JP5442998B2 - 腫瘍性疾患を処置するための手段および方法 - Google Patents

Description

本発明は、抗体構築体、特に二重特異性一本鎖抗体構築体を患者に投与することに基づく、免疫学的医療介入のための投薬手段および方法に関する。詳細には、本発明は遅進性または攻撃性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫（B NHL）またはＢ細胞性白血病を処置するための投薬手段および方法であって、二重特異性一本鎖抗体の投与を伴う手段および方法に関する。本発明はさらに、遅進性または攻撃性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫（B NHL）またはＢ細胞性白血病の処置に用いる医薬の調製のための、二重特異性一本鎖抗体の使用に関する。

抗体に基づく療法はヒトの疾患の処置に広く用いられている。それらの処置計画は、一般に抗体療法薬を複数回”ボーラス注入”すること、すなわち、処置の全期間にわたって間欠的に分配して、抗体を普通は静脈内（i.v.）に高用量で複数回注射することを伴う−Webster's Online Dictionaryによれば、”ボーラス注入”は普通は１回量の薬物を血管内へ短期間で注入することを表わす；www.nlm.nih.gov/medlineplusおよびwww.phoenix5.org/glossaryも参照されたい。たとえば再発性または難治性の軽度または濾胞性CD20+Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫(NHL)を処置するためのモノクローナル抗CD20抗体であるリツキシマブ(Rituximab) (リツキサン(Rituxan))は、4〜8週間にわたって各週投与として反復適用された(Ghielmini M., J. Clin. Oncol. 2004)。下記のものについても、ボーラス注入パターンが記載されている：慢性リンパ性白血病におけるヒト化抗CD52モノクローナル抗体であるアレムツヅマブ(Alemtuzumab) (O'Brian, 2003, Cancer, 98, 2657-63)、転移性乳癌におけるトラスツヅマブ(Trastuzumab) (ハーセプチン(Herceptin)、抗Her2抗体)、急性骨髄球性白血病(AML)におけるゲムツヅマブ(Gemtuzumab) (ミエロタルグ(Myelotarg)、抗CD33抗体)、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病(CLL)におけるアレムツヅマブ(カンパス(Campath)、抗CD52抗体)、および再発性または難治性の軽度、濾胞性またはトランスフォームドＢ細胞性NHLにおけるイブリツモマブ(Ibritumomab) (ゼバリン(Zevalin)、抗CD20抗体) (概説についてはCersosimo, 2003, Am. J. Health-Syst-Pharm., 60, 1531-48を参照)。抗17-1Aモノクローナル抗体エドレコロマブ(Edrecolomab) (パノレックス(Panorex))も、高負荷用量(500 mg)から出発し、続いて2週間後、28日毎に100 mgの静脈内注入を行う反復注入として適用された(Makower, 2003, Cancer Invest., 2, 177-84)。

抗体療法に一般にみられる現象は、注入関連の副作用、たとえばサイトカイン放出症候群(”CRS”)の発症である。CRSはＴ細胞に結合する抗体の注入に応答して起きる即時型合併症である。CRSは、Ｔ細胞／単球の活性化、二次的には補体カスケードの活性化と関連があるとされている。これらのプロセスはＴ細胞および単球を架橋して補体を活性化することができる抗体のFc部により仲介される。CRSの病原性は、OKT3によるＴリンパ球刺激に応答した腫瘍壊死因子(TNF)アルファ、IL-2およびIL-6ならびにガンマ-インターフェロンの合成に起因するとされている。一般にそれらの抗体はＴ細胞の受容体に結合し、これによりＴ細胞を活性化する。活性Ｔ細胞により放出されるサイトカイン（たとえばTNFアルファ、インターロイキン(IL-2、IL-6)およびインターフェロン(IFNガンマ)は、重篤な感染症にみられるものと類似した、高血圧、発熱および悪寒を特徴とするタイプの全身性炎症反応を生じる。患者は高熱があるかのように著しい不調を感じる−事実、CRSは実際上、あるタイプの非感染性熱病である。CRSに関連すると記載されている他の有害な副作用は、疲労、嘔吐、頻脈、高血圧、頭痛および背痛である。

CRSは、多様なモノクローナル抗体の投与に際して同様に観察されている。たとえば抗CD20抗体リツキシマブの抗腫瘍活性は、Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病(B-CLL)の治療に利用される。リツキシマブが単剤として有意の臨床活性を生じるには、週3回投与により達成される用量漸増、すなわち用量増加が必要である(Lin, 2003, Seminar Oncol. 30, 483-92)。しかし、この投与計画はサイトカインTNF-アルファおよびIL-6の放出の引き金となり、これらの血清濃度は各注入の開始後90分でピークに達する。このサイトカイン上昇には発熱、悪寒、高血圧および吐き気が伴う(Winkler, 1999, Blood, 94, 2217-24)。注入毒性は適切な前薬（pre-pharmaceutical agent）および漸増投与計画（stepped-up administration scheme）によって減少させることができる (Lin, 2003, Seminar Oncol. 30, 483-492)。

CRSは、他の抗体フォーマット、たとえば二重特異性抗体を投与する際にも観察されている。二重特異性抗体MDX-2H12 (抗Fcガンマ受容体 I×抗Her-2/neu)をGCSF（顆粒球コロニー刺激因子）と組み合わせて乳癌患者に１回注入すると、MDX-2H12の注入後、それぞれ2および4時間目にTNF-アルファおよびIL-6が最大濃度になった。TNF-アルファおよびIL-6のピーク濃度は、二重特異性抗体の適用量とは相関性がなかった(Repp, 2003, Br. J. Cancer, 89, 2234-43)。

WO 99/54440に記載されるように、CRSは、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体(bscCD19xCD3)をＢ細胞由来慢性リンパ性白血病(B-CLL)患者に反復注入により投与して実施した内部臨床試験においても観察されている。WO 99/54440の図19および20に示されるように、TNF、IL-6およびIL-8の放出は、20分間注入2回（それぞれ3μgおよび10μgの二重特異性一本鎖抗体）それぞれに応答してみられ、各投与後にサイトカインが放出された。最大のサイトカイン放出は、10μgの二重特異性一本鎖抗体を投与した後にみられた。

Ten Berge et al., 1996, Transplant. Proc. 28, 3217-20には、抗CD3モノクローナル抗体OKT3の2時間連続注入を伴う試験が記載されている。この試験の目標は、OKT3投与に関連することが知られている塞栓性合併症がこの分子の投与様式によるものであるかを判定することであった。一般に連続注入によるOKT3の投与の方が１回ボーラス注入より良好に耐容された。

連続注入は抗体関連医薬に関する先行技術にも記載されている。たとえばGD3ガングリオシド特異的モノクローナル抗体R24を連続注入すると、R24関連毒性が主に25および50 mg/m²の用量で生じた(Alpaugh, 1998, Med. Oncol., 15, 191-8)。ガングリオシドGM3に特異的なヒトIgMモノクローナル抗体を転移性黒色腫患者に2回の24時間注入で48時間にわたって連続注入すると、注入の途中および後にわずかな副作用が誘発された(Irie, 2004, Cancer Immunol. Immunother. 53, 110-7)。この場合、臨床効果を達成するためにはきわめて高い投与率の療法抗体、すなわちグラム規模の抗体が必要であった。

さらに、ネズミIgG1としてハイブリットハイブリドーマから産生された抗CD16×抗CD30二重特異性抗体が、種々の注入計画でホジキン病患者に適用された(Hartmann, 2001, Clin. Cancer Res., 7, 1873-1881)。この抗体はCD16 (Fc-ガンマ受容体III)への結合によりNK細胞を活性化する。注入は、24時間にわたる連続4日間の連続注入または隔日に１時間注入として行われた。注入１回当たりの二重特異性抗体の絶対量は、5%ヒトアルブミン溶液中25 mgの4倍であった。二重特異性抗体の注入後−投与計画に関係なく−一貫した末梢血細胞数の変化はみられなかった。ただし、この細胞数は個体間で著しく異なっていた。抗体治療計画が連続的であるか間欠的であるかにかかわらず、患者は発熱した。療法用抗体を間欠的にボーラスとして注入するのではなく連続的に注入しても、患者が受ける副作用の発症率または重症度は低下しなかった。標的エフェクター細胞の量および／または活性化状態の増大を達成するためには、たとえば同時にサイトカインを適用することにより、二重特異性抗体療法の抗腫瘍効力を高めることも必要であろうと述べられている。前記の試験で全量100 mgの療法用抗体が用いられたにもかかわらず二重特異性抗体による療法の成功および広範な適用性に対して大きな障害があるのは、二重特異性抗体の利用能に限界があることであると確認された。その著者らは、1)二重特異性抗体の用量を高めること、および2)治療サイクル数を増加させることにより、かなり改善された臨床効力を達成できると提唱している。

したがって、望ましくない副作用の軽減が求められている。

したがって本発明の目的は、患者の耐容性が高い抗体に基づく医療のための投薬手段および方法を提供することである。詳細には、そのような手段および方法により投与抗体の生物活性を最大限に保持でき、一方ではこの投与による目的外の有害な副作用を最小限に抑えることが目的である。

本発明は、癌または充実性もしくは非充実性腫瘍の予防、治療または軽減に用いる医薬組成物の調製のための、二重特異性一本鎖抗体構築体の使用に関するものであり、その際、二重特異性一本鎖抗体構築体はより長期間かけて持続的に投与されるものである。

したがって本発明の第１観点は、遅進性または攻撃性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫（B NHL）またはＢ細胞性白血病の予防、治療または軽減に用いる医薬組成物の調製のための、二重特異性一本鎖抗体構築体の使用であって、二重特異性一本鎖抗体構築体がヒトCD3およびヒトCD19に特異的な結合ドメインを含み、対応するＨ鎖可変領域(V_H)および対応するＬ鎖可変領域(V_L)がＮ末端からＣ末端へ下記の順に配置され：
V_L(CD19)-V_H(CD19)-V_H(CD3)-V_L(CD3) (SEQ ID NO.: 2)、
V_H(CD19)-V_L(CD19)-V_H(CD3)-V_L(CD3) (SEQ ID NO.: 4)、
V_H(CD3)-V_L(CD3)-V_H(CD19)-V_L(CD19) (SEQ ID NO.: 6)、または
V_H(CD3)-V_L(CD3)-V_L(CD19)-V_H(CD19) (SEQ ID NO.: 8)、
二重特異性一本鎖抗体構築体は患者の体表面積m²当たり10〜80μgの１日量で少なくとも１週間投与されるものであり、この１日量は少なくとも6時間かけて投与されるものである使用を提供する。

他の態様において本発明は、遅進性または攻撃性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫（B NHL）またはＢ細胞性白血病を予防、治療または軽減するための方法であって、その必要がある対象に二重特異性一本鎖抗体構築体を含む医薬組成物を投与することを含み、二重特異性一本鎖抗体構築体がヒトCD3およびヒトCD19に特異的な結合ドメインを含み、対応するＨ鎖可変領域(V_H)および対応するＬ鎖可変領域(V_L)がＮ末端からＣ末端へ下記の順に配置され：
V_L(CD19)-V_H(CD19)-V_H(CD3)-V_L(CD3) (SEQ ID NO.: 2)、
V_H(CD19)-V_L(CD19)-V_H(CD3)-V_L(CD3) (SEQ ID NO.: 4)、
V_H(CD3)-V_L(CD3)-V_H(CD19)-V_L(CD19) (SEQ ID NO.: 6)、または
V_H(CD3)-V_L(CD3)-V_L(CD19)-V_H(CD19) (SEQ ID NO.: 8)、
二重特異性一本鎖抗体構築体は患者の体表面積m²当たり10〜80μgの１日量で少なくとも１週間投与されるものであり、この１日量は少なくとも6時間かけて投与されるものである方法に関する。

他の態様において本発明は、下記のものを含むキットに関する：ヒトにおいて遅進性または攻撃性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫（B NHL）またはＢ細胞性白血病を予防、治療または軽減するための医薬組成物であって、ヒトCD3およびヒトCD19に特異的な結合ドメインを含み、対応するＨ鎖可変領域(V_H)および対応するＬ鎖可変領域(V_L)がＮ末端からＣ末端へ下記の順に配置された二重特異性一本鎖抗体構築体を含む医薬組成物：
V_L(CD19)-V_H(CD19)-V_H(CD3)-V_L(CD3) (SEQ ID NO.: 2)、
V_H(CD19)-V_L(CD19)-V_H(CD3)-V_L(CD3) (SEQ ID NO.: 4)、
V_H(CD3)-V_L(CD3)-V_H(CD19)-V_L(CD19) (SEQ ID NO.: 6)、または
V_H(CD3)-V_L(CD3)-V_L(CD19)-V_H(CD19) (SEQ ID NO.: 8)、
ならびに、二重特異性一本鎖抗体構築体について、患者の体表面積m²当たり10〜80μgの１日量で少なくとも１週間投与し、この１日量は少なくとも6時間かけて投与されるものであることを含む投与計画が記載された指示シート。

本発明の他の態様は、ヒトCD3およびヒトCD19に特異的な結合ドメインを含み、対応するＨ鎖可変領域(V_H)および対応するＬ鎖可変領域(V_L)がＮ末端からＣ末端へ下記の順に配置された二重特異性一本鎖抗体構築体：
V_L(CD19)-V_H(CD19)-V_H(CD3)-V_L(CD3) (SEQ ID NO.: 2)、
V_H(CD19)-V_L(CD19)-V_H(CD3)-V_L(CD3) (SEQ ID NO.: 4)、
V_H(CD3)-V_L(CD3)-V_H(CD19)-V_L(CD19) (SEQ ID NO.: 6)、または
V_H(CD3)-V_L(CD3)-V_L(CD19)-V_H(CD19) (SEQ ID NO.: 8)、
の投与を含み、その際、二重特異性一本鎖抗体構築体は患者の体表面積m²当たり10〜80μgの１日量で少なくとも１週間投与されるものであり、この１日量は少なくとも6時間かけて投与されるものである、ヒトにおいて遅進性または攻撃性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫（B NHL）またはＢ細胞性白血病を予防、治療または軽減する際に使用するためのキットであって、下記の構成要素を含むキットに関する：
(a)少なくとも7つの個別の１日量140〜320μgの二重特異性一本鎖抗体構築体；および
(b)投薬計画に対するコンプライアンスを推進するように構成要素を配置する手段。

その際、本発明による方法、キットまたは使用に関して患者の平均体表面積は1.7〜2.2 m²と計算される。

有利には、本発明のキットはさらに、場合により反応緩衝液（１以上）、保存液、および／または前記の使用に必要な残りの試薬もしくは材料を含む。さらに、本発明のキットの部品は個別にバイアルもしくはボトル内に、または組み合わせて容器もしくは多容器ユニット内にパッケージすることができる。キットの作製は当業者に既知の標準法に従うのが好ましい。

本明細書に記載する抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体構築体(bscCD19xCD3)の安全性および耐容性を評価するために、再発性非ホジキンリンパ腫（B NHL）を伴う患者2人に本発明配合物を長期連続注入により投与した。

