también provee oportunidades únicas para terapia génica. Específicamente, hoy en día pueden corregirse defectos genéticos o pueden introducirse modificaciones genéticas benéficas en células somáticas por medio de la manipulación de células madre autólogas obtenidas de un individuo que hayan sido inmortalizadas en forma condicional y aumentadas utilizando el método de la presente invención. Las células madre pueden ser reintroducidas luego en el individuo del cual fueron obtenidas.

Las células madre producidas por medio del método de invención pueden ser utilizadas también en una variedad de ensayos para descubrimiento de fármacos. Ya que se pueden producir ahora suministros virtualmente ilimitados de células madre homogéneas que pueden ser fácilmente almacenadas, recuperadas, expandidas y manipuladas, tales células madre pueden ser utilizadas como células madre o diferenciadas en diferentes linajes celulares y utilizadas en ensayos para evaluar diferentes compuestos para efectos sobre la diferenciación celular, expresión génica, y procesos celulares. Las células pueden ser manipuladas antes de ponerlas en contacto con los compuestos, tal como por medio de manipulación genética. Las células madre de individuos con defectos genéticos pueden ser evaluadas en tales ensayos con el propósito de identificar compuestos terapéuticos (por ejemplo, compuestos terapéuticos para el cáncer) y evaluar terapias de reemplazo génico. En realidad, la tecnología de la presente invención proporciona una oportunidad para fijar como objetivo las células de un individuo específico para identificar candidatos a fármacos y candidatos terapéuticos y estrategias que sean "confeccionadas a la medida" para las células del individuo. Un ejemplo de tal ensayo es descrito en detalle más adelante más adelante.

Con relación a la investigación y el descubrimiento en el área de preservación del linaje y diferenciación y desarrollo celular, antes de la presente invención, tales estudios fueron severamente obstaculizados por la falta de acceso y la inhabilidad para generar cantidades suficientes de la población deseada de células para llevar a cabo los experimentos deseados. Por ejemplo, con el propósito de identificar o seleccionar intermediarios en la diferenciación de una línea particular de células progenitoras, deben obtenerse un número suficiente de células para proveer resultados significativos y reproducibles. La línea de células progenitoras debe retener también la habilidad para diferenciarse adicionalmente en el linaje para el cual ya ha sido comprometida, elaborando por lo tanto estas nuevas herramientas que actualmente no existen, ni existen otras descripciones de tecnología necesaria para generar esas células. Usando las tecnologías disponibles al momento de la invención, esto no era posible. La presente invención resuelve el problema proveyendo suministros expandibles y esencialmente ilimitados de células madre homogéneas que pueden ser utilizadas en una variedad de experimentos. Esta tecnología mejorará grandemente las posibilidades de investigación en el área de la diferenciación y descubrimiento de células.

Como se discutió anteriormente, el método para inmortalizar en forma condicional las lt-HSC de la presente invención puede ser adaptado para células madre adicionales derivadas de otros tejidos. Por ejemplo, por medio de la adaptación del suministro de genes y de factores de crecimiento, si se requieren, puede aplicarse la presente invención a una variedad de diferentes células madre como se describe más adelante. Tales células pueden también ser expandidas in vitro, y proceder a su diferenciación por inactivación de los oncogenes, como se describe aquí

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para células madre hematopoyéticas. Estas células pueden ser luego utilizadas para aplicaciones terapéuticas que incluyen reparación de tejidos y regeneración/modificación por ingeniería genética de tejidos. Por lo tanto, la combinación de genes MYC-ER y Bcl2, o cualquiera de las otras combinaciones descritas aquí, pueden ser transfectadas por medio de cualquiera de los métodos descritos aquí o considerados adecuados por alguien capacitado en el arte de acuerdo con esta descripción (incluida una variedad de métodos mediados por virus), en células incluyendo, pero sin limitarse a, células madre mesenquimales (incluyendo, pero sin limitarse a, células madre mesenquimales de pulmón, células estromales de médula ósea), células madre neurales (incluyendo, pero sin limitarse a, células madre dopaminérgicas neuronales y células madre neuronales motoras), células madre epiteliales (incluyendo, pero sin limitarse a, células madre epiteliales de pulmón, células madre epiteliales de mama, y células madre epiteliales intestinales), células madre progenitoras de miocito cardíaco, células madre de piel (incluyendo, pero sin limitarse a, células madre epidérmicas y células madre foliculares), células madre de músculo esquelético, células madre endoteliales (por ejemplo, células madre endoteliales de pulmón), y células madre de hígado, para generar líneas de células inmortalizadas en forma condicional que pueden ser expandidas in vitro y proceder a diferencia de las por inactivación de los oncogenes. Además del potencial terapéutico de tales líneas de células, estas líneas pueden ser adicionalmente modificadas in vitro (o ex vivo) con el propósito de corregir defectos genéticos innatos, y usadas para estudiar a nivel molecular la preservación y diferenciación temprana de linajes. Aunque estas células pueden ser una nueva fuente de objetivos terapéuticos potencialmente relevantes, estas líneas de células serán útiles también para la selección de moléculas pequeñas que o bien prevengan o induzcan la diferenciación, y para la identificación de nuevos compuestos y objetivos moleculares para diferentes terapias, incluyendo, pero sin limitarse a, terapia contra el cáncer y terapia de inmunodeficiencia.

Definiciones generales

De acuerdo con la presente invención, la referencia a una molécula aislada de ácido nucleico aquí es una molécula de ácido nucleico que ha sido removida de su medio ambiente natural (es decir, que ha sido sometida a manipulación humana), siendo su medio ambiente natural el genoma o el cromosoma en el cual se encuentra en forma natural la molécula de ácido nucleico. Como tal, "aislada" no necesariamente refleja el grado en el cual ha sido purificada la molécula de ácido nucleico, pero indica que la molécula no incluye un genoma completo o un cromosoma entero en el cual se encuentra la molécula de ácido nucleico en la naturaleza. Una molécula aislada de ácido nucleico puede incluir un gen. Una molécula aislada de ácido nucleico que incluya un gen no es un fragmento de un cromosoma que incluya tal gen, sino más bien que incluye la región de codificación y las regiones reguladoras asociadas con el gen, pero no se les adicionales que se encuentran en forma natural sobre el mismo cromosoma. Una molécula aislada de ácido nucleico puede incluir también una secuencia especificada de ácido nucleico flanqueada por (es decir, en el extremo 5’ y/o 3’ de la secuencia) ácidos nucleicos adicionales que normalmente no flanquean la secuencia especificada de ácido nucleico en la naturaleza (es decir, secuencias heterólogas). La molécula aislada de ácido nucleico puede incluir ADN, ARN (por ejemplo, ARNm), o derivados de ADN o ARN (por ejemplo, ADNc, ARNsi, ARNsh). Aunque la frase "molécula de ácido nucleico" se refiere fundamentalmente a la molécula física de ácido nucleico y la frase "secuencia de ácido nucleico" se refiere principalmente a la secuencia de nucleótidos sobre la molécula de ácido nucleico, se pueden utilizar las dos frases en forma intercambiable, especialmente con respecto a una molécula de ácido nucleico, o una secuencia de ácido nucleico, siendo capaz de codificar una proteína o un dominio de una proteína.

Preferiblemente, se produce una molécula aislada de ácido nucleico de la presente invención utilizando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación) o síntesis química. Las moléculas aisladas de ácido nucleico incluyen moléculas naturales de ácido nucleico y homólogos de las mismas, incluyendo, pero sin limitarse a, variantes alélicas naturales y moléculas modificadas de ácido nucleico en las cuales se han insertado, suprimido, sustituido, y/o invertido nucleótidos en tal forma que tales modificaciones proveen el efecto deseado (por ejemplo, la provisión de un protooncogén inducible, como se describe aquí).

Se puede producir un homólogo de una molécula de ácido nucleico utilizando una cantidad de métodos conocidos por aquellos capacitados en arte (ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press (1989)). Por ejemplo, se pueden modificar moléculas de ácido nucleico utilizando una variedad de técnicas que incluyen, pero no se limitan a, técnicas clásicas de mutagénesis y técnicas de ADN recombinante, tales como mutagénesis dirigida al sitio, tratamiento químico de una molécula de ácido nucleico para inducir mutaciones, escisión con enzimas de restricción de un fragmento de ácido nucleico, ligación de fragmentos de ácido nucleico, amplificación por PCR y/o mutagénesis de regiones seleccionadas de una secuencia de ácido nucleico, síntesis de mezclas de oligonucleótido y ligación de grupos de mezclas para "construir" una mezcla de moléculas de ácido nucleico y combinaciones de los mismos. Los homólogos de moléculas de ácido nucleico pueden seleccionarse a partir de una mezcla de ácidos nucleico modificados seleccionando la función de la proteína codificada por el ácido nucleico y/o por hibridación con un gen de tipo silvestre.

El tamaño mínimo de una molécula de ácido nucleico o polinucleótido de la presente invención es un tamaño suficiente para codificar una proteína útil en la presente invención, tal como una proteína codificada por un protooncogén o una porción funcional del mismo (es decir, una porción que tenga la actividad biológica de la proteína de longitud completa y que sea suficiente para uso en el método de la invención), o una proteína antiapoptótica o una porción funcional de la misma (es decir, una porción que tenga la actividad biológica de la proteína de longitud completa y que sea suficiente para el uso en el método de la invención). Otras moléculas de ácido nucleico que pueden ser útiles en la presente invención pueden incluir moléculas de ácido nucleico de un tamaño mínimo suficiente para formar una sonda o un iniciador oligonucleótido que sea capaz de formar un híbrido estable con la secuencia complementaria de una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína natural (por ejemplo, bajo condiciones de rigurosidad moderadas, altas o muy altas), que tiene al menos típicamente 5 nucleótidos de longitud, y preferiblemente rangos desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50 o de aproximadamente 500 nucleótidos o más, incluyendo cualquier longitud entre, en incrementos de números enteros (es decir, 5, 6, 7, 8, 9,10,… 33, 34,… 256, 257,… 500). No existe límite, diferente a un límite práctico, sobre el tamaño máximo de una molécula de ácido nucleico de la presente invención, ya que la molécula de ácido nucleico puede incluir una secuencia o secuencias suficientes para ser útiles en cualquiera de las modalidades de la invención descritas aquí.

Como se utiliza aquí, condiciones rigurosas de hibridación se refieren a condiciones de hibridación estándar bajo las cuales se utilizan moléculas de ácido nucleico para identificar moléculas similares de ácido nucleico. Tales condiciones estándar están divulgadas, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. Sambrook et al., ibid., que se incorpora aquí como referencia en su totalidad (ver especialmente las páginas 9.31 - 9.62). Además, las fórmulas para calcular la hibridación apropiada y las condiciones de lavado para lograr que la hibridación permita diferentes grados de falta de correspondencia de nucleótidos se divulgan, por ejemplo, en Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 267 - 284; Meinkoth et al., ibid., se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

Más particularmente, la hibridación de rigurosidad moderada y las condiciones de lavado, como las mencionadas aquí, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen aproximadamente al menos 70% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la molécula de ácido nucleico que es utilizada como sonda en la redacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente 30% o menos falta de correspondencia de nucleótidos). La hibridación de alta rigurosidad y las condiciones lavado, como las mencionadas aquí, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen aproximadamente al menos 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la molécula de ácido nucleico que es utilizada como sonda en la redacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente 20% o menos falta de correspondencia de nucleótidos). La hibridación de muy alta rigurosidad y las condiciones lavado, como las mencionadas aquí, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen aproximadamente al menos 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la molécula de ácido nucleico que es utilizada como sonda en la redacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente 10% o menos falta de correspondencia de nucleótidos). Como se discutió anteriormente, alguien capacitado del arte puede utilizar las fórmulas en Meinkoth et al., ibid. para calcular la hibridación apropiada y las condiciones de lavado para lograr estos niveles particulares de falta de correspondencia de nucleótidos. Tales condiciones variarán, dependiendo de si se forman híbridos de ADN:ARN o ADN:ADN. Las temperaturas de fusión calculadas para híbridos de ADN:ADN son de 10ºC menores que para híbridos de ADN:ARN. En modalidades particulares, condiciones rigurosas de hibridación para híbridos de ADN: ADN incluyen la hibridación con una fuerza iónica de 6X SSC (Na+ 0,9 M) con una temperatura aproximadamente entre 20ºC y aproximadamente 35 °C (menor rigurosidad), más preferiblemente, aproximadamente entre 28ºC y aproximadamente 40 °C (más rigurosidad), e incluso más preferiblemente, aproximadamente entre 35 °C y aproximadamente 45ºC (incluso más rigurosa), con condiciones de lavado apropiadas. En modalidades particulares, las condiciones de hibridación rigurosas para híbridos de ADN:ARN incluyen hibridación con una fuerza iónica de 6X SSC (Na+ 0,9 M) con una temperatura aproximadamente entre 30ºC y aproximadamente 45 °C, más preferiblemente, aproximadamente entre 38ºC y aproximadamente 50 °C, e incluso más preferiblemente, aproximadamente entre 45 °C y aproximadamente 55ºC, con condiciones de lavado similarmente rigurosas. Estos valores se basan en los cálculos de una temperatura de fusión para moléculas mayores de 100 nucleótidos, 0% de formamida y un contenido de G + C de aproximadamente 40%. Alternativamente, se puede calcular Tm empíricamente como se expone en Sambrook et al., más arriba, páginas 9.31 a 9.62. En general, las condiciones de lavado deben ser tan rigurosas como sea posible, y deben ser apropiadas para las condiciones de hibridación escogidas. Por ejemplo, las condiciones de hibridación pueden incluir una combinación de sal y condiciones de temperatura que sean aproximadamente de 20 - 25ºC por debajo de la Tm calculada de un híbrido particular, y las condiciones de lavado típicamente incluyen una combinación de sal y condiciones de temperatura que sean aproximadamente de 12 - 20 °C por debajo de la Tm calculada del híbrido particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación adecuadas para uso con híbridos de ADN: ADN incluye una hibridación de 2 - 24 horas en 6X SSC (formamida al 50%) aproximadamente a 42 °C, seguida por etapas de lavado que incluyen una o más lavadas a temperatura ambiente aproximadamente en 2X SSC, seguido por lavadas adicionales a mayor temperatura y menor fuerza iónica (por ejemplo, al menos una lavada aproximadamente a 37 °C en aproximadamente 0,1X - 0,5X SSC, seguida por al menos una lavada aproximadamente a 68 °C en aproximadamente 0,1X - 0,5X SSC).

En una modalidad de la presente invención, cualquier secuencia de aminoácidos descrita aquí, incluidas formas truncadas (fragmentos o porciones) y homólogos de tales secuencias, pueden ser producidas con desde al menos uno, hasta aproximadamente 20, aminoácidos heterólogos adicionales que flanquean cada uno de los extremos del terminal C y/o N de la secuencia dada de aminoácidos. La proteína resultante o el polipéptido pueden denominarse como "que consisten esencialmente de" una secuencia dada de aminoácidos. De acuerdo con la presente invención, los aminoácidos heterólogos son una secuencia de aminoácidos que no se encuentran naturalmente (es decir, no encontrados en la naturaleza, in vivo) flanqueando la secuencia dada de aminoácidos o que no sería codificada por los nucleótidos que flanquean la secuencia de ácidos nucleicos de ocurrencia natural que codifican la secuencia dada de aminoácidos como ocurre en el gen, si tales nucleótidos en la secuencia de ocurrencia natural fueran traducidos utilizando un codón estándar para el organismo a partir del cual se deriva la secuencia dada de aminoácidos. En forma similar, la frase "que consiste esencialmente de", cuando se la utiliza aquí con referencia a una secuencia de ácidos nucleico, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia dada de aminoácidos que puede estar flanqueada por desde al menos uno, y tantos como aproximadamente 60, nucleótidos heterólogos adicionales en cada uno de los extremos 5’ y/o 3’ de la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia dada de aminoácidos. Los nucleótidos heterólogos no se encuentran naturalmente (es decir, no se encuentran en la naturaleza, in vivo) flanqueando la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia dada de aminoácidos como se presenta en el gen natural.

De acuerdo con la presente invención, un vector recombinante (también denominado generalmente como una molécula de ácido nucleico recombinante, particularmente cuando contiene una secuencia de ácido nucleico de interés de acuerdo con la invención) es una molécula de ácido nucleico modificada por ingeniería genética (es decir, producida en forma artificial) que es utilizada como una herramienta para manipulación de una secuencia de ácido nucleico de escogencia y para la introducción de tal secuencia de ácido nucleico en una célula huésped. El vector recombinante es por lo tanto adecuado para uso en clonación, secuenciación, y/o bien la manipulación de la secuencia de ácido nucleico de escogencia, tal como por expresión y/o suministro de la secuencia de ácido nucleico de escogencia dentro de una célula huésped. Tal vector típicamente contiene secuencias de ácido nucleico hubo heterólogas, en decir, secuencias de ácido nucleico que no se encuentran natural o usualmente adyacentes a una secuencia de ácido nucleico que va a ser clonada o suministrada, aunque el vector puede contener también secuencias reguladoras de ácido nucleico (por ejemplo, promotores, regiones no traducidas) que se encuentran naturalmente adyacentes a moléculas de ácido nucleico de la presente invención, o que son útiles para la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención (discutidas en detalle más adelante). Un vector puede ser o bien ARN o ADN, o bien procariota o eucariota, y típicamente es un plásmido o un vector viral. El vector puede ser mantenido como un elemento extracromosómico (por ejemplo, un plásmido) o puede estar integrado dentro del cromosoma de una célula huésped. El vector completo puede permanecer en su lugar dentro de una célula huésped, o bajo ciertas condiciones, se puede suprimir el ADN del plásmido, dejando atrás la molécula de ácido nucleico de la presente invención. Bajo otras condiciones, se diseña el vector para ser cortado (removido) del genoma de la célula huésped en un momento seleccionado (descrito con más detalle más adelante). La molécula de ácido nucleico integrada puede estar bajo el control del promotor cromosómico, bajo el control del promotor nativo o del plásmido, o bajo una combinación de diferentes controles del promotor. Se pueden integrar copias individuales o múltiples de la molécula de ácido nucleico dentro del cromosoma. Un vector recombinante de la presente invención puede contener al menos un marcador seleccionable.

