JP5435099B2 - 上限臨界溶液温度を有する高分子の水溶液、この高分子で修飾された粒子の水分散体 - Google Patents

Description

本発明は、上限臨界溶液温度を有する高分子の水溶液、この高分子で修飾された粒子の水分散体、及びそれらの保存方法に関する。

温度によって応答性を示す高分子組成物としては、水溶液の状態で下限臨界溶液温度（以下「ＬＣＳＴ」と記述する。）を示すポリイソプロピルアクリルアミドを、粒径が１００〜２００ｎｍ程度の磁性粒子に固定化した刺激応答性磁性粒子が知られている（例えば、非特許文献１及び２参照。）。

前記刺激応答性磁性粒子は、その粒径が１００〜２００ｎｍ程度と微小であることから水によく分散する。前記刺激応答性磁性粒子の水溶液を加熱して、その温度をＬＣＳＴ以上とした場合には、刺激応答性磁性粒子が凝集する。この凝集物は磁力で容易に回収可能であることから、刺激応答性磁性粒子に抗体や抗原を固定化した刺激応答性磁性粒子を用い、種々の生体分子や微生物の分離を行う試みがなされている。

しかしながら、前述の方法で生体分子等の分離を行う場合、その目的物質と刺激応答性磁性粒子とを含有する溶液との両方の温度をＬＣＳＴ以上にする必要がある。用いる刺激応答性磁性粒子のＬＣＳＴ、さらには目的物質の熱安定性によっては、目的物質である生体分子等を損傷又は失活させてしまう場合がある。

同じく、温度によって応答性を示す高分子組成物としては、水溶液の状態で上限臨界溶液温度（以下「ＵＣＳＴ」とも記述する。）を示す高分子及びこの高分子を担体粒子に固定化した温度応答性微粒子が知られている（例えば、特許文献１〜３参照。）。ＵＣＳＴを示す高分子を固定化した温度応答性微粒子を、生体分子等の分離に用いた場合には、その目的物質である生体分子等を、加温によって損傷又は失活させることなく分離、回収することが可能である。

前記温度応答性微粒子を生体試料の分離に用いる場合では、温度応答性微粒子は、種々の生体分子や微生物の分離を行うために抗体や抗原等をリガンドとして固定化してあることが多く、これらリガンドの損傷や失活を防ぐために、通常０℃から１０℃の低温で保存される。しかし、温度応答性微粒子の種類にもよるが、多くの場合０℃から１０℃の低温にＵＣＳＴを示す高分子を用いるため、低温保存時は高分子が凝集状態で保持されることになる。長期間（例えば一か月間）前記高分子が凝集した状態を保つと、ＵＣＳＴ以上の温度に昇温しても、温度応答性微粒子が分散せず、又は分散に時間がかかる場合がある。

アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）１９９４年、４１巻、９９〜１０５頁 ジャーナルオブファーメンテーションアンドバイオテクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）１９９７年、８４巻、３３７〜３４１頁

特開２０００−０８６７２９号公報 国際公開第０２／０１６４５４号 特開２００５−０８２５３８号公報

本発明は、抗体や抗原等のリガンドが温度によって失活しない温度で長期保存しても溶解状態及び分散状態が損なわれない、ＵＣＳＴを示す温度応答性高分子の水溶液及び温度応答性粒子の水分散体及び保存方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した。その結果、ＵＣＳＴを示す高分子を水溶液状態で保存する場合において、特定の塩又は水溶性の有機溶媒を所定量添加してＵＣＳＴを保存温度以下にせしめて溶解した状態で保存すると、長期保存しても高分子の分散状態が損なわれないこと、及びＵＣＳＴを示す高分子で修飾された粒子を水中で保存する場合において、該高分子と同様にＵＣＳＴを保存温度以下にせしめた状態で保存すると、長期保存しても抗体や抗原等のリガンドが失活せずに前記粒子の分散状態が損なわれないことを見出し、これらをもとに本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の通りである。

［１］ 温度応答性高分子を含有する温度応答性高分子の水溶液を、この水溶液の組成で
該温度応答性高分子が有する上限臨界溶液温度以下の保存温度で保存する方法であって、該水溶液に、上限臨界溶液温度を下げる上限臨界溶液温度降下剤を、上限臨界溶液温度を該保存温度以下に下げる含有量で含有させて、上限臨界溶液温度を該保存温度以下に下げることを特徴とする、水溶液の状態での温度応答性高分子の保存方法。

［２］ 担体粒子及びこの担体粒子に担持される温度応答性高分子を有する温度応答性粒
子を含有する温度応答性粒子の水分散体を、この水分散体の組成で温度応答性高分子により温度応答性粒子が有する上限臨界溶液温度以下の該保存温度で保存する方法であって、水分散体に、上限臨界溶液温度を下げる上限臨界溶液温度降下剤を、上限臨界溶液温度を保存温度以下に下げる含有量で含有させて、上限臨界溶液温度を保存温度以下に下げることを特徴とする、水分散体の状態での温度応答性粒子の保存方法。

［３］ 前記温度応答性高分子は、Ｎ−アクリロイルグリシンアミド及びＮ−アクリロイ
ルアスパラギンアミドの一方又は両方を主成分とするモノマーを重合又は共重合させてなる高分子であることを特徴とする［１］又は［２］に記載の保存方法。