第１患者は、2000年に濾胞性リンパ腫と診断された。この患者はそれまでに複数の化学療法および免疫療法を受けたにもかかわらず、その疾患が進行した。本明細書に記載する抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体構築体で本明細書に提示する使用および方法に従って治療すると、その疾患が休止しただけでなく、リンパ腫病変部の劇的な縮小を初めて達成できた。後記の例（限定ではない）に記載するように、この患者に本明細書に記載する抗CD3×抗CD19二重特異性一本鎖抗体構築体を15μg/m²/24時間のレベルで4週間の連続注入として投与した場合、この治療は良好に耐容され、すなわち有意の副作用はみられなかった。この治療によって強いＴ細胞活性化および拡張が起きた。細胞傷害性表現型をもつＴ細胞が主にCD8⁺Ｔ細胞の拡張の原因である。Ｔ細胞の活性化および増殖は、腫瘍内において、本明細書に記載する抗CD3×抗CD19二重特異性一本鎖抗体で修飾されたＢリンパ腫細胞により誘発された。治療中のＢ細胞数測定により、本発明の構築体はリンパ腫細胞に対する細胞毒性により循環Ｂ（リンパ腫）細胞を完全に排除できることを示した。治療後の病期再判定に際して、NHLについての応答評価によればリンパ腫腫瘍塊の明らかな縮小がみられた：6つの基準リンパ腫病変部の和積直径（Sum Product Diameters）(SPD)の低下が58.0%と診断され、これはコンピューター断層撮影(CT)による腫瘍応答評価における部分応答(PR)に相当する。

第２患者は1999年に小リンパ球性リンパ腫(SLLまたはB-CLL)と診断された。この疾患の病歴7年中に患者は7種類の異なる化学療法ならびに免疫療法および放射線療法を受けたが、主応答は何ら証明されなかった；この患者を抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体構築体で本発明の投薬手段および方法に従って治療すると、基準リンパ腫病変部の50%以上の縮小を達成できたという点で、初めて有効な療法が得られた。この第２患者を本明細書に記載する抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体構築体15μg/m²/24時間で2週間連続治療すると、循環Ｂ（リンパ腫）細胞が効果的に枯渇した。さらに、本明細書に記載する抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体構築体により骨髄からの完全なリンパ腫細胞排除がみられた。この所見は完全骨髄応答と一致する；これは、たとえば一般的な化学療法によれば達成が困難である。治療後の病期再判定に際して、リンパ腫腫瘍塊の明らかな縮小がみられた：6つの基準リンパ腫病変部のサイズの縮小はコンピューター断層撮影(CT)により57.2%と診断され、これは腫瘍応答評価における部分応答(PR)に相当する。

本発明による”二重特異性一本鎖抗体”もしくは”一本鎖二重特異性抗体”という用語または関連の用語は、完全な免疫グロブリン中に存在する定常部および／またはFc部（１以上）を除いて、少なくとも2つの抗体可変領域を単一ポリペプチド鎖中で結合させることにより得られた抗体構築体を意味する。本明細書中で用いる”リンカー”は同一特異性のVドメインを連結し、これに対し本明細書中で用いる”スペーサー”は異なる特異性のVドメインを連結する。たとえば、二重特異性一本鎖抗体は、それぞれ別個の抗原に特異的に結合しうる合計2つの抗体可変領域、たとえば2つのVH領域をもち、短い（通常は10個未満のアミノ酸）合成ポリペプチドスペーサーにより互いに連結され、これによりこれら2つの抗体可変領域が介在スペーサーと共に単一の連続ポリペプチド鎖として存在する構築体であってもよい。二重特異性一本鎖抗体の他の例は、3つの抗体可変領域をもつ単一ポリペプチド鎖であってもよい。この場合、2つの抗体可変領域、たとえば１つのVHおよび１つのVLがscFvを構成することができ、その際、これら2つの抗体可変領域が合成ポリペプチドリンカーにより互いに連結され、リンカーはしばしば免疫原性を最小限に抑えた一方でなおかつタンパク質分解に対して最大限に抵抗性であるように遺伝子工学的に処理されている。このscFvは、特定の抗原に特異的に結合することができ、かつscFvが結合するものとは異なる抗原に結合しうる他の抗体可変領域、たとえばVH領域に結合している。二重特異性一本鎖抗体のさらに他の例は、4つの抗体可変領域領域をもつ単一ポリペプチド鎖であってもよい。この場合、最初の2つの抗体可変領域、たとえばVH領域およびVL領域が、ある抗原に結合しうる１つのscFvを形成し、一方では第２のVH領域およびVL領域が、他の抗原に結合しうる第２のscFvを形成してもよい。単一の連続ポリペプチド鎖内で、１つの特異性をもつ個々の抗体可変領域が有利には前記の合成ポリペプチドリンカーにより分離されていてもよく、一方では各scFvが有利には前記の短いポリペプチドスペーサーにより分離されていてもよい。二重特異性一本鎖抗体およびそれらを作製する方法の例（限定ではない）は、WO 99/54440、WO 2004/106381、Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-70; Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-5; Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-7; Loeffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-103; Bruehl, J. Immunol., (2001), 166, 2420-2426に示されている。

本明細書中で用いる”CD3”は、ヒトＴ細胞に多分子Ｔ細胞受容体複合体の一部として発現する抗原を表わし、CD3は5つの異なる鎖からなる：CD3-イプシロン、CD3-ガンマ、CD3-デルタ、CD3-イータおよびCD3ゼータ。Ｔ細胞はＴ細胞上での抗CD3抗体によるクラスター形成により、抗原が結合したと同様に、ただし前記のＴ細胞サブセットのクローン特異性とは独立して活性化される。したがって、本明細書中で用いる”その特異性の１つによりヒトCD3抗原を特異的に結合する二重特異性一本鎖抗体”という用語は、ヒトＴ細胞上に発現したヒトCD3複合体に特異的に結合して標的細胞の排除／溶解を誘発しうるCD3特異的構築体に関する。その際、それらの標的細胞は、特異的な二重特異性一本鎖抗体の他の非-CD3結合性部分により結合される抗原を保有／提示する。当技術分野で既知のように、CD3複合体にCD3特異的結合剤（たとえば本発明の投薬手段および方法に従って投与される二重特異性一本鎖抗体）が結合すると、Ｔ細胞の活性化が生じる；たとえばWO 99/54440またはWO 2004/106381を参照。したがって、本発明の投薬手段および方法に適切な構築体は、インビボおよび／またはインビトロで標的細胞を有利に排除／溶解することができる。対応する標的細胞は腫瘍抗原、たとえばCD19を発現する細胞を含み、これが前記構築体の第２特異性（たとえば二重特異性一本鎖抗体の非-CD3結合性部分）により認識される。好ましくは、この第２特異性はヒトCD19に対するものであり、これは既にWO 99/54440またはWO 2004/106381に記載されている。この態様によれば、二重特異性一本鎖抗体の抗原特異的部分はそれぞれ、抗体VH領域および抗体VL領域を含む。この二重特異性一本鎖抗体の有利な変異体は、Ｎ末端からＣ末端へ下記のものである：
V_L(CD19)-V_H(CD19)-V_H(CD3)-V_L(CD3) (SEQ ID NO.: 2)、
V_H(CD19)-V_L(CD19)-V_H(CD3)-V_L(CD3) (SEQ ID NO.: 4)、
V_H(CD3)-V_L(CD3)-V_H(CD19)-V_L(CD19) (SEQ ID NO.: 6)、または
V_H(CD3)-V_L(CD3)-V_L(CD19)-V_H(CD19) (SEQ ID NO.: 8)。

より具体的には、本発明の意味において用語”特異的に結合する”、または関連用語、たとえば”特異性”は、主に2つのパラメーターを特徴とすることを理解すべきである：質的パラメーター（結合エピトープ、すなわち抗体が結合する部位）および量的パラメーター（結合親和性、またはこの抗体がそれの結合部位に結合する強度）。どのエピトープに抗体が結合するかは、たとえばFACS法、ELISA、ペプチド-スポット-エピトープマッピング、または質量分析によって有利に判定できる。特定のエピトープへの抗体結合の強度は、たとえば既知のビアコア（Biacore）および／またはELISA法によって有利に判定できる。それらの方法を組み合わせることにより、結合特異性の代表的な尺度としての信号：ノイズ比を計算することができる。そのような信号：ノイズ比において、信号は目的エピトープへの抗体結合の強度を表わし、一方、ノイズは目的エピトープと異なる他の無関係なエピトープへの抗体結合の強度を表わす。たとえばビアコア、ELISAまたはFACSにより測定した目的エピトープそれぞれについてたとえば少なくとも50、ただし好ましくは約80の信号：ノイズ比を、評価した抗体が目的エピトープに特異的に結合すること、すなわち”特異的結合剤”であることの指標と解釈できる。”に結合する／と相互作用する”という用語は、ヒト標的分子またはその一部の2つの領域からなる立体配座エピトープ、構造エピトープまたは不連続エピトープに関するモノクローナル抗体であってもよい。本発明に関して立体配座エピトープは、一次配列中においては離れた2以上の別個のアミノ酸配列であって、そのポリペプチドが折り畳まれて天然タンパク質になった際に分子の表面で互いに接近する配列と定義される(Sela, (1969) Science 166, 1365、およびLaver, (1990) Cell 61, 553-6)。用語”不連続エピトープ”は、本発明に関して、ポリペプチド鎖の離れた部分からの残基により組み立てられる非直線エピトープを意味する。これらの残基は、そのポリペプチド鎖が折り畳まれて三次元構造になった際に分子の表面で互いに接近して立体配座／構造エピトープを構成する。

本発明によれば、Ig-誘導抗原-相互作用に関して用いる用語”可変領域”には、少なくとも、抗体、抗体フラグメントまたはその誘導体に由来する１つのCDRを含むポリペプチドのフラグメントおよび誘導体が含まれる。本発明によれば、その少なくとも１つのCDRは、好ましくはCDR3、より好ましくは抗体のＨ鎖のCDR3 (CDR-H3)であると想定される。しかし、具体的には他の抗体由来CDRも用語”可変領域”に含まれる。

用語”抗体フラグメントまたはその誘導体”は、一本鎖抗体もしくはそのフラグメント、合成抗体、抗体フラグメント、たとえばFab、F(ab2)'、FvもしくはscFvフラグメント、単一ドメイン抗体など、またはこれらのうちのいずれかの化学修飾誘導体に関する。本発明に従って使用するための抗体またはそれらに対応する免疫グロブリン鎖（１以上）を、それらのモチーフの外側において、当技術分野で既知の常法により、たとえば当技術分野で既知のアミノ酸欠失（１以上）、挿入（１以上）、置換（１以上）、付加（１以上）および／または組換え（１以上）、および／または他のいずれかの修飾（１以上）（たとえば翻訳後修飾および化学修飾、たとえばグリコシル化およびリン酸化）を単独でまたは組み合わせて用いてさらに修飾することができる。免疫グロブリンのアミノ酸配列の基礎となるDNA配列にそのような修飾を導入する方法は当業者に周知である；たとえばSambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 1989および第3版 2001を参照。

本明細書中で用いる用語”ペプチド”または”ポリペプチド”は、ペプチド群およびポリペプチド群を含めた一群の分子を表わす。ペプチド群は最高30個のアミノ酸を含む分子からなり、ポリペプチド群は30個より多いアミノ酸を含む分子からなる。用語”抗体フラグメントまたはその誘導体”は、具体的には少なくとも１つのCDR、好ましくはCDR-H3を含むペプチドまたはポリペプチド構築体に関する。列記した抗体のフラグメントまたは誘導体は、前記の抗体分子の一部であるペプチドもしくはポリペプチド、および／または化学／生化学もしくは分子生物学的方法により修飾されたペプチドもしくはポリペプチドを規定する。対応する方法は当技術分野で既知であり、特に実験手引きに記載されている(参照：Sambrook et al., 前掲; Gerhardt et al.; Methods for General and Molecular Bacteriology; ASM Press, 1994; Lefkovits; Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002)。

特定アミノ酸配列中のモチーフを同定する方法は当業者に既知であり、幾つかの実験手引きに記載されている(たとえばSambrook et al., 前掲; Mulhardt; Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics; Spektrum Akademischer Verlag, 2001)。さらに、それらの方法を後記の例中に例示する。

本明細書中で用いる用語”投与”は、療法有効量の前記の二重特異性一本鎖抗体を個体に投与することを意味する。”療法有効量”とは、その投与の目的である効果を生じる用量を意味するものとする。厳密な用量はその処置の目的に依存し、当業者が既知の方法で確認できるであろう。当技術分野で既知のとおり、かつ前記に述べたように、全身送達か局所送達、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、および／またはその状態の重症度に対する調整が必要な可能性があり、それらは当業者がルーティン試験により確認できるであろう。

担当医および臨床要因が投与計画を決定するであろう。医療技術分野で周知のとおり、各患者に対する用量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全般的健康状態、ならびに併用する他の薬物を含めた多数の要因に依存する。

医療技術分野で周知のとおり、各患者に対する用量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全般的健康状態、ならびに併用する他の薬物を含めた多数の要因に依存する。一般的な用量は、たとえば本発明の態様および後記の例に述べた範囲であってよい；ただし、特に前記の要因を考慮して、この例示範囲未満または例示範囲を超える用量も含まれる。

本明細書に記載するように、これまでの研究は療法用抗体の投与のために好ましくはボーラス注入を用いた。本明細書中で用いる用語”ボーラス（borus）注入”は6時間より早期に断続する注入を表わし、これに対し用語”連続（continuous）注入”は少なくとも6時間は断続することなく持続的に（permanently）遂行し続ける注入を表わす。”連続注入”は持続的に投与する注入を表わす。したがって、本発明に関して”持続的”と”連続”は同義語として用いられる。本発明の意味において、”少なくとも6時間かけて投与”という用語は、本発明による投薬手段および方法に使用する二重特異性一本鎖抗体を、本発明の投薬手段および方法に必要な全期間中、継続した一定の様式で、患者の身体に連続投与する状況を表わす。二重特異性一本鎖抗体の導入の断続を避ける。すなわち、投与している二重特異性一本鎖抗体の供給の補充または必要となる医療介入など以外の理由で、この抗体を患者の身体に投与している状態からこの抗体をもはや患者の身体に投与していない状態への移行が、本発明の投薬手段および方法に必要な全投与期間にわたって起きないか、または有意には起きない。そのような必要な補充により投与抗体の導入が一時的に断続される限りにおいては、そのような投与はやはり、本発明による投薬手段および方法の意味で”非断続的（uninterrupted）”または”持続的”であると解釈すべきである。大部分の場合、そのような補充は一般にきわめて短時間であるので、抗体が患者の身体に導入されていない期間は、本発明による投薬手段および方法に従った投与法全体について計画した時間と比較すれば無視できるほど小さいであろう。特に好ましいのは、二重特異性一本鎖抗体の投与を少なくとも１週間、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12週間、またはさらに長期間、非断続的または持続的に行うという計画である。大部分の好ましい態様において、二重特異性一本鎖抗体を24時間かけて4〜8週間、すなわち4、5、6、7または8週間、連続投与する。たとえば処置患者を4週間の連続投与後に病期判定した際に、二重特異性一本鎖抗体に対してわずかまたは部分的応答（後記に定義）と診断される場合がある。この場合、さらに良好な療法結果、たとえば完全応答を達成するために、連続投与を延長することができる。本発明による投薬手段および方法の様式で二重特異性一本鎖抗体を長期間断続せずに連続投与することにより、後記のように有利なＴ細胞活性化が可能になり、罹患細胞すべてを身体から有利に排除するのに十分なほど長期間その効果が発揮される。非断続投与する二重特異性一本鎖抗体の速度が低く維持されるので、患者に有害な副作用のリスクなしに療法薬の投与を長期間継続することができる。

