JP5433825B2 - ウイルス特異的ctlの製造方法 - Google Patents
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Description
造血幹細胞移植は、白血病などの造血器腫瘍への適用にとどまらず、一部の固形腫瘍や代謝疾患にもその適用が広がっている。移植される幹細胞の起源は、HLA適合ドナーのみならず、骨髄バンク・臍帯血バンクやHLA不適合ドナーといった代替ドナーからの幹細胞を使用した症例数も増加している。これら代替ドナーからの移植のときには、移植患者に対して強力な免疫抑制治療を施すので、日和見感染症のリスクが高くなる。特に、HCMVの再活性化は移植患者のほぼ全例にみられるので、HCMV感染症の制御は移植手術後の大きな問題点のひとつである。ガンシクロビルは優れた抗ウイルス剤であり、HCMV感染症にも汎用されているが、頻回投与による副作用が度々問題となる。このため、HCMVを安全にかつ有効に制御する新しい方法が強く望まれている。
(1)HCMV特異的CTLを誘導させるために、抗原提示細胞の調製を必要とする。抗原提示細胞としては、樹状細胞が使われることが多いが、樹状細胞の調製は煩雑で費用が嵩む。
(2)誘導したHCMV特異的CTLをさらに増殖させる場合に、樹状細胞が使われる(非特許文献5)。このため、上記(1)と同様の問題が生じる。また、増殖において使用する樹状細胞を調製するため、再度ドナーから採血する必要がある。更に、増殖時には誘導時に比べて、多数の樹状細胞が必要となることからドナーにかかる負担が大きい。
また、非常に効率の良い増殖法としてREM法が知られている。REM法は大量の末梢血単核球と、EBV-LCLを必要とすることから、事業化において現実的な方法ではない。
(4)誘導、増殖したHCMV特異的CTLの純度を高めるための方法として、MHC-tetramerを使ったHCMV特異的CTL単離法が一般化している(非特許文献3)。MHC-tetramerは、大腸菌由来の蛋白質を用いて作られるので、安全面での問題があることに加え、CTLの生存率が低下するという問題点がある(非特許文献4)。
また、純度を高めるための究極の手段として、HCMV特異的CTLのクローニングを行うことも報告されている。しかし、現在のところ、作業の効率、費用面から、この方法を事業化することは現実的ではない。
(6)日本人に多いHLA-A24に拘束性のHCMV特異的CTLについては、臨床応用に向けた体外での調製方法に関する報告はなされていない。HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLが末梢血中に含まれる数は、欧米人に多いHLA-A2拘束性HCMV特異的CTLのそれに比べると百分の一程度である。これは、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLの体外での誘導、増殖が困難であることの理由のひとつと考えられる。従って、日本においては、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLを体外で調製する方法を工夫する必要がある。
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ウイルス(特に、HCMV)特異的CTLによる細胞治療の実用化を実現するため、簡便性と安全性を兼ね備え、しかも低コストで実施可能なウイルス特異的CTLの閉鎖系培養システムの提供することである。
すなわち、本発明に係るHCMV特異的CTLの調製方法は、以下の通りである。
下記(1)〜(3)は、CTLの誘導工程に関するものである。
(1)HTLV-1、インフルエンザ、アデノウィルス、エイズウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルス、及びヒトサイトメガロウイルス(HCMV)からなる群から選択される一つのウイルス(特に、HCMV)特異的CTLを誘導する方法であって、末梢血単核球とウイルス特異的CTLエピトープペプチドを混合培養することを特徴とする誘導方法。
(2)前記混合培養において、エピトープペプチドの培地中での終濃度が0.01μg/mL-10μg/mLであることを特徴とする上記(1)に記載の誘導方法。このとき、ウイルスがHCMVである場合には、HLA-A2拘束性エピトープであるNLVPMVATV(配列番号1)では0.05μg/mL-2μg/mL、HLA-A24拘束性エピトープであるQYDPVAALF(配列番号2)では0.2μg/mL-5μg/mLであることが好ましい。
下記(4)〜(10)は、CTLの単離工程に関するものである。
(4)ウイルス特異的CTLを単離する方法であって、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の誘導方法、またはその他の方法で誘導されたウイルス特異的CTLを、誘導に用いたエピトープペプチドと同じエピトープペプチドと培地中で接触させることにより再刺激後、新たに発現するCD137抗原を標的として、ウイルス特異的CTLを単離することを特徴とする単離方法。
(5)ウイルス特異的CTLを単離する方法であって、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の誘導方法、またはその他の方法で誘導されたウイルス特異的CTLを、誘導に用いたエピトープペプチドと同じエピトープペプチドを提示した抗原提示細胞と培地中で接触させることにより再刺激後、新たに発現するCD137抗原を標的として、ウイルス特異的CTLを単離することを特徴とするウイルス特異的CTLの単離方法。
(6)ウイルス特異的CTLを単離する方法であって、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の誘導方法、またはその他の方法で誘導されたウイルス特異的CTLを、誘導に用いたエピトープペプチドと同じエピトープペプチドと複合体を形成するMHC分子と培地中で接触させることにより再刺激後、新たに発現するCD137抗原を標的として、ウイルス特異的CTLを単離することを特徴とするウイルス特異的CTLの単離方法。