［４］ 前記温度応答性高分子は、Ｎ−アクリロイルグリシンアミド及びＮ−アクリロイ
ルアスパラギンアミドの一方又は両方を合わせて９０モル％以上含むモノマーを重合又は共重合させてなる高分子であることを特徴とする［３］に記載の保存方法。

［５］ 前記保存温度は２〜６℃であることを特徴とする［１］〜［４］のいずれか一項
に記載の保存方法。

［６］ 前記上限臨界溶液温度降下剤は、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化リチウム、又はジメチルスルホキシドを含むことを特徴とする［５］に記載の保存方法。

［７］ 前記上限臨界溶液温度降下剤は、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸マグネ
シウム、又は塩化リチウムであり、水溶液又は水分散体に、１，０００ｍＭ以上の濃度で上限臨界溶液温度降下剤を含有させることを特徴とする［６］に記載の保存方法。

［８］ 前記上限臨界溶液温度降下剤は、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、又は硫酸マ
グネシウムであり、水溶液又は水分散体に、４５０ｍＭ以上の濃度で上限臨界溶液温度降下剤を含有させることを特徴とする［６］に記載の保存方法。

［９］ 前記上限臨界溶液温度降下剤はジメチルスルホキシドであり、水溶液又は水分散
体に、６０体積％以上の濃度で上限臨界溶液温度降下剤を含有させることを特徴とする［６］に記載の保存方法。

［１０］ 前記担体粒子は磁性粒子であることを特徴とする［２］に記載の保存方法。

［１１］ 前記温度応答性粒子の粒径が５０〜２００ｎｍであることを特徴とする［１０
］に記載の保存方法。

［１２］ 前記温度応答性粒子は、温度応答性高分子に担持されるリガンドをさらに有す
ることを特徴とする［１０］又は［１１］に記載の保存方法。

［１３］ Ｎ−アクリロイルグリシンアミド及びＮ−アクリロイルアスパラギンアミドの
一方又は両方を合わせて９０モル％以上含むモノマーを重合又は共重合させてなる高分子と；水と；４５０ｍＭ以上の塩化ナトリウム、４５０ｍＭ以上の硝酸ナトリウム、４５０ｍＭ以上の硫酸マグネシウム、１，０００ｍＭ以上の塩化リチウム、又は６０体積％以上のジメチルスルホキシドと；を含有する温度応答性高分子の保存用の水溶液。

［１４］ 塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、又は塩化リチウムの濃
度が５Ｍ以下であることを特徴とする［１３］に記載の水溶液。

［１５］ 担体粒子及びこの担体粒子に担持されるＮ−アクリロイルグリシンアミド及び
Ｎ−アクリロイルアスパラギンアミドの一方又は両方を合わせて９０モル％以上含むモノマーを重合又は共重合させてなる高分子を有する温度応答性粒子と；水と；４５０ｍＭ以上の塩化ナトリウム、４５０ｍＭ以上の硝酸ナトリウム、４５０ｍＭ以上の硫酸マグネシウム、１，０００ｍＭ以上の塩化リチウム、又は６０体積％以上のジメチルスルホキシドと；を含有する温度応答性粒子の保存用の水分散体。

［１６］ 前記担体粒子は磁性粒子であることを特徴とする［１５］に記載の水分散体。

［１７］ 前記温度応答性粒子の粒径が５０〜２００ｎｍであることを特徴とする［１６
］に記載の水分散体。

［１８］ 前記温度応答性粒子は、Ｎ−アクリロイルグリシンアミド及びＮ−アクリロイ
ルアスパラギンアミドの一方又は両方を合わせて９０モル％以上含むモノマーを重合又は共重合させてなる高分子に担持されるリガンドをさらに有することを特徴とする［１６］又は［１７］に記載の水分散体。

［１９］ 塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、又は塩化リチウムの濃
度が５Ｍ以下であることを特徴とする［１５］〜［１８］のいずれかに記載の水分散体。

本発明における温度応答性高分子の上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）とは、温度応答性高分子を含有する温度応答性高分子の水溶液を所望の組成に調製し、必要に応じて加温して
清澄な（溶解した）状態（水溶液）とし、次いで温度応答性高分子の水溶液の温度を１分間で１℃の割合で降下させていき、温度応答性高分子の水溶液の可視光の透過率が、清澄な状態時の１／２の値（温度応答性高分子が凝集した状態）になったときの温度である。

本発明における温度応答性高分子とは、水溶液の状態でＵＣＳＴを示す高分子のことである。温度応答性高分子はＵＣＳＴ以下では水溶液中から凝集し、ＵＣＳＴより高い温度で溶解するが、溶解する温度とＵＣＳＴの差は小さいほどよく、ＵＣＳＴから＋１０℃までの温度で水に溶解する高分子が好ましく、さらにＵＣＳＴから＋５℃までの温度で水に溶解する高分子がより好ましい。

本発明における温度応答性高分子の水溶液の組成とは、温度応答性高分子及び水を含む、水溶液中に含まれる全成分及びその成分比をいう。これは、水溶液中に含まれる共存物質の影響で、ＵＣＳＴの値が変化するためである。前記所望の組成とは、前記水溶液の用途や共存物質の組成によって異なるが、例えば水溶液中の温度応答性高分子の濃度は、０．００１〜１０重量％の範囲から適宜決めることができる。

本発明における温度応答性粒子の上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）とは、温度応答性粒子を含有する温度応答性粒子の水分散体を所望の組成に調製し、必要に応じて加温して清澄な（分散した）状態とし、次いで水分散体の温度を１分間で１℃の割合で降下させていき、水分散体の可視光の透過率が、清澄な状態時の１／２の値（温度応答性粒子が凝集した状態）になったときの温度である。