De acuerdo con la presente invención, la frase "operativamente enlazado" se refiere al enlazamiento de una molécula de ácido nucleico con una secuencia de control de la expresión (por ejemplo, una secuencia de control de la transcripción y/o una secuencia de control de la traducción) en una forma tal que la molécula puede ser expresada cuando se la transfecta (es decir, transformada, transducida, transfectada, conjugada o conducida) dentro de una célula huésped. Las secuencias de control de la transcripción son secuencias que controlan la iniciación, el alargamiento, o la terminación de la transcripción. Las secuencias particularmente importantes del control de la transcripción son aquellas que controlan el inicio de la transcripción, tal como secuencias promotoras, reforzadoras, operadoras y represoras. Las secuencias adecuadas de control de la transcripción incluyen cualquier secuencia de control de la transcripción que pueda funcionar en una célula huésped u organismo dentro del cual se va a introducir la molécula de ácido nucleico recombinante.

De acuerdo con la presente invención, el término "transfección" es utilizado para referirse a cualquier método por medio del cual una molécula exógena de ácido nucleico (es decir, una molécula de ácido nucleico recombinante) puede ser insertada dentro de una célula. El término "transducción" es un tipo específico de transfección en la cual se transfiere material genético desde una fuente hasta otra, tal como por medio de un virus (por ejemplo, un retrovirus) o un bacteriófago para transducción. El término "transformación" puede ser utilizado en forma intercambiable con el término "transfección" cuando se utiliza tal término para referirse a la introducción de moléculas de ácido nucleico dentro de células microbianas, tales como bacterias y levaduras. En sistemas microbianos, el término "transformación" se utiliza para describir un cambio heredado debido a la adquisición de ácidos nucleico exógenos por el microorganismo y es esencialmente sinónimo con el término "transfección". Sin embargo, en células animales, la transformación ha adquirido un segundo significado que puede referirse a cambios en las propiedades de crecimiento de células en cultivo después de que se han convertido en cancerosas, por ejemplo. Por lo tanto, para evitar confusión, el término "transfección" se usa preferiblemente aquí con relación a la introducción de ácidos nucleicos exógenos en células animales. Por lo tanto, el término "transfección" será utilizado aquí para abarcar generalmente transfección o transducción de células animales, y transformación o transducción de células microbianas, hasta el grado en que los términos se relacionan con la introducción de ácidos nucleicos exógenos dentro de una célula. Las técnicas de transfección incluyen, pero no se limitan a, transformación, transducción, bombardeo de partículas, difusión, transporte activo, sonicación en baño, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, infección y fusión de protoplastos.

Como se utiliza aquí, la referencia a una proteína aislada o polipéptido en la presente invención incluye proteínas de longitud completa, proteínas de fusión, proteínas quiméricas, o cualquier fragmento (forma truncada, porción) u homólogo de tal proteína. Más específicamente, una proteína aislada de acuerdo con la presente invención, es una proteína (que incluye un polipéptido o péptido) que ha sido removida de su medio ambiente natural (es decir, que ha sido sometida a manipulación humana), y puede incluir, pero sin limitarse a, proteínas purificadas, proteínas parcialmente purificadas, proteínas producidas en forma recombinante, proteínas enlazadas a la membrana, proteínas que forman complejos con lípidos, proteínas solubles, proteínas producidas en forma sintética, y proteínas aisladas asociadas con otras proteínas. Como tal, "aisladas" no refleja el grado en el cual ha sido purificada la proteína. Preferiblemente, una proteína aislada de la presente invención es producida en forma recombinante. Además, y nuevamente por medio de un ejemplo con respecto al nombre de una proteína particular (Bcl-2), una "proteína Bcl-2 humana" o una proteína "derivada de" una proteína Bcl-2 humana se refiere a una proteína Bcl-2 (que incluye un homólogo o una porción de una proteína Bcl-2 de ocurrencia natural) de un humano (Homo sapiens)

o a una proteína Bcl-2 que ha sido por lo demás producida a partir del conocimiento de la estructura (por ejemplo, una secuencia) y quizás la función de una proteína Bcl-2 de ocurrencia natural de Homo sapiens. En otras palabras, una proteína Bcl-2 humana incluye a cualquier proteína Bcl-2 que tenga una estructura y función sustancialmente similar de una proteína Bcl-2 de ocurrencia natural de Homo sapiens como se describe aquí en forma detallada. Como tal, una proteína Bcl-2 humana puede incluir proteínas purificadas, parcialmente purificadas, recombinantes, montadas/modificadas y sintéticas. De acuerdo con la presente invención, los términos "modificación" y "mutación" pueden ser utilizados en forma intercambiable, particularmente con relación a las modificaciones/mutaciones con la secuencia de aminoácidos de una proteína (o secuencias de ácido nucleico) descrita aquí.

Como se utiliza aquí, el término "homólogo" se utiliza para referirse a una proteína o péptido que difiere de una proteína o péptido de ocurrencia natural (es decir, la proteína "prototipo" o "de tipo silvestre") por modificaciones, incluidas modificaciones menores, con respecto a la proteína o al péptido de ocurrencia natural, pero que mantiene la proteína básica y la estructura de la cadena lateral de la forma de ocurrencia natural. Tales cambios incluyen, pero no se limitan a: cambios en una o en unas pocas (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10) cadenas laterales de aminoácidos; cambios de uno o de unos pocos aminoácidos, incluidas las supresiones (por ejemplo, una proteína o una forma truncada de la proteína o del péptido), inserciones y/o sustituciones; cambios en estereoquímica de uno o de unos pocos átomos; y/o derivatizaciones menores, incluyendo pero sin limitarse a: metilación, glicosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palmitación, amidación y/o adición de glicosilfosfatidil inositol. Un homólogo puede tener propiedades ya sea mejoradas, menores, o sustancialmente similares comparado con la proteína o el péptido de ocurrencia natural. Un homólogo puede incluir un agonista de una proteína o un antagonista de una proteína.

Los homólogos pueden ser el resultado de una variación alélica natural o de una mutación natural. Una variante alélica de ocurrencia natural de un ácido nucleico que codifica una proteína es un gen que se presenta esencialmente el mismo locus (o loci) el genoma como el gen que codifica tal proteína, pero que, debido a variaciones naturales causadas por, por ejemplo, mutación o recombinación, tiene una secuencia similar pero no idéntica. Las variantes alélicas típicamente codifican proteínas que tienen actividad similar a aquella de la proteína codificada por el gen con el cual están siendo comparadas. Una clase de variantes alélicas puede codificar la misma proteína pero tienen diferentes secuencias de ácido nucleico debido a la degeneración del código genético. Las variantes alélicas pueden incluir también alteraciones en las regiones no producidas 5’ ó 3’ del gen (por ejemplo, en regiones reguladoras de control). Las variantes alélicas son bien conocidas por aquellos capacitados en el arte.

Los homólogos pueden ser producidos utilizando técnicas conocidas en el arte para la producción de proteínas incluyendo, pero sin limitarse a, modificaciones directas a la proteína aislada de ocurrencia natural, síntesis directa de proteína, o modificaciones a la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína utilizando, por ejemplo, técnicas clásicas o recombinantes de ADN para efectuar mutagénesis aleatoria o dirigida.

En una modalidad, un homólogo de una proteína dada comprende, consiste esencialmente de, o consiste de, una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 45%, o aproximadamente al menos 50%, o aproximadamente al menos 55%, o aproximadamente al menos 60%, hubo aproximadamente al menos 65%, o aproximadamente al menos 70%, o aproximadamente al menos 75%, o aproximadamente al menos 80%, o aproximadamente al menos 85%, o aproximadamente al menos 90%, o aproximadamente al menos 95% idéntica, o aproximadamente al menos 96% idéntica, o aproximadamente al menos 97% idéntica, o aproximadamente al menos 98% idéntica, o aproximadamente al menos 99% idéntica (o cualquier porcentaje de identidad entre 45% y 99%, en incrementos de números enteros), con la secuencia de aminoácidos de la proteína de referencia. En una modalidad, el homólogo comprende, consiste esencialmente de, o consiste de, una secuencia de aminoácidos que es menos del 100% idéntica, aproximadamente menos del 99% idéntica, aproximadamente menos del 98% idéntica, aproximadamente menos del 97% idéntica, aproximadamente menos del 96% idéntica, aproximadamente menos del 95% idéntica, y así sucesivamente, en incrementos de 1%, hasta aproximadamente menos del 70% idéntica con la secuencia de aminoácidos de ocurrencia natural de la proteína de referencia.

Como se utiliza aquí, a menos que se especifique otra cosa, la referencia a un porcentaje (%) de identidad se refiere a una evaluación de la homología que se realiza utilizando: (1) una búsqueda de homología con BLAST 2.0 Basic BLAST utilizando blastp para búsquedas de aminoácidos y blastn para búsquedas de ácido nucleico con parámetros estándar por defecto, en donde la secuencia de consulta es filtrada para regiones de baja complejidad por defecto (descrito en Altschul, S. F., Madden, T. L., Schääffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D. J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389 - 3402, incoporado aquí como referencia en su totalidad); (2) una alineación con BLAST 2 (utilizando los parámetros descritos más adelante); (3) y/o PSI-BLAST con los parámetros estándar por defecto (BLAST Iterado Específico de la Posición. Se observa que debido a algunas diferencias en los parámetros estándar entre BLAST 2.0 Basic BLAST y BLAST 2, dos secuencias específicas pueden ser reconocidas por tener homología significativa utilizando el programa BLAST 2, mientras que una búsqueda realizada en BLAST 2.0 Basic BLAST utilizando una de las secuencias como la secuencia de consulta puede no identificar la segunda secuencia en las correspondencias superiores. Además, PSI-BLAST proporciona una versión automatizada, fácil de utilizar de un "perfil" de búsqueda, que es una forma sensible de buscar homólogos de secuencia. El programa lleva a cabo primero una búsqueda en la base de datos de BLAST con espacios. El programa PSI-BLAST utiliza la información de cualquiera de las alineaciones significativas retornadas para construir una matriz de puntuación específica de la posición, que reemplaza la secuencia de consulta por la siguiente ronda de la búsqueda en la base de datos. Por lo tanto, debe entenderse que el porcentaje de identidad se puede determinar por medio del uso de cualquiera de estos programas.

Todos secuencias específicas pueden alinearse entre sí utilizando una secuencia BLAST 2 como la descrita en Tatusova y Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: 247 - 250, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. La alineación de la secuencia con BLAST 2 se lleva a cabo en blastp o blastn utilizando el algoritmo BLAST 2.0 para realizar una búsqueda con Gapped BLAST (BLAST 2.0) entre las dos secuencias permitiendo la introducción de espacios (supresiones e inserciones) en la alineación resultante. Para propósitos de claridad aquí, una alineación de secuencia con BLAST 2 se lleva a cabo utilizando parámetros estándar por defecto de la siguiente manera.

Para blastn, utilizando la matriz 0 BLOSUM62:

Recompensa por coincidencia = 1

Penalización por falta de coincidencia = -2

Penalizaciones por espacio abierto (5) y extensión de la brecha (2)

Caída por brecha x (50) esperado (10) tamaño de palabra (11) filtro (activo)

Para blastp, utilizando la matriz 0 BLOSUM62:

Penalizaciones por espacio abierto (11) y extensión de la brecha (1)

Caída por brecha x (50) esperado (10) tamaño de palabra (3) filtro (activo).

De acuerdo con la presente invención, una proteína aislada, incluido un homólogo biológicamente activo o un fragmento del mismo, tiene al menos una característica de actividad biológica, de actividad de tipo silvestre, o de proteína natural (nativa). En general, la actividad biológica o la acción biológica de una proteína se refiere a cualquier función(es) exhibida(s) o llevada(s) a cabo por la proteína que se atribuye a la forma de ocurrencia natural de la proteína como se midió u observó in vivo (es decir, bajo condiciones de laboratorio). Las modificaciones, actividades o interacciones que resultan en una disminución de la expresión de la proteína o en una disminución en la actividad de la proteína, pueden denominarse como inactivación (completa o parcial), reducción de la expresión, acción reducida, o una menor acción o actividad de una proteína. En forma similar, las modificaciones, actividades o interacciones que resultan en un incremento en la expresión de la proteína o en un incremento en la actividad de la proteína, pueden denominarse como ampliación, sobreproducción, activación, mejoramiento, aumento de la expresión o una mayor acción de una proteína.

Método para inmortalización condicional de la invención

Una modalidad de la presente invención se relaciona con un método para producir células madre adultas inmortalizadas en forma condicional, y preferiblemente células madre a largo plazo. El método generalmente incluye las siguientes etapas: (a) obtener una población expandida de células madre adultas; (b) transfectar (transducir) las células madre con un vector que contiene un protooncogén que promueve la supervivencia y proliferación de las células, en donde el protooncogén puede ser regulado (inducible, controlable), (c) transfectar (transducir) las células madre con un vector que codifica una proteína que inhiben la apoptosis de la célula; y (d) expandir las células transfectadas en presencia de una combinación de factores de crecimiento de células madre bajo condiciones por medio de las cuales se activa el protooncogén. En una modalidad, el vector es un vector de integración. Las células producidas por este método pueden ser cultivadas, expandidas, almacenadas, recuperadas, utilizadas en métodos terapéuticos, utilizadas en métodos de investigación y descubrimiento, manipuladas genéticamente, inducidas para diferenciación removiendo las condiciones por medio de las cuales se activa el protooncogén, y/o utilizadas en cualquier otro método descrito aquí o evidente para alguien capacitado en el arte de acuerdo con esta descripción. Las etapas (b) y (c) pueden ser llevadas a cabo en cualquier orden.

De acuerdo con la presente invención, la frase "inmortalizada en forma condicional" se refiere a células que son inmortalizadas (por ejemplo, capaces de crecimiento indefinido sin diferenciación en una forma que depende de citoquina, mientras se mantiene su habilidad y su potencial para diferenciarse en una cantidad de linajes diferentes bajo las condiciones apropiadas) en una forma reversible, de tal manera que se inmortalizan las células bajo un conjunto específico de condiciones, y cuando se remueven o cambian esas condiciones (u otras condiciones añadidas), las células no se inmortalizan más y se diferencian en otros tipos de células. La frase "inmortalizada en forma condicional" puede ser utilizada en forma intercambiable con la frase "inmortalizada en forma reversible". Por ejemplo, con referencia al método de la presente invención, la presencia del protooncogén regulable que promueve la supervivencia de la célula y provoca la proliferación de las células para retener un fenotipo inmortalizado cuando la célula madre es colocada bajo condiciones que permitan que el protooncogén sea activado (por ejemplo, Tamoxifeno o un agonista del mismo en el caso de MYC-ER). En otras palabras, el crecimiento y expansión de las células indefinidamente en cultivo, y que son mantenidas en un estado no diferenciado bajo estas condiciones específicas. Cuando se quitan estas condiciones (por ejemplo, se retira el Tamoxifeno con respecto a MYC-ER), las células madre ya no son inmortalizadas y pueden diferenciarse en diferentes linajes de células de acuerdo al ambiente apropiado (por ejemplo, la combinación apropiada de factores de crecimiento).

Con referencia a "células madre", como se utiliza aquí, se refiere al término como es generalmente entendido en el arte. Por ejemplo, células madre, independientemente de su fuente, son células que son capaces de dividirse y de renovarse por sí mismas durante largos períodos de tiempo, y son no especializadas (no diferenciadas), y pueden dar lugar a (diferenciarse en) tipos de células especializadas (es decir, son células progenitoras o precursoras para una variedad de diferentes tipos de células especializadas). "Largo plazo", cuando se utiliza junto con células madre, se refiere a la habilidad de las células madre para renovarse por sí mismas dividiéndose en el mismo tipo de células no especializadas durante largos periodos (por ejemplo, muchos meses, tal como al menos 3 meses, hasta años) dependiendo del tipo específico de células madre. Como se discutió aquí, características fenotípicas de diferentes células madre a largo plazo de diferentes especies animales, tal como células madre hematopoyéticas a largo plazo (lt-HSC) son conocidas en el arte. Por ejemplo, las lt-HSC de múrido pueden ser identificadas por medio de la presencia de los siguientes fenotipos marcadores de la superficie de la célula: c-kit+, Sca-1+, CD34-, flk2- (ver los Ejemplos). Las células madre adultas incluyen células madre que pueden ser obtenidas a partir de cualquier tejido o fuente no embrionaria, y generan típicamente los tipos de células del tejido en el cual residen. El término "célula madre adulta" puede ser utilizado en forma intercambiable con el término "célula madre somática".

En una modalidad de la invención, las células madre utilizadas en la presente invención incluyen cualquiera de las células madre adultas obtenidas a partir de cualquier fuente. Las células madre útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, células madre hematopoyéticas, células madre mesenquimales (incluyendo, pero sin limitarse a, células madre mesenquimales de pulmón, células estromales de médula ósea), células madre neurales, células madre epiteliales (incluyendo, pero sin limitarse a, células madre epiteliales de pulmón, células madre epiteliales de mama, células madre epiteliales vasculares, y células madre epiteliales intestinales), células madre intestinales, células madre progenitoras de miocito cardiaco, células madre de la piel (incluyendo, pero sin limitarse a, células madre epidérmicas y células madre foliculares (células madre del folículo capilar)), células madre de músculo esquelético, células madre precursoras osteoblásticas, y células madre de hígado.