二重特異性一本鎖抗体を体表面積m²当たり10〜80μgの１日量で投与することにより本発明の投薬手段および方法の有益な予想外の効果を得ることができるのが見いだされた。この１日量を投与期間にわたって一定に維持してもよい。しかし、本明細書に記載する投薬方法の前に、注入期間の最初の日（１以上）についてはより低い用量（”初回量”）の二重特異性一本鎖抗体を投与し、一方で残りの注入期間についてはより高い用量（”維持量”）を適用することもこの態様の範囲に含まれる。たとえば、体表面積m²当たり5μgの二重特異性一本鎖抗体を注入期間の１日目に投与し、続いて残りの期間については体表面積m²当たり15μgを１日量として投与してもよい。あるいは体表面積m²当たり15μgの二重特異性一本鎖抗体を注入期間の１日目に投与し、続いて残りの期間については体表面積m²当たり45μgを１日量として投与してもよい。体表面積m²当たり5μgの二重特異性一本鎖抗体を注入期間の１日目に投与し、続いて体表面積m²当たり15μgの二重特異性一本鎖抗体を注入期間の2日目に投与し、続いて残りの期間については体表面積m²当たり45μgを一日（維持）量として投与することも想定される。このように、患者の生体を処置に徐々に適応させるために、処置の１日目に、または１日目と2日目に、本明細書に記載する二重特異性一本鎖抗体構築体を患者の体表面積m²当たり10〜80μgより低い（一日）初回量で投与してもよい。その後、体表面積m²当たり10〜80μgという実際の維持量を投与することができる。その際、本発明による方法、キットまたは使用に関して患者の平均体表面積は1.7〜2.2 m²と計算される。本発明者らは、目標とする療法効果を長期間にわたって達成するのに必要な絶対最小量になるように二重特異性一本鎖抗体の非断続投与（すなわち連続注入）速度を維持することにより、きわめて有益であると前記に述べたＴ細胞活性化増大を最も良く実現できることを見いだした。低速での二重特異性一本鎖抗体の適用によって、以下に列挙する自然のＴ細胞活性化の模倣に伴う利点のほか、より低い絶対量の二重特異性一本鎖抗体を投与することが可能になる。その結果、各患者に対する経費が低くなり、本発明の投薬手段および方法による処置をその必要がある広範囲の患者に与えることができる。

本発明の意味において、用語”Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫”または”Ｂ細胞由来非ホジキンリンパ腫”は、遅進性（indolent）および攻撃性（aggressive）両方のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫（B NHL）を含む。本明細書中で用いる用語”遅進性または攻撃性Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫（B NHL）”は、悪性のＢ細胞由来腫瘍性疾患を表わす。遅進性B NHLは低悪性リンパ腫である。攻撃性B-NHLは高悪性リンパ腫である。Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫（B NHL）は、有利には濾胞性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯細胞性リンパ腫、外套膜細胞性リンパ腫（mantle cell lymphoma）(MCL)、びまん性大Ｂ細胞性リンパ腫(DLBCL)、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫(SLL/CLL)、および他のいずれかのＢ細胞由来サブタイプである。本明細書中で用いる用語”Ｂ細胞性白血病”は、有利にはいかなるＢ細胞性白血病であってもよい（たとえば慢性リンパ球性白血病または急性リンパ球性白血病）。より詳細な参照事項については、たとえばhttp://www.cancer.orgを参照。好ましくは、遅進性Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫を、後記の例中で証明するように、ヒトCD3およびヒトCD19の両方を指向する二重特異性一本鎖抗体で処置することができる。

本明細書中で用いる用語”予防”は下記のように理解すべきである：ヒト患者においてリンパ腫病変部（１以上）の化学療法または放射線療法後にリンパ腫病変部（１以上）が完全に寛解した後、必ずしもすべてのリンパ腫細胞を身体から排除できていない場合がある。ところが、これらの残存腫瘍細胞は再発性リンパ腫を発症させる可能性がある。本発明の投薬手段および方法を用いると、リンパ腫の再発（初期治療後に体内に残存する潜在リンパ腫細胞に由来する）を予防するためにこれらの残存腫瘍細胞を死滅させることができる。こうして、本発明の投薬手段および方法はB NHLまたはＢ細胞性白血病を伴う患者における疾患再発を予防するのに役立つ。

内部臨床試験において、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体の安全性プロフィールをさらに評価した。その結果、難治性Ｂ細胞性悪性疾患を伴う患者に等量の二重特異性一本鎖抗体を反復ボーラス注入した際に、望ましくない初回量作用が見いだされた。本明細書中で後記に示すように、CRS強度は初回量投与に際して最高であり、後続の抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体注入に対する応答は低下した。6回の注入後には、ベースラインと比較してサイトカインレベルの誘導はほとんどみられなかった。漸増量の二重特異性一本鎖抗体を再発性または難治性のＢ細胞性慢性リンパ性白血病を伴う患者に投与した場合にも、二重特異性一本鎖抗体の反復投与後にCRS強度の低下がみられた。理論により拘束されるわけではないが、前記の現象は反復刺激に対するＴ細胞適応（”Ｔ細胞不活動(T cell silencing)”）に起因する可能性が最も高い。さらに、治療した患者においてＴ細胞数をモニターすると、各注入に際して活発なＴ細胞数変動がみられた；これは、短期間の爆発的なＴ細胞活性化を示唆する。これらの試験で、Ｔ細胞活性化、サイトカイン放出、およびＢ細胞数減少をもたらす抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体の生物活性を証明することはできたが、最適な生物学的用量(OBD)を決定することはできなかった。さらに、CRS関連の有害な副作用がみられた。

これに対し本発明に関して予想外に、本明細書に記載する二重特異性一本鎖抗体によって、たとえば二重特異性一本鎖抗体を患者の体表面積m²当たり10〜80μgの１日量で少なくとも１週間投与し、かつこの１日量を少なくとも6時間かけて投与することにより、望ましい生物学的効果、すなわち腫瘍細胞に対する長期間のＴ細胞活性化および拡張および細胞傷害活性を達成できることが見いだされた（一方で、療法用抗体のボーラス適用に普通は伴う望ましくない副作用は、低下し、最小限に抑えられ、または完全に排除された）。後記の例（限定ではない）に記載するように、小リンパ球性リンパ腫(SLL/CLL)または濾胞性リンパ腫を伴う患者に24時間かけて少なくとも2週間にわたって連続投与した低い量の二重特異性一本鎖抗体、すなわち15 μg/m²の二重特異性一本鎖抗体が、インビボでの長期間のＴ細胞活性化および増殖に十分であり、実質的な抗腫瘍応答が得られる：これら2人の患者は部分応答(PR)、すなわち6つの基準リンパ腫の50%以上の縮小を示した。さらに、これらの患者のうち１人においては骨髄からの効果的なリンパ腫細胞枯渇が証明された；これは、化学療法などの一般的な方法では達成するのが困難である。重要な点は、このような低用量の二重特異性一本鎖抗体によって二重特異性一本鎖抗体のボーラス投与と比較してより大きな生理的Ｔ細胞応答が患者に生じた点である。さらに、本明細書に示す方法および使用は、Ｔ細胞活性化に通常は伴うCRSなどの有意の有害な副作用を生じない。これらの低用量でもなお、遅進性または攻撃性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫（B NHL）またはＢ細胞性白血病を伴う患者において有益な抗腫瘍応答を誘導することができる。

反復ボーラス注入を用いた従来の投与計画では、内部第Ｉ相臨床試験において最低開始量を投与した場合ですら、CD3+、CD4+およびCD8+Ｔ細胞を含めた末梢血リンパ球数の突然の減少がみられた（例を参照）。この減少に対する説明のひとつは、組織への活性Ｔ細胞および他の活性白血球の突然の付着および−少なくとも部分的には−移動である。二重特異性一本鎖抗体のボーラス投与によるこの爆発的なＴ細胞活性化が原因で起きる内皮機能不全および局所サイトカインプロフィール撹乱が、CRSにおいて通常みられる有害な副作用に関与すると考えられる。これに対し、後記の例において証明するように、本発明による投薬手段および方法はＴ細胞集団をより緩徐に活性化（および移行）することができ、これはサイトカイン放出量が劇的に抑えられることを示唆する。したがって、本発明による投薬手段および方法の提供により、局所サイトカインネットワークの突然の撹乱などの現象が避けられる。その結果、本発明の方法および使用に従って処置した患者から有意の有害な副作用は報告されていない。さらに、本発明による投薬手段および方法に従った二重特異性一本鎖抗体の投与は、たとえば二重特異性一本鎖抗体のボーラス注入に際してみられる劇的なＴ細胞変動を起こさない。

例に示すように、注入期間の開始時にわずかなＴ細胞数減少がみられる可能性があった（これは、共投与するステロイドによる可能性が最も高い）が、本発明による処置はむしろ血中の活性Ｔ細胞数を増加させる。詳細には、細胞傷害性CD8+Ｔ細胞数が増殖によって増加する。これは、好ましくないエフェクター細胞：標的細胞(E:T)比を示す腫瘍性疾患、たとえばインビボで1:100〜1:1000のE:T比に達するＢ細胞性リンパ腫性病変に特に関連がある。そのような好ましくないE:T比は、先のインビトロ試験により示唆されたように、Ｂ細胞死滅速度をはるかに低下させる可能性がある。そのような状況では、同じＴ細胞が繰り返しＢ細胞を死滅させて腫瘍塊を有意に縮小させる効力をもつことを考えなければならない。さらに、E:T比を改善するためには悪性Ｂ細胞性疾患（たとえばＢ細胞性リンパ腫）内に局在するＴ細胞プールの拡張が療法効果の達成に必要であろうと仮定できる。本発明による投薬手段および方法は、血流中に少なくとも一定の、またはさらに、漸増する活性Ｔ細胞数をもたらすので、腫瘍細胞（たとえばＢ細胞性リンパ腫における腫瘍性Ｂ細胞）に対する細胞傷害効力が長期間にわたって改善される。

さらに、本発明による投薬手段および方法は、CD69またはCD25（短期活性化マーカー）と比較して、Ｔ細胞活性化マーカーHLA-DR（長期活性化マーカー）により例示されるようにCD8+Ｔ細胞の長期活性化をもたらす。前記に指摘したように、活性CD8+Ｔ細胞数を長期間にわたって増加させるのに、たとえば後記の例および図６〜８に証明されるように低い量の抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体の連続投与で十分である。これは、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体をボーラス投与した際にみられた爆発的なＴ細胞活性化との明らかな相異である；たとえば図１を参照。このように、本発明の投薬手段および方法による二重特異性一本鎖抗体の持続的な存在によって徐々に長期間にわたってＴ細胞が活性化および増殖しうることは、好ましくないE:T比を特徴とする腫瘍性疾患、たとえばＢ細胞性リンパ腫の処置に特に適切である。さらに、連続注入の再開後（たとえば医療介入の後）、細胞傷害性CD8+Ｔ細胞のはるかに迅速かつ強力な活性化および拡張が起きることが見いだされた。したがって、注入しない期間を伴う数回の注入サイクルを実施するのが好ましい。たとえば、本明細書に定める二重特異性一本鎖抗体を患者に4週間連続注入した後、4週間の注入しない期間をおいてもよいことが本発明の範囲に含まれる。その後、このシーケンスを１、2、3回、またはさらに多数回、反復してもよい。

さらに、本発明の投薬手段および方法に従って処置した患者においては、長期間のＴ細胞活性化をみることができるけれども、関連する有害な副作用は有意に減少し、または排除すらされる。こうして、本発明の投薬手段および方法に従って二重特異性一本鎖抗体を適用することによりCRS関連の副作用を最小限に抑え、または予防することができる。

結論として、本明細書に記載する使用、方法およびキットには低い量の二重特異性一本鎖抗体を適用したにすぎないが、この抗体処置は腫瘍性Ｂ細胞を枯渇させるのにきわめて有効であり、これによりインビボで検出可能な抗腫瘍応答が起きることを強調すべきである。これは、図９および１１のＢ細胞数ならびに図１０および１３に示すリンパ腫サイズ縮小により例示される。特に、本発明による投薬手段および方法に従って治療した2人の患者は、部分応答、すなわち6つの基準リンパ腫病変部の50%以上の縮小を示した。さらに、これらの患者のうち１人においては骨髄からの効果的なリンパ腫細胞枯渇が証明された；図１２を参照。したがって、本発明の投薬手段および方法を適用すると有害な副作用は軽減または排除され、同時に細胞傷害活性が低下することはない。

これに対し抗体療法薬のボーラス投与様式では、著しい短期Ｔ細胞活性化が起き、続いて活性Ｔ細胞が内皮および組織へ再局在化／移行し、血流中には少数の有効Ｔ細胞が残るにすぎない。当技術分野で周知のように、著しいＴ細胞活性化に続いてＴ細胞が内皮細胞に付着し、組織へ移動することにより、内皮は著しく破壊される可能性がある。病的状態では、そのような突然のＴ細胞活性化は、たとえば細菌毒素により起きる著しい敗血症にみることができる(たとえば、Li (2004), Br. J. Pharmacol. 141(4): 709-16; Matzen (2004), Virus Res. 104(2): 145-55; Jacob HS. (1980) Arch. Pathol. Lab. Med. 104(12): 617-20; Salyer (1990), Am. J. Pathol. 136(4): 831-41; Okajima (2004) Curr. Vasc. Pharmacol. 2(2): 125-33; Ferrero (2004) Methods Mol. Med. 98: 127-36を参照)。さらに、この爆発的なＴ細胞活性化にはサントカインにより起きる有害な副作用が伴う。反復ボーラス注入を用いた従来の投与試験で、内部第Ｉ相臨床試験において最低開始量を投与した場合ですら、CD3+、CD4+およびCD8+Ｔ細胞を含めた末梢血リンパ球数の突然の減少が同様にみられた。この減少の説明のひとつは、組織への活性Ｔ細胞および他の活性白血球の突然の付着および−少なくとも部分的には−移動である。そのような多量の活性Ｔ細胞集団の急激な活性化および移行（約70%のヒトＴ細胞プールが常に末梢血中にある）により、Ｔ細胞恒常性および組織の局所サントカインプロフィールが撹乱されるという仮説が立てられる。

したがって、従来の第Ｉ相臨床試験と比較して、有意に長期間、二重特異性一本鎖抗体に被曝し、単位時間当たりの投与量が有意に減少することにより、耐容性を増大させ、薬物の抗腫瘍活性を最大にすることができる。

二重特異性一本鎖抗CD19×抗CD3抗体の反復ボーラス注入の安全性および耐容性を調べる従来の臨床試験では、各注入の後に望ましくないＴ細胞数変動がみられた；これは、各注入に応じた爆発的なＴ細胞活性化を示唆する。注目すべきことに、この作用は処方した二重特異性一本鎖抗体の等量投与および漸増投与の両方にみられた。

本発明による投薬手段および方法の提供により、より多量の抗体をボーラス注入した後に得られたものと比較して、質的に異なるＴ細胞活性化パターンが生じる。具体的には、本発明の投薬手段および方法に従った二重特異性一本鎖抗体の投与により、初期の緩徐な増加が生じ、続いて自然感染、たとえばウイルス感染の経過中にみられるものに類似する、一定の、またはさらに、漸増する細胞性免疫応答がインビボで維持されることが見いだされた。自然感染の場合、病原性抗原に特異的な循環Ｔ細胞が排出リンパ腫組織においてこの抗原に遭遇すると活性化された状態になる。自然感染におけるこのような活性化に続いて、病原性抗原に特異的なＴ細胞サブセットの増殖が起きる。CD8⁺Ｔ細胞が増殖するため、この増加は侵入病原性に対する、またはこの病原体に感染した細胞に対する、細胞傷害効力と相関する。したがって、本発明の投薬手段および方法は、活性Ｔ細胞数の緩徐な漸増が起きるという点で、自然感染、たとえばウイルス感染に対する免疫応答に類似する。