本発明における温度応答性粒子とは、前記水分散体の状態でＵＣＳＴを示す粒子のことである。温度応答性粒子は、水分散体がＵＣＳＴ以下では水分散体から凝集し、ＵＣＳＴより高い温度で分散するが、分散する温度とＵＣＳＴの差は小さいほどよく、ＵＣＳＴから＋１０℃までの温度で水分散体において分散する粒子が好ましく、さらにＵＣＳＴから＋５℃までの温度で水分散体において分散する粒子がより好ましい。

本発明における温度応答性粒子の水分散体の組成とは、温度応答性粒子及び水を含む、水分散体中に含まれる全成分及びその成分比をいう。これは、水分散体中に含まれる共存物質の影響で、ＵＣＳＴの値が変化するためである。前記所望の組成とは、前記水分散体の用途や共存物質の組成によって異なるが、例えば水分散体中の温度応答性粒子の濃度は、０．００１〜１０重量％の範囲から適宜決めることができる。

なお、本発明においては、温度応答性高分子の水溶液と温度応答性粒子の水分散体とにおいて、水溶液中の温度応答性高分子の含有率と水分散体中の温度応答性粒子の含有率とが同じであり、さらに共存物質等の他の成分の組成が同じである場合では、温度応答性粒子の水分散体の前記組成におけるＵＣＳＴは、温度応答性高分子の水溶液における前記組成のＵＣＳＴに比べて、概ね＋５℃以内に入る。本発明では、このことを利用して、温度応答性粒子の水分散体のある組成におけるＵＣＳＴ及び温度応答性高分子の水溶液における同様の組成のＵＣＳＴの一方のＵＣＳＴから他方のＵＣＳＴを概算値として求めてもよい。

本発明によれば、抗体や抗原等のリガンドが温度によって失活しない温度で長期保存しても分散状態が損なわれない、ＵＣＳＴを示す高分子の水溶液及び温度応答性粒子の水分散体を得ることができる。

また、本発明の手法によれば、水溶液の状態で所定のＵＣＳＴを示す高分子及びこの高分子で修飾された温度応答性粒子をＵＣＳＴ以下の温度で長期保存しても、ＵＣＳＴを示
す高分子を水溶液の状態で、またこの高分子で修飾された温度応答性粒子を水分散体の状態で長期に保存することができる。特に温度応答性粒子がリガンドを有する場合では、抗体や抗原等のリガンドが失活せずに前記温度応答性粒子を水分散体中に良好に分散させることができる。

温度応答性重合体１を０．１重量％で塩化ナトリウム水溶液に溶解した水溶液において塩化ナトリウムの濃度を代えたときの水溶液のＵＣＳＴと塩化ナトリウムの濃度との関係を示す図である。 各水分散体３〜７から回収されたタンパク質からＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたバンドの写真である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明では、温度応答性高分子を含有する温度応答性高分子の水溶液を、この水溶液を使用する条件で温度応答性高分子が有するＵＣＳＴ以下の保存温度で保存する。本発明では、水溶液に、ＵＣＳＴを下げる上限臨界溶液温度降下剤（ＵＣＳＴ降下剤）を、ＵＣＳＴを保存温度以下に下げる含有量で含有させて、ＵＣＳＴを保存温度以下に下げ、水溶液の状態での温度応答性高分子を保存する。

また本発明では、担体粒子及びこの担体粒子に担持される温度応答性高分子を有する温度応答性粒子を含有する温度応答性粒子の水分散体を、この水分散体を使用する条件で温度応答性高分子による温度応答性粒子が有する上限臨界溶液温度以下の保存温度で保存する。本発明では、水分散体に、ＵＣＳＴを下げるＵＣＳＴ降下剤を、ＵＣＳＴを保存温度以下に下げる含有量で含有させて、ＵＣＳＴを保存温度以下に下げ、水分散体の状態での温度応答性粒子を保存する。

前記温度応答性高分子には、温度応答性高分子の水溶液の組成でＵＣＳＴを示す高分子を用いることができる。前記温度応答性高分子は一種の高分子であってもよいし二種以上の高分子であってもよい。

さらに前記温度応答性高分子には、温度応答性高分子が凝集した状態でその含有水を長期間（例えば一か月間）保存したときには、上限臨界溶液温度を超えた温度でも水に溶解しきらない高分子が存在するが、本発明ではこのような温度応答性高分子も、水中において長期安定した良好な状態で保存することができる。

前記温度応答性高分子としては、アクリロイルグリシンアミド、アクリロイルニペコタミド、及びアクリロイルアスパラギンアミドからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマーが利用できる。また、これらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーであってもよい。これらのモノマーと好適に共重合できるモノマーとしては、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクリロイルトリメチレンアミド、アクリロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクリロイルメチルウラシル、及びアクリロイルグルタミンアミド等が挙げられる。温度応答性高分子を共重合体とすると、共重合するモノマーの種類、割合を変えることでＵＣＳＴを制御できるため、使用温度に合わせたポリマー設計が可能である。

なかでも、Ｎ−アクリロイルグリシンアミド及びＮ−アクリロイルアスパラギンアミドの一方又は両方を主成分とするモノマーを重合又は共重合させてなる高分子は、共重合の
割合を変えることで約０℃から約３０℃の間でＵＣＳＴの制御が可能であるため、前記温度応答性高分子を固定化した本発明における温度応答性粒子に好適に用いることができ、好ましく、Ｎ−アクリロイルグリシンアミド及びＮ−アクリロイルアスパラギンアミドの一方又は両方を合わせて９０モル％以上含むモノマーを重合又は共重合させてなる高分子であることがより好ましい。