Las células madre hematopoyéticas dan lugar a todos los tipos de células sanguíneas, incluyendo, pero sin limitarse a, glóbulos rojos (eritrocitos), linfocitos B, linfocitos T, células asesinas naturales, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos, macrófagos, y plaquetas.

Las células madre mesenquimales (incluidas las células estromales de médula ósea) dan lugar a una variedad de tipos de células, incluyendo, pero sin limitarse a, células óseas (osteocitos), células de cartílago (condrocitos), células de grasa (adipocitos), células de pulmón, y otras clases de células del tejido conectivo tal como aquellas de los tendones.

Las células madre neurales en el cerebro dan lugar a sus tres tipos principales de células: células nerviosas (neuronas) y dos categorías de células no neuronales, astrocitos y oligodendrocitos.

Las células madre epiteliales en el revestimiento de diferentes tejidos dan lugar a diferentes tipos de células que forman los tejidos en el epitelio.

Las células madre de la piel se presentan en la capa basal de la epidermis y en la base de los folículos capilares. Las células madre epidérmicas dan lugar a queratinocitos, que migran a la superficie de la piel y forman una capa protectora, y las células madre foliculares pueden dar lugar tanto en folículo capilar como a la epidermis. Otras fuentes de células madre adultas son conocidas por aquellos capacitados en el arte.

Las células madre embrionarias pueden dar lugar a todos los tejidos y células del cuerpo.

Los métodos para obtener tales células madre y proveer las condiciones iniciales de cultivo, tales como un cultivo líquido o un medio de cultivo semisólido, son conocidos en el arte. Las células son inicialmente expandidas in vivo o in vitro, poniendo en contacto la fuente de las células madre con un reactivo adecuado que expande o enriquece tales células en la fuente del tejido o en cultivo. Por ejemplo, en el caso de células madre hematopoyéticas, el individuo donante puede ser tratado con un agente que enriquece de células madre hematopoyéticas y estimula tales células para proliferar sin diferenciación, tal como 5-fluorouracilo. Otros agentes adecuados para la expansión de un tipo deseado de célula madre serán conocidos por aquellos capacitados en el arte. Alternativamente, y preferiblemente, se aíslan células madre adultas de una fuente del tejido y luego se expanden o enriquecen in vitro por exposición a un agente adecuado. Por ejemplo, con relación a las células madre hematopoyéticas, un método para producir un cultivo expandido de progenitores hematopoyéticos adultos está escrito en Van Parijs et al., (1999; Immunity, 11, 763 - 70). Las células se obtienen de un individuo por medio de cualquier método adecuado para obtener una muestra de células de un animal, incluyendo, pero sin limitarse a, la recolección de médula ósea, la recolección de un fluido corporal (por ejemplo, sangre), la recolección de sangre del cordón umbilical, picado de tejido, y disección de tejido, incluyendo particularmente, pero sin limitarse a, cualquier biopsia de piel, intestino, cornea, médula espinal, tejido cerebral, cuero cabelludo, estómago, mama, pulmón (por ejemplo, incluyendo lavado y bronquioscopía), aspiraciones con aguja fina de la médula ósea, fluido amniótico, placenta y saco vitelino.

En una modalidad, las células útiles en la invención puede ser obtenidas también a partir de sangre del cordón umbilical fresca, o criopreservada (almacenada), células madre hematopoyéticas (las HSC) obtenidas a partir de sangre periférica de pacientes normales tratados con el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) que han sido inducidos para movilizar sus lt-HSC hacia la circulación periférica.

Una vez se obtiene una población expandida de células madre (puesta a disposición, suministrar, o producida), las células son transfectadas, ya sea en forma secuencial (en cualquier orden) o en forma simultánea, con: (1) un vector que contiene un protooncogén que promueve la supervivencia y proliferación de las células, en donde el protooncogén es regulable (inducible, controlable), y (2) un vector que codifica una proteína que inhibe la apoptosis de la célula. Preferiblemente, el vector es un vector de integración, definido aquí como cualquier vector que tiene la habilidad de integrarse dentro del genoma de una célula (por ejemplo, un vector retroviral). Más adelante se describen en detalle diferentes vectores y métodos de transfección. El protooncogén es regulable (inducible o controlable), de manera que el protooncogén puede ser activado y desactivado (es decir, encendido o apagado) según se desee ya sea para mantener la célula madre en un estado inmortalizado o para permitir que se diferencie en un tipo de célula deseado. Los protooncogenes se pueden seleccionar, o diseñar, para ser regulados por medio de cualquier método adecuado, incluyendo una respuesta a cualquier condición, tal como la presencia o la ausencia de un compuesto o agente, temperatura, o cualquier otra condición adecuada. Por ejemplo, los protooncogenes MYC-ER (MYC regulado del receptor de estrógeno (ER)) e ICN-1-ER (la porción intracelular regulada del ER de Notch-1) descritos aquí son ambos inducibles en presencia de Tamoxifeno. Se observa que tales genes pueden ser también modificados por ingeniería genética para ser sensibles a otros fármacos de dimerización, tales como FK1012, formas alteradas de Rapamicina, o podrían ser expresados a partir de vectores que contienen un elemento sensible a la tetraciclina. El escenario de este último regula la expresión de la proteína, no la función de un polipéptido presente en la célula. Otras modificaciones similares de esta tecnología de la plataforma serán evidentes para aquellos capacitados en el arte.

El protooncogén útil en el método de la presente invención es cualquier protooncogén que promueva la supervivencia y proliferación de las células. Los protooncogenes preferidos para ser utilizados en el método de la invención incluyen, pero no se limitan a MYC, ICN-1, hTERT (componente de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana), NMYC, S-MYC, L-MYC, Akt (miristilada).Además, otros genes adecuados para ser utilizados o métodos de la invención o formas para modificar genes para lograr el resultado deseado incluyen, pero no se limitan al uso de efectores de señalización secuencia abajo tales como piruvato deshidrogenasa quinasa 1 (PDK-1); mamífero objetivo de la Rapamicina (mTOR); pérdida de fosfatasa y homólogo de tensina (PTEN) por ARNsh; Bcl-3, Ciclina D1, Ciclina D3, Bcl-10, Bcl-6, BCR-ABL (fusión de la región de agrupación del punto de ruptura con ABL) y sus diferentes formas mutantes, formas constitutivamente activas de Stat5 y Stat3, AML1-ETO (fusión de leucemia mielógena aguda 1 y el factor de transcripción 1 relacionado con enanos), MLL-ENL (leucemia de linaje mixto y leucemia once diecinueve), genes Hox, formas activadas de la cadena β del receptor de interleukina-3 (IL-3), y otras cadenas del receptor de citoquina (receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), c-kit, receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), etc.), así como wnt (todas las formas del mamífero), β-catenina, erizo Sonic (shh-1 y todas las formas del mamífero), bmi-1 y c-jun (todas las formas del mamífero). También, la presente invención incluye inducción de la pérdida (o inhibición) de inhibidores de ciclina quinasa por ARNsh, incluyendo, pero sin limitarse a, p16, p19, p21 y p27. En una modalidad, la presente invención incluye el uso de homólogos regulables de cualquiera o de tales protooncogenes (por ejemplo, MYC-ER o ICN-1-ER) u otros genes. Los ejemplos describen el uso de ambos MYC-ER o ICN-1-ER para producir exitosamente lt-HSC inmortalizadas en forma condicional utilizando el método de la presente invención.

La secuencia de ácido nucleico que codifica MYC humana es representada aquí como la SEQ ID NO: 1, que codifica una secuencia de aminoácidos representada aquí como la SEQ ID NO: 2. La secuencia de ácido nucleico que codifica hTERT es representada aquí como la SEQ ID NO: 3, que codifica una secuencia de aminoácidos representada aquí como la SEQ ID NO: 4. La secuencia de ácido nucleico que codifica ICN-1 humana es representada aquí como la SEQ ID NO: 11, que codifica una secuencia de aminoácidos representada aquí como la SEQ ID NO: 12. ICN-1, una porción de Notch-1, y específicamente, los aminoácidos 1757 - 2555 de Notch-1 (ver Aster et al., Mol Cell Biol. 2000 Oct; 20(20): 7505 - 15, incorporada aquí como referencia en su totalidad). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para MYC-ER son conocidas en el arte y la proteína MYC-ER es descrita en Soloman et al., Oncogene. 1995 Nov 2; 11(9): 1893 - 7, incorporada aquí como referencia en su totalidad. ICN-1-ER fue creada aquí por los presentes inventores y la secuencia de ácido nucleico que codifica esta proteína es representada aquí como la SEQ ID NO: 13, que codifica una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 14.

En forma similar, un gen preferido anti-apoptosis es Bcl-2, aunque otros genes que codifican proteínas que inhiben la apoptosis y particularmente, mantienen la supervivencia de la célula cuando se inactiva el protooncogén en la célula madre, están incluidos en la presente invención. La secuencia de ácido nucleico que codifica Bcl-2 alfa está representada aquí como la SEQ ID NO: 5, que codifica una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. Bcl-2 beta está representado aquí como la SEQ ID NO: 7, que codifica una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:

8. Un gen "anti-apoptosis" se define aquí como cualquier gen que codifica una proteína que puede inhibir (reducir, incrementar, estimular, permitir) la supervivencia de la célula, incluso en presencia de condiciones que podrían inducir apoptosis. Las proteínas asociadas con apoptosis, y los genes que codifican tales proteínas, son bien conocidos en el arte. Tales otros genes incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los genes en la familia Bcl-2 que probablemente serán importantes en el establecimiento de la transformación condicional de células madre adultas (es decir, no solamente células madre hematopoyéticas). Estos genes incluyen, pero no se limitan a, otros miembros en pro de la supervivencia de la familia Bcl-2, tales como Bcl-X, Bcl-w, BclXL, Mcl-1, Dad-1, o hTERT (componente de la transcriptasa reversa de la telomerasa humana, que ha mostrado que inhibe la proliferación). Tales genes son ectópicamente sobreexpresados en presencia del oncogén regulado, como se describe con Bcl-2 aquí en los ejemplos de trabajo. Además, este aspecto de la presente invención incluye el uso de desactivación del gen mediada por ARNsh (o ruptura o inhibición por medio de cualquier otro método) para los únicos miembros BH3 de la familia bcl-2 que son proapoptóticos (por ejemplo, Bim, PUMA, NOXA, Bax, Bak, BclXS, Bad, Bar, y otros), así como la ruptura de Caspasas 3, 9, 10, MLL-1 (y todas las formas de los mamíferos), Enl-1 (Sin endoseprma-1) y todas las formas del mamífero, Apaf-1 y otros elementos que forman parte del apoptosoma.

La secuencia de ácido nucleico para cada uno de estos genes descritos anteriormente o la región de codificación de los mismos es conocida en el arte y se encuentra públicamente disponible, incluida la de los humanos. En forma similar, la secuencia de aminoácidos para proteínas codificadas por estos genes es conocida en el arte y se encuentra públicamente disponible.

Los presentes inventores han producido varias células madre diferentes inmortalizadas en forma condicional a largo plazo utilizando el método de la presente invención y utilizando diferentes combinaciones de protooncogenes y genes anti-apoptóticos, incluidas las siguientes combinaciones: MYC-ER y Bcl-2; MYC-ER y hTERT (componente de la transcriptasa reversa de la telomerasa humana); ICN-1-ER y Bcl-2; ICN-1-ER y hTERT; y MYC-ER e ICN-1-ER.

Cabe señalar que con respecto ya sea al protooncogén o al gen que codifica una proteína anti-apoptosis usados en el presente método, que no se requiere utilizar el gen completo en las construcciones descritas aquí, ya que cualquier porción del gen o de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADNc) que codifica al producto proteico funcional deseado, una porción funcional del mismo, o un homólogo funcional del mismo están abarcados por la invención. Por lo tanto, se entiende que la referencia que se hace aquí en forma general a los genes o a los transgenes utilizados para transfectar células madre es sólo un ejemplo y para incluir el uso de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifican al gen completo, la región entera de codificación del gen, o porciones de los genes u homólogos de los mismos, siempre que tales secuencias de ácido nucleico codifiquen proteínas funcionales adecuadas para uso en la presente invención.

En una modalidad de la presente invención, el presente método adicional incluye el uso de los ARNsh o los ARNsi que están dirigidos contra los ARN que codifican proteínas proapoptóticas, tales como los miembros proapoptóticos de la familia Bcl-2, especialmente aquellos únicamente del tipo BH3 (Bim, Bax, Bak, Puma, Noxa, etc.). La ruptura de un gen proapoptótico en el contexto de un oncogén regulado se espera que resulte en una inmortalización más eficiente de ciertas poblaciones de células madre. La interferencia de ARN (ARNi) es un proceso por medio del cual se usa ARN bicatenario, y en sistemas de mamíferos, ARN de interferencia corta (ARNsi) o ARN de horquilla corta (ARNsh), para inhibir o silenciar la expresión de genes complementarios. En la célula objetivo, se desarrollan ARNsi y se asocian con un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que es luego guiado hasta las secuencias de ARNm que son complementarias con el ARNsi, por lo cual el RISC escinde al ARNm. El ARNsh es transfectado dentro de una célula objetivo en un vector en donde es transcrito, y luego procesado por las enzimas DICER para formar moléculas del tipo ARNsi que activan al RISC, que, como con el ARNsi, es luego guiado hasta las secuencias de ARNm que son complementarias con el ARNsh, por lo cual el RISC escinde al ARNm.

Las células madre pueden ser transfectadas con los vectores que contienen al protooncogén y que codifican a la proteína anti-apoptosis utilizando cualquier método adecuado de transfección de células, y particularmente células de mamífero, incluso mediante el uso de combinaciones de técnicas. Los presentes inventores han descubierto que es la coordinación particular entre los genes (o construcciones) que se expresan lo que ha resultado en la generación de células madre a largo plazo, inmortalizadas en forma condicional como se describe aquí. Los Ejemplos han demostrado el uso de vectores retrovirales, pero otros métodos incluyen, pero no se limitan a, el uso de otros virus y de vectores virales derivados a partir de allí, incluyendo, pero sin limitarse a, vectores lentivirales, parvovirus, virus vacuna, coronavirus, calicivirus, virus del papiloma, flavivirus, ortomixovirus, ortomixovirus, togavirus, picornavirus, vectores adenovirales, herpesvirus atenuados y modificados. Cualquiera de tales virus puede ser modificado adicionalmente con moléculas expresadas en superficies específicas que dirigen estas hacia las HSC u otras células madre, tal como SCF enlazada a la membrana, u otros ligandos del factor de crecimiento específicos de células madre. Otros métodos de transfección de células de mamífero incluyen, pero no se limitan a, electroporación de vectores de expresión de mamíferos, tal como por medio del uso de tecnología NUCLEOFECTORTM (AMAXA Biosystems). Esta tecnología es un método de transferencia de genes no viral altamente eficiente para la mayoría de las células primarias y para líneas de células difíciles de transfectar, que es una mejora sobre el método largo tiempo conocido de electroporación, basado en el uso de combinaciones específicas de tipo celular de corriente eléctrica y soluciones para transferir macromoléculas polianiónicas directamente dentro de los núcleos. Adicionalmente, los métodos adecuados de transfección pueden incluir cualquier método bacteriano, de levadura u otros métodos artificiales de suministro de genes que son conocidos en el arte.

La etapa de expandir las células madre transfectadas o de cultivar las células madre y las proteínas de fusión exógena (por ejemplo, las proteínas de fusión Tat descritas en las variaciones de este método descrito más adelante) en presencia de factores de crecimiento adecuados puede incluir el uso de cualquiera de las condiciones adecuadas de cultivo, incluyendo aquellas específicamente descritas aquí. La combinación de factores de crecimiento de células madre adecuadas pueden incluir cualquiera de los factores de células madre que permite que las células transfectadas de la invención crezcan, sobrevivan y proliferen en el cultivo. Aunque se describen aquí combinaciones específicas, y aunque esta es una etapa importante del presente método, esta etapa puede ser simplemente descrita como proveyendo cualquier combinación de factores de crecimiento que son adecuados para el crecimiento, proliferación y supervivencia de las células madre, e incluye cualquiera de las combinaciones que son conocidas en el arte. Por lo tanto, la invención no se limita a una combinación particular. Una combinación preferida de factores de crecimiento incluye: nterleuquina-6 (IL-6), IL-3 y el factor de célula madre (SFC). Otra combinación preferida de factores de crecimiento incluye un factor de células madre (SCF), trombopoyetina (TPO), un Factor de Crecimiento 2 tipo insulina (IGF-2) y un Factor de Crecimiento 1 de fibroblastos (FGF-1), en medio libre de suero. Esta última combinación fue recientemente descrita en Zhang y Lodich (2005; Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion, Blood 105, 4314 - 20). Las células madre transfectadas con moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de combinaciones descritas aquí (por ejemplo, MYC-ER y Bcl-2 como se describe en los ejemplos) se espera que también se vuelvan inmortalizadas en forma condicional en este coctel de factores de crecimiento, como con el coctel descrito en los Ejemplos anteriores (utilizando IL-3, IL-6 y SCF). Otros factores de crecimiento para uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas tipo angiopoyetina (por ejemplo, Agpt12, Angpt13, Angpt15, Angpt17, etc.), proliferina-2 (PLF2), inhibidores de glicógeno sintasa quinasa-3, inducidores de las rutas de señalización wnt y Notch, Flt3L y citoquinas relacionadas, factor de crecimiento 2 de fibroblastos (FGF2) y citoquinas relacionadas, wnt-1 y otros activadores de la ruta Wnt, erizo Sonic (shh-1) y otros activadores de esa ruta. Otras combinaciones adecuadas de factores de crecimiento serán aplicables al método de la presente invención y serán evidentes para aquellos capacitados en el arte. En realidad, las líneas de células generadas utilizando el método de la presente invención pueden ser usadas fácilmente para seleccionar citoquinas adicionales y factores de crecimiento que podrían ser utilizados para expandir las células madre a largo plazo, o cualquiera de sus progenitores derivados, in vitro bajo condiciones neutras o dirigidas.