まとめると、本発明は下記の主な利点を提供する：
−より生理的なＴ細胞応答が刺激され、劇的なＴ細胞変動がなく、血流中のエフェクター（細胞傷害性）Ｔ細胞数が一定であり、または増加する場合すらある
−低い量の二重特異性一本鎖抗体であるためサントカイン放出が減少し／初回量作用がなく、効果的な抗腫瘍（CTL）活性を伴う（2人の患者が部分応答、これらの患者のうち１人においては骨髄からの効果的なリンパ腫細胞枯渇）
−有害な副作用が軽減
−反復するＴ細胞活性化および不活性化サイクルにより起きる異常なＴ細胞活性化が最小限に抑えられる
−細胞傷害性Ｔ細胞が長期間活性化および拡張する
−薬物が長期間存在することは、リンパ腫病変部にしばしばみられる好ましくないE:T比のためＢ細胞死滅が当初予想したより遅くなるのを克服するのに役立つ
−薬物が長期間存在することにより、１個の同一Ｔ細胞により行われるＢ細胞死滅が反復して起き、したがって著しい腫瘍塊が確実に縮小する
−局在Ｔ細胞プールの拡張により、E:T比および療法効果が改善される
−異なる末梢血単球（PBMC）ドナー間でインビトロ活性が顕著に変動する（EC₅₀値の変動に反映される）。薬物に対する被曝時間を延長することにより、有意割合の患者において抗CD19指向性細胞毒性が改善される。

したがって、従来の第Ｉ相臨床試験と比較して、有意に長期間、薬物に被曝し、単位時間当たりの投与量が有意に減少することによって、耐容性が増大し、薬物の抗腫瘍活性が最大になり、その結果、安全性プロフィールがより良好になる可能性がある。

本発明の計画による投与は、１日当たり6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、さらに24時間にわたってもよい。好ましくは、本発明の計画による投与は、10時間、より好ましくは12時間、さらに好ましくは24時間にわたる。

本発明の方法、使用またはキットの好ましい態様においては、二重特異性一本鎖抗体構築体の１日量を少なくとも8時間、より好ましくは少なくとも10時間かけて投与する。

本発明の方法、使用またはキットのさらに好ましい態様においては、１日量を少なくとも12時間、14時間、16時間、18時間、20時間または22時間かけて投与する。最も好ましくは、１日量を終日、すなわち24時間かけて投与する。

本発明の方法、使用またはキットの他の好ましい態様において、CD3特異的ドメインのV_HおよびV_L領域は下記よりなる群から選択されるCD3特異的抗体に由来する：OKT-3、X35-3、VIT3、BMA030 (BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT31、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2およびF101.01。これらの各抗体は当技術分野で記載されている。

より具体的には、CD3特異的ドメインのV_H領域はSEQ ID NO. 11に示すアミノ酸配列を含むかまたはそのアミノ酸配列である少なくとも１つのCDR3領域を含み、CD3特異的ドメインのV_H領域はSEQ ID NO. 10に示すアミノ酸配列を含むかまたはそのアミノ酸配列である少なくとも１つのCDR2領域を含み、および／またはCD3特異的ドメインのV_H領域はSEQ ID NO. 9に示すアミノ酸配列を含むかまたはそのアミノ酸配列である少なくとも１つのCDR1領域を含む。

本発明の構築体はV_L領域をも含むことができる。CD3特異的ドメインのV_L領域はSEQ ID NO. 14に示すアミノ酸配列を含むかまたはそのアミノ酸配列である少なくとも１つのCDR3領域を含み、CD3特異的ドメインのV_L領域はSEQ ID NO. 13に示すアミノ酸配列を含むかまたはそのアミノ酸配列である少なくとも１つのCDR2領域を含み、および／またはCD3特異的ドメインのV_L領域はSEQ ID NO. 12に示すアミノ酸配列を含むかまたはそのアミノ酸配列である少なくとも１つのCDR1領域を含むことができる。

大部分の好ましい態様において、前記に定めたCDR (CDR1、CDR2、CDR3)は本発明に従って投与される単一の二重特異性構築体に含まれると理解される。

本発明による方法、使用またはキットの他の好ましい態様において、CD3特異的ドメインのV_H領域はSEQ ID NO 17を含むかまたはそれであり、CD19特異的ドメインのV_H領域はSEQ ID NO 15を含むかまたはそれであり、CD3特異的ドメインのV_L領域はSEQ ID NO 18を含むかまたはそれであり、CD19特異的ドメインのV_L領域はSEQ ID NO 16を含むかまたはそれである。

本発明の方法、使用またはキットが下記よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む二重特異性一本鎖抗体構築体を利用することも想定される：
(a) SEQ ID NO 2、4、6または8に示すアミノ酸配列；
(b) SEQ ID NO 1、3、5または7に示す核酸によりコードされるアミノ酸配列；
(c) (b)の核酸配列に対して少なくとも70%、80%、90%、95%または99%の同一性を有する核酸配列によりコードされるアミノ酸配列であって、CD3およびCD19に（特異的に）結合できるアミノ酸配列；および
(d) (b)の核酸配列に対し遺伝子コードの結果として縮重である核酸配列によりコードされるアミノ酸配列であって、CD3およびCD19に特異的に結合できるアミノ酸配列。

いずれか特定の核酸分子またはポリペプチドが本明細書に定める核酸配列またはアミノ酸配列に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるかは、一般に、既知のコンピュータープログラムを用いて判定できる。照会配列（本明細書に定める配列）と対象配列間の最良の全般的一致（包括的配列アラインメントとも呼ばれる）を判定するのに好ましい方法は、Brutlagらのアルゴリズムに関するFASTDBコンピュータープログラムを用いて決定できる(Comp. App. Biosci. 6:237-245(1990))。配列アラインメントに際して照会配列および対象配列は両方ともDNA配列である。RNA配列は、U'をT'に変換することにより比較できる。

本発明の方法、使用またはキットのさらに好ましい態様においては、前記の可変ドメインを前記の、かつたとえばWO 2004/106381に示される、追加リンカーおよび／またはスペーサー配列により連結する。

本発明の方法、使用またはキットの好ましい態様においては、毎日の投与を少なくとも3週間、少なくとも4週間または少なくとも8週間続ける。したがって、投与を持続的に１日当たり少なくとも6時間、好ましくは１日当たり少なくとも8時間、より好ましくは１日当たり少なくとも10時間、最も好ましくは１日当たり少なくとも24時間、少なくとも1、2、3、4、5、6、7もしくは8週間、またはさらに長期間、実施することも想定される。注入しない期間を伴う数回の注入サイクルを実施できることも想定される。たとえば、本明細書に定める二重特異性一本鎖抗体を患者に4週間連続注入した後、4週間の注入しない期間をおくことができる。その後、リンパ腫病変部が通常の手段、たとえばコンピューター断層撮影法による検出可能レベルを下回るまで、このシーケンスを１、2、3回、またはさらに多数回、反復してもよい。有利には、完全応答が達成されるまで、すなわちすべてまたは本質的にすべてのリンパ腫細胞が死滅するまで、投与を延長する。さらに、連続注入の再開（たとえば、注入しない期間の後、または医療介入の後）の後、細胞傷害性CD8+Ｔ細胞のはるかに迅速かつ強力な活性化および拡張が起きることが見いだされた。したがって、注入しない期間を伴う数回の注入サイクルを実施するのが好ましい。

本発明による方法、使用またはキットの他の好ましい態様においては、本発明の医薬組成物を１種類以上の他の医薬と組み合わせて投与する。

本発明は、併用療法によるアプローチおよび併用療法による投薬計画にも有用である。特定の態様においては、本明細書中に定める二重特異性一本鎖抗体を１種類以上の他の療法薬と組み合わせて投与するものとする。特定の態様においては、本明細書中に定める二重特異性一本鎖抗体を１種類以上の他の療法薬と共に患者に投与するものとする。好ましくは、それらの療法は本明細書に定めるB NHLまたはＢ細胞性白血病の処置に有用である。用語”共に（concurrently）”は医薬または療法薬を厳密に同時に投与することに限定されず、むしろ本明細書中に定める二重特異性一本鎖抗体と他の薬剤を、本明細書中に定める二重特異性一本鎖抗体が他の薬剤と一緒に作用してそれらを別の様式で投与した場合より増大した有益性を提供する順序でその時間間隔内に、対象に投与することを意味する。たとえばそれぞれの医薬または療法薬を同時に、または異なる時点において任意の順序で逐次投与することができる；ただし、同時に投与しない場合、目的とする療法効果または薬剤効果を得るのに十分なほど接近した時点でそれらを投与すべきである。

各（併用）療法薬を個別に、いずれか適切な剤形でいずれか適切な経路により投与することができる。他の態様においては、本明細書中に定める二重特異性一本鎖抗体を外科処置前、外科処置と同時、または外科処置後に投与するものとする。好ましくは、外科処置により局在化リンパ腫を完全に摘除し、または大腫瘍のサイズを縮小させる。外科処置は予防措置として、または痛みを軽減するために実施することもできる。

本明細書中に示す投与量および投与頻度は療法効果という用語に含まれる。さらに、投与量および頻度は一般に、各患者に特異的な要因に従い、投与される具体的な療法薬または医薬、B NHLまたはＢ細胞性白血病の重症度およびタイプ、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答、および過去の病歴に応じて変動するであろう。適切な投薬計画は当業者がたとえば文献中に報告された投与量およびPhysicians' Desk Reference (第59版, 2005)中に推奨される投与量などの要因を考慮して、それに従って選択できる。

ある態様においては、本明細書中に定める二重特異性一本鎖抗体の投与による療法を、１種類以上の療法、たとえば化学療法、放射線療法、ホルモン療法および／または生物学的療法／免疫療法の適用と組み合わせることができる。医薬または療法薬には下記のものが含まれるが、これらに限定されない；タンパク質系分子：ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（翻訳後修飾タンパク質を含む）、抗体などを含むが、これらに限定されない；あるいは低分子（1000ダルトン未満）、無機または有機化合物；あるいは核酸分子：二本鎖もしくは一本鎖DNA、または二本鎖もしくは一本鎖RNA、三重らせん核酸分子などを含むが、これらに限定されない。医薬または療法薬はいずれか既知の生物（動物、植物、細菌、真菌および／または原生生物、またはウイルスを含むが、これらに限定されない）または合成分子ライブラリーに由来するものであってよい。

前記の併用療法は、二重特異性一本鎖抗体を非断続投与する前、途中および／または後に、１種類以上の療法薬または医薬を共投与することを含む。二重特異性抗体と共投与されるそれらの療法薬または医薬は、好ましくは標準的な非ホジキンリンパ腫（NHL）療法に用いられる化学療法薬、たとえば白金製剤、アントラサイクリン類、アルキル化剤、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害薬、抗生物質、細胞分裂阻害薬、抗チューブリン薬などである。しかし、この併用療法は炎症を軽減するためのものであってもよい。この場合、抗炎症薬、たとえばグルココルチコステロイドを、前記に述べたいずれかの様式で共投与することが特に好ましい。後記の例に記載するように、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体を連続投与する前に、連続投与の初期におけるサイトカイン産生を抑制するために100 mgのステロイドを患者に投与しておく。あるいは、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体の連続投与の初期に１日目から4日目までステロイドを投与してもよい。たとえば連続注入の１時間前に投与するステロイドの用量は、１日目に500 mg、2日目（24時間の連続注入の後）に250 mg、3日目（48時間の連続注入の後）に125 mg、4日目（72時間の連続注入の後）に125 mgであってもよい。ただし、二重特異性一本鎖抗体を連続投与する前、途中および／または後に、ステロイドを投与しないことも想定される。もちろん、化学療法薬および抗炎症薬／剤を組み合わせて投与してもよい。二重特異性一本鎖抗体を非断続投与する途中に共投与を行う場合、その共投与を本発明抗体の投与の全期間について、またはその１以上の部分のみについて行ってもよい。たとえば、その共投与を二重特異性一本鎖抗体の投与前に開始し、二重特異性一本鎖抗体の非断続投与を開始した後に終了することが本発明のこの態様の範囲に含まれる。そのような場合、二重特異性一本鎖抗体の連続投与の残りの期間を通してそれ以上の共投与を行わないことが有利な可能性があり、あるいはその後の時点で二重特異性一本鎖抗体を非断続投与する途中および／または後に医薬の共投与を再開することが有利な可能性がある。二重特異性一本鎖抗体を非断続投与する前および／または後にのみ共投与を行い、非断続投与の途中には行わないように併用療法の投薬計画を立てるのが有利な場合もある。したがって、本発明のこの態様の意味に含まれる”併用療法の投薬計画（a regimen of co-therapy）”は、時間的な（chronological）意味で二重特異性一本鎖抗体を非断続投与することを含むと理解すべきである。二重特異性一本鎖抗体を非断続投与する前および／または後に、医薬を併用療法の一部として共投与することが可能であるので、これは併用療法の投薬計画が場合によっては二重特異性一本鎖抗体の非断続投与より長期間実施される可能性があることを意味する。逆に、併用療法の投薬計画の共投与は二重特異性一本鎖抗体の非断続投与期間の一部としてのみ行うことができるので、併用療法の投薬計画が二重特異性一本鎖抗体の非断続投与より短期間実施される可能性がある。好ましくは、例に示すかまたは前記に指示した計画に従って、そこに示す用量で前記ステロイドを投与する。

共投与を本発明による二重特異性一本鎖抗体の非断続投与の全期間にわたる連続注入として行う場合、両薬剤−併用療法に用いるもの（１以上）と二重特異性一本鎖抗体−を１つの溶液中で組み合わせることができる。二重特異性一本鎖抗体を患者に適用する溶液／配合物に、併用療法に用いる薬剤を直接添加することができる。さらに、併用療法に用いる薬剤と二重特異性一本鎖抗体を別個の溶液として、同一期間にわたって併行して適用することもできる。

併用療法は、本発明の投薬手段および方法に従う処置を受ける患者に既に存在する、推測される、または予想される他の条件に応じて、場合によっては有利または必要であろう。そのような共投与は、本発明の投薬手段および方法に従った非断続投与の前、途中および／または後に、１回以上のボーラス投与として行うことができる。あるいは、そのような共投与も同様に非断続的なものであってもよく、この場合、本発明による方法、キットまたは使用に述べた二重特異性一本鎖抗体の非断続投与と同時に、かつ同一投与ビヒクル中においてすら、行うことができる。

本明細書に定める二重特異性一本鎖抗体と他の療法薬（１以上）が相乗的に作用してもよい。本明細書中で用いる用語”相乗的”は、いずれか2以上の単一療法（たとえば１種類以上の医薬または療法薬）の相加効果より有効な組合わせの療法（たとえば、本明細書に定める二重特異性一本鎖抗体と本明細書中に述べる他の療法薬（１以上）の組み合わせ）を表わす。組合わせ療法（たとえば、本明細書に定める二重特異性一本鎖抗体と本明細書中に述べる他の療法薬（１以上）の組合わせ）の相乗効果によって、たとえば本明細書に定めるB NHLまたはＢ細胞性白血病などの疾患の患者に、より低い用量で１種類以上の療法（たとえば１種類以上の医薬または療法薬）を使用すること、および／またはより低い頻度でその療法を適用することが可能になる。より低い用量で療法（たとえば医薬または療法薬）を使用でき、および／またはより低い頻度でその療法を適用できることによって、たとえば本明細書に定めるB NHLまたはＢ細胞性白血病などの疾患の予防または治療におけるそれらの療法の有効性を低下させることなく、それらの療法を対象に適用することに伴う毒性が低下する。さらに、相乗効果により、本明細書に定めるB NHLまたはＢ細胞性白血病の予防、管理、治療および／または軽減における療法（たとえば医薬または療法薬）の有効性を改善することができる。さらに、組合わせ療法（たとえば医薬または療法薬）の相乗効果により、いずれかの単一療法の使用に伴う有害または望ましくない副作用を回避または軽減できる。