温度応答性高分子は、その分子量は特に限定されないが、重量平均分子量が１，０００〜１，０００，０００であることが好ましく、５，０００〜５００，０００であることがより好ましい。質量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａ
ｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって測定することができる。

前記温度応答性高分子は、上記モノマーを有機溶媒又は水に溶解し、不活性ガスで系中を置換したのち重合温度まで昇温し、有機溶媒中であればアゾビスイソブチロニトリル等のアゾ系開始剤、過酸化ベンゾイル等の過酸化物、水系であれば過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）等の重合開始剤を添加し、攪拌下加熱を続けることにより得ることができる。その後、貧溶媒中で再沈殿を行い、凝集したポリマーをろ取したり、得られた反応液をＵＣＳＴ以下の温度に冷却することで生成した温度応答性高分子を凝集させ、遠心により分離する等の手法で、製造した温度応答性高分子を精製することもできる。

前記温度応答性粒子は、担体粒子と、この担体粒子に担持される温度応答性高分子とを有する。担体粒子には、高分子によって被覆できる粒子状の担体を用いることができる。担体粒子には、用いる媒体、つまり水や有機溶媒に不溶であるものがよく、ガラスビーズ、シリカゲル、シリコーン等の無機高分子化合物、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリメチレンメタクリレート等の合成有機高分子化合物、セルロース、アガロース、デキストリン等の多糖類からなる有機化合物、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機等の複合体等が挙げられる。これらはアミノ基、アミノアルキル基、カルボキシル基、アシル基、水酸基等の官能基を導入したものであってもよい。

前記担体粒子が磁性粒子であると、温度応答性粒子の水分散体の温度をＵＣＳＴ以下にして温度応答性粒子を凝集させた後に磁力によって容易に捕集することが可能となり、水分散体中の目的物質の容易な回収、精製に利用することができるため、好ましい。さらに担体粒子が磁性粒子である場合では、温度応答性粒子の粒径が５０〜２００ｎｍであると、水分散体において凝集している温度応答性粒子のみを磁力によって捕集できることから好ましい。

このような磁性粒子は、例えば特表２００２−５１７０８５号公報等に開示された方法によって製造することができる。すなわち、鉄（II）化合物、又は鉄（II）化合物及び金属（II）化合物を含有する水溶液を、磁性酸化物の形成のために必要な酸化状態下に置き、溶液のｐＨを７以上に維持して、酸化鉄又はフェライト磁性体ナノ粒子を形成する方法である。また、前記磁性粒子は、金属（II）化合物含有の水溶液と鉄（III）含有の水溶
液をアルカリ性条件下で混合することによっても製造することができる。

あるいは前記磁性粒子は、磁性粒子とこれを被覆する有機化合物とから構成されていてもよい。このような磁性粒子における有機化合物には、例えば多価アルコールを用いることができ、このような磁性粒子は例えば多価アルコールとマグネタイトから製造することもできる。この多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し、鉄イオンと結合可能なアルコール構造体であれば、特に制限なく使用することができる。前記多価ア
ルコールには、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリン等が挙げられる。このような多価アルコール等の有機化合物で被覆された形態の磁性粒子は、例えば、特許文献３に開示されているような、デキストランを用いた磁性粒子の製造方法によって得ることができる。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシ基を有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も、有機化合物で被覆された形態の磁性粒子を製造する際の原料として使用できる。

このような多価アルコールを用いて調製された磁性粒子は、良好な分散性を有するように、その平均粒径が、０．９ｎｍ以上１，０００ｎｍ未満であることが好ましく、特に、磁性粒子表面にリガンドをさらに有する場合では、リガンドと目的物質との反応速度を高めるためには、平均粒径が２００ｎｍ以下であることが好ましく、磁力による捕集の速度を速めるためには５０ｎｍ以上が好ましい。

前記温度応答性粒子における前記担体粒子と前記温度応答性高分子との結合は、反応性の官能基を介して結合する方法や、磁性粒子中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入し、温度応答性高分子を磁性粒子にグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の（例えば、ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５やＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．，Ｐａｒｔ−Ａ，３，ｐ１０３１，１
９６５に記載されている）方法で得られる。このようにして前記温度応答性粒子を得ることができる。

前記温度応答性粒子は、温度応答性高分子に担持されるリガンドをさらに有していてもよい。前記リガンドは、タンパク質等の種々の生体分子や微生物と相互に特異的に吸着する物質であり、リガンドには、ビオチン、アビジン、グルタチオン、レクチン、及び抗体等が挙げられ、温度応答性高分子によるリガンドの担持は、例えば特許文献３に記載されている方法及び通常行われている方法によって行うことができる。

前記温度応答性高分子の水溶液、又は前記温度応答性粒子の水分散体の保存温度は、ＵＣＳＴ以下の温度であればよい。保存温度は、温度応答性高分子及び温度応答性粒子の用途や、温度応答性粒子が有するリガンドの種類等の条件に応じて決めることができる。例えば前記用途が生体試料からの生体分子又は微生物の分離、精製である場合や、温度応答性粒子がリガンドを有する場合では、これらの目的物質やリガンドに対する温度による変質を防止する観点から２〜６℃であることが好ましい。