De acuerdo con la presente invención, un medio adecuado para el cultivo de células animales puede incluir cualquier medio disponible que haya sido desarrollado para el cultivo de células animales y particularmente, células de mamífero, o que pueda ser preparado en el laboratorio con los componentes apropiados necesarios para el crecimiento de células animales, tales como carbono asimilable, nitrógeno y micronutrientes. Tal medio incluye un medio base, que es cualquier medio base adecuado para el crecimiento de células animales, incluyendo, pero sin limitarse a, el Medio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM), medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), MEM alfa (Gibco), RPMI 1640, o cualquier otro medio adecuado comercialmente disponible. Al medio base se le añaden fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y micronutrientes, incluyendo, pero sin limitarse a, una fuente de suero, factores de crecimiento, aminoácidos, antibióticos, vitaminas, agentes reductores, y/o fuentes de azúcar. Se observa que medios complementados que contienen un medio base y muchos de los componentes adicionales necesarios para el crecimiento de células animales se encuentran comercialmente disponibles, y algunos medios se encuentran disponibles para tipos particulares de cultivo de células. Además, se encuentran disponibles muchos medios libres de suero y pueden ser particularmente adecuados para el cultivo de células madre de acuerdo con la invención.

Células y composiciones

Otra modalidad de la presente invención se relaciona con una célula, una línea de células, o una población de células producidas de acuerdo con el método de la presente invención como se describe aquí. También están incluidas en la invención composiciones que contienen tales células, líneas de células o poblaciones de células. Para métodos terapéuticos, tales composiciones pueden incluir un portador farmacéuticamente aceptable, que incluye excipientes farmacéuticamente aceptables y/o vehículos para suministro, para el suministro de las células, líneas de células, o poblaciones de células a un paciente. Como se lo usa aquí, un portador farmacéuticamente aceptable se refiere a cualquier sustancia adecuada para el suministro de una composición terapéutica útil en el método de la presente invención para un sitio adecuado in vivo.

Adaptación del método de la invención para producir linajes de en etapas intermedias de desarrollo

Otra modalidad de la presente invención se relaciona con adaptaciones de los métodos nuevos descritas aquí para generar líneas de células que capturan etapas intermedias de desarrollo para los linajes hematopoyéticos. De acuerdo con la presente invención como una etapa "intermedia" de desarrollo o diferenciación se refiere a una etapa pluripotente del desarrollo o diferenciación de las células que está más abajo de la etapa de desarrollo o diferenciación de la célula madre a partir de la cual se deriva la célula "intermedia", pero está más arriba del punto de diferenciación final o terminal de una célula. Por ejemplo, una célula pre-B es una etapa intermedia de una célula madre hematopoyética, que puede diferenciarse todavía en una célula B madura. Las etapas intermedias de desarrollo o diferenciación serán entendidas por aquellos capacitados en el arte.

Más particularmente, para muchas aplicaciones terapéuticas y de descubrimiento o de investigación, así como para el almacenamiento de líneas de células, es deseable que las líneas de células tengan un fenotipo estable y retengan su habilidad para diferenciarse aún más a lo largo de su ruta comprometida una vez que el oncogén activo con el cual ha sido transfectada la célula se inactive. Por lo tanto, la presente invención abarca etapas adicionales de la producción de células que no se han diferenciado completamente (no están totalmente diferenciadas), sino más bien, están en una etapa intermedia de diferenciación. En un ejemplo no limitante de esta modalidad, las células madre a largo plazo producidas utilizando el método descrito anteriormente se diferencian en forma aleatoria in vitro después del retiro de las comisiones que mantenían la actividad del protooncogén o de otro gen que promueva la supervivencia y proliferación de la célula (por ejemplo, 4-OHT en el caso de los protooncogenes que dependen de Tamoxifeno), o por medio de la aplicación de las condiciones apropiadas que desactiven (inactiven) al protooncogén/oncogén. Esta etapa puede ser llevada a cabo mientras se mantiene al cultivo en condiciones neutras de crecimiento de citoquina (por ejemplo, IL-3, IL-6 y SCF), o por medio del reemplazo de esas citoquinas que podrían dirigir específicamente la diferenciación hacia un cierto linaje (por ejemplo, IL-7 y ligandos Notch para linajes linfoideos, GM-CSF e IL-4 para células dendríticas, G-CSF para células mielomonocíticas, etc.) con citoquinas que son neutras para diferenciación (no dirigen o conducen la diferenciación de las células). Una vez que los cultivos comienzan a mostrar marcadores de diferenciación consistentes con un linaje específico, se suplementa nuevamente el medio de cultivo con las condiciones que activan al protooncogén (por ejemplo, 4-OHT) o se lo expone a las condiciones que de otra manera reactivarían al protooncogén, con el propósito de estabilizar el fenotipo y de generar líneas de células que tengan un fenotipo estable de diferenciación intermedia.

A manera de ejemplo de este método, los inventores han generado células T CD4+, αβ+ in vitro a partir de células ABM42 (lt-HSC producidas por medio del método de la invención; ver los Ejemplos) por medio el retiro de 4-OHT del medio, y de una nueva adición de 4OHT después de la diferenciación. Los inventores también han generado líneas de células dendríticas por medio de la incubación de células ABM46 (ver los Ejemplos) en GM-CSF, IL-4 y FLT3L Y luego colocar nuevamente los cultivos en presencia de 4-OHT después de la diferenciación.

Otra aproximación para crear tales líneas de células involucra la introducción de las células ctlt-HSC en ratones para permitir la diferenciación, y detención, o estabilización de los fenotipos in vivo después de las inyecciones de 4-OHT. Este método está descrito en detalle en el Ejemplo 8. En resumen, y a manera de ejemplo, las lt-HSC generadas por medio del presente método son inyectadas en animales inmunocomprometidos (por ejemplo, ratones inmunocomprometidos). El oncogén en las lt-HSC se reactiva utilizando inyecciones del agente activador (por ejemplo, 4-OHT), se recolectan luego las células, y después se las puede cultivar in vitro para diferenciar las células, y entonces se las almacena o utiliza según se desee. Esta aproximación, y las otras descritas anteriormente, pueden ser utilizadas tanto por las líneas de células ctlt-HSC humanas como de múrido, por ejemplo por medio del uso ya sea de ratones NOD/SCID como receptores, o de ratones Rag-1-/- neonatales, a los cuales se les administrará inyecciones intrahepáticas.

Variaciones o modificaciones del método de inmortalización en forma condicional para la remoción del transgén

En una modalidad de la invención, con el propósito de evitar tomar el riesgo de introducir células madre que albergan transgenes tal como aquellos descritos aquí (por ejemplo, MYC-ER) en humanos y/o en ratones, se diseñan las construcciones recombinantes de tal manera que sean cortados estos fragmentos de ADN. Esta modalidad puede lograrse utilizando cualquier método adecuado para establecer primero las células madre a largo plazo de acuerdo con el método de la invención, y luego exponiendo las células (o un paciente) condiciones bajo las cuales será removido el ADN recombinante, cortado o completamente silenciado.

Por ejemplo, en un aspecto de la invención, se utiliza una aproximación de recombinasa bacteriana. En este aspecto de la invención, preferiblemente, se utilizan dos recombinasas diferentes con el propósito de permitir el control sobre cuál de los dos genes se extirpa en cualquier momento en el tiempo. Dos ejemplos de tales recombinasas son las recombinasas Cre y Flp, que son bien conocidas en el arte. En resumen, se introduce una de las secuencias para reconocimiento del sustrato (RSS) para una de las recombinasas en las construcciones retrovirales de tal manera que flanqueen el marco de lectura abierto del oncogén, así como al gen reportero (por ejemplo, GFP o Thy1.1). En este caso, se incuban las células en medio que contenga una proteína de fusión Tat-Cre (es decir, VIH u otra proteína retroviral Tat fusionada con Cre). Esta proteína recombinante ha sido previamente descrita y ha demostrado que es capaz de entrar en forma pasiva a las células, y mediar la recombinación que depende del sitio loxP de ADN genómico. Otros métodos de excisión del gen (molécula de ácido nucleico) son conocidos por aquellos capacitados en el arte y podrían ser fácilmente aplicados a la presente invención. Los Ejemplos 5 y 13 ejemplifican esta modalidad de la invención.

En otra modalidad de la invención, para proveer otro método de evitar el riesgo de introducir células madre que alberguen transgenes tales como aquellos descritos aquí en humanos y/o otros animales (por ejemplo, ratones), en vez de transfectar las células madre con la combinación de las construcciones recombinantes para el protooncogén

o la proteína anti-apoptosis, se lleva a cabo la invención haciendo uso de proteínas de fusión Tat como un método para permitir que las proteínas tengan acceso al interior de la célula sin tener que introducir transgenes dentro de la célula. Por ejemplo, pueden utilizarse construcciones recombinantes que codifiquen al tat-protooncogén o genes tatanti-apoptosis (por ejemplo, Tat-MYC-ER o Tat-Bcl-2) para inmortalizar en forma condicional células madre. En esta modalidad de la invención, se cultivarán células madre objetivo bajo condiciones de cultivo adecuadas, en un medio que contenga proteínas de fusión Tat recombinantes purificadas codificadas por la combinación del gen específico seleccionado (por ejemplo, MYC-ER y Bcl-2). En esta modalidad de la invención, el producto del protooncogén o un producto génico similar pueden ser inducibles, como en las modalidades anteriores. Alternativamente, o además, la acción de esta proteína puede ser regulada simplemente suministrando o removiendo la proteína del cultivo. Aunque las líneas de células que son generadas con esta aproximación dependerán continuamente de la admisión de las proteínas de fusión Tat exógenas, no tendrán una secuencia de nucleótidos exógena específica introducida dentro de ellas. Se espera que la ausencia de secuencias foráneas del oncogén mejore la implementación clínica del método de la presente invención. El virus de inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) Tat, es un ejemplo de proteína Tat, aunque se conocen otras proteínas Tat retrovirales en el arte. Como un ejemplo no limitante, la secuencia de ácido nucleico que codifica a la Tat de VIH-1 está representada aquí como la SEQ ID NO: 9, que codifica una secuencia de aminoácidos representada aquí por la SEQ ID NO: 10.

En otra modalidad, para proporcionar otro método de evitar el riesgo de introducir células madre que alberguen transgenes tales como aquellos descritos aquí en humanos y/o en otros animales (por ejemplo, ratones), en vez de transfectar las células madre con la combinación de las construcciones recombinantes para él protooncogén o la proteína anti-apoptosis, se lleva a cabo la invención por medio de la introducción de proteínas (por ejemplo, MYC y Bcl-2) dentro de una célula utilizando tecnología de aptámeros. Los aptámeros son hebras cortas de ácidos nucleicos sintéticos (usualmente ARN pero también ADN) seleccionadas a partir de bibliotecas de ácido nucleico combinatorial al azar en virtud de su habilidad para enlazarse con una molécula objetivo específica predeterminada con alta afinidad y especificidad. Los aptámeros asumen una estructura tridimensional definida y son capaces de discriminar entre compuestos con diferencias muy pequeñas en estructura. Por lo tanto, se pueden conjugar los aptámeros con las proteínas utilizadas en la invención o con ADNc no integrante que codifica las proteínas, por ejemplo, y usarlos para suministrar las proteínas o el ADN a las células. Además, se pueden utilizar fácilmente los aptámeros para suministrar ARNsi las células, por ejemplo, cuando se rompen proteínas proapoptóticas de acuerdo con la presente invención. La tecnología de aptámeros es discutida, por ejemplo, en Davidson, 2006, Nature Biotechnol. 24(8):951 - 952; y en McNamara et al., 2006, Nature Biotechnol. 24(8): 1005 - 1015). Nuevamente, se espera que la ausencia de secuencias foráneas de oncogén mejore la implementación clínica del método de la presente invención.

En otra modalidad, para proporcionar otro método de evitar el riesgo de introducir células madre que alberguen transgenes tales como aquellos descritos aquí en humanos y/o en otros animales (por ejemplo, el ratones), en vez de transfectar las células madre con la combinación de las construcciones recombinantes para el protooncogén o la proteína anti-apoptosis, se lleva a cabo la invención por medio de la introducción del protooncogén y/o de la proteína anti-apoptosis dentro de una célula utilizando tecnología CHARIOTTM (Krackeler Scientific, Inc., Albany, NY). Con esta tecnología, se forma un enlace no covalente entre un péptido CHARIOTTM y la proteína de interés. Esto protege la proteína de la degradación y preserva sus características naturales durante el proceso de transfección. Después del envío a una célula, se disocia el complejo y se transporta CHARIOTTM hasta el núcleo, mientras que la proteína suministrada está biológicamente activa y libre para proceder hasta su objetivo celular. Un suministro eficiente puede presentarse en presencia o en ausencia de suero, y es independiente de la ruta endosomal, que pueden modificar macromoléculas durante la internalización. Éste sistema de suministro también pasa por alto el proceso de transcripción - traducción. Por lo tanto, las proteínas útiles en la presente invención pueden ser suministrar a una célula y liberadas para inmortalizar en forma condicional la célula, sin la necesidad de la introducción de un protooncogén u oncogenes a la célula. Como anteriormente, se espera que la ausencia de secuencias foráneas del oncogén mejore la implementación clínica del método de la presente invención.

Incluso como otra alternativa (o adicional) se describe aquí un medio para controlar la posibilidad de una inserción de un protooncogén dentro del genoma de la célula huésped por medio de las diferentes aproximaciones virales descritas aquí, y por lo tanto evitar un evento de transformación, se pueden introducir un casete de sensibilidad al medicamento (susceptibilidad al fármaco) dentro de las construcciones virales que van a ser utilizadas de tal manera que se expresará en cada célula transducida y su progenie diferenciada. Un casete de sensibilidad al fármaco o un casete de susceptibilidad al fármaco es una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que vuelve una célula susceptible o sensible a la presencia de un fármaco particular, de manera que por exposición al fármaco, se inhibe la actividad de la célula y preferiblemente, sufren apoptosis. Aquellos pacientes en los cuales los niveles de una población particular de células sanguíneas se incrementan sin una causa aparente (por ejemplo, infección, trauma, estrés, etc.), se les puede dar un tratamiento reducido del fármaco hacia el cual se ha generado sensibilidad con el propósito de extirpar aquellas células y mitigar cualquier posible complicación adicional que involucre a las células en las cuales las inserciones genéticas pueden haber causado inadvertidamente una mutación oncogénica. Por lo tanto, como un ejemplo no limitante, se podría introducir dentro de una construcción utilizada en el método de la invención un casete que codifique al ADNc para HPRT con el propósito de volver susceptibles a las células transducidas a la 6-tioguanina. Otro ejemplo no limitante es la introducción del ADNc de timidina quinasa de un miembro de la familia del virus del Herpes simple (HSV-TK), con el propósito de volver a las células transducidas susceptibles a inhibidores relevantes tales como Ganciclovir, Aciclovir, y cualquiera de los derivados relevantes. Además, cualquier otro de tales casetes de sensibilidad al fármaco y sus agonistas relevantes funcionaria en este contexto.

Otros métodos para introducir ácidos nucleicos o proteínas de acuerdo con la presente invención dentro de una célula serían evidentes para aquellos capacitados en el arte. Aquellos que minimizan o eliminan el riesgo de introducir ADN recombinante dentro del genoma de una célula huésped son los preferidos por la invención, muchos de cuyos ejemplos están descritos más arriba.

Métodos de uso para células inmortalizadas en forma condicional de la invención

Otra modalidad de la presente invención incluye cualquiera de las poblaciones de células madre, incluidas poblaciones mixtas y clonales, que son producidas por medio del método de la invención, así como el uso de las células madre de la invención en cualquiera de los métodos descritos aquí, incluida diferenciación dentro de un tipo de célula deseada, y cualquier método de trasplantación, reemplazo de células, terapia para enfermedades, modificación por ingeniería genética, descubrimiento de fármacos, e investigación del desarrollo y diferenciación de células como se describe aquí.

Ya que se pueden producir ahora suministros virtualmente ilimitados de células madre homogéneas que pueden ser fácilmente almacenadas, recuperadas, expandidas y manipuladas, tales células madre pueden ser utilizadas como células madre o diferenciadas en diferentes linajes de células y utilizadas en ensayos para probar diferentes compuestos por los efectos sobre la diferenciación celular, la expresión génica, y los procesos celulares. Por lo tanto, una modalidad de la invención se relaciona con un método para identificar compuestos, que efectúa la diferenciación celular, expresión génica, y/o procesos celulares. El método generalmente incluye las etapas de poner en contacto las células madre producidas por medio del método de la presente invención con un compuesto que va a ser analizado, y medir un resultado particular, y particularmente un resultado deseado, tal como la expresión génica, una actividad biológica, diferenciación celular, crecimiento celular, proliferación celular, etc. (ver más adelante), comparado con la ausencia de compuesto, para determinar si el compuesto analizado tenía el efecto deseado o no sobre la célula madre. Este método puede ser usado para analizar virtualmente cualquier aspecto de la diferenciación celular, actividad celular o expresión génica. En un aspecto, se manipulan las células madre antes de ponerlas en contacto con los compuestos, por ejemplo por medio de manipulación genética. Se pueden evaluar en tales ensayos las células madre de individuos con defectos genéticos con el propósito de identificar compuestos terapéuticos (por ejemplo, compuestos terapéuticos contra el cáncer) y para evaluar las terapias de reemplazo de genes, por ejemplo. En realidad, la tecnología de la presente invención proporciona una oportunidad para elegir como blanco las células de un individuo específico para identificar candidatos a medicamentos y candidatos terapéuticos y estrategias que sean "confeccionadas" para las células de un individuo. Además, como se discutió anteriormente, se puede utilizar también tales ensayos para identificar otros factores de crecimiento o condiciones de cultivo que sean adecuadas para mantener las células madre de la invención en cultivo. Un ejemplo de tal ensayo está escrito en detalle más adelante en el Ejemplo 7, aunque la invención no se limita a este ensayo.