他の態様において、併用療法は炎症を軽減するためのものであってもよい。この場合、前記に述べたいずれかの様式で抗炎症薬、たとえばグルココルチコステロイドを共投与することが特に好ましい。

本発明のこの態様の併用療法投薬計画も、免疫エフェクター細胞、細胞増殖または細胞刺激に、活性化シグナルを有利に供給することができる。

二重特異性一本鎖抗体の非断続投与は、静脈内、非経口、皮下、経皮、腹腔内、筋肉内または肺への投与であってもよい。静脈内投与方式は、二重特異性一本鎖抗体を非断続投与するために、また場合により併用療法の投薬計画の一部として医薬を共投与するために、大部分の場合に選択される方式であろう。したがって、静脈内投与が特に好ましい。この場合、適切な計量器具、たとえばBaxterが製造している多剤療法用注入ポンプモデル6060を選択するのが有利である。いかなる計量器具を選択するとしても、カートリッジ交換および／または電池の入替えもしくは充電に際して療法薬の投与の断続を最小限に抑える（または排除するのがより良い）設計および構造のものでなければならない。これはたとえば、交換すべきカートリッジとは別に二重特異性一本鎖抗体溶液の第２の溜めを備え、したがって空またはほとんど空のカートリッジを取り外して新たなカートリッジと交換する間ですらこの第２の溜めから患者への連続注入を継続できる器具を選択することにより達成できる。

静脈内投与、場合により併用療法の投薬計画の一部としての共投与の方式は、そのような投与の計量のためにポンプを患者の体内に埋め込むことを伴う。そのような計量ポンプ、たとえば前記のBaxterが製造しているモデル6060は、当業者に知られているであろう。

例（限定ではない）として、非断続、すなわち連続投与は、患者が装着した、または患者に埋め込んだ、患者の体内への療法薬の流入を計量するための小型ポンプシステムにより実現することができる。そのようなポンプシステムは当技術分野で一般に知られており、普通は注入すべき療法薬を収容したカートリッジの定期的な交換に依存する。そのようなポンプシステムにおいてカートリッジを交換する際、それ以外では非断続的である患者の体内への療法薬の流れが結果的に一時断続する可能性がある。そのような場合、カートリッジ交換前の投与時期とカートリッジ交換後の投与時期は、本発明の投薬手段および方法の意味の範囲内ではやはり、合わせて１つのそれらの療法薬の”非断続投与”を構成するとみなされる。１回より多くカートリッジを交換する必要があり、またはポンプを駆動する電池を入れ替える必要があり、これにより患者の体内への療法薬溶液の流入の一時的オフセットが生じるようなきわめて長期間の投与にも、同じことが当てはまる。

患者の体内に投与する穿刺部位における感染の危険性を最小限に抑えるためにも、適切な措置をとるべきである。このような長期間の創傷は特にそのような感染を受けやすいからである。これは、同様な送達システムによる筋肉内投与にも当てはまる。

連続投与は、皮膚に装着して時折り交換するパッチによる経皮投与であってもよい。この目的に適切な薬物送達のためのパッチシステムは当業者に知られている。経皮投与は特に非断続投与に適用しやすいことを留意すべきである。たとえば使用ずみの第１パッチのすぐ隣の皮膚の表面に、使用ずみの第１パッチを除去する直前に新たな第２パッチを配置すると同時に、使用ずみの第１パッチの交換を行うことができるからである。流入断続または電池機能不良の問題は起きない。

他の好ましい態様において、連続投与は肺経路で、たとえば一方または両方の鼻孔に装着したチューブにより達成される；チューブは加圧タンクに接続され、その内容物は正確に計量される。

しかし、本明細書および後記の例に示すように、最も好ましい投与方式は一定の時間／期間にわたる静脈内投与である。

本明細書中で用いる二重特異性一本鎖抗体は、有利にはヒト患者に投与するための医薬組成物の形である。本明細書中で用いる二重特異性一本鎖抗体は単独で投与してもよいが、好ましくは医薬的に許容できるキャリヤー中において投与される。医薬的に許容できる適切なキャリヤーの例は当技術分野で周知であり、リン酸緩衝化生理食塩水、水、リポソーム、種々のタイプの湿潤剤、無菌溶液などを含む。そのようなキャリヤーを含む組成物は、周知の常法により配合できる。これらの医薬組成物を適切な用量で対象に投与できる。投薬計画は担当医および臨床要因により決定されるであろう。医療技術分野で周知のように、各患者についての投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全般的健康状態、ならびに共に投与される他の薬物を含めた、多数の要因に依存する。非経口投与のための製剤には、無菌の水性または非水性液剤または懸濁液剤が含まれる。非水性溶剤の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射用有機エステル、たとえばオレイン酸エチルである。水性キャリヤーには、水、水溶液、または懸濁液が含まれ、これには塩類溶液および緩衝化媒質が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、または乳酸加リンガー液が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養の補充液、電解質補充液（たとえばリンガーのデキストロース）などが含まれる。保存剤および他の添加剤、たとえば抗菌薬、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどが存在してもよい。さらに、本発明組成物はタンパク質系のキャリヤーなど、たとえば血清アルブミンまたは免疫グロブリン、好ましくはヒト由来のものを含むことができる。本発明組成物は、その医薬組成物の意図する用途に応じて、タンパク質系の二重特異性一本鎖抗体のほかに、さらに生物活性有効薬剤を含有しうることが想定される。そのような薬剤は、当技術分野で既知の細胞増殖抑制薬、高尿酸血症を予防する薬剤、免疫反応を阻害する薬剤（たとえばコルチコステロイド、FK506）、循環系に作用する薬物、および／またはＴ細胞共刺激分子またはサイトカインであってもよい。

好ましくは、本明細書に定める二重特異性一本鎖抗体を、緩衝液、安定剤および界面活性剤中に配合する。緩衝液はリン酸、クエン酸、コハク酸または酢酸緩衝液であってもよい。安定剤はアミノ酸（１以上）および／または糖類であってもよい。界面活性剤は洗浄剤、PEGなどであってもよい。より好ましくは、本明細書に定める二重特異性一本鎖抗体をクエン酸緩衝液、リシン、トレハロースおよびトゥイーン（Tween）80中に配合する。本発明の医薬組成物の希釈剤としては、等張塩類溶液およびトゥイーン80が好ましい。

好ましくは、本発明の使用、方法およびキットにおいて、医薬組成物はヒト患者に投与するためのものである。

二重特異性一本鎖抗体療法の成果は、各疾患の実体について確立された標準法によりモニターすることができる：Ｂ細胞性白血病療法については、たとえば白血球の計数、識別、蛍光活性化セルソーティング（FACS）、骨髄吸引、および種々の白血病特異的な臨床化学パラメーター、ならびに他の確立された標準法を使用できる。Ｂ細胞性リンパ腫療法については、たとえばコンピューター支援動断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴動断層撮影（たとえば国立がん研究所(National Cancer Institute)基準に基づく応答評価に関して(Cheson (1999), J. Clin. Oncol.; 17(4):1244）、ポジトロンエミッション断層撮影スキャン、白血球の計数、識別、蛍光活性化セルソーティング、骨髄吸引、リンパ節生検／組織学的検査、および種々のリンパ腫特異的な臨床化学パラメーター（たとえば乳酸デヒドロゲナーゼ）、ならびに他の確立された標準法を使用できる。

細胞毒性は、当技術分野で既知の方法ならびに本明細書において以下および後記の例に示す方法により検出できる。

以下の例を参照して本発明を記載する。これらは説明のためのものにすぎず、本発明の範囲の限定と解釈すべきではない。

例１：
１．種々のドメイン再配置を含むCD19xCD3およびCD3xCD19二重特異性一本鎖抗体の構築
一般に、それぞれヒトCD3抗原に対する結合特異性をもつドメインおよびヒトCD19抗原に対する結合特異性をもつドメインを含む二重特異性一本鎖抗体分子を、下記の表１に示すように設計した。

HD37ハイブリドーマ(Pezzutto, J. Immunol. 138 (1997), 2793-9)由来の可変Ｌ鎖(VL)および可変Ｈ鎖(VH)ドメインを標準PCR法に従ってクローニングした(Orlandi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 3833-7)。オリゴdTプライマーおよびTaqポリメラーゼを用いてcDNA合成を実施した。PCRによる抗CD19 Vドメインの増幅についてはVLドメインをフランキングするプライマー5'L1 (SEQ ID NO: 19)および3'K (SEQ ID NO: 20)、ならびにＨ鎖については5'H1 (SEQ ID NO: 21)および3'G (SEQ ID NO: 22)を、Duebel, J. Immunol. Methods 175 (1994), 89-95に記載のプライマーに基づいて使用した。抗CD3 scFvフラグメントのcDNAは、Trauneckerにより好意的に提供された(Traunecker, EMBO J. 10 (1991) 3655-9)。

表１に示した構築体１を下記に従って作製した。抗CD19 scFvフラグメントを得るために、別個のプラスミドベクター内へクローニングした対応するVL領域およびVH領域を、それぞれオリゴヌクレオチドプライマー対5'VLB5RRV (SEQ ID NO: 23) / 3'VLGS15 (SEQ ID NO: 24)および5'VHGS15 (SEQ ID NO: 25) / 3'VHBspE1 (SEQ ID NO: 26)を使用するVL特異的およびVH特異的PCRの鋳型として用いた。オーバーラップ相補配列をPCR生成物に導入すると、これらは後続の融合PCRに際して結合して15アミノ酸(Gly₄Ser₁)₃-リンカーのコード配列を形成した。この増幅工程はプライマー対5'VLB5RRV (SEQ ID NO: 23) / 3'VHBspE1 (SEQ ID NO: 26)を用いて実施され、得られた融合生成物(または正確には抗CD19 scFvフラグメント)を制限酵素EcoRVおよびBspE1で開裂させて、抗17-1A/抗CD3二重特異性一本鎖抗体(実際にはFlagタグを含まない形のもの) (Kufer, Cancer Immunol. Immunother. 45 (1997) 193)の(EcoR1/Sal1-クローン化)コード配列を含むbluescript KS-ベクター(Statagene)内へクローニングした。これにより、抗17-1A特異性は抗CD19-scFVフラグメントで置換され、C末端-抗-CD3 scFvフラグメントを連結する5アミノ酸Gly₄Ser-リンカーは保存された。次いで、VL_CD19-VH_CD19-VH_CD3-VL_CD3ドメイン配置をもつ抗CD19/抗CD3二重特異性一本鎖抗体をコードするこのDNAフラグメントを、文献記載の発現ベクターpEF-DHFR (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7021-5)のEcoR1/Sal1部位へサブクローニングした。得られたプラスミドDNAをDHFR欠損CHO細胞内へエレクトロポレーションによりトランスフェクションした。選択、遺伝子増幅およびタンパク質産生を先の記載に従って実施した(Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7021-5)。前記の表１に示した構築体１に対応するDNA配列は、SEQ ID NO: 1に示すものである。このDNA配列（リーダー配列を含む）のタンパク質翻訳体は、SEQ ID NO: 2に示すものである。

前記の表１に示した残りの構築体を下記に従って作製した。SEQ ID NO: 1 (構築体1)に対応するDNA配列（それのタンパク質翻訳体はSEQ ID NO: 2により表わされる）を、前記の表１に示した種々の抗CD3/抗CD19二重特異性一本鎖抗体の設計に際してPCR鋳型として用いた。

位置A1およびA2におけるVH-VL配置のCD19 (WO2004/106381の図1Aおよび1Bに定められたもの)を作製するために、各プライマー組合わせ5'VHCD19BsrGI (SEQ ID NO: 36)と3'VHCD19GS15 (SEQ ID NO: 37)または5'VLCD19GS15 (SEQ ID NO: 38)と3'VLCD19BspEI (SEQ ID NO: 39)を用いた。これらのPCRサイクルに際してオーバーラップ相補配列がPCR生成物中に導入され、後続の融合PCRに際して15アミノ酸リンカーのコード配列を形成した。増幅したVLおよびVHドメインを、第２PCR反応(融合PCR)において融合させた；この反応には、アウタープライマーのみ、すなわち5'VHCD19BsrGI (SEQ ID NO: 36)と3'VLCD19BspEI (SEQ ID NO: 39)、および両アンプリコンが必要であった。

他の組合わせのプライマーを用いる同様な方法を利用して、他のドメイン配置を構築した。PCRベースの多重クローニング工程を実施するために適切なプライマー組を設計して、最終的に多様なVL-VHドメイン配置を得た。使用したプライマー組合わせを次表に挙げる。

C末端位置のVL-VHドメイン配置、すなわちWO2004/106381の図1Aおよび1Bに定められた位置B1およびB2を変化させるために、表記した制限酵素認識部位を含む下記のプライマーを設計して、PCRベースのクローニング工程を実施した。

2つのBspEI部位でフランキングされた対応するPCR生成物を、BS-CTIと表示されるプラスミド中へクローニングし、これをBspEIおよびXmaI制限酵素で消化した。Bluescript KSベクター(GenBank寄託番号X52327)中へ、CTIと表示されるポリリンカー(SEQ ID NO: 45)を、追加の開裂部位を供給するための制限酵素開裂部位XbaIおよびSalIを用いて予め挿入し、同様に、G₄Sリンカーをコードする配列、6個の連続ヒスチジン残基および終止コドンをも挿入した。このクローニング工程中に、VHドメインのBspEI部位にプラスミドのXmaI部位が融合し、これにより両部位が破壊された。可変ドメインの配向が適正であることを標準プロトコルに従った配列決定により立証した。

前記の分子生物学的方法はすべて、Sambrook, Molecular Cloning (A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(2001)に記載される標準プロトコルに従って実施された。

表１の二重特異性一本鎖抗体をコードするDNA (SEQ ID NO: 1、3、5、7)を、DHFR欠損CHO細胞中での真核細胞タンパク質発現のために、Mack et al. (Mack, Proc Natl Acad Sci USA 92 (1995), 7021-25)の記載に従ってDHFR欠損CHO細胞中へトランスフェクションした。メトトレキセート（methotrexate）(MTX)濃度を20 nM MTXの最終濃度に高めることにより、構築体の遺伝子増幅を誘導した。次いでトランスフェクションした細胞を増殖させ、１リットルの上清を調製した。

２．CD3およびCD19に対する二重特異性一本鎖抗体の発現および精製
前記の二重特異性一本鎖抗体をチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)において発現させた。細胞のリン酸カルシウム処理により発現ベクターのトランスフェクションを実施した(”Molecular Cloning”, Sambrook et. al. 1989)。CHO改変DMEM培地(HiQ(登録商標), HiClone)を入れたローラーボトル内で7日間細胞を増殖させた後、回収した。細胞を遠心により分離し、発現タンパク質を含有する上清を-20℃に保存した。

Aekta(登録商標) FPLCシステム(Pharmacia)およびUnicorn(登録商標)ソフトウェアをクロマトグラフィーに用いた。すべての化学薬品が研究用であり、Sigma (ダイセンホーフェン)またはMerck (ダルムシュタット)から購入された。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(”IMAC”)をFractogel(登録商標)カラム(Merck)により実施し、製造業者が提供するプロトコルに従ってこれにZnCl₂を装填した。カラムを緩衝液A2 (20 mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.5, 0.4 M NaCl)で平衡化し、細胞培養上清(500 ml)をカラム(10 ml)に3 ml/分の流速で付与した。カラムを緩衝液A2で洗浄して、結合していない試料を除去した。結合したタンパク質を下記に従って2段階勾配の緩衝液B2 (20 mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.5, 0.4 M NaCl, 0.5 Mイミダゾール)により溶離した：
工程1: 6カラム容量中に20%の緩衝液B2；
工程2: 6カラム容量中に100%の緩衝液B2；
工程2から溶離したタンパク質画分をさらに精製するためにプールした。