本発明では、前記水溶液又は前記水分散体に、ＵＣＳＴを下げるＵＣＳＴ降下剤を、ＵＣＳＴを保存温度以下に下げる含有量で含有させて、ＵＣＳＴを保存温度以下に下げる。ＵＣＳＴ降下剤には、水溶性の塩や水溶性の有機溶媒を用いることができる。ＵＳＣＴ降下剤は、ＵＣＳＴを低下させることができる塩又は有機溶媒であればよく、ＵＣＳＴ降下剤の種類やその含有量は、温度応答性高分子の種類、及び保存温度等の条件によって決められる。

例えば、前記温度応答性高分子がＮ−アクリロイルグリシンアミド及びＮ−アクリロイルアスパラギンアミドの一方又は両方を主成分とするモノマーを重合又は共重合させてなる高分子である場合では、上限臨界溶液温度降下剤には、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化リチウム、及びジメチルスルホキシド等が挙げられる。

なかでも塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、及び塩化リチウムは、ＵＣＳＴを大きく低下させることができるため好ましく用いることができる。これら塩の溶液は酸やアルカリ等により中和して用いても良く、緩衝液等に溶解して用いてもよい。

前記ＵＣＳＴ降下剤の含有量は、水溶液又は水分散体のＵＣＳＴを保存温度以下に下げることができる量であればよく、温度応答性高分子の種類、保存温度、及びＵＣＳＴ降下剤の種類等の条件によって決められる。

例えば塩濃度としては、概ね３００ｍＭ以上５Ｍ以下が好ましく、ＵＣＳＴを保存温度より大きく低下又は消失させて温度応答性高分子の凝集又は温度応答性粒子の凝集をより押さえるためには４５０ｍＭ以上が好ましく、タンパク質等のリガンドの安定性の観点からでは２Ｍ以下が好ましい。

例えば、前記温度応答性高分子がＮ−アクリロイルグリシンアミド及びＮ−アクリロイルアスパラギンアミドの一方又は両方を主成分とするモノマーを重合又は共重合させてなる高分子であり、前記保存温度が２〜６℃であり、前記上限臨界溶液温度降下剤が、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、又は塩化リチウムである場合では、ＵＳＣＴの含有量は、水溶液又は水分散体に対して１，０００ｍＭ以上の濃度であることが好ましく、さらには上限臨界溶液温度降下剤が塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、又は硫酸マグネシウムである場合では、ＵＣＳＴ降下剤の含有量は、水溶液又は水分散体に対して４５０ｍＭ以上の濃度であることが好ましい。

また例えば、前記温度応答性高分子がＮ−アクリロイルグリシンアミド及びＮ−アクリロイルアスパラギンアミドの一方又は両方を主成分とするモノマーを重合又は共重合させてなる高分子であり、前記保存温度が２〜６℃であり、前記上限臨界溶液温度降下剤がジメチルスルホキシドである場合では、ＵＳＣＴの含有量は、水溶液又は水分散体に対して６０体積％以上の濃度であることが好ましく、タンパク質等のリガンドの安定性の観点からでは９０体積％以下が好ましい。

本発明における温度応答性高分子の水溶液には、より具体的には、Ｎ−アクリロイルグリシンアミド及びＮ−アクリロイルアスパラギンアミドの一方又は両方を合わせて９０モル％以上含むモノマーを重合又は共重合させてなる高分子と；水と；４５０ｍＭ以上の塩化ナトリウム、４５０ｍＭ以上の硝酸ナトリウム、４５０ｍＭ以上の硫酸マグネシウム、１，０００ｍＭ以上の塩化リチウム、又は６０体積％以上のジメチルスルホキシドと；を含有する温度応答性高分子の水溶液が挙げられる。

また本発明における温度応答性高分子の水分散体には、より具体的には、担体粒子及びこの担体粒子に担持されるＮ−アクリロイルグリシンアミド及びＮ−アクリロイルアスパラギンアミドの一方又は両方を合わせて９０モル％以上含むモノマーを重合又は共重合させてなる高分子を有する温度応答性粒子と；水と；４５０ｍＭ以上の塩化ナトリウム、４５０ｍＭ以上の硝酸ナトリウム、４５０ｍＭ以上の硫酸マグネシウム、１，０００ｍＭ以上の塩化リチウム、又は６０体積％以上のジメチルスルホキシドと；を含有する温度応答性粒子の水分散体が挙げられる。

前記担体粒子は磁性粒子であることが好ましく、温度応答性粒子の粒径が５０〜２００ｎｍであることがより好ましく、温度応答性粒子が、前記Ｎ−アクリロイルグリシンアミド及びＮ−アクリロイルアスパラギンアミドの一方又は両方を合わせて９０モル％以上含むモノマーを重合又は共重合させてなる高分子に担持されるリガンドをさらに有することがさらに好ましい。

また前記温度応答性高分子の水溶液及び前記温度応答性粒子の水分散体は、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、又は塩化リチウムの濃度が５Ｍ以下であることが好ましい。

前述の温度応答性高分子の水溶液及び温度応答性粒子の水分散体では、ＵＣＳＴ以下の保存温度において、温度応答性高分子が溶解した状態で、又は温度応答性粒子が分散した状態で保存される。このため、水溶液の状態で温度応答性高分子を、又は水分散体の状態で温度応答性粒子を保存温度において長期にわたって保存したときに、この水溶液又は水分散体を上限臨界溶液温度に加温しても、温度応答性高分子が溶解しきらない、又は温度応答性粒子が分散しきらない、等の長期保存に係る溶解性又は分散性の悪化を防止することができる。