Otra modalidad de la invención se relaciona con un método para estudiar el compromiso y/o la diferenciación del linaje celular y el desarrollo de células a partir de una célula madre, que generalmente comprende cultivar las células madre inmortalizadas en forma condicional de la presente invención y evaluar tales células para marcadores genéticos y biológicos relacionados con el desarrollo y diferenciación de la célula bajo diferentes condiciones y en presencia y ausencia de compuestos o agentes que puedan afectar el compromiso o la diferenciación del linaje celular. Como se discutió anteriormente, antes de la presente invención, tales estudios se vieron fuertemente obstaculizados por la falta de acceso y la inhabilidad para generar cantidades suficientes de la población deseada de células para llevar a cabo los experimentos deseados. Por ejemplo, con el propósito de identificar o seleccionar los intermediarios en la diferenciación de una línea de células progenitora particular, se debe obtener una cantidad suficiente de células para proporcionar resultados significativos y reproducibles. Utilizando las tecnologías disponibles al momento de la invención, esto no era posible. Sin embargo, la presente invención resuelve el problema proveyendo suministros expandibles y esencialmente ilimitados de células madre homogéneas que pueden ser utilizadas en una variedad de experimentos. Esta tecnología mejorará mucho las posibilidades de investigación en el área de la diferenciación y descubrimiento de células. En un aspecto, se expanden las células madre inmortalizadas en forma condicional de la invención, y luego se cultiva una parte de ellas en ausencia de las condiciones que mantienen a las células en el estado inmortalizado en forma condicional (por ejemplo, en ausencia de Tamoxifeno, de acuerdo con el método de ejemplo ilustrado aquí). Las células pueden ser evaluadas por cambios en la expresión del gen, marcadores de la superficie de la célula, secreción de biomoléculas, o cualquier otro marcador genotípico o fenotípico, para estudiar el proceso de la diferenciación y el compromiso del linaje. Se pueden añadir factores de crecimiento u otros factores a los cultivos, por ejemplo para conducir la diferenciación hacia abajo a una ruta particular que linaje celular, y se pueden evaluar los cambios en las células en presencia o en ausencia de tales factores. Además, se pueden utilizar las células para evaluar las condiciones de cultivo, las condiciones in vivo, factores, y agentes que influyen (regulan) la diferenciación y el desarrollo celular.

Se conocen en el arte diferentes métodos para la detección de cambios en las características genotípicas o fenotípicas de las células en cualquiera de los ensayos de la invención. Los ejemplos de métodos que pueden ser utilizados para medir o detectar la secuencia o expresión de un gen incluyen, pero no se limitan a, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR in situ, PCR cuantitativo (q-PCR), hibridación in situ, transferencias tipo Southern, transferencias tipo Northern, análisis de secuencia, análisis de microarreglos, detección de un gen reportero, u otras plataformas de hibridación de ADN/ARN. Los métodos para medir niveles de proteína, incluyen, pero no se limitan a: transferencias tipo Western, inmunotransferencias, ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoprecipitación, resonancia de plasmones superficiales, quimioluminiscencia, polarización fluorescente, fosforescencia, análisis inmunohistoquímicos, espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción/ionización de matriz, asistida por láser (MALDI-TOF), microcitometría, microarreglos, microscopía, clasificación de células activada por fluorescencia (FACS), citometría de flujo, y ensayos basados en una propiedad de la proteína que incluye pero no se limita a enlazamiento de ADN, enlazamiento de ligando, interacción con otros compañeros de la proteína, transducción de señal de la célula, actividad enzimática, y secreción de factores solubles o proteínas.

En ensayos de selección de fármacos, el término "compuesto de prueba", "compuesto inhibidor putativo" o "compuesto regulador putativo" se refiere a compuestos que tienen una actividad reguladora previamente no apreciada o desconocida en un proceso particular. Como tal, el término "identificación" con relación a los métodos para identificar compuestos pretende incluir a todos los compuestos, cuya utilidad como compuesto para un propósito particular (por ejemplo, regulación de la diferenciación celular) se determina por medio de un método de la presente invención, preferiblemente en presencia y en ausencia de tal compuesto. Los compuestos que son seleccionados en los métodos de la invención incluyen compuestos orgánicos conocidos tales como anticuerpos, productos de bibliotecas de péptidos, y productos de bibliotecas químicas combinatoriales. Los compuestos pueden ser identificados también utilizando un diseño racional del fármaco. Tales métodos son conocidos por aquellos capacitados en el arte y pueden involucrar el uso de programas de formación de imágenes tridimensionales. Por ejemplo, diferentes métodos de diseño de fármacos, útiles para diseñar o seleccionar miméticos u otros compuestos terapéuticos útiles en la presente invención son discutidos en Maulik et al., 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc., que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

En cualquiera de los ensayos descritos anteriormente, las condiciones bajo las cuales se expone una célula, un lisado celular, una molécula de ácido nucleico o proteína de la presente invención o se la pone en contacto con compuesto regulador putativo, tal como una mezcla, son cualquiera de las condiciones adecuadas de ensayo o de cultivo, que pueden incluir el uso de un medio efectivo en el cual la célula pueda ser cultivada (por ejemplo, como se describió anteriormente) o en las cuales se puede evaluar el lisado celular en presencia en ausencia de un compuesto regulador putativo. Las células de la presente invención pueden ser cultivadas en una variedad de contenedores que incluyen, pero no se limitan a, frascos para cultivo de tejidos, tubos de ensayo, placas de microtitulación, cajas de Petri. El cultivo se lleva a cabo a una temperatura, pH y contenido de dióxido de carbono apropiados para la célula. Tales condiciones de cultivo están también dentro del oficio del estado del arte, y particularmente, las condiciones adecuadas para el cultivo de células madre inmortalizadas en forma condicional de la presente invención están descritas en detalle aquí en otra parte. Se ponen en contacto las células con un compuesto regulador putativo bajo condiciones que tienen en cuenta el número de células por contenedor contactado, la concentración del(de los) compuesto(s) regulador(es) putativo(s) administrada a una célula, el tiempo de incubación del compuesto regulador putativo con la célula, y la concentración del compuesto administrado a una célula. Aquellas personas capacitadas en el arte pueden determinar los protocolos efectivos con base en variables tales como el tamaño del contenedor, el volumen de líquido en el contenedor, condiciones que se sabe que son adecuadas para el cultivo del tipo particular de célula utilizada en el ensayo, y la composición química del compuesto regulador putativo (es decir, tamaño, carga, etc.) que está siendo analizado.

En una modalidad de la invención, las células y los métodos de la invención son útiles para métodos dirigidos a evaluar la pluripotencia de las ctlt-HSC derivadas de la sangre del cordón umbilical humano, células CD34+, o células CD34+ adultas aisladas de sangre periférica. Al método está descrito en el Ejemplo 11.

Aún otra modalidad de la invención se relaciona con el uso de líneas de células ctlt-HSC como plataforma para generar nuevos modelos de Leucemia Mieloide Aguda (AML). Más particularmente, los presentes inventores han generado un modelo de ratón de leucemia mieloide aguda utilizando las ctlt-HSC de la invención. Estas son leucemias compuestas de células que se parecen a las HSC, con base en su expresión del marcador de superficie. Con el propósito de generar las ctlt-HSC para proveer leucemia en ratones, se transfieren 103 - 105 ctlt-HSC junto con 101 Rag-1-/- células enteras de médula ósea en ratones receptores irradiados en forma letal. A los ratones se les dan dosis semanales de 4-OHT con el propósito de mantener la actividad del oncogén, y monitorear los signos clínicos asociados con la leucemia, como se conoce en el estado del arte. Se han recuperado los tumores de estos animales y pueden ser propagados en cultivo en ausencia de 4-OHT. Estas células retienen su fenotipo tipo HSC, lo que indica que ya no dependen exquisitamente de la hiperactividad de MYC para proliferar, sobrevivir y diferenciación detenida. Las líneas de células leucémicas también pueden conferir la enfermedad después del trasplante secundario a ratones receptores irradiados. Estas herramientas proporcionan una nueva plataforma para estudiar la biología y exportar nuevas avenidas terapéuticas para AML y enfermedades relacionadas. Además, la introducción de las líneas de células ctlt-HSC en ratones que son tratados con 4-OHT, proporcionarán un buen control positivo integrado: el retiro de 4-OHT. Las líneas de células secundarias que surgieron después del establecimiento de los tumores in vivo pueden ser utilizadas también para entender los objetivos terapéuticos relevantes para las formas resistentes a los fármacos de AML.

Otras modalidades de la presente invención se relacionan con el uso de las células madre generadas por medio del método de la presente invención, así como con las células diferenciadas a partir de esas células madre, en una variedad de métodos terapéuticos y relacionados con la salud. Estos métodos generalmente incluyen las etapas de obtener una población, el cultivo de la línea de células madre inmortalizadas en forma condicional producidas por medio del método de la presente invención, la remoción de las condiciones bajo las cuales esas células son inmortalizadas en forma condicional, y luego la utilización de las células en un protocolo terapéutico. Por ejemplo, se pueden administrar las células directamente a un individuo que la requiera o se pueden diferenciar las células en un tipo deseado de célula in vitro y luego administrarlas a un individuo. Además, antes o justamente después de la remoción de las condiciones bajo las cuales se inmortalizan las células, se pueden modificar genéticamente las células in vitro para expresar o silenciar un gen o genes, como un nuevo método de terapia génica bajo un ambiente controlado. Se pueden administrar luego las células a un individuo como células madre o primero diferenciarlas in vitro hasta un linaje celular deseado.

Para obtener las células madre, en una modalidad, se obtienen las células madre de un individuo que va a ser tratado, y se las inmortalizan luego en forma condicional de acuerdo con el método de la invención. Estas células pueden ser extensivamente expandidas, almacenadas (por ejemplo, congeladas o criopreservadas), y luego retiradas y expandidas nuevamente, manipuladas, y/o utilizadas repetidamente según se requiera. En otra modalidad, se pueden obtener las células madre accediendo previamente a una fuente almacenada de células madre inmortalizadas en forma condicional del individuo que va a ser tratado. En aún otra modalidad, se obtienen las células madre a partir de un panel de líneas de células madre humanas que fueron previamente generadas y que cubren un porcentaje significativo de la población de acuerdo con los criterios actuales utilizados para identificar los "correspondientes" donantes. En una modalidad, se obtienen las células a partir de sangre fresca del cordón umbilical o criopreservada, de poblaciones progenitoras hematopoyéticas que pueden derivarse de la diferenciación dirigida de células ES in vitro, de las HSC obtenidas a partir de la sangre periférica de pacientes normales o tratados con G-CSF quienes han sido inducidos para movilizar sus lt-HSC hacia la circulación periférica. Otras fuentes de células madre serán evidentes para aquellos capacitados en el arte. Las células se cultivan de acuerdo con los métodos descritos previamente aquí y se pueden remover las condiciones que controlan la inmortalización en el momento apropiado. Además, antes de la administración de las células a un individuo, se pueden manipular las células para cortar los genes o a las construcciones que son las responsables de la inmortalización en forma condicional (es decir, el protooncogén y/o el gen que codifica la anti-apoptosis), o si las células son mantenidas a través del uso de proteínas de fusión solubles en el medio de cultivo, como se describió anteriormente para las fusiones Tat, estas proteínas solubles pueden ser removidas gradualmente el cultivo o en forma inmediata.

Por lo tanto, la presente invención incluye el suministro de células madre producidas por medio del método de la invención (incluidas las composiciones que contienen tales células madre), o células diferenciadas a partir de estas células, a un individuo (que puede incluir cualquier animal). Ya que las células madre utilizadas en estos métodos son producidas in vitro, incluso si las células madre fueran inicialmente aisladas del paciente, el proceso completo de administración de las células es esencialmente un protocolo de administración ex vivo. Administración ex vivo se refiere a llevar a cabo parte de la etapa reguladora por fuera del paciente, produciendo así las células madre inmortalizadas en forma condicional que fueron removidas de un individuo (que puede incluir producir genéticamente células madre modificadas además de células madre esencialmente normales), y retornar las células, o las células diferenciadas a partir de estas células, al paciente. Las células madre producidas de acuerdo con la presente invención o las células diferenciadas a partir de ellas pueden ser retornadas a un individuo, o administradas a un individuo, por medio de cualquier forma adecuada de administración. Tal administración puede ser sistémica, a través de mucosas y/o en forma próxima a la localización de un sitio objetivo. Las rutas preferidas de administración serán evidentes para aquellos capacitados en el arte, dependiendo del tipo de condición que va a ser prevenida o tratada o la razón de la administración. Los métodos preferidos de administración incluyen, pero no se limitan a, administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración intramuscular, administración intranodal, administración intracoronaria, administración intraarterial (por ejemplo, dentro de una arteria carótida), administración subcutánea, suministro transdérmico, administración intratraqueal, administración subcutánea, administración intraarticular, administración intraventricular, intraespinal, administración pulmonar, impregnación de un catéter, e inyección directa en un tejido (por ejemplo, tal como canulación del hígado, por ejemplo).

Las células pueden ser administradas con portadores o con excipientes farmacéuticamente aceptables. Los portadores son típicamente compuestos que incrementan la vida media de una composición terapéutica en el individuo tratado. Los portadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, formulaciones poliméricas de liberación controlada, implantes biodegradables, liposomas, aceites, ésteres, y glicoles. Como se utiliza aquí, un excipiente farmacéutica aceptable se refiere a cualquier sustancia adecuada para el suministro de células producidas por medio del método de la presente invención en un sitio adecuado in vivo. Los excipientes preferidos farmacéuticamente aceptables son capaces de mantener unas células en una forma que, después del arribo de las células a un tejido objetivo o sitio en el organismo, las células son capaces de funcionar en una forma que es benéfica para el individuo.

De acuerdo con la presente invención, un protocolo efectivo de administración comprende parámetros adecuados de dosificación y modos de administración que resultan en un suministro de un número útil de células funcionales a un paciente con el propósito de proporcionar un beneficio transitorio o a largo plazo para el paciente. Los parámetros de una dosis efectiva se pueden determinar utilizando métodos estándar en el arte para una concesión particular o enfermedad. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la determinación de las tasas de supervivencia, efectos secundarios (es decir, toxicidad) y el progreso o la regresión de la enfermedad.

Una dosis única adecuada de células madre o de células diferenciadas a partir de ellas de acuerdo con la presente invención es una dosis que es capaz de proporcionar un número benéfico de células a un paciente, cuando se la administra una o más veces durante un período de tiempo adecuado. Por ejemplo, una dosis única preferida de células madre de acuerdo con la presente invención es aproximadamente de 0,5 x 104 hasta aproximadamente 5,5 x 108, o aproximadamente desde 0,5 x 105 hasta aproximadamente 5,5 x 107, o aproximadamente desde 0,5 x 106 hasta aproximadamente 5,5 x 1010 células madre por individuo por administración, siendo incluso más preferible con dosis aproximadamente de 1 x 108 hasta aproximadamente 5,5 x 1010. Cualquier dosis entre 0,5 x 104 y aproximadamente 5,5 x 1010 es abarcada por la invención, en incrementos de 102 células. Dosis mayores o menores serán conocidas por aquellos capacitados en el arte dependiendo del tipo de célula madre o célula diferenciada que es administrada, y también dependiendo de la vía de administración. Será obvio para alguien capacitado en el arte que el número de dosis administradas a un animal depende del grado de la concesión o enfermedad y de la respuesta de un paciente individual al tratamiento. De este modo, está dentro del alcance de la presente invención de un número adecuado de dosis incluye cualquier número requerido para tratar una enfermedad dada.

Como se la utiliza aquí, la frase "protegido de una enfermedad" se refiere a la reducción de los síntomas de la enfermedad; la reducción de la incidencia de la enfermedad, y/o la reducción de la severidad de la enfermedad. La protección de un animal (un individuo, un sujeto) puede referirse a la habilidad de las células producidas de acuerdo con la presente invención, cuando se las administra un animal, para prevenir la aparición de una enfermedad y/o para curar o para aliviar los síntomas, signos o causas de una enfermedad. Como tal, proteger a un animal de una enfermedad incluye tanto prevenir la aparición de la enfermedad (tratamiento profiláctico) cómo tratar un animal que tiene una enfermedad o que está experimentando los síntomas iniciales de una enfermedad (tratamiento terapéutico). El término, "enfermedad" se refiere a cualquier desviación de la salud normal de un mamífero e incluye un estado cuando se presentan los síntomas de una enfermedad, así como condiciones en las cuales se ha presentado una desviación (por ejemplo, infección, mutación génica, defecto genético, etc.), pero los síntomas no se han manifestado aún.