PBS (Gibco)で平衡化したSephadex S200 HiPrepカラム(Pharmacia)上でゲル濾過クロマトグラフィーを実施した。溶離したタンパク質試料(流速1 ml/分)につき、検出のために標準的なSDS-PAGEおよびウェスタンブロット法を行った。精製の前に、カラムを分子量測定のために検量した(分子量マーカーキット, Sigma MW GF-200)。タンパク質アッセイ色素(MicroBCA, Pierce)および標準タンパク質としてのIgG (Biorad)を用いてタンパク質濃度を測定した。

二重特異性一本鎖抗体をIMACおよびゲル濾過の2工程精製法で単離した。主生成物は自然条件下でPBS中のゲル濾過により測定して約52 kDaの分子量をもっていた。この分子量は前記の二重特異性一本鎖抗体に相当する。すべての構築体をこの方法に従って精製した。

精製した二重特異性一本鎖抗体を、SDS PAGEでプレキャスト4〜12%ビストリス（Bis Tris）ゲル(Invitrogen)を用いて還元条件下に分析した。試料の調製および付与は、製造業者が提供するプロトコルに従って実施された。MultiMarkタンパク質標準品(Invitrogen)を用いて分子量を測定した。ゲルをコロイド状クーマシーで染色した(Invitrogenプロトコル)。単離したタンパク質の純度は、SDS-PAGEにより測定して>95%であった。

Optitran(商標) BA-S83メンブレンおよびInvitrogen Blot Moduleを用い、製造業者が提供するプロトコルに従ってウェスタンブロット法を実施した。使用した抗体は、Hisタグ(Penta His, Qiagen) に対するものおよびアルカリホスファターゼ(AP)標識したヤギ-抗マウスIg (Sigma)、ならびに基質としてのBCIP/NBT (Sigma)であった。二重特異性一本鎖抗体をウェスタンブロット法によって特異的に検出できた。精製した二重特異性抗体に相当する52 kDの単一バンドが検出された。

３．CD19xCD3特異的ポリペプチドのフローサイトメトリー結合分析
CD19およびCD3への結合能に関して構築体の機能を試験するために、FACS分析を実施した。この目的に、CD19陽性NALM-6細胞（ヒトＢ細胞前駆体白血病）およびCD3陽性ジャーカット細胞（ヒトＴ細胞性白血病）を用いた。200,000個のNALM-6細胞および200,000個のジャーカット細胞をそれぞれ氷上で30分間、CD19およびCD3の異なる配置のVHおよびVLドメインを含む二重特異性抗体（前記のセクション２に記載したもの）を発現する純粋なCHO細胞培養の細胞上清50μlと共にインキュベートした。細胞をPBS中で2回洗浄し、下記に従って構築体の結合を検出した。前記に従って処理した細胞を非標識ネズミPenta His抗体(2%のFCSを含有する50μlのPBS中に1:20希釈; 注文No. 34660)と接触させた；これは、細胞結合した構築体に、構築体のC末端ヒスチジンタグを介して特異的に結合する。続いて、結合していないネズミPenta His抗体を除去するために洗浄工程を行う。結合した抗His抗体を、フィコエリトリンに共役したFcガンマ特異的抗体(Dianova)（2%のFCSを含有する50μlのPBS中に1:100希釈）で検出した。陰性対照として、培養上清の代わりに新鮮な培地を用いた。

細胞をFACS-Calibur装置(Becton Dickinson, ハイデルベルク)上でのフローサイトメトリーにより分析した。FACS染色および蛍光強度の測定をCurrent Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 2002)の記載に従って実施した。WO2004/106381に示すように、数種類のドメイン配置の結合能を明確に検出できた。FACS分析では、CD19およびCD3に特異的な種々の配置のVHおよびVLドメインを含むすべての構築体が、培地を用いた陰性対照ならびに1.および2.の検出抗体と比較してCD3への結合を示した。表１に述べた構築体について、蛍光強度>5×10¹のシフトを生じる強い結合活性がみられた。

４．CD19およびCD3に特異的な二重特異性一本鎖抗体の生物活性
再配置したVHおよびVLドメインを含む二重特異性抗体の細胞毒性を、フルオロクロム放出ベースの細胞毒性アッセイにおいて測定した。CD19陽性NALM-6細胞を標的細胞として用い(1.5×10⁷)、10μMカルセイン（calcein）AM (Molecular Probes, オランダ、ライデン, no. C-1430)により37℃で30分間、細胞培養培地中において標識した。細胞培養培地中で2回洗浄した後、細胞を計数し、CD4陽性Ｔ細胞クローンCB15細胞(好意的にFickenscher博士により提供された；エルランゲン大学/ドイツ、ニュルンベルク)と混合した。ml当たり2×10⁶個のCB15細胞と2×10⁵個のNALM-6細胞を混合し(E:T比は1:10)、96ウェル丸底プレートのウェル当たりこの懸濁液50μlを用いた。抗体をRPMI/10% FCS中に必要濃度に希釈し、この溶液50μlを細胞懸濁液に添加した。標準反応物を37℃/5% CO₂で2時間インキュベートした。細胞毒性反応の後、インキュベーション媒質中に放出された色素を蛍光読取り器(Tecan, ドイツ、クレイルスハイム)で定量し、対照反応（二重特異性抗体なし）からの信号および総溶解細胞(1% サポニン中で10分間)について得た蛍光信号と比較することができる。これらの読みに基づいて、特異的細胞毒性を下記の方程式に従って計算した：[蛍光(試料) - 蛍光(対照)] : [蛍光(総溶解物)- 蛍光(対照)]×100。

S字状用量応答曲線は、Prism Software (GraphPad Software Inc., 米国サンディエゴ)により判定して一般に>0.97のR²値をもっていた。分析プログラムにより計算したEC₅₀値を生物活性の比較に用いた。

WO2004/106381に示すように、CD19を発現するNALM-6細胞に対してすべての構築体が細胞毒性を示した。前記の表１に示す構築体について、EC 50値< 500 pg/mlのきわめて強い生物活性が検出された。

例２：
Ｂ細胞性リンパ腫を伴う患者におけるbscCD19xCD3の臨床使用
特別な使用において、Ｂ細胞由来慢性リンパ性白血病(B-CLL)に罹患している患者(女性、1937年生まれ)を、WO 99/54440に詳述される二重特異性一本鎖抗体(SEQ ID NO.2)で治療した。FACS分析により、この患者の末梢血細胞の95 %がCD19陽性であり、77 %の細胞がCD20抗原を発現することが明らかになった。患者の末梢血細胞をbscCD19xCD3と共にインキュベートすると、CD19陽性Ｂ細胞の顕著な枯渇が示された。急激なサイトカイン反応および腫瘍溶解の合併を防ぐために、2 mgのクレマスチン（clemastine）(Tavegil(登録商標))および200 mgのシメチジン（cimetidine）(Tagamet(登録商標))ならびに300 mgのアロプリノール（allopurinol）および20 mgのオメプラゾール（omeprazol）(Antra(登録商標))を患者に予防的に静脈内投与した。

患者に初回量の3μgのbscCD19xCD3を、5 %のヒト血清アルブミン(HSA)を含有する等張リン酸緩衝液中において20分間注入として投与した。この注入期間中、患者に有害作用はなかった。注入の約１時間後、患者は約5分間の悪寒を生じ、その後、発汗、約10 mm Hgの中等度の血圧降下および中等度の体温上昇(+ 0.5℃)が数時間続いた。さらに、患者の頭痛がわずかに悪化した。患者をさらに2 mgのTavegil(登録商標)および200 mgのTagamet(登録商標)、250 mgのプレドニゾロン（prednisolone）(Solu-Decortin(登録商標))ならびに50 mgのペチジン（pethidine）(Dolantin(登録商標))で治療した。同日にすべての症状が続発症なしに除かれた。

第２量の10μgのbscCD19xCD3を、１日後に前記と同じ条件で投与した。注入の約１時間後、患者に顕著な悪寒、発熱(39.2℃)、軽度の呼吸亢進および低血圧反応が起きた。患者を2 mgのTavegil、200 mgのTagametおよび300 mgのSolu-Decortinならびに15 mgのピリトラミド（piritramide）(Dipidolor(登録商標))で治療した。患者の心血管機能を安定化するために、患者にドーパミン（dopamine）を注入し、循環血代用液を投与した。この治療の後、症状は顕著に軽減した。

患者はその後3日間、亜熱性体温(約37.2℃)が続き、わずかな胸水（第２量投与の１日後）および軽度の下肢浮腫を発症した。

脾臓ならびに5つの腹部および腋窩リンパ節の超音波検査を、第２量のbscCD19xCD3投与の１日後および4日後に実施した。10μg投与の１日後に既にリンパ節および脾臓は治療前のリンパ節および脾臓のサイズと比較して約20 %の縮小を示した。この所見は２回目の超音波評価において確認された。脾臓の重量は350 g減少した(治療前の1630 gから治療後の1280 gに)。

白血球数（大部分が悪性Ｂ細胞を含む）は治療経過中および経過観察日中に減少した。C反応性タンパク質(CRP)は、Ｔ細胞活性化および炎症性サイトカイン（proinflammatory cytokine）の作用を反映する急性期反応タンパク質である。これは10μgのbscCD19xCD3を投与した後に顕著に増加し、続いてその後3日間の観察日中に連続的に減少した。

本発明化合物の投与に対する急性免疫応答を反映する血清サイトカイン濃度を、投与前に、および投与後の種々の時点で測定した。血清サイトカイン濃度は、製造業者の指示に従って定量ELISAアッセイにより測定された。腫瘍壊死因子TNF-αは、bscCD19xCD3投与後１時間以内に用量依存性様式で有意に増加した。インターロイキン6 (IL-6)およびインターロイキン8 (IL-8)も、有意の用量依存性増加を示した。それらの最大濃度は、bscCD19xCD3投与の2〜4時間後にみられた。

結論として、bscCD19-CD3は再発性B-CLLに罹患している患者に安全に投与された。大部分はサイトカイン放出によるものと思われる有害な副作用がみられたが、3μgおよび10μg用量のbscCD19xCD3の耐容性は許容できるものであり、予防処置および対症処置によって良好に抑制できた。重要な点は、超音波検査に示されるように、bscCD19xCD3がそれまでは肥大していた患者の脾臓およびリンパ節を縮小させたことである。脾臓およびリンパ節の肥大は悪性Ｂ細胞の浸潤により起きるので、この縮小はbscCD19xCD3投与の結果として悪性Ｂ細胞が破壊されたことを反映する。

例３：
用量漸増第Ｉ相試験−患者0202
この用量漸増第Ｉ相試験の目的は、再発性Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫（NHL）を伴う患者の腫瘍標的組織において免疫活性の変化の用量依存性を調べることであった。このために、各患者に抗CD19×抗CD3二重特異性抗体(SEQ ID NO.2; WO 99/54440も参照)を週１回または2回の治療計画で4時間かけて0、2、7、9、14および16日目に6回の静脈内投与を行う計画を立てた。抗CD19×抗CD3の用量を個体内で下記の用量で漸増させた：1、2、4、7、10および13μg/m²体表面積。

漸増bscCD19xCD3用量が循環リンパ球サブセットの数および分布に与える影響を評価するために、投与前および投与中に全血試料を採取した。リンパ球の総数を鑑別血球数分析により測定し、リンパ球小集団の数をFACS分析により測定し、総リンパ球に対する％として表示した；例２の記載と同様。特に末梢血単核細胞中のCD3+、CD4+およびCD8+ Ｔ細胞数を蛍光活性化セルソーター（FACS）により測定した。

薬物治療相を完了した１人の患者(すなわち患者0202)について図１に例示したように、最低開始量の二重特異性抗体を用いた場合ですら、突然のCD3+、CD4+およびCD8+ Ｔ細胞数低下（総リンパ球に対する％として示す）が4時間の注入期間内にみられた。Ｔ細胞数は24〜48時間までにほぼ投与前値にまで回復した。同様なＴ細胞の曲線経過が、この試験に参加した他の患者にもみられた。この低下についての説明のひとつは、Ｔ細胞および活性化された他の白血球が組織へ突然に付着および−少なくとも部分的には−移動するためである。膨大な活性Ｔ細胞集団（約80%のヒトＴ細胞プールが常に末梢血中にある）のこのような突然の活性化および移行の結果、Ｔ細胞恒常性が障害を受け、かつ組織の局所サイトカインプロフィールが撹乱されるという仮説が立てられる。実際に、図１の様式に従って患者に薬物を投与すると、有害な副作用が生じる。この結果から、より緩徐なＴ細胞集団の活性化および移行の方が生理的な免疫応答に近似し、局所サイトカインネットワークの突然の撹乱およびそれにより生じる有害な副作用などの現象を避けることができると示唆された。

例４：
第Ｉ相臨床試験−患者1003
追加の臨床試験で、二重特異性一本鎖抗CD19×抗CD3抗体(SEQ ID NO.2; WO 99/54440も参照)の反復静脈内注入の安全性プロフィール試験において、再発性の遅進性もしくは攻撃性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫（B NHL）またはＢ細胞性白血病を伴う患者における最大耐量および生物学的最適量を調べた。各患者に抗CD19×抗CD3を2時間または4時間かけて試験の0、2、4、14、16および18日目に6回注入した。合計15人の患者を最高3.0 μg/m²の用量で治療した。

薬物投与の前および途中の種々の時点で血液を採取して、生化学的、血液学的および免疫学的パラメーターを追跡した。前記に従ってＴ細胞数を測定した。さらに、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)およびサイトメトリービーズアレイ（cytometric bead array）(CBA)を用いて、患者の血清サイトカイン濃度を測定した。

治療患者においてＴ細胞数をモニタリングした際に、著しいＴ細胞数変動が各注入に際してみられた；これは、先の試験でもみられたように、短期間の爆発的なＴ細胞活性化を示唆する；例３を参照。さらに、外套膜細胞性リンパ腫(MCL)と診断された１人の患者(すなわち患者1003)について図２〜５に示すように、二重特異性抗体の注入に際して、治療患者にTNF-α、インターフェロンガンマ、インターロイキン-6およびインターロイキン-10の著しいサイトカイン放出がみられた。サイトカイン放出強度は初回量の投与に際して最高であり、二重特異性一本鎖抗CD19×抗CD3抗体の後続注入に対する応答は低下した（初回量作用）。6回の注入後、サイトカインレベルの誘導はほとんどみられなかった。例３に示した試験の場合のように、急激なＴ細胞活性化およびサイトカイン放出により患者に有害な副作用が生じた。これらの事象は大部分が軽度または中等度であり、すべてが一過性であった。最も頻度の高い検査室的異常は種々の血液学的および凝集パラメーターにみられ、同様に一過性であり、大部分が性質および臨床的有意性において軽度ないし中等度であった。この試験で得られた結果から、前記の臨床試験でみられた局所サイトカインネットワークの突然の撹乱などの現象を避けるためにはより緩徐なＴ細胞活性化が必要であるという可能性が示唆された。