本発明において、前記温度応答性高分子の水溶液又は前記温度応答性粒子の水分散体には、ＵＣＳＴ降下剤によるＵＣＳＴの降下、及び温度応答性高分子の溶解性又は温度応答性粒子の分散性に悪影響を及ぼさない範囲で、添加剤をさらに含有させることができる。このような添加剤は、温度応答性高分子や温度応答性粒子の用途に応じて決めることができ、例えば生体試料の分離、精製の用途であれば、添加剤には、酸、アルカリ、ｐＨ緩衝液、水溶性の有機溶剤等が挙げられる。

なお、保存温度で保存した本発明における温度応答性高分子の水溶液又は温度応答性粒子の水分散体は、そのまま利用してもよいし、ＵＣＳＴより高い温度に加温した後に利用してもよいし、ＵＣＳＴ降下剤の濃度を下げて保存温度よりも高いＵＣＳＴに戻すために精製水等の水で希釈して用いてもよい。担体粒子として磁性粒子を有する温度応答性粒子の水分散体を水で希釈した場合では、希釈した前記水溶液又は水分散体を再びＵＣＳＴ以下に冷却し、水分散体から温度応答性粒子を凝集させ、凝集した温度応答性粒子を磁石等の磁力発生手段を用いて捕集し、残存した塩や溶媒を除去し、必要な緩衝溶液等で置換することもできる。

本発明では、保存時にＵＣＳＴを有する高分子溶液及びＵＣＳＴを有する高分子で修飾された粒子分散体のＵＣＳＴを保存温度以下にすること、又はＵＣＳＴを消失させることが特徴である。ＵＣＳＴは水溶液中で測定するが、ＵＣＳＴは、水溶液が液体状態を示す凝固点以上沸点以下の温度で測定が可能である。従ってＵＣＳＴが水溶液の凝固点以下又は水溶液の沸点以上の場合は、見かけ上ＵＣＳＴが消失する。本発明ではこのようなＵＣＳＴが消失する条件も好適に用いることができる。

以下実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
窒素ガス導入装置、温度計、及び攪拌装置を付した２００ｍＬの三口フラスコに、Ｎ−アクリロイルグリシンアミド４ｇ、Ｎ−アクリロイルアスパラギンアミド２ｇ及び１００ｍＬのミリＱ水（ミリポア社製Ｄｉｒｅｃｔ−Ｑで精製された超純水）を入れ、窒素を３０分間バブリングし、溶存酸素を除いた。ここにペルオキソ二硫酸アンモニウム０．６ｇ及びＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド０．４ｍＬを投入し、室温で５時間反応させた。反応終了後、分画分子量１，０００の透析膜を用い精製を行った。得られた精製物を凍結乾燥させ、Ｎ−アクリロイルグリシンアミド−Ｎ−アクリロイルアスパラギンアミド共重合体（以下、「温度応答性重合体１」と言う）を得た。収量３．５ｇ。

上記温度応答性重合体１を０．１重量％で塩化ナトリウム水溶液に溶解し、塩化ナトリウムの濃度を代えた各種水溶液を作製し、これらの水溶液のＵＣＳＴを測定した。測定結果を図１に示す。図１に示すように、水溶液中の塩化ナトリウムの濃度が上昇するに従いＵＣＳＴは低下し、塩化ナトリウム濃度が３５０ｍＭを超えるとＵＣＳＴは４℃以下になることがわかった。つまり温度応答性重合体１の水溶液を４℃で保存する場合、塩化ナト
リウム濃度を３５０ｍＭ以上にすることで、温度応答性重合体１を水溶液中で凝集させずに、透明な状態で保存できることがわかった。

温度応答性重合体１を用いて、温度応答性重合体１を０．１重量％で６００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液に溶解した水溶液を常温で調製した。調製時における水溶液の外観は透明であった。この水溶液を４℃の冷蔵庫で１か月間保存したが、水溶液は透明なままであった。この水溶液を精製水で４倍に希釈して塩化ナトリウムの濃度を１５０ｍＭとし、氷水で冷却すると温度応答性重合体１が凝集し、１０℃以上に加温すると、再び透明な水溶液になった。

比較例１
実施例１で得た温度応答性重合体１を用いて、温度応答性重合体１を０．１重量％で１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液に溶解した水溶液を常温で調製した。調製時における水溶液の外観は透明であった。この水溶液を４℃に冷却すると温度応答性重合体１が凝集した。さらに４℃の冷蔵庫で１か月間保存したが、温度応答性重合体１は凝集し、析出したままであった。この水溶液を１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液で４倍に希釈して１０℃以上に加温しても、温度応答性重合体１は完全には溶解せず、濁りが見られた。

以上より、６００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液中で４℃保存した温度応答性重合体１は、塩化ナトリウムの濃度を１５０ｍＭに希釈しても水溶液中に良好に再溶解が可能であった。一方、１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液中で４℃保存した温度応答性重合体１は、完全には溶解せず、水溶液の温度をＵＣＳＴ以上の温度に戻しても濁りが見られた。