Como se discutió anteriormente, las células madre de la presente invención se pueden administrar a un individuo para tratar o para prevenir una variedad de condiciones. Por ejemplo, las líneas de células madre de la presente invención proveen una fuente única de células madre expandibles para uso en una variedad de estrategias terapéuticas y de trasplantación, incluyendo el tratamiento del cáncer, y particularmente, el cáncer que es tratado por radiación. Además, una variedad de trastornos de inmunodeficiencia y trastornos anémicos (por ejemplo, anemia aplástica o anemia hemolítica) se beneficiarán también grandemente de esta tecnología, ya que la presente invención proporciona la habilidad para repoblar células hematopoyéticas de un individuo según éste las requiera. Otra aplicación de la presente invención se relaciona con la generación de células madre del folículo capilar continuamente expandibles y renovables, para uso, por ejemplo en el contexto de cirugía reconstructiva para víctimas de quemaduras, para cualquier individuo que reciba quimioterapia y/o terapia de radiación lo que resulta en la pérdida irreversible del crecimiento del cabello, así como pacientes después de cualquier procedimiento quirúrgico que afecte al cráneo o en procedimientos electivos que involucren la inducción del crecimiento del cabello en individuos afectados por calvicie del patrón hereditario. En forma similar, la aplicación de la presente invención a células madre de la piel será invaluable para el uso en cicatrización de heridas y el tratamiento de víctimas de quemaduras, así como cirugía plástica reconstructiva por trauma y otros pacientes, así como cirugías electivas, incluyendo, pero sin limitarse a, cirugía cosmética. Tales células pueden ser adicionalmente manipuladas genéticamente para corregir defectos genéticos adquiridos o innatos en individuos jóvenes y viejos. Alguien capacitado en el arte entenderá con base en esta descripción que pueden derivarse beneficios por el uso de la presente invención sobre diferentes otras poblaciones de células madre, incluyendo, pero sin limitarse a, células madre derivadas pulmón, mama, y epitelio intestinal y ser las madres derivadas de tejido neural y cardíaco, para mencionar sólo unas pocas.

Además, como se discutió anteriormente, la presente invención proporciona la oportunidad única para un individuo de tener acceso a suministros expandibles de células madre autólogas y de células diferenciadas a partir de las mismas según se requiera a lo largo de toda la vida del individuo. Tales células madre generadas por medio del presente método pueden ser almacenadas y utilizadas como parte de protocolos terapéuticos durante el tiempo de vida en un individuo, en caso de ser necesario (por ejemplo, en el evento de que un individuo desarrolle un cáncer o una enfermedad de inmunodeficiencia).

Los defectos genéticos pueden ser corregidos ahora o se pueden introducir modificaciones genéticas beneficiosas en células somáticas por medio de la manipulación de células madre autólogas obtenidas de un individuo que hayan sido inmortalizadas en forma condicional, y expandidas utilizando el método de la presente invención. Las células madre pueden ser entonces introducidas nuevamente en el individuo a partir del cual ellas fueron obtenidas.

Las aplicaciones adicionales de la presente invención incluyen el uso de líneas de células madre para reparar lesiones pulmonares que se presentan como resultado de COPD, IPF, enfisema, asma y tabaquismo. Además, tales células podrían ser utilizadas para tratar daños de los vasos sanguíneos en el corazón, y ayudar en enfermedades autoinmunes después de una irradiación letal (por ejemplo, SLE, diabetes, RA).

En el método de la presente invención, las células producidas de acuerdo con el método de la invención y las composiciones que contienen las células pueden ser administradas a cualquier animal, incluido cualquier miembro de la clase de los vertebrados, mamíferos, incluyendo, sin limitación, primates, roedores, ganado y mascotas domésticas. Un mamífero preferido para tratar es un humano.

Diferentes aspectos de la presente invención son descritos con más detalle en los siguientes Ejemplos y en las figuras anexas. Sin embargo, la presente invención no se limita a estos ejemplos e ilustraciones de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

El siguiente ejemplo describe el desarrollo de un método para inmortalizar en forma reversible células madre hematopoyéticas a largo plazo (las lt-HSC).

La elucidación de las bases moleculares del deterioro en el desarrollo del linaje hematopoyético ha sido históricamente complicada por la baja frecuencia de poblaciones de células relevantes, que impide el análisis bioquímico de respuestas de señalización y secuencia abajo. En realidad, éste ha sido un factor limitante principal en todos los estudios de hematopoyesis. Además, la disponibilidad limitada de las LT-HSC ha sido también un obstáculo principal en el tratamiento de muchos tipos de cánceres así como de diferentes clases de inmunodeficiencias en humanos.

En un esfuerzo para vencer esta limitación, los presentes inventores desarrollaron un método para producir líneas de células transformadas en forma condicional que representan progenitores tempranos de células madre hematopoyéticas. La estrategia inicial involucró transducción retroviral de células madre de médula ósea de ratones de 3-83 jóvenes e inmunológicamente envejecidos tratados con 5FU. Los inventores utilizaron el vector retroviral bisistrónico pMSCV con insertos que codifican Bcl-2 y GFP, y MYC-ER y GFP [Van Parijs, L., Y. Refaeli, A. K. Abbas, y D. Baltimore. (1999) Autoimmunity as a consequence of retrovirus-mediated expression of C-FLIP in lymphocytes. Immunity, 11, 763 - 70]. Estos genes fueron seleccionados debido a que los presentes inventores sabían que MYC tiene la habilidad para reemplazar señales proliferativas y supervivientes derivadas de citoquina en linfocitos. Por medio de la restricción de la célula objetivo, los inventores esgrimieron la hipótesis de que pueden formarse tumores de células madre. En forma muy importante, la función de MYC-ER depende del Tamoxifeno en este contexto, permitiendo la terminación de la función MYC y la transformación por medio del retiro del Tamoxifeno del animal o de los cultivos. En células transducidas con MYC-ER, se produce la proteína de fusión, pero es retenida en el citoplasma hasta ser expuesta al Tamoxifeno.

Más específicamente, las poblaciones de células madre de ratones tratados con 5FU fueron transducidas con ambos retrovirus (que codifican MYC-ER y Bcl-2) y transferidas en ratones receptores irradiados en forma letal (1200 rads). Diez días después, se iniciaron semanalmente inyecciones intraperitoneales de 1 mg/ratón de 4hidroxitamoxifeno (40HT) emulsionadas en aceite para activar la función de MYC (Fig. 1). En un lapso de cuatro semanas, los receptores de células madre transducidas jóvenes (pero no viejas) desarrollaron tumores. Los tumores fueron recolectados de la médula ósea, el bazo y de nodos linfáticos y cultivados in vitro con Tamoxifeno, pero sin citoquinas añadidas. Estas células crecieron aproximadamente durante 10 días, pero luego se detuvo el crecimiento y las células eventualmente murieron. Los inventores sospechan que las células se diferenciaron y consideraron que esto pudo haberse debido a requerimientos de citoquinas para el crecimiento de las células. Con referencia a la Fig. 1, las curvas representan las cinéticas de mortalidad después de la trasplantación y activación de la función MYC in vivo. Los ratones sucumbieron uniformemente a la leucemia. Aunque la sobreexpresión de MYC puede reemplazar la función de proliferación y supervivencia que depende de citoquina, no parece estar involucrada en las señales de diferenciación derivadas de la citoquina.

Cuando enfermaron, se les practicó la eutanasia a los ratones. Se recolectaron células de médula ósea, bazo y nodo linfático y se las colocó en cultivo con Tamoxifeno y un coctel de factores de crecimiento de células madre (IL-6, IL-3 y factor de células madre (SCF)). En forma paralela, se analizaron las células por medio de citometría de flujo (Fig. 2). Con referencia a la Fig. 2, las gráficas de puntos representan los datos citométricos de flujo para las características de dispersión lateral (SSC) y hacia adelante (FSC) de las HSC después de tres días en cultivo con IL3, IL-6 y SCF. Estos dos criterios se correlacionan con el tamaño de la célula (FSC) y con la granularidad (SSC). Las dos poblaciones tienen perfiles similares. Los histogramas representan los niveles de GFP expresados en cada población de células. Esto refleja la eficiencia de la transducción retroviral in vitro con retrovirus que codifican los ADNc para MYC-ER y Bcl-2.

En todos los casos, las células GFP+ ex vivo eran > 90% de Sca-1+ y marcador negativo de Linaje. Después de unos pocos días en cultivo, las células comenzaron a crecer y aproximadamente se congelaron 400 líneas para estudio posterior. Después de la propagación, estas células retuvieron la expresión de EGFP y fueron homogéneamente positivas para SCA1 y negativas para CD34, Flk2 y marcadores de linaje (Fig. 3). La única diferencia en la expresión del marcador entre marcadores derivados de ratones viejos y derivados de ratones jóvenes fue una mayor expresión de c-kit en los jóvenes. Si estar vinculado por una teoría, los presentes inventores creen que esto puede haber resultado de un cultivo más largo (3 meses versus 3 semanas) de líneas envejecidas en ligando c-kit antes de que los marcadores fueran analizados. Finalmente, los inventores descubrieron que estas líneas pueden ser recuperadas fácilmente después de congelación y retuvieron su fenotipo original. En forma muy importante, estas líneas de células son homogéneas en fenotipo y exhiben el fenotipo de lt-HSC que proporciona toda la reconstitución a largo plazo en ratones (Reya, T., Duncan, A. W., Ailles, L., Domen, J., Scherer, D. C., Willert, K., Hintz, L., Nusse, R., y Weissman, I. L. (2003). A role for Wnt signaling in self-renewal of hematopoietic stem cells. Nature 423, 409 14).

Recientemente, los inventores descongelaron 10 líneas derivadas de médula ósea producidas como se describió más arriba, y fueron capaces de recuperar 9 de 10 de estas líneas fácilmente por medio de cultivo en el coctel de citoquina y 40HT. Los inventores hicieron un fenotipo de estos tumores, y los resultados fueron extremadamente promisorios. Específicamente, cada línea contenía dos poblaciones distintas de células con base en la dispersión de la luz hacia adelante y a 90°. Las nueve líneas diferían únicamente en la proporcionalidad de estas poblaciones. Entre más grande el tamaño de las células en estas poblaciones, eran uniformemente brillantes en GFP y positivas para Sca1, Endoglin y c-kit pero negativas para Flt3, B220, Cd19 y mIgM. CD34- también pareció ser negativa, aunque esto requiere confirmación (Fig. 3). Este fenotipo corresponde perfectamente con las características publicadas de células madre pluripotentes para repoblación a largo plazo (Reya et al., ver más arriba). Los inventores observaron el mismo fenotipo inicial sobre las líneas de células que ellos obtuvieron recientemente de las leucemias que desarrollaron a partir del las HSC transducidas obtenidas de ratones donantes jóvenes (Fig. 3).

Para analizar la habilidad de estas células para diferenciarse, se cultivaron líneas representativas con y sin Tamoxifeno y en presencia de IL-3, IL-6 y SCF para terminar la función de MYC-ER durante 7 días antes de analizar los marcadores fenotípicos. Como se muestra en la Fig. 4, una proporción significativa de células adquirió marcadores de linaje B incluyendo B220 (~ 12%), CD19 (~ 10%) y mIgM (~ 10%). Además, los inventores han sido capaces de generar los siguientes linajes in vitro por medio del retiro de 40HT de los cultivos: células T CD4+ ab, células mieloides (Mac-1+), células progenitoras eritroides ter-119+, células que expresan NK1.1, neutrófilos (células Gr-1+). Experimentos adicionales evaluarán la habilidad de estas células para originar otros linajes, así como el efecto de alterar el régimen de citoquina sobre la diferenciación. Aunque aún no se ha llevado a cabo la comparación, los presentes inventores esperan que la diferenciación a partir de animales jóvenes, comparado con animales viejos sean mucho más eficiente en la producción de células B. Para el mejor conocimiento de los presentes inventores, este es el primer ejemplo de una línea de células madre hematopoyéticas inmortales en forma condicional que puede ser inducida para diferenciarse in vitro.

Ejemplo 2

El siguiente ejemplo describe los resultados de transferencia adoptiva de líneas de LT-HSC en receptores irradiados en forma letal.

Si las líneas de HSC descritas en el Ejemplo 1 son sujetos apropiados para análisis de la base de linfopoyesis de células B en animales envejecidos, ellas deben recapitular el defecto in vivo. Los inventores han comenzado a hacer frente a esta situación por medio de transferencia adoptiva de líneas de LT-HSC en receptores irradiados en forma letal. En experimentos iniciales, se transfirieron líneas de animales envejecidos (> 60% de ID-) junto con médula ósea de RAG2-/-, y no se trataron los receptores con Tamoxifeno con el propósito de silenciar MYC-ER. Seis semanas después se recolectaron células de bazo y médula ósea del receptor y se analizó la recuperación y el fenotipo de las células GFP+ (células marcadoras de GFP derivadas de líneas de HSC) (Fig. 5).

En los datos de tres ratones presentados en la Fig. 5, un ratón recibió la línea ABM42 de HSC envejecidas, y dos ratones recibieron la línea ABM46 de HSC envejecidas. Dependiendo de la línea transferida, 30 a 70% de las células en la puerta de dispersión linfoide eran GFP+. Como se muestra en la Fig. 5, ambas líneas analizadas (ABM46 y ABM42) dieron lugar a células B (CD19+) y T (TCR+, CD4+, CD8+), macrófagos (CD11b+) y granulocitos (GR1+). Hubo alguna variación de receptor a receptor en la proporcionalidad de estos linajes. Sin embargo, en forma muy importante como mientras que ambas líneas analizadas dieron lugar a células T positivas únicas CD4 y CD8 maduras (Fig. 7), el desarrollo de células B no procedió más allá de la etapa progenitora (Fig. 6). Aunque se desarrollaron células B220+, CD19+, ellas no progresaron hasta la etapa de mlg+. Esta es precisamente la consecuencia predicha por los resultados de los experimentos que involucran autoreconstitución y reconstitución adoptiva utilizando HSC de BM de ratones inmunológicamente envejecidos (Johnson, S. A., S. J. Rozzo, y J. C. Cambier, Aging-dependent exclusion of antigen-inexperienced cells from the peripheral B cell repertoire. J Immunol, 2002. 168(10): p. 5014 - 23). En otras palabras, la misma detención del desarrollo se observa cuando toda la médula ósea de ratones inmunológicamente envejecidos que es utilizada para trasplantación.

Los inventores han encontrado que este sistema puede ser tomado como un paso más, restableciendo exitosamente las líneas de LT-HSC de médula ósea de receptores adoptivos de las líneas de HSC originales (datos no mostrados). Esto se logró simplemente cultivando células de médula ósea en citoquinas de célula madre más Tamoxifeno para reactivar MYC. Estas células están creciendo ahora y exhiben el fenotipo original.

Ejemplo 3

El incipiente ejemplo describe un método para inmortalizar en forma reversible las HSC utilizando un método conocido enteramente in vitro.

Además del método para la generación de líneas de células HSC inmortalizadas en forma condicional a largo plazo descritas previamente aquí como los inventores han sido capaces de llevar a cabo este procedimiento completamente in vitro. El método descrito anteriormente se basa en la introducción de las HSC transducidas en ratones, e inducen su transformación in vivo. La ventaja de llevar a cabo este procedimiento in vitro es que cada aspecto del proceso se lleva a cabo en un ambiente controlado.

El método incluye primero el tratamiento de ratones donantes con 5-fluorouracilo (5-FU) con el propósito de enriquecer las HSC y de inducir estas células que proliferen. Se recolectaron células madre hematopoyéticas enriquecidas con 5FU de tibia y fémures de ratones y luego se las sembró en placas de cultivo para tejido de 24 pozos en medio DMEM que contenía 15% de suero de ternera fetal inactivado con calor y IL-3, IL-6 y SCF, con una densidad de 1,8 - 2,0 x 106 células por pozo. Las células fueron sometidas a tres rondas de infección por giro con el propósito de transducir las células en forma retroviral con vectores retrovirales que codifican MYC-ER y Bcl-2. En resumen, se transfectaron las células con pMIG-MYC.ER o pMIT-Bcl2. Se recolectaron los sobrenadantes que contenían virus y se los suplementó con 4 μg/ml de polibreno y HEPES 10 mM, y se los pasó a través de un filtro de 0,45 μm. Se mezclaron los dos sobrenadantes virales diferentes en una proporción 1:1 y se lo añadió a los pozos. Se centrifugaron luego las células a 2000 rpm durante una hora. Se reemplazaron los sobrenadantes virales al final de cada infección por giro. 24 horas después de la última ronda de infección, se determinaron los niveles de transducción por medio de análisis de citometría de flujo con el propósito de determinar la eficiencia de la transducción. Las células transducidas fueron luego incubadas en medio DMEM que contenía IL-3, IL-6, SCF y 40HT 10 nM. Se reemplazó el medio cada 3 días y se puso un énfasis especial en garantizar un suministro fresco de citoquinas y 40HT. Las células se pasan lentamente, y según se requiera.

Utilizando esta aproximación in vitro, los inventores han sido capaces de generar líneas de células inmortalizadas en forma condicional con las siguientes combinaciones de genes: MYC-ER y Bcl-2; MYC-ER y hTERT (componente de la transcriptasa reversa de la telomerasa humana); ICN-1-ER (elemento activo regulado de ER de la porción intracelular de Notch-1) y Bcl-2; ICN-1-ER y hTERT; y MYC-ER y ICN-1-ER. Los datos presentados en las Figs. 8 - 11 muestran la caracterización inicial de la mayoría de estas líneas de células. Ellas produjeron líneas compuestas de células c-kit+, Sca-1+, CD34-, flk2-, que es un fenotipo que es consistente con aquellas presentadas por células madre hematopoyéticas normales, a largo plazo. Los datos presentados en las Figs. 8 - 11 se derivan de análisis de citometría de flujo de genes reporteros codificados en forma retroviral (GFP y thy1.1), así como cuatro marcadores para células madre: c-kit, sca-1, CD34 y flk-2. Las líneas de células mostradas en las Figs. 8 - 11 han estado en cultivo durante 5 semanas antes de la elaboración del fenotipo. Estas células han sido expandidas y divididas en un cultivo continuo por más de 35 días hasta la fecha.