例５：
１．非ホジキンリンパ腫（B NHL）患者の抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体(SEQ ID NO. 2)連続注入治療試験
抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体(bscCD19xCD3；SEQ ID NO. 2に示すアミノ酸配列)の安全性および耐容性を評価するために、この化合物を長期連続注入により投与した。再発性Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫（B NHL）を伴う2人の患者を次のセクション２および３に示す(患者#105003および患者#102003)。治療の１日目に、これら2人の患者に”初回被曝量”5μg/m²/24時間の抗CD19×抗CD3二重特異性抗体を連続静脈内(i.v.)注入として投与した。その後、投与量を”維持量”15μg/m²/24時間に高め、これを連続静脈内注入として残り2週間(患者#102003について)または4週間(患者#105003について)の注入期間、投与した。被験薬物の１日量は、5%のHSAを含有する等張NaCl溶液500 ml中において投与された。二重特異性抗体の注入を開始する１時間前に、注入期間の初期におけるサイトカイン放出を抑制するために、各患者に1×100 mg (i.v.)濃度のグルココルチコステロイド（メチルプレドニゾロン(methylprednisolone)）との併用療法を施した。

この例５のセクション４に、”初回被曝量”（0.5〜5μg/m²/24時間）および”維持量”（15μg/m²/24時間）で治療した患者の詳細な総括データを提示する。

２．濾胞性リンパ腫（Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫）と診断された患者#105003
この44歳の男性患者は2000年に濾胞性リンパ腫と診断された。この患者はこれまでに複数の化学療法(CHOP; ベンダムスチン(Bendamustin)）および免疫療法（リツキシマブ(Rituximab)；抗CD20モノクローナル抗体）を受けていた。ワクチン接種試験に2年間参加した後、この疾患が再び進行した。2005年の秋、患者は骨髄浸潤の増大を示して結果的に貧血症になり、肺に浸潤して呼吸機能不全となった。さらに、B-症状の悪化(脾腫、寝汗亢進、および3週間で3 kgの体重減少)のため、この患者の生活の質は明らかに低下した。この臨床状態のため新たな療法が必要になった。

その後、前記に詳述したように患者に用量レベル15μg/m²/24時間の抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体(SEQ ID NO.2)を4週間の連続注入として投与した。この治療は2005年10月3日に開始され、良好に耐容され、すなわち有意の有害な副作用はみられなかった。

2.1 抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体によるＴ細胞の活性化および増殖
患者#105003より試験プロトコルに従って種々の時点で得た末梢血試料からの単核細胞を、下記の組合わせの4種類の異なる抗体または表面マーカーで染色した後、4色フローサイトメトリーにより分析した：
パネル1：CD2×CD3×CD4×CD8 (T細胞)
パネル2：CD3×CD16×CD19×CD56 (リンパ球数：B、TおよびNK細胞)
パネル3：CD8×CD25×CD69×HLA-DR (CD8⁺T細胞活性化)
パネル4：CD8×CD28×CD45RA×CCR7 (CD8⁺T細胞サブセット)。

リンパ球サブセット、すなわちそれぞれCD19⁺/CD3^-、CD3⁺およびCD3^-/CD56⁺細胞と定義されるB、TおよびNK細胞の絶対細胞数は、パネル2から、%(B、TまたはNK細胞) / (%B + %T + %NK細胞)に、ルーティン検査により測定した各血液試料の総リンパ球数を掛けたものとして計算された。絶対CD4⁺およびCD8⁺T細胞数は、パネル1から、それぞれ%CD3⁺CD4⁺CD8^-細胞 / %CD3⁺細胞、または%CD3⁺CD4^-CD8⁺細胞 / %CD3⁺細胞に、パネル2から計算した絶対Ｔ細胞数を掛けたものとして計算された。CD8⁺ T細胞サブセットの絶対細胞数は、パネル4から得た下記の比率の%それぞれに、パネル2から計算した絶対CD8⁺T細胞数を掛けたものから計算された：
%CD8⁺CD45RA⁺CD28⁺細胞 / %CD8⁺細胞(ナイーブCD8⁺ T細胞に相当)、
%CD8⁺CD45RA^-CCR7⁺細胞 / %CD8⁺細胞(中枢記憶CD8⁺ T細胞 = T_CMに相当)、
%CD8⁺CD45RA^-CCR7^-細胞 / %CD8⁺細胞(エフェクター記憶CD8⁺ T= T_EMに相当)、および
%CD8⁺CD45RA⁺CD28^-細胞 / %CD8⁺細胞(最終分化CTL (細胞傷害性T細胞) = CD45RA陽性エフェクター記憶CD8⁺ T細胞 = T_EMRAに相当)。

この患者における細胞活性化を、すべてのCD8⁺Ｔ細胞に対する、細胞表面活性化マーカーCD25、CD69またはHLA-DR (フローサイトメトリーパネル3)を発現するCD8⁺ Ｔ細胞の％として測定した。

まずCD4⁺およびCD8⁺Ｔ細胞数を分析した。図６に示すように、CD8⁺およびCD4⁺ Ｔ細胞は、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体の注入開始後に大部分が末端血から消失した。これは、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体が仲介する末梢血Ｔ細胞とＢ細胞の架橋によるＴ細胞活性化により誘発された分布現象として説明される。しかし、半週間の治療後にCD8⁺およびCD4⁺ Ｔ細胞は血中に再び出現し、それぞれ7日および21日目までさらに増加した。CD8⁺およびCD4⁺Ｔ細胞は、それらの出発値と比較して血中に3.5〜4倍の拡張を示した。CD8⁺およびCD4⁺ Ｔ細胞数は2週および3週目の治療中には高い状態を維持し、その後、4週目の治療中にＴ細胞数が減少し始めた。CD8⁺およびCD4⁺Ｔ細胞数は、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体を4週間注入した後、対応する治療前の値より依然として高く、この時点で、後記のように部分応答の基準を満たす実質的な腫瘍縮小と診断された。

次いで、CD8⁺ Ｔ細胞小集団をより詳細に分析した。図７に示すように、CD8⁺Ｔ細胞小集団の分析により、エフェクター記憶サブセットTEMが、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体により誘導されるCD8⁺ Ｔ細胞の拡張にほぼ独占的に関与することが明らかになった。すべてのＴ細胞のうちCD8⁺Ｔ細胞が大部分の細胞傷害活性の原因となり、CD8⁺ Ｔ細胞のうちTEM細胞がTEMRAサブセットと共に大部分の細胞傷害活性の原因となる。TEMサブセットを除いて、他のCD8⁺Ｔ細胞小集団、たとえば抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体により提供される単一活性化シグナルに際して増殖できないナイーブＴ細胞、または全く増殖できないTEMRAサブセットには、有意の細胞数変化をみることができなかった。したがって増殖コンピテントCD8⁺ TEM細胞の選択的拡張は明らかに、CD8⁺TEM細胞と抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体で修飾されたＢリンパ腫細胞との、腫瘍内での接触に応答した細胞分裂および増殖に起因するということができる；図１４も参照。血中を循環する抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体で修飾されたＢリンパ腫細胞がＴ細胞拡張に有意に寄与したということは除外できる。循環Ｂリンパ腫細胞は3日目に、すなわちＴ細胞拡張がみられる前に既に末梢血から枯渇しているからである。

最後に、CD8⁺ Ｔ細胞活性化を分析した；その際、図８に示すようにCD8⁺Ｔ細胞活性化マーカーを追跡した。CD8⁺ Ｔ細胞拡張に先立って、活性化マーカーHLA-DRの持続的アップレギュレーションにより示されるようにCD8⁺Ｔ細胞が強く活性化される。他の活性化マーカー、たとえばCD69およびCD25は、本発明の構築体の注入開始後に短期間の一過性アップレギュレーションを示したにすぎない。これは、治療の最初の3日間で循環Ｂリンパ腫細胞は枯渇したので、血中を循環している抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体で修飾されたＢリンパ腫細胞による活性化により説明される。これに対し、3週間にわたる持続的なHLA-DRアップレギュレーションは、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体で修飾された腫瘍定住Ｂリンパ腫細胞との接触による、腫瘍内でのCD8⁺ Ｔ細胞の活性化を反映している。腫瘍内Ｔ細胞活性化により腫瘍内での増殖性Ｔ細胞応答が生じ、これによりＴ細胞が拡張し、これは二次的に循環血中にも現れる。腫瘍内で活性化され、次いで血中に移動したこれらのＴ細胞はなお長期活性化マーカーHLA-DRを示すが、短期活性化マーカーCD69およびCD25は既にダウンレギュレーションしている。

結論として、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体による治療は長期間のＴ細胞活性化および拡張を生じた。細胞傷害性表現型をもつＴ細胞は、主にCD8⁺ Ｔ細胞の拡張に原因がある。Ｔ細胞の活性化および増殖は、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体で修飾されたＢリンパ腫細胞により、腫瘍内で誘導される。注入の第3週中におけるＴ細胞活性化の低下および第4週中におけるＴ細胞数の減少は、この患者において抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体の効力により説明できる；この効力により、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体で4週間治療した後に診断して58.0%の腫瘍縮小が生じ（後記を参照）、したがって抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体により仲介されるＴ細胞活性化および増殖を誘導することができるＢリンパ腫細胞の総数が減少する。

2.2 抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体による末梢血Ｂ（リンパ腫）細胞の枯渇
最良の臨床応答が得られるまでの種々の時点で被験患者#105003より得た末梢血の試料からの単核細胞を、下記の4種類の細胞表面マーカーに対する抗体の組合わせで染色した後、標準法に従って4色フローサイトメトリーにより分析した：CD3 (T細胞マーカー)×CD16 (NK細胞／マクロファージマーカー)×CD19 (B細胞マーカー)×CD56 (NK細胞マーカー)。リンパ球サブセット、すなわちそれぞれCD19⁺/CD3^-、CD3⁺およびCD3^-/CD56⁺細胞と定義されるB、TおよびNK細胞は、%(B、TまたはNK細胞) / (%B + %T + %NK細胞)に、ルーティン検査により測定した各血液試料の総リンパ球数を掛けたものとして計算された。したがって、Ｂ（リンパ腫）細胞の絶対数はCD19⁺/CD3^-細胞の総数として計算された。

図９に示すように、この患者は治療前に血液ml当たり約140個のＢ（リンパ腫）細胞から開始した。抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体の注入開始後、循環Ｂ（リンパ腫）細胞は治療の最初の3日間以内に急速に減少し、最終的に治療の第１週の終わりまでに完全に末梢血から消失した。さらに、Ｂ（リンパ腫）細胞は4週間の治療後に部分応答と診断されるまで末梢血中に存在しない状態を維持した；後記を参照。これらのデータは、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体がこれらの細胞に対するその細胞毒性のため、循環Ｂ（リンパ腫）細胞を完全に排除できることを示す。

2.3 抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体によるリンパ腫サイズの縮小
抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体による治療の効力を評価するために、非ホジキンリンパ腫（NHL）に関する規格化された応答評価基準を用いた。これらの基準に従って、6つの代表的なリンパ腫病変部を選択した。リンパ腫病変部の最大断面直径の積の和をベースラインSPD（和積直径）と定義する。次いでこのSPDの変化を試験の治療期間および経過観察期間全体の正規基礎として評価する。たとえば、部分応答は³ 50%のSPD低下と定義される。図１０に示すように、4週間の治療後に病期再判定した際に、前記に述べたNHLに関する応答評価によれば明らかなリンパ腫腫瘍塊縮小がみられた：6つの基準リンパ腫病変部のSPDに58.0%の縮小が診断され、これはコンピューター断層撮影(CT)による腫瘍応答評価において部分応答(PR)に相当する。抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体による治療の8週間後には、腫瘍縮小66%（SPD）を示すコンピューター断層撮影により部分応答が確認された。

３．小リンパ球性リンパ腫(B-CLL)と診断された患者#102003
この60歳の男性患者は1999年に小リンパ球性リンパ腫(B-CLL)と診断された。患者の病歴における関連所見は睡眠無呼吸症候群、急性腎不全、帯状疱疹、間欠性気管支炎および間欠性肝障害であった。患者は複数の化学療法（クロラムブシル(Chlorambucil)；フルダラビン(Fludarabin)；クノスプ(Knospe)；エンドキサン(Endoxan)）、免疫療法（リツキシマブ(Rituximab)；抗CD20モノクローナル抗体）、および腹部領域の放射線療法の治療歴があった。

この疾患の7年間の病歴において、患者は単独療法または併用療法として7種類の化学療法計画およびリツキシマブ、ならびに放射線療法を受け、何ら大きな応答がなかった。抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体の投与はこの患者にとって13番目の投薬療法計画であった。患者に抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体(SEQ ID NO.2)を15μg/m²/24時間の用量レベルで2週間、前記に詳述した連続注入として投与した。この治療を2005年5月9日に開始した。2週間の治療後、完全な病期再判定を行った。結果は以下に提示するとおりである。

3.1 抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体による末梢血Ｂ（リンパ腫）細胞の枯渇
前記セクション2.2に述べたように、Ｂ細胞数を測定した。図１１に示すように、患者は治療前に920個/ml血液のＢ（リンパ腫）細胞から開始した。抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体の注入開始後、循環Ｂ（リンパ腫）細胞は急速な減少を示し、続いて最初の3日以内に、細胞の再分布と一致した600個/mlの一過性の限定回復期があった。2週間の治療後に部分応答と診断されるまで、以後の治療経過中にＢ（リンパ腫）細胞は循環から完全に消失した。これらのデータから、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体はその臨床効力の一部として循環Ｂ（リンパ腫）細胞を完全に排除できることが確認される。

3.2 抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体による骨髄からのリンパ腫浸潤物の排除
さらに、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体による治療の前と後に骨髄組織病理検査を実施した。図１２、左パネルに示すように、治療前には小リンパ球性リンパ腫細胞による40〜50%の骨髄浸潤がみられた。小リンパ球性リンパ腫／CLLの診断が確認された。

図１２、右パネルに示すように、抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体で治療した後、もはや小リンパ球性リンパ腫細胞の浸潤の証拠をみることができず、これに対し有意のＴ細胞増加をみることができた。これらのデータは、リンパ腫細胞が抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体により検出限界未満にまで骨髄から排除されたことを証明する。この所見は、たとえば一般的な化学療法では達成困難である完全骨髄応答と一致する。

3.3 抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体によるリンパ腫サイズの縮小
さらに、2週間の治療後に病期再判定を行った時点で、リンパ腫腫瘍塊の明らかな縮小がみられた：図１３に示すように、6つの基準リンパ腫病変部の57.2%縮小がコンピューター断層撮影(CT)により診断され、これは腫瘍応答評価において部分応答(PR)に相当する。この疾患の7年間の病歴において、患者は7種類の化学療法計画ならびに免疫療法および放射線療法を受け、何ら大きな応答がなかった。抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体によるこの患者の治療は、基準リンパ腫病変部の50%を超える縮小を達成できたという点で、初めて治療の成功をもたらした。

４．臨床データのまとめ
初回量0.5μg/m²/24時間で古典的な3+3用量漸増計画に従って、再発性遅進性NHLを伴う患者を参加させた。推定サイトカイン放出症候群を緩和するために、最初にステロイド保護を施した。安全性および耐容性をCTC-AE (common terminology criteria for adverse events；有害事象共通用語規準)により評価した。このNCI（国立がん研究所）の有害事象共通用語規準は、有害事象(AE)報告に利用できる記述用語である。各AE用語規準についてグレーディング（重症度）尺度が設けられ、用量漸増は、データ査察委員会が14日間のDLT (dose limiting toxicity；用量制限毒性)期間をおいて前用量の安全性を結論した後に初めて許可された。特異的ELISAを用いて全身サイトカインレベルを調べ、末梢免疫細胞サブセットをFACS分析で定量および特性分析することにより、生物活性をモニターした。4週間の抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体治療後、対照CT（コンピューター断層撮影）スキャンを実施した。患者が少なくとも標準化チェソン（Cheson）規準(セントラル・ラジオロジー(central radiology)により概説)に従って安定していれば、さらに4週サイクルの抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体を患者に施した。チェソン規準は、国立がん研究所および国際製薬工業（the international pharmaceutical industry）により、NHLにおける臨床応答を評価するための指針を提供するために開発された。この規準によれば、疾患および疾患関連症状の検出可能な臨床証拠およびＸ線撮影証拠がすべて完全に消失し、すべてのリンパ節が正常サイズに戻り、脾臓のサイズが退縮し、かつ骨髄からリンパ腫が排除された場合に、完全応答が得られたことになる。部分応答については、6つの最大の主リンパ節のサイズが50%縮小し、他のリンパ節、肝臓または脾臓のサイズの増大がなく、脾リンパ節、肝リンパ節は少なくとも50%退縮しなければならなず、かつ新たな疾患部位があってはならない。