実施例２
実施例１で得た温度応答性重合体１を用いて、表１及び表２に示すような各種塩濃度及び溶媒濃度の溶液を常温で作製し、実施例１と同様に、常温で作製した水溶液を４℃で一か月間保存し、塩濃度を１５０ｍＭ、又は溶媒濃度を２０体積％に調整した後、１０℃に加温して再分散させる方法でポリマーの安定性を調べた。なお、下記表１及び表２において、再分散性が「良好」とは、１０℃に加温した水溶液の外観が透明であったことを示す。

表１及び表２に示すように、高濃度の塩又は溶媒を添加しＵＣＳＴを保存温度以下にせしめて透明な分散状態で保存することにより、長期低温保存後も、水溶液の外観が透明である、水溶液中での分散性の良好な状態での温度応答性重合体を得ることができた。

実施例３
Ｎ−アクリロイルグリシンアミド７５ｍｇ、Ｎ−アクリロイルアスパラギンアミド３６ｍｇ及びＮ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミド０．７ｍｇを用い、特許文献３に記載の手法により、マグネタイト−デキストラン複合体に修飾した、上限臨界
溶液温度を７℃に有する温度応答性磁性粒子１を調製した。より詳しくは、５０ｍＬの三口フラスコに、Ｎ−アクリロイルグリシンアミド７５ｍｇ、Ｎ−アクリロイルアスパラギンアミド３６ｍｇ及びＮ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミド０．７ｍｇ、マグネタイト−デキストラン複合体（４０ｎｍ）の２重量％水溶液１ｍＬを入れ、蒸留水で２０ｍＬに調節した。この溶液を窒素置換した後、更に０．２Ｍ硝酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）硝酸溶液２００μＬを添加し、２時間攪拌し、反応を進行させることで、温度応答性磁性粒子１を得た。

前記マグネタイト−デキストラン複合体は以下の方法で行った。
１００ｍＬ容のフラスコに、塩化第二鉄・六水和物（１．０ｍｏｌ）及び塩化第一鉄・四水和物（０．５ｍｏｌ）混合水溶液を３ｍＬ、多価アルコールであるデキストラン（和光純薬社製、分子量３２，０００〜４０，０００）の１０重量％水溶液６０ｍＬを入れ、メカニカルスターラーで攪拌し、この混合溶液を５０℃に昇温した後、これに２５重量％アンモニア溶液５．０ｍＬを滴下し、１時間程度攪拌した。この操作で、平均粒径が約４０ｎｍのデキストランが固定された磁性粒子が得られた。

得られた温度応答性磁性粒子１の平均粒径は、大塚電子株式会社製レーザーゼータ電位計ＥＬＳ−８０００で測定したところ、約１１０ｎｍであった。

上記で得た温度応答性磁性粒子１を用いて、温度応答性磁性粒子１を１．６重量％で６００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液に分散させた水分散体１を常温で調製した。調製時における水分散体１の外観は透明な褐色の水溶液であった。この水分散体１を４℃の冷蔵庫で１か月間保存したが、水分散体１は透明なままであった。この水分散体１を精製水で４倍に希釈して水分散体１中の塩化ナトリウムの濃度を１５０ｍＭとし、水分散体１を氷水で冷却すると温度応答性磁性粒子１が凝集し、水分散体１を１０℃以上に加温すると、再び透明になった。

比較例２
実施例３で得た温度応答性磁性粒子１を用いて、温度応答性磁性粒子１を０．４重量％で１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液に分散させた水分散体２を常温で調製した。調製時における水分散体２の外観は透明な褐色の水溶液であった。この水分散体２を４℃に冷却すると温度応答性磁性粒子１が凝集し、析出した。さらに４℃の冷蔵庫で１か月間保存したが、温度応答性磁性粒子１は凝集したままであった。この水分散体２を１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液で４倍に希釈し１０℃以上に加温しても、温度応答性磁性粒子１は完全には分散せず、水分散体２には濁りが見られた。

以上より、６００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液中で４℃で保存した温度応答性粒子は、その後に塩化ナトリウムの濃度を１５０ｍＭに希釈した水分散体中でも良好に分散していた。一方、１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液中で４℃で保存した温度応答性粒子は、完全には分散せず、水分散体の温度をＵＣＳＴ以上の温度に戻しても濁りが見られた。

実施例４
実施例３で得た温度応答性磁性粒子１に、特許文献３に記載の手法を用いて、アビジンを導入した温度応答性磁性粒子３を得た。より詳しくは、前記温度応答性磁性粒子１の０．１重量％水溶液５０μＬを１．５ｍＬエッペンドルフチューブにとり、さらに１ｇ／Ｌのアビジン溶液５０μＬをチューブに加え、４０℃で２０分間混合した。その後、チューブを氷水中で冷却し、生成した微粒子を凝集させ、磁石で回収し、上清部分と分離した。凝集部分にバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）２００μＬを加え、生成した微粒子を加温して分散させ、再度冷却して凝集させ、凝集塊に混入した成分を洗浄し取り除いた。この操作を４回繰
り返して温度応答性磁性粒子３を得た。得られた温度応答性磁性粒子３の粒径は、実施例３と同様に測定したところ、１５０ｎｍであった。

上記で得た温度応答性磁性粒子３を用いて、温度応答性磁性粒子３を１．２重量％で４５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液に分散させた水分散体３、温度応答性磁性粒子３を１．６重量％で６００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液に分散させた水分散体４、及び温度応答性磁性粒子３を２．０重量％で７５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液に分散させた水分散体５をそれぞれ調製した。調製時におけるこれらの水分散体３〜５の外観は、それぞれ透明な褐色の水溶液であった。これらの水分散体３〜５を４℃の冷蔵庫で１か月間保存したが、水分散体３〜５は透明なままであった。保存後に、水分散体３を精製水で３倍に希釈し、水分散体４を精製水で４倍に希釈し、水分散体５を精製水で５倍に希釈して、それぞれ塩化ナトリウム濃度を１５０ｍＭとし、氷水で冷却すると、各水分散体において温度応答性磁性粒子３が凝集し、１０℃以上に加温すると、再び透明な溶液になった。