Con referencia a la Fig. 8, esta figura muestra la comparación fenotípica de líneas de células derivadas a partir de las HSC obtenidas de ratones C57/BL6 jóvenes que fueron transducidas en forma retroviral con BCL-2 y MYC-ER y mantenidas en un cultivo continuo in vitro durante >90 días. Se muestra el fenotipo de clones representativos (jóvenes) 3 meses después de 90 días de cultivo continuo.

Con referencia a la Fig. 9, esta figura muestra la comparación fenotípica de líneas de células derivadas a partir de las HSC obtenidas de ratones C57/BL6 jóvenes que fueron transducidas en forma retroviral con diferentes combinaciones de oncogenes y mantenidas en un cultivo continuo in vitro durante >90 días. Se transdujeron en forma retroviral las HSC enriquecidas con 5FU con pMIG-MYC y pMIT-Bcl-2 (paneles superiores), pMIG-MYC.ER y pMIG-hTERT (paneles intermedios), o pMIG-ICN.1.ER y pMIT-Bcl-2. Las células fueron mantenidas en DMEM suplementado con 15% de suero de ternera fetal, y un coctel de IL-6, IL-3 y SCF. Se muestra el fenotipo de clones representativos (jóvenes) 3 meses después de 90 días de cultivo continuo. Los paneles representan los resultados del análisis por citometría de flujo para la expresión de los marcadores de expresión viral (GFP y Thy1.1), así como cuatro marcadores requeridos para definir las HSC a largo plazo en ratones, Sca-1, c-kit, CD34 y Flk-2. Las cuatro líneas de células contenían subpoblaciones que retenían los fenotipos de las lt-HSC (Sca-1+, c-kit+, CD34-, flk-2-).

Con referencia a la Fig. 10, esta figura muestra la comparación fenotípica de líneas de células derivadas a partir de las HSC obtenidas de ratones C57/BL6 jóvenes que fueron transducidas en forma retroviral con diferentes combinaciones de oncogenes y mantenidas en un cultivo continuo in vitro durante >90 días. Se transdujeron en forma retroviral las HSC enriquecidas con 5FU con pMIG-ICN.1.ER y pMIT-Bcl-2 (paneles superiores), pMIG-ICN.1 y pMIT-Bcl-2 (paneles de la segunda fila), o pMIG-ICN.1 y pMIG-Bcl-2 (paneles de la tercera fila), o pMIG-hTERT y pMIT-Bcl-2 (paneles inferiores). Las células fueron mantenidas en DMEM suplementado con 15% de suero de ternera fetal, y un coctel de IL-6, IL-3 y SCF. Se muestra el fenotipo de clones representativos (jóvenes) 3 meses después de 90 días de cultivo continuo. Los paneles representan los resultados del análisis por citometría de flujo para la expresión de los marcadores de expresión viral (GFP y Thy1.1), así como cuatro marcadores requeridos para definir las HSC a largo plazo en ratones, Sca-1, c-kit, CD34 y Flk-2. Las cuatro líneas de células contenían subpoblaciones que retenían los fenotipos de las lt-HSC (Sca-1+, c-kit+, CD34-, flk-2-).

Con referencia a la Fig. 11, esta figura muestra la comparación fenotípica de líneas de células derivadas a partir de las HSC obtenidas de ratones C57/BL6 jóvenes que fueron transducidas en forma retroviral con diferentes combinaciones de oncogenes y mantenidas en un cultivo continuo in vitro durante >90 días. Se transdujeron en forma retroviral las HSC enriquecidas con 5FU con pMIG-MYC y pMIGICN.1 (paneles superiores), pMIG-MYC.ER y pMIG-ICN.1 (paneles medios), o pMIG-ICN.1.ER y pMIG-MYC. Las células fueron mantenidas en DMEM suplementado con 15% de suero de ternera fetal, y un coctel de IL-6, IL-3 y SCF. Se muestra el fenotipo de clones representativos (jóvenes) 3 meses después de 90 días de cultivo continuo. Los paneles representan los resultados del análisis por citometría de flujo para la expresión de los marcadores de expresión viral (GFP y Thy1.1), así como cuatro marcadores requeridos para definir las HSC a largo plazo en ratones, Sca-1, c-kit, CD34 y Flk-2. Las cuatro líneas de células contenían subpoblaciones que retenían los fenotipos de las lt-HSC (Sca-1+, c-kit+, CD34-, flk-2-).

Estas líneas de células también han sido utilizadas para reconstituir compartimientos celulares in vivo. Con referencia a la Fig. 12, esta figura muestra los resultados de reconstitución in vivo de compartimientos de células T y células B de líneas de células derivadas de las HSC obtenidas de ratones C57/BL6 jóvenes que fueron transducidas en forma retroviral con diferentes combinaciones de oncogenes y mantenidas en un cultivo continuo in vitro durante >90 días. En resumen, se transdujeron en forma retroviral las HSC enriquecidas con 5FU con pMIGICN.1-ER y pMIG-hTERT (paneles superiores), pMIG-MYC.ER y pMIG-hTERT (paneles medios), o pMIG-MYC-ER y pMIT-Bcl-2 (paneles inferiores). Las líneas de células fueron mantenidas en DMEM suplementado con 15% de suero de ternera fetal, y un coctel de IL-6, IL-3 y SCF. Se reconstituyeron los ratones C57/BL6 jóvenes irradiados en forma letal utilizando células madre de médula ósea de ratones Rag2-/-y líneas de LT-HSC generadas in vitro. Seis semanas después, se recolectó médula ósea y se la tiñó con un panel de marcadores de linaje específico. El desarrollo de células positivas GFP/células positivas B220 y CD4 maduras se puede observar fácilmente. Los datos de cuatro ratones representativos se presentan en esta figura. En cada grupo, aproximadamente 30% de los ratones retiene al marcador de GFP.

Ejemplo 4

El siguiente ejemplo describe una extensión del método para inmortalizar en forma reversible sangre del cordón umbilical humano y las HSC derivadas de médula ósea in vitro.

Una aplicación adicional de esta tecnología es la habilidad para expandir células madre hematopoyéticas humanas a largo plazo in vitro a través de su inmortalización condicional. Los inventores han adaptado por lo tanto el método in vitro descrito en los ejemplos previos para células humanas con unos pocos cambios. Primero, se empacan los retrovirus preferiblemente con envolturas anfotrópicas con el propósito de permitir una transducción eficiente de células humanas. Además, la fuente de las células es sangre del cordón umbilical humano obtenida en forma anónima del banco de sangre del cordón umbilical, siguiendo todas las reglas y regulaciones expuestas por el Institutional Review Boards of the inventors’ institutions. Las células resultantes expresarán genes reporteros que pueden en última instancia ser útiles para el aislamiento de una población pura por medio de clasificación de células a alta velocidad. Los inventores han notado que muchas células maduras que resultan de las líneas de células lt-HSC de múrido pierden expresión de los marcadores de superficie, potencialmente debido a la metilación del genoma retroviral después de la determinación y diferenciación de linaje. Los inventores que esperan ver un comportamiento similar en las células humanas, en cuyo caso las lt-HSC y su prevalencia en receptores de trasplantes pueden ser monitoreadas por la presencia de genes reporteros en tales células, en combinación con marcadores de la superficie de la célula para esa población de células.

Ejemplo 5

El siguiente ejemplo describe una aproximación a la excisión secuencial de los fragmentos de ADN que codifican MYC-ER y Bcl-2 a partir de células HSC inmortalizadas en forma condicional.

Con el propósito de evitar tomar el riesgo de introducir las HSC que albergan transgenes que codifican MYC.ER y Bcl-2 en humanos y/o en ratones, estos dos fragmentos de ADN serán cortados utilizando una aproximación de recombinasa bacteriana. Se utilizarán dos recombinasas diferentes con el propósito de permitir el control sobre cuál de los dos genes es cortado en algún momento en el tiempo. Dos ejemplos de tales recombinasas son las recombinasas Cre y Flp. En resumen, se introduce una de las secuencias para reconocimiento del sustrato (RSS) para una de las recombinasas en las construcciones retrovirales de tal manera que flanqueen el marco de lectura abierto del oncogén, así como al gen reportero (GFP o Thy1.1). En este caso, se incuban las células en medio que contenga una proteína de fusión Tat-Cre. Esta proteína recombinante ha sido previamente descrita y ha demostrado que es capaz de entrar en forma pasiva a las células, y mediar la recombinación que depende del sitio loxP de ADN genómico.

Esta aproximación permitirá el logro de una cantidad de cosas con el propósito de permitir la generación de muchas HSC para diferenciación in vitro e in vivo. Primero, las células pueden ser gradualmente destetadas de los altos niveles de señales de supervivencia y proliferativas a las cuales han estado acostumbradas durante el proceso de transformación condicional. Segundo, las células pueden ser readaptadas para depender de citoquinas normales para sus funciones homeostáticas y de diferenciación. Tercero, la pérdida secuencial de expresión del reportero permitirá la definición del estatus y del grado de supresión de cada uno de los genes en cuestión. Por lo tanto, las células que expresan ambos genes reporteros (GFP y Thy1.1) albergan ambas secuencias (MYC y Bcl-2, respectivamente), células que expresan Thy1.1 pero no GFP han suprimido exitosamente las secuencias de codificación de MYC, pero aún contienen genes Bcl-2, y por último, células que no expresan ni GFP ni Thy1.1 han suprimido estos dos alelos. La Fig. 13 representa esta aproximación en un diagrama.

Además, esta aproximación es analizada en ratones obteniendo las HSC de BM enriquecidas con 5FU a partir de una cepa de ratones en la cual se puede inducir la expresión de un transgén MYC humano por medio del retiro de la tetraciclina y la presencia de una proteína bacteriana llamada tTA (proteína del transactivador de tetraciclina). Se clonó ADNc de MYC humano secuencia abajo de un elemento de transcripción regulador de tetraciclina (TRE). Los ratones TRE-MYC son tratados con 5FU y usados para recolectar las HSC de BM. Estas células son transducidas in vitro con retrovirus que expresan Bcl-2 t tTA (pMIT-Bcl2 y pMIG-tTA). Las células se cultivan en presencia continua de Doxiciclina con el propósito de mantener el silencio del transgén MYC. Una vez las células son analizadas por medio de citometría de flujo, pueden ser utilizadas para ser trasplantadas nuevamente en ratones que no serán mantenidos con una dieta que contiene doxiciclina (esta es una forma más estable de la tetraciclina que es normalmente utilizada in vivo).

Una vez se generan las líneas de células lt-HSC, el efecto de cultivarlas en presencia de doxiciclina in vitro será examinada en forma paralela con líneas de células que albergan MYC.ER que serán cultivadas en ausencia de 40HT. Los niveles de proteína de MYC se monitorean por medio de transferencias tipo Western y de enfoques a través de tinción intracelular.

Ejemplo 6

El siguiente ejemplo describe la generación de muchos linajes hematopoyéticos in vitro, después del retiro de 40HT del medio de cultivo líquido para tejido.

Los métodos tradicionales utilizados para determinar la potencia de una HSC involucran el uso de medio semisólido (metilcelulosa) con citoquinas definidas con el propósito de potenciar la diferenciación de las HSC en linajes específicos. Los inventores estaban interesados en determinar la pluripotencia de esta población de células creada utilizando el método de la presente invención in vitro. Con el propósito de examinar este problema, se mantuvieron las líneas de células ABM42 y ABM46 descritas aquí en medio que contenía IL-3, IL-6 y SCF, pero sin 40HT. Además de los linajes que los inventores fueron capaces de detectar en lo ratones reconstituidos (es decir, linfoideos, mieloides y granulocíticos), se podrían detectar también células GFP+ que expresaron NK1.1 o ter-119 (Fig. 14). Las células NK1.1 podrían ser células NK, o células NK-T. Las células que expresan tre-119 son del linaje eritroideo. Estos hallazgos indican que estas líneas de células son capaces de dar lugar a todos los elementos de un sistema hematopoyético normal y que las células serán útiles para la generación de grandes cantidades de elementos específicos que son utilizados para terapias pasivas. Además, serán de gran uso e importancia para estudiar los eventos tempranos en hematopoyesis y para identificar una terapia nueva para intervención terapéutica en trastornos genéticos, o complicaciones que surjan en el transcurso normal de la quimioterapia, o incluso una enfermedad infecciosa.

Ejemplo 7

El siguiente ejemplo describe un método para selecciones de alto rendimiento de moléculas pequeñas o de agentes biológicos que inducen o inhiben la diferenciación en las HSC transformadas en forma condicional a largo plazo.

El siguiente es un método general para seleccionar moléculas pequeñas o agentes biológicos que inducen o inhiben la diferenciación de HSC. Previamente, se prohibieron estos tipos de selecciones grandes por el hecho de que no pudieron ser obtenidos grandes números de células madre. Con la capacidad actual de la presente invención para inmortalizar en forma condicional las HSC a largo plazo, hoy en día es posible proponer tales tecnologías.

A manera de ejemplo, uno de tales métodos es una lectura de la diferenciación mieloide que ha sido adaptada de Schneider, et al. (Schneider, T., y Issekutz, A. C. (1996). Quantitation of eosinophil and neutrophil infiltration into rat lung by basic assays for eosinophil peroxidase and myeloperoxidase. Application in a Brown Norway rat model of allergic pulmonary inflammation. J Immunol Methods 198, 1 - 14). En resumen, se siembran en placa las HSC transformadas en forma condicional a largo plazo en placas de fondo plano de 96 pozos con diferentes concentraciones de números de células (usualmente 2 x 104 - 5 x104 células/pozo). Las selecciones se llevan a cabo ya sea en medio completo (DMEM + suero de ternera fetal al 15% inactivado por calor, 1X penicilina/estreptomicina, 1X 1-glutamina y 1X aminoácidos no esenciales, suplementado con IL-3, IL-6 y SCF) con la adición de 40HT con el propósito de mantener las células en un estado no diferenciado, o en ausencia de 40HT añadido con el propósito de inducir diferenciación. Estas condiciones han demostrado que dan lugar a células Mac-1+, consistente con un patrón de diferenciación mieloide. Se pueden añadir citoquinas adicionales para dirigir la diferenciación en rutas específicas, aunque este sistema puede ser utilizado también para seleccionar funciones específicas de un panel de citoquinas. En este caso, se añadirá medio completo sin suplementación con IL-3, IL-6 y SCF, pero en vez de eso con las citoquinas dadas que van a ser analizadas o utilizadas para diferenciación directa (por ejemplo, CSF-1, GCSF, GM-CSF, EPO, TEPO, etc.).

Se titulan moléculas pequeñas, agentes biológicos o sustancias para control positivo (por ejemplo, Arsénico 03) a través de la placa de 96 pozos y se incuba con las lt-HSC para plazos que van desde 24 hasta 72 horas, o más largos, si se requiere y como se determinó con base en los agentes o moléculas que van a ser analizadas. Después de la incubación, se lava las células con PBS y se resuspenden en PBS para almacenamiento durante la noche a 80°C para lisar las células. Se descongelan luego las células a temperatura ambiente y se centrifugan las placas durante 10 min a 3.000 rpm. Se transfiere luego el sobrante a una nueva placa de 96 pozos y se mezcla con tetrametilbencidina (TMB) durante 40 min. Se detiene en la redacción con H2SO4 4 N y se lee la O.D. a 450 nm. Este tipo de ensayo de alto rendimiento puede ser utilizado para analizar moléculas pequeñas o agentes biológicos por la habilidad para inducir o bloquear la diferenciación de las HSC transformadas en forma condicional a largo plazo en una amplia variedad de tipos de células. Los resultados de estas selecciones pueden ser luego analizados aisladamente por la habilidad para inducir o inhibir la diferenciación de HSC in vivo. Las variaciones sobre este formato de ensayo serán evidentes para aquellos capacitados en el arte y están abarcados por la presente invención.

Ejemplo 8

El siguiente ejemplo describe el uso del método de la invención para generar líneas de células de un linaje hematopoyético intermedio.

El siguiente protocolo puede ser utilizado para inducir el desarrollo de líneas de células que representan etapas intermedias del desarrollo del linaje hematopoyético después de trasplantación de líneas de células de lt-HSC inmortalizadas en forma condicional en ratones irradiados en forma letal. Primero, se transfieren 103 - 105 líneas de células de lt-HSC transformadas en forma condicional generadas de acuerdo con el método de la invención en cohortes de ratones receptores irradiados en forma letal. Los trasplantes también incluirán 105 Rag-1-/- células como portadoras con el propósito de garantizar la supervivencia inicial de los ratones irradiados. Los ratones son tratados con inyecciones semanales de 1 mg de Tamoxifeno, en forma intraperitoneal, con el propósito de inmortalizar parcialmente células diferenciadas derivadas de las líneas de células lt-HSC transformadas en forma condicional. Se comienza con las inyecciones entre 3 días y 1 semana después del trasplante inicial, u 8 semanas después del trasplante, una vez que los ratones han sido completamente restituidos por las líneas de células lt-HSC transformadas en forma condicional. Se recolectan las células del bazo y células de la médula ósea de ratones tres días después del tratamiento con Tamoxifeno, o un cuando ellos muestran signos clínicos asociados con leucemias. Las células son cultivadas ya sea en condiciones estándar de cultivo de médula ósea con 4-OHT (DMEM, suero de ternera fetal al 15%, penicilina/estreptomicina, L-glutamina, aminoácidos no esenciales, IL-3, IL-6 y SCF), o en presencia de otras citoquinas y medio utilizado para diferentes tipos de células hematopoyéticas. Las líneas de células son congeladas y/o expandidas, y las líneas de células son también clonadas a partir de una célula única por medio de dilución limitante y definidas por medio de amplificación por PCR de integraciones provirales, congeladas, y luego caracterizadas para la expresión del marcador de superficie por medio de citometría de flujo. Estos tipos de aproximaciones son utilizadas tanto para las líneas de células ctlt-HSC humanas como de múrido, utilizando ya sea ratones NOD/SCID como receptores, o ratones Rag-1-/- neonatales, que recibirán inyecciones intrahepáticas.