現在までに、平均数4の従来の化学療法／免疫療法を受けた19人の患者が参加した。DL1 (0.5μg/m²/24時間) (DL = 用量レベル)からDL3 (5μg/m²/24時間)まで用量漸増した間に、用量制限毒性はみられず、AE(有害事象)は一般に中等度であった。DL4 (１日目に5μg/m²/24時間、維持量として15μg/m²/24時間)では7人の患者を治療し、2人の患者に14日未満の治療を施した(1人はDLT、１人は検査員の決断により中断)。

抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体注入の終了時までに、評価可能な患者（2週間を超える治療、かつ抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体注入の前に末梢血中にＢ細胞を検出可能）14人中9人に循環Ｂ（リンパ腫）細胞の完全排除がみられた。DL4では用量依存性の頻度増大は100%に達した。DL4では、7人中3人に関連の骨髄(BM)浸潤があり(> 10%)、１人の患者は改善を示し、2人の患者は骨髄中の完全なリンパ腫細胞消失を示した。評価した患者（2週間を超える治療、および関連領域すべてのスキャン）14人における最良の全腫瘍応答は１人のCR (完全応答：患者# 109002、61歳の男性、濾胞性リンパ腫と診断、グランド1、IIIa期)、2人のPR (部分応答)、１人のMR (わずかな応答)、7人のSD (安定疾患)および3人のPD (進行性疾患)であった。特に、患者#109002はさらに印象的な結果、すなわち完全寛解（comprete remission(CR)）を示した；図１４〜１６を参照。この完全寛解は、この患者において治療１日目の初回量5μg/m²/24時間および4週間の後続量15μg/m²/24時間で達成された。これらの4週間の後、患者# 109002は部分応答を示し、直ちに患者にさらに15μg/m²/24時間を4週間投与すると完全応答が生じた。

下記に限定されるわけではないが、当技術分野では”完全応答(complete response)”、”部分応答(partial response)”、”進行性疾患(progressing disease)”および”わずかな応答(minor response)”を下記のように定義する：
CT撮影および他の検査により病変部が検出されない場合、しばしば完全応答が宣言される。CT撮影および骨髄検査で疾患の証拠が示されない場合、それはより厳密に完全応答を規定する。

部分応答は、療法に対して測定可能な腫瘍負荷の少なくとも50%低下が測定される応答を表わす。

患者に症状（発熱、寝汗など）がある場合、およびリンパ節のサイズが増大し、または新たなリンパ節腫脹がみられた場合、患者は進行性疾患を伴うとみなされる。

患者に症状がない場合、およびリンパ節が肥大しつつある状態ではなく、またはサイズが退縮しつつあるとみられる場合、患者は安定疾患または退行性疾患を伴うとみなされる。この状態または疾患の不活性が臨床的にみられる状態を時には寛解と記述する。

”わずかな応答”はおおまかに、少量の縮小を意味する。わずかな応答は実際には標準用語ではないが、使用が増している。おおまかに言えば、わずかな応答は全腫瘍容積の25%を超えるが、部分応答（PR）を構成する50%より少ない。

再発性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫(B NHL)を伴う患者に静脈内投与した抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体(bscCD19xCD3)の用量漸増試験−末梢CD3+、CD4+およびCD8+リンパ球数に対する影響。再発性B NHLを伴うと診断された患者0202に、bscCD19xCD3を週2回の治療計画で4時間かけて6回、静脈内投与した。bscCD19xCD3の用量を下記の用量で漸増させた：1、2、4、7、10および13μg/m²体表面積。総リンパ球数に対する％として示したCD3+ Ｔリンパ球（灰色菱形）、CD4+ Ｔリンパ球（黒色四角）およびCD8+ Ｔリンパ球（黒色三角）を、それぞれ0、2、7、9、14および16日目の4時間の注入の前と終了時にフローサイトメトリーにより測定した。4時間の注入期間を矢印と灰色の棒で示す。 難治性Ｂ細胞性悪性疾患を伴う患者に静脈内投与した抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体(bscCD19xCD3)の用量漸増試験−TNFアルファの血清濃度に対する影響。外套膜細胞性リンパ腫(MCL)を伴うと診断された患者1003に、1.5μg（0日目における初回量）および3μg（以後の試験日における維持量）のbscCD19xCD3を、試験の0、2、4、14、16および18日目に4時間かけて6回注入した。4時間の注入期間の前と後にTNFアルファの血清濃度を測定した。4時間の注入期間を矢印と灰色の棒で示す。 図２の説明に示した患者1003に静脈内投与したbscCD19xCD3の用量漸増試験−IFNガンマの血清濃度に対する影響。 図２の説明に示した患者1003に静脈内投与したbscCD19xCD3の用量漸増試験−IL6の血清濃度に対する影響。 図２の説明に示した患者1003に静脈内投与したbscCD19xCD3の用量漸増試験−IL10の血清濃度に対する影響。 CD3⁺ / CD8⁺およびCD3⁺/ CD4⁺ Ｔ細胞数の分析。bscCD19xCD3注入の開始後にCD8⁺およびCD4⁺ Ｔ細胞は大部分が末梢血から消失した。これは、bscCD19xCD3により仲介された末梢血Ｔ細胞とＢ細胞の架橋によるＴ細胞活性化によって誘発された分布現象として説明される。しかし、半週間の治療後にCD8⁺およびCD4⁺Ｔ細胞が血中に再び出現し、さらにそれぞれ7および21日目まで数が増加した。それらの出発時の数値と比較してCD8⁺およびCD4⁺Ｔ細胞は血中に3.5〜4倍の拡張を示した。CD8⁺およびCD4⁺ Ｔ細胞数は2および3週目の治療中は高いままであり、その後、4週目の治療中にＴ細胞数が減少し始めた。4週間のbscCD19xCD3注入後、CD8⁺およびCD4⁺Ｔ細胞数は対応する治療前値より依然として高く、この時点で部分応答の基準を満たす実質的な腫瘍縮小が診断された。 CD8⁺ Ｔ細胞小集団の分析。エフェクター記憶サブセットTEMは、bscCD19xCD3により誘導されたCD8⁺Ｔ細胞拡張にほぼ独占的に関与していた。すべてのＴ細胞のうちCD8⁺ Ｔ細胞が大部分の細胞傷害活性の原因となり、CD8⁺Ｔ細胞のうちTEM細胞がTEMRAと共に大部分の細胞傷害活性の原因となる。TEMサブセットを除いて、他のCD8⁺ Ｔ細胞小集団、たとえばbscCD19xCD3により供給される単一活性化シグナルに際して増殖できないナイーブＴ細胞、または全く増殖できないTEMRAサブセットには、有意の細胞数変化がみられなかった。したがって増殖コンピテントCD8⁺TEM細胞の選択的拡張は、明らかにCD8⁺ TEM細胞とbscCD19xCD3で修飾されたＢリンパ腫細胞との、腫瘍内での接触に応答した細胞分裂および増殖に起因する可能性がある。bscCD19xCD3で修飾された血中循環Ｂリンパ腫細胞がＴ細胞拡張に有意に寄与したことは除外できる。循環Ｂリンパ腫細胞は3日目に、すなわちＴ細胞拡張がみられる前に既に末梢血から枯渇しているからである。 CD8⁺ Ｔ細胞活性化マーカーの分析。CD8⁺Ｔ細胞の拡張に先立って、活性化マーカーHLA-DRの持続的アップレギュレーションにより示されるようにCD8⁺ Ｔ細胞が強く活性化される。他の活性化マーカー、たとえばCD69およびCD25は、bscCD19xCD3の注入開始後に短期間の一過性アップレギュレーションを示したにすぎない；これは、治療の最初の3日間で循環Ｂリンパ腫細胞は枯渇したので、bscCD19xCD3で修飾された血中循環Ｂリンパ腫細胞による活性化により説明される。これに対し、3週間にわたる持続的なHLA-DRアップレギュレーションは、bscCD19xCD3で修飾された腫瘍定住Ｂリンパ腫細胞との接触による、腫瘍内でのCD8⁺Ｔ細胞の活性化を反映している。腫瘍内でのＴ細胞活性化により腫瘍内で増殖性Ｔ細胞応答が生じ、これによりＴ細胞が拡張し、これは二次的に循環血中にも現れる。腫瘍内で活性化され、次いで血中に移動したこれらのＴ細胞も、長期活性化マーカーHLA-DRを示すが、短期活性化マーカーCD69およびCD25は既にダウンレギュレーションしている。 患者#105003のＢ細胞数。この患者は治療前に血液ml当たり約140個のＢ（リンパ腫）細胞から出発した。注入開始後、循環Ｂ（リンパ腫）細胞は治療の最初の3日間以内に急速に減少し、最終的に１週目の治療の終わりまでに完全に末梢血から消失した。したがってbscCD19xCD3は、循環Ｂ（リンパ腫）細胞をこれらの細胞に対するその細胞毒性のため完全に排除できる。 (A)リンパ腫病変部#2 (図１０(B)中の表に示す)のコンピューター断層撮影(CT)によるサイズ測定：bscCD19xCD3で治療する前(左パネル；2005年9月26日)および4週間の治療後(右パネル；2005年10月31日)。(B) (A)に示すリンパ腫のサイズ縮小を、有効性評価のために選択した他の5つのリンパ腫病変部と共に、(B)に示す表中に記載したように定量した。総リンパ腫サイズ縮小を、6つの選択したリンパ腫病変部の最大断面直径の積の和（すなわち和積直径、またはSPD）の低下率として表わす。したがって、58.0%のリンパ腫縮小は部分応答(PR)の基準を満たすと診断できた。 患者#102003のＢ細胞数。この患者は治療前に血液ml当たり約920個のＢ（リンパ腫）細胞から出発した。bscCD19xCD3の注入開始後、循環Ｂ（リンパ腫）細胞は急速な減少を示し、最初の3日間以内に600個/mlに限定回復する一過性の時期がこれに続いた；これは細胞再分布と一致する。2週間の治療後に部分応答(PR)と診断されるまで、以後の治療経過中にＢ（リンパ腫）細胞は完全に循環から消失した。これらのデータから、bscCD19xCD3はその臨床効果の一部として循環Ｂ（リンパ腫）細胞を完全に排除できることが確認される。 2週間のbscCD19xCD3治療の前と後の患者#102003の骨髄組織病理学的検査。左パネルはbscCD19xCD3による治療の前：骨髄は40〜50%の骨髄への小リンパ球性リンパ腫細胞浸潤を示す。右パネルはbscCD19xCD3による2週間の治療の後：小リンパ球性リンパ腫細胞浸潤の証拠はどこにも見ることができず、これに対し有意のＴ細胞増加を見ることができた。 (A) 患者#102003の4つの中隔膜リンパ腫病変部(図１３(B)中の表に示す)のコンピューター断層撮影(CT)によるサイズ測定：bscCD19xCD3で治療する前(左パネル；2005年5月2日)および2週間後(右パネル；2005年5月31日)。(B) (A)に示すリンパ腫のサイズ縮小を、有効性評価のために選択した他の2つのリンパ腫病変部（後腹膜および腸間膜）と共に、(B)に示す表中に記載したように定量した。総リンパ腫サイズ縮小を、6つの選択したリンパ腫病変部の最大断面直径の積の和（すなわち和積直径、またはSPD）の低下率として表わす。したがって、57.2%のリンパ腫縮小は部分応答(PR)の基準を満たすと診断できた。 CD8+ Ｔ細胞拡張は臨床応答の相異と相関する。CD8⁺TEMサブセットの細胞周期を、異なる臨床応答に達した2人の患者、すなわち患者# 109002 (完全応答)および# 105003 (部分応答)について示す。全臨床応答に対するそれぞれ治療の最初の4週間および第2の4週間の寄与、ならびに最初の4週間のTEMサブセット曲線下面積(AUC)をも示す。患者の臨床応答に対する最大の寄与は、治療の最初の4週間に起き、CD8⁺TEMサブセットの拡張と良好に相関する。拡張に際して到達した絶対細胞数と治療前レベルに対比した相対的増加との両方が最適臨床応答に寄与するという所見によって強調されるように、細胞傷害性の高いこれらのＴ細胞の増殖が臨床効果の前提条件であると思われる。 患者# 109002におけるCTスキャンにより検出した腸骨リンパ腫（丸でマークした）：抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体治療前のサイズ3.2×2.2 cm²。同じリンパ腫病変部が4週間の連続抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体注入後に1.7×1.2 cm²のサイズに縮小した。8週間の連続抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体注入後にはリンパ腫が消失した；すなわち、サイズが正常なリンパ節のサイズ(0.8×0.8 cm²)に正常化した。 患者# 109002に抗CD19×抗CD3二重特異性一本鎖抗体を連続注入すると、治療前に著しく肥大していた脾臓のサイズが正常化した。

Claims (7)

1. 二重特異性一本鎖抗体構築体を含有してなる薬剤を含む、遅進性または攻撃性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫（B NHL）またはＢ細胞性白血病の予防、治療または軽減に用いる治療薬であって、二重特異性一本鎖抗体構築体がヒトCD3およびヒトCD19に特異的な結合ドメインを含み、対応するＨ鎖可変領域(V_H)および対応するＬ鎖可変領域(V_L)がＮ末端からＣ末端へ下記の順に配置され：
   V_L(CD19)-V_H(CD19)-V_H(CD3)-V_L(CD3)、
   二重特異性一本鎖抗体構築体は患者の体表面積m²当たり15μgの１日量で少なくとも１週間投与されるものであり、この１日量は少なくとも24時間かけて投与されるものであり、
   前記CD3特異的ドメインの前記VH領域がSEQ ID NO. 17を含み、前記CD19特異的ドメインの前記VH領域がSEQ ID NO. 15を含み、前記CD3特異的ドメインの前記VL領域がSEQ ID NO. 18を含み、および前記CD19特異的ドメインの前記VL領域がSEQ ID NO. 16を含む
   ことを特徴とする、前記治療薬。
2. 二重特異性一本鎖抗体構築体が、下記よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の治療薬：
   (a) SEQ ID NO 2に示すアミノ酸配列；
   (b) SEQ ID NO 1に示す核酸配列によりコードされるアミノ酸配列；
   ならびに
   (c) (b)の核酸配列に対し遺伝子コードの結果として縮重である核酸配列によりコードされるアミノ酸配列であって、CD3およびCD19に特異的に結合できるアミノ酸配列。
3. 可変ドメインが追加のリンカー配列により連結された、請求項１〜２のいずれか１項に記載の治療薬。
4. 毎日の投与を少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間継続する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療薬。
5. 二重特異性一本鎖抗体構築体を他の１種類以上の医薬と組み合わせて投与する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の治療薬。
6. 二重特異性一本鎖抗体構築体をヒト患者に投与する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の治療薬。
7. 二重特異性一本鎖抗体構築体は治療の１日目に患者の体表面積m²当たり0.5〜5μgの初回量で少なくとも24時間かけて投与され、次いで患者の体表面積m ² 当たり15μgで少なくとも24時間かけて投与されるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の治療薬。