また、温度応答性磁性粒子３を１．２重量％で６０体積％ジメチルスルホキシド水溶液に分散させた水分散体６、及び温度応答性磁性粒子３を１．８重量％で９０体積％ジメチルスルホキシド水溶液に分散させた水分散体７をそれぞれ調整した。これらの水分散体６及び７を４℃の冷蔵庫で１か月間保存したが、水分散体６及び７は透明なままであった。保存後に、水分散体６を精製水で３倍に希釈し、水分散体７を精製水で４．５倍に希釈し、それぞれジメチルスルホキシドの濃度を２０体積％とし、氷水で冷却すると、各水分散体において温度応答性磁性粒子３が析出し、１０℃以上に加温すると、再び透明な溶液になった。

実施例５
４℃で１か月間保存後の水分散体３〜７を用いて、水分散体３〜７における温度応答性磁性粒子３の濃度を０．１重量％に調整し、特許文献３に記載の手法を用いてビオチン化抗ＩｇＧの回収実験を行った。また水分散体３と同じ条件で新たに水分散体を調整し、調製直後の水分散体としてこの回収実験に用いた。より詳しくは、この微粒子の０．１重量％水溶液５μＬを１．５ｍＬエッペンドルフチューブに取り、１ｇ／Ｌビオチン化抗ＩｇＧ（商品名:Anti-IgG (Fc), Rabbit, Goat-Poly, Biotin、ロックランド社製）１０μＬ
を添加し、４０℃で２０分間混合後、４℃に冷却し、得られたビオチン化抗ＩｇＧ結合−温度応答性磁性粒子３を凝集させ、磁石で回収し、不純物を除去した。その後、バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）を添加し、同様に凝集、分散を繰り返し、前記粒子を洗浄してビオチン化抗ＩｇＧを回収した。

各水分散体から回収された温度応答性磁性粒子３に結合しているタンパク質の抽出液を用い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によってタンパク質を分離し、クーマシーブリリアントブルー染色液で染色、脱色した後のバンドを図２に示す。図２中、レーン１は水分散体３、レーン２は水分散体４、レーン３は水分散体５、レーン４は水分散体６、レーン５は水分散体７、レーン６は調製直後の水分散体のバンドを表し、「ＩｇＧ（Ｌ）」は抗体の軽鎖を表し、「ＩｇＧ（Ｈ）」は抗体の重鎖を表している。

また図２中、「Ｍａｒｋｅｒ」は市販のビオチン化抗ＩｇＧ（商品名:Anti-IgG (Fc), Rabbit, Goat-Poly, Biotin、ロックランド社製）を表し、Ｍａｒｋｅｒのレーンの数字
はＭａｒｋｅｒの量（μｇ）を表している。Ｍａｒｋｅｒのレーンは、Ｍａｒｋｅｒの各使用量におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる前記のバンドを示している。さらに「ＢＳＡ」は牛血清アルブミンを表している。

その結果から明らかなように、どの水分散体においても、アビジンの失活はみられず、調製直後の活性を維持していた。

Claims (7)

1. Ｎ−アクリロイルグリシンアミド及びＮ−アクリロイルアスパラギンアミドの一方又は両方を合わせて９０モル％以上含むモノマーを重合又は共重合させてなる高分子と；水と；４５０ｍＭ以上の塩化ナトリウム、４５０ｍＭ以上の硝酸ナトリウム、４５０ｍＭ以上の硫酸マグネシウム、１，０００ｍＭ以上の塩化リチウム、又は６０体積％以上のジメチルスルホキシドと；を含有する温度応答性高分子の保存用の水溶液。
2. 塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、又は塩化リチウムの濃度が５Ｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の水溶液。
3. 担体粒子及びこの担体粒子に担持されるＮ−アクリロイルグリシンアミド及びＮ−アクリロイルアスパラギンアミドの一方又は両方を合わせて９０モル％以上含むモノマーを重合又は共重合させてなる高分子を有する温度応答性粒子と；水と；４５０ｍＭ以上の塩化ナトリウム、４５０ｍＭ以上の硝酸ナトリウム、４５０ｍＭ以上の硫酸マグネシウム、１，０００ｍＭ以上の塩化リチウム、又は６０体積％以上のジメチルスルホキシドと；を含有する温度応答性粒子の保存用の水分散体。
4. 前記担体粒子は磁性粒子であることを特徴とする請求項３に記載の水分散体。
5. 前記温度応答性粒子の粒径が５０〜２００ｎｍであることを特徴とする請求項４に記載の水分散体。
6. 前記温度応答性粒子は、Ｎ−アクリロイルグリシンアミド及びＮ−アクリロイルアスパラギンアミドの一方又は両方を合わせて９０モル％以上含むモノマーを重合又は共重合させてなる高分子に担持されるリガンドをさらに有することを特徴とする請求項４又は５に記載の水分散体。
7. 塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、又は塩化リチウムの濃度が５Ｍ以下であることを特徴とする請求項３〜６のいずれか一項に記載の水分散体。

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