Ejemplo 9

El siguiente ejemplo describe el uso del método de la invención y la adopción de protocolos utilizados para generar células T CD4+ αβ maduras in vitro para desarrollar líneas de células que representan etapas intermedias del desarrollo de células T.

En este experimento, se siembran en placa líneas de células lt-HSC inmortalizadas en forma condicional generadas de acuerdo con el método de la invención en presencia del coctel normal de citoquina, suplementado con IL-7 y sin Tamoxifeno. Se establecieron cultivos paralelos sobre una capa de células estromales OP-9 que expresan un ligando Notch-1, Jagged. Se tiñen las células por marcadores de linaje de células T cada 48 horas después de que los cultivos han comenzado a monitorear los signos de desarrollo de células T. Los pozos que muestran signos de compromiso y desarrollo del linaje T son conmutados por un medio que contiene Tamoxifeno con el propósito de estabilizar el fenotipo y establecer líneas de células. Las líneas de células resultantes se expanden, se clonan y se caracterizan como se describe en el Ejemplo 8. Las líneas de células T son específicamente teñidas por alelos TCRVβ individuales con el propósito de determinar su uso del repertorio receptor de células T. Algunas líneas de células T maduras, o líneas de células que representan poblaciones progenitoras, son trasplantadas en ratones Rag-1-/-con el propósito de evaluar su habilidad para conformar con tolerancia normal y mecanismos homeostáticos in vivo, así como su habilidad para diferenciarse adicionalmente in vivo, cuando sea apropiado. Finalmente, se evalúa su habilidad para responder a estimulación antigénica in vitro e in vivo.

Ejemplo 10

El siguiente ejemplo describe el uso del método de la invención y la adopción de protocolos utilizados para la diferenciación directa de las HSC en linajes de células mieloides para desarrollar líneas de células de desarrollo intermedio y modelos de leucemia mieloide.

En este experimento, se siembran en placa líneas de células lt-HSC inmortalizadas en forma condicional generadas de acuerdo con el método de la invención en presencia del coctel normal de citoquina, suplementado con G-CSF y sin Tamoxifeno. Se tiñen las células por marcadores de linaje mieloide cada 48 horas después de que los cultivos han comenzado a monitorear los signos de desarrollo mieloide. Los pozos que muestran signos de compromiso y desarrollo del linaje mieloide son conmutados por un medio que contiene Tamoxifeno con el propósito de estabilizar el fenotipo y establecer líneas de células. Las líneas de células resultantes se expanden, se clonan y se caracterizan como se describe en el Ejemplo 8. Algunas de las líneas de células resultantes son trasplantadas nuevamente en ratones con el propósito de monitorear su habilidad para repoblar ratones Op/Op (ratones mutantes que carecen naturalmente de macrófagos). Esas líneas de células son también trasplantadas en ratones de tipo silvestre que serán mantenidos sobre Tamoxifeno todo el tiempo, con el propósito de determinar si estas líneas de células daránlugar también a leucemias mieloides similares a AML, CML y APL humanas. Éstos nuevos tumores proporcionan nuevos modelos para terapéuticas preclínicas.

Ejemplo 11

El siguiente ejemplo describe la generación de líneas de células ctlt-HSC adultas humanas y el examen de su pluripotencia in vivo utilizando modelos de xenotrasplante de RAG-/-o NOD/SCID.

En este experimento, células CD34+ (de sangre movilizada o sangre del cordón umbilical) son transducidas in vitro con vectores retrovirales MYC-ER, Bcl-2 y GFP (para detección posterior de células trasplantadas), empacadas utilizando envolturas anfotrópicas (de acuerdo con los métodos de la presente invención). Se seleccionan las lt-HSC por medio de propagación in vitro en presencia de 40HT y de factores de crecimiento, como se describió anteriormente utilizando las HSC de múrido. Se evalúa la pluripotencia de las células seleccionadas por medio de trasplantación de líneas lt-HSC en ratones NOD/SCID o NOD/SCID/β-2M-/-o Rag-1-/-o Rag-2-/-, después de 6 - 12 semanas más tarde por medio del análisis de todos los linajes de células sanguíneas por citometría de flujo de inmunofluorescencia. Más particularmente, después de la generación de líneas de células ctlt-HSC utilizando el método de la presente invención, se pueden utilizar dos aproximaciones diferentes y complementarias para examinar su pluripotencia. En una primera aproximación, se introducen diferentes cantidades de líneas de células ctlt-HSC clonales en ratones NOD/SCID irradiados en forma subletal o en ratones NOD/SCID/β-2M-/-. En este caso, se transfieren 103 - 105 células derivadas de líneas de células ctlt-HSC humanas en forma intravenosa después de que los ratones son sometidos a un régimen de irradiación subletal (0,3 Gy). Los ratones son analizados por reconstitución a las 6 - 12 semanas después de la trasplantación. Segundo, se introducen103 - 105 células derivadas de líneas de células ctlt-HSC humanas en el hígado de ratones Rag-1-/- o Rag-2-/- neonatales por medio de inyección directa. Esos xenotransplantes serán también analizados por reconstitución apropiada 6 - 12 semanas después de la trasplantación.

Ejemplo 12

El siguiente ejemplo describe el uso de aproximaciones condicionales para anular la expresión de MYC y Bcl-2 de las ctlt-HSC después de trasplantación.

En este experimento, se hace reingeniería genética de virus (vectores virales) utilizados para transformar células madre para contener dos sitios loxP que flanquean los marcos de lectura abierta de MYC-ER, Bcl-2 y GFP (ORFS). Cuando las células son trasplantadas, se utilizará una forma regulada de la proteína de fusión Cre o CRE-TAT para suprimir las secuencias que codifican al oncogén, eliminando así el riesgo de insertar neoplasias malignas conducidas en receptores. Esta aproximación es primero desarrollada en ratones, luego aplicada a las lt-HSC humanas.

En una segunda aproximación, se usan las lt-HSC de ratones TRE-MYC para generar las líneas de células con retrovirus que codifican Bcl-2 o rtTA. Estas son trasplantadas en ratones. Los ratones son alimentados con Doxiciclina para anular la expresión de MYC. Se pueden utilizar las lt-HSC obtenidas a partir de ratones bigénicos TRE-MYCxTRE-Bcl-2 que pueden ser transducidos con un retrovirus pMIG-rtTA para eliminar la expresión de MYC y Bcl2.

Ejemplo 13

El siguiente ejemplo describe el uso de fusiones de proteína Tat del VIH-1 con MYC y/o Bcl-2 para lograr la transformación condicional sin modificación genética de las lt-HSC.

Las proteínas de fusión MYC-Tat y Bcl-2-Tat son generadas y purificadas utilizando protocolos establecidos. Las proteínas de fusión son analizadas por medio del tratamiento de células en las cuales se pueden analizar fácilmente los efectos de Bcl-2 sobreexpresado (por ejemplo, células T activadas, líneas de células de linfoma de células B que se vuelven resistentes a BCMA-Fc, etc.) o MYC (por ejemplo, células B anérgicas, células T no intervenidas, células T activadas). Se utilizan combinaciones de proteínas MYC-Tat y Bcl-2-Tat para permitir la propagación de las lt-HSC antes de la trasplantación. Esta aproximación es fácilmente desarrollada y analizada en el sistema de ratón, luego aplicado a humanos.

La descripción completa de cada una de las Solicitudes Provisionales de Patente Estadounidense No. 60/728.131 y No. 60/765.993 es incorporada aquí como referencia.

Aunque se han descrito en detalle diferentes modalidades de la presente invención, es evidente que se presentarán modificaciones y adaptaciones de esas modalidades para aquellos capacitados en el arte. Se debe entender expresamente, sin embargo, que tales modificaciones y adaptaciones están dentro de alcance de la presente invención, como se expone en las siguientes reivindicaciones.

5 Listado de Secuencias

<110> National Jewish Medical and Research Center The Regents of the University of Colorado

<120> Células madre inmortalizadas en forma condicional a largo plazo y métodos para la elaboración y uso de tales células

<130> 2879 - 117- PCT 10 <150> 60/728.131

<151> 2005 - 10 - 18

<150> 60/765.993

<151> 2006 - 02 - 06

<160> 14 15 <170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 2377

<212> ADN

<213> Homo sapiens 20 <400> 1

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<210> 2

<211> 454

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

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<210> 3

<211> 51552

<212> ADN 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (31450)..(31450)

<223> n es a, c, g, o t

10 <400> 3

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<210> 4

<211> 1132

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

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<210> 5

<211> 6492

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5

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<210> 6

<211> 239

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

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<210> 7

<211> 1207

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

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<210> 8

<211> 205

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

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<210> 9

<211> 2594

<212> ADN

<213> Virus de Inmunodeficiencia Humana 1

<400> 9 <210> 10

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<211> 86

<212> PRT

<213> Virus de inmunodeficiencia humana 1

<400> 10

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<210> 11

<211> 2397

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 11

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<210> 12

<211> 799

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

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<210> 13

<211> 814

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 13

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<210> 14

<211> 799

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

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REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

•

US 728131 P [0169] • US 60728131 B [0171]

•

US 765993 P [0169] • US 60765993 B [0171] Literatura citada en la descripción que no es de patente:

•

Reya et al. Nature, 2003, vol. 423, 409 - 14 [0035]

•

Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Press, 1989 [0048] [0050]

•

Meinkoth et al. Anal. Biochem., 1984, vol. 138, 267 - 284 [0050]

•

Altschul, S. F. ; Madden, T. L. ; Schääffer, A. A. ; Zhang, J. ; Zhang, Z. ; Miller, W. ; Lipman, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res., 1997, vol. 25, 3389 - 3402 [0061]

•

Tatusova ; Madden. Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences. FEMS Microbiol Lett., 1999, vol. 174, 247 - 250 [0062]

•

Van Parijs et al. Immunity, 1999, vol. 11, 763 - 70 [0076]

•

Aster et al. Mol Cell Biol., October 2000, vol. 20 (20), 7505 - 15 [0080]

•

Soloman et al. Oncogene, 02 November 1995, vol. 11 (9), 1893 - 7 [0080]

•

Zhang ; Lodich. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood, 2005, vol. 105, 4314 - 20 [0087]

•

Davidson. Nature Biotechnol., 2006, vol. 24 (8), 951 - 952 [0097]

•

McNamara et al. Nature Biotechnol., 2006, vol. 24 (8), 1005 - 1015 [0097]

•

Maulik et al. Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies. Wiley-Liss, Inc, 1997 [0105]

•

Van Parijs, L. ; Y. Refaeli ; A. K. Abbas ; D. Baltimore. Autoimmunity as a consequence of retrovirus-mediated expression of C-FLIP in lymphocytes. Immunity, 1999, vol. 11, 763 - 70 [0124]

•

Reya, T. ; Duncan, A. W. ; Ailles, L. ; Domen, J. ; Scherer, D. C. ; Willert, K. ; Hintz, L. ; Nusse, R. ; Weissman, I. L. A role for Wnt signaling in self-renewal of hematopoietic stem cells. Nature, 2003, vol. 423, 409 - 14 [0127]

•

Johnson, S. A. ; S. J. Rozzo ; J. C. Cambier. Aging-dependent exclusion of antigen-inexperienced cells from the peripheral B cell repertoire. J Immunol, 2002, vol. 168 (10), 5014 - 23 [0132]

•

Schneider, T. ; Issekutz, A. C. Quantitation of eosinophil and neutrophil infiltration into rat lung by basic assays for eosinophil peroxidase and myeloperoxidase. Application in a Brown Norway rat model of allergic pulmonary inflammation. J Immunol Methods, 1996, vol. 198, 1 - 14 [0154]

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una célula madre adulta inmortalizada en forma condicional a largo plazo que comprende:

   a.

   una proteína recombinante codificada por un protooncogén o un fragmento biológicamente activo u homólogo de la proteína que promueve la supervivencia y proliferación de la célula, o una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la misma, en donde la expresión o la función de la proteína, fragmento u homólogo de la misma es inducible; y

   b.

   una proteína recombinante que inhibe la apoptosis de la célula madre, o una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína que inhibe la apoptosis de la célula madre.

2. 2.

   La célula madre adulta inmortalizada en forma condicional a largo plazo de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico de (a) y/o (b) está contenida en un vector.

3. 3.

   La célula madre adulta inmortalizada en forma condicional a largo plazo de la reivindicación 2, en donde el vector contiene un elemento sensible a la tetraciclina.

4. 4.

   La célula madre adulta inmortalizada en forma condicional a largo plazo de la reivindicación 2, en donde la molécula de ácido nucleico de (a) y/o (b) está contenida en un vector que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de reconocimiento de sustrato para una recombinasa que flanquea la molécula de ácido nucleico de (a) o (b).

5. 5.

   La célula madre adulta inmortalizada en forma condicional a largo plazo de la reivindicación 1, en donde la proteína recombinante codificada por un protooncogén o un fragmento biológicamente activo u homólogo de la proteína que promueve la supervivencia y proliferación de la célula, o una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la misma se selecciona del grupo que consiste de MYC-ER e ICN-1-ER.

6. 6.

   La célula madre adulta inmortalizada en forma condicional a largo plazo de la reivindicación 1, en donde la proteína recombinante que inhibe la apoptosis de la célula madre es Bcl-2.

7. 7.

   La célula madre adulta inmortalizada en forma condicional a largo plazo de la reivindicación 1, que comprende:

   a.

   la proteína recombinante codificada por el protooncogén o fragmento biológicamente activo u homólogo de la proteína que promueve la supervivencia y proliferación de la célula, en donde la función de la proteína, fragmento u homólogo de la misma es inducible; y

   b.

   la proteína recombinante que inhibe la apoptosis de la célula madre.

8. 8.

   La célula madre adulta inmortalizada en forma condicional a largo plazo de la reivindicación 1, en donde la proteína recombinante codificada por un protooncogén o fragmento biológicamente activo u homólogo de la proteína que promueve la supervivencia de la célula es una proteína de fusión Tat, o la proteína recombinante que inhibe la apoptosis de la célula madre es una proteína de fusión Tat.

9. 9.

   Un método para producir células madre adultas inmortalizadas en forma condicional, que comprende:

   a.

   suministrar en una población de células madre una primera proteína codificada por un protooncogén o fragmento biológicamente activo u homólogo de la proteína que promueve la supervivencia y proliferación de la célula, o una molécula de ácido nucleico que codifica la misma, en donde la expresión o función de la proteína, fragmento u homólogo de la misma es inducible;

   b.

   inhibir apoptosis en las células madre por medio del suministro en las células madre de una segunda proteína que inhibe apoptosis de la célula madre, o una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína que inhibe apoptosis de la célula madre; y

   c.

   expandir las células madre en presencia de una combinación de factores de crecimiento de células madre bajo condiciones por medio de las cuales la expresión o función de la primera proteína, fragmento u homólogo de la misma es activa, para producir células madre adultas inmortalizadas en forma condicional.

10. 10. El método de la reivindicación 9, en donde suministrando en una población de células madre una primera proteína codificada un protooncogén o fragmento biológicamente activo u homólogo de la proteína que promueve la supervivencia y proliferación de la célula comprende el cultivo de las células madre en presencia de una primera proteína de fusión Tat, en donde Tat se fusiona con la proteína codificada por el protooncogén o fragmento biológicamente activo u homólogo de la proteína que promueve la supervivencia y proliferación de la célula; y

    en donde la inhibición de apoptosis en las células madre por medio del suministro en las células madre de una segunda proteína que inhibe apoptosis de la célula madre que comprende el cultivo de las células madre con una segunda proteína de fusión Tat, en donde Tat se fusiona con la proteína que inhibe en la célula madre.

11. 11.

    El método de la reivindicación 9, en donde la proteína recombinante codificada por un protooncogén o fragmento biológicamente activo u homólogo de la proteína que promueve la supervivencia y proliferación de la célula, o una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la misma es MYC-ER, y en donde la proteína recombinante que inhibe apoptosis de la célula madre es Bcl-2.

12. 12.

    El método de la reivindicación 9, en donde la proteína que inhibe apoptosis de la célula madre inhibe una proteína proapoptótica en las células madre.

13. 13.

    Un método para identificación de compuestos que regula el compromiso del linaje y/o la diferenciación y desarrollo de la célula, que comprende:

    a.

    poner en contacto células madre adultas inmortalizadas en forma condicional a largo plazo con un compuesto que va a ser analizado; y

    b.

    detectar al menos una característica genotípica o fenotípica en las células madre adultas inmortalizadas en forma condicional a largo plazo, comparado con las células madre adultas inmortalizadas en forma condicional a largo plazo en ausencia del compuesto, en donde la detección de una diferencia en la característica en presencia del compuesto indica que el compuesto afecta la característica en la célula madre;

    en donde las células madre adultas inmortalizadas en forma condicional a largo plazo comprenden:

    i. una proteína recombinante codificada por un protooncogén o fragmento biológicamente activo u homólogo de la proteína que promueve la supervivencia y proliferación de la célula, o una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la misma, en donde la expresión o función de la proteína, fragmento u homólogo de la misma es inducible; y

    ii. una proteína recombinante que inhibe apoptosis de la célula madre, o una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína que inhibe apoptosis de la célula madre.