(7)前記再刺激に用いるエピトープペプチドの培地中での終濃度が0.1ng/mL-1000ng/mLであることを特徴とする上記(4)〜(6)に記載の単離方法。このとき、ウイルスがHCMVである場合には、1ng/mL-10ng/mLであることが好ましい。
(9)CD137抗原を標的とする際に、磁気標識した抗CD137抗体を用いることを特徴とする上記(4)〜(8)のいずれかに記載の単離方法。
(10)CD137抗原を標的とする際に、抗CD137抗体を感作した固相を用いることを特徴とする上記(4)〜(8)のいずれかに記載の単離方法。
また、上記(1)〜(3)の誘導方法、および(4)〜(10)の単離方法については、ウイルス特異的CTLとは、ウイルス特異的CD8+CTLに加えて、ウイルス特異的CD4+T細胞も含まれる。
下記(11)〜(13)は、CTLの増殖工程に関するものである。
(11)ウイルス特異的CTLの増殖方法であって、OKT3(抗CD3モノクローナル抗体)を用いて末梢血単核球から増殖させたT細胞と、上記(1)〜(3)のいずれかにおいて誘導の際用いたエピトープペプチドと同じエピトープペプチドとを培地中で接触させた後に、このT細胞と、上記(4)〜(10)のいずれかに記載の単離方法で単離したウイルス特異的CTLまたは(1)〜(3)のいずれかに記載の誘導方法で誘導したウイルス特異的CTLとを共培養することを特徴とするウイルス特異的CTLの増殖方法。
(a)培地中に加えるエピトープペプチドの終濃度; 0.0001μg/mL〜10μg/mL
(b)接触時間;30分間〜60分間
(c)培養温度;18℃〜25℃
(d)培地;血清、血漿など蛋白成分を含まないRPMI1640。
(13)上記(11)において、以下の共培養条件を特徴とする増殖方法。
(e)ウイルス特異的CTL:OKT3を用いて増殖させたT細胞の混合比;10:1〜1:3
(f)培地組成 共培養開始後1日目-3日目まで;RPMI1640(5%〜10%自己血漿、10 IU/mL〜50 IU/mL IL-2)またはRPMI1640(5%〜10%自己血漿、10ng/mL IL-15)、共培養開始後1日目−3日目以降;ALyS505N(100 IU/mL〜1000 IU/mL IL-2、0.1%〜1%自己血漿)またはALyS505N(10ng/mL IL-15、0.1%〜1%自己血漿)。
(15)上記(4)〜(10)のいずれかに記載の単離方法によりウイルス特異的CTLを単離する工程を含むウイルス特異的CTLの製造方法。
(16)上記(11)〜(13)のいずれかに記載の増殖方法によりウイルス特異的CTLを増殖する工程を含むウイルス特異的CTLの製造方法。
(17)上記(1)〜(3)のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの誘導方法、上記(4)〜(10)のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの単離方法、上記(11)〜(14)のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの増殖方法をそれぞれ組み合わせることを特徴とするウイルス特異的CTLの製造方法。
(18)上記(14)〜(17)のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの製造方法によって製造されたウイルス特異的CTL。
(20)上記(19)に記載のウイルス感染症の治療剤及び/または予防剤を用いることを特徴とするウイルス感染症の治療方法及び/または予防方法。
(21)CTLの免疫応答能の検査方法であって、培地中で、(a)CTLエピトープペプチド、このCTLエピトープペプチドを提示した抗原提示細胞、または前記CTLエピトープペプチドと複合体を形成するMHC分子からなる群から選択される少なくとも一つの成分と、(b)被験者から採取したリンパ球または培養中のCTLとを接触させながら共培養した後、前記リンパ球またはCTL上に新たに発現するCD137分子を検出することにより免疫応答能を判断することを特徴とする検査方法。
なお、上記については、ウイルスのエピトープペプチドに対して応用できる製造方法等を説明したが、本発明に関する技術は、その他のペプチド(例えば、腫瘍抗原)についても応用できる。
本発明によれば、安全で効果的なウイルス特異的CTLによるウイルス予防薬、治療薬、及び、これを簡便で安価に調製する技術を提供することができる。
以下、本発明の実施形態については、ウイルスの代表としてHCMVを例にとって説明するが、その他のウイルス(HTLV-1、インフルエンザ、アデノウィルス、エイズウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルス)についても同様に実施することができる。CTLの製造について、(1)HCMV特異的CTLの誘導工程、(2)HCMV特異的CTLの単離工程、および(3)HCMV特異的CTLの増殖工程の三つに分けて説明する。
本実施形態におけるHCMV特異的CTLの誘導方法(以下、「本実施形態の誘導方法」という。)では、末梢血単核球とHCMV特異的CTLエピトープペプチドを血漿を含む培地中で接触させながら培養する。「CTLエピトープペプチド」とは、隣接するアミノ酸残基のα-アミノ基とカルボキシル基間のペプチド結合により相互に結合した線状のアミノ酸の分子鎖であって、ヒト白血球抗原(human leucocyte antigen、以下「HLA」という。)クラスI分子と複合体を形成し、HCMV特異的CTL上に発現するT細胞レセプターと結合性を有するペプチドを意味する。T細胞に対する抗原提示は、抗原提示細胞上に発現するMHCとペプチドとの複合体(以下、「MHC-ペプチド複合体」という)がT細胞受容体(TCR)に認識され、かつ抗原提示細胞上のB7-1、B7-2等の補助分子がT細胞側の補助分子であるCD28等と結合することによってなされる。本実施形態の誘導方法においては、末梢血単核球に含まれる単球、B細胞、微量に含まれる樹状細胞等の膜表面上に発現するHLAクラスI分子とCTLエピトープペプチドが複合体を形成し、抗原提示細胞として機能するものと考えられる。
次に、本実施形態における誘導方法において、培養条件の詳細を説明する。基礎培地としては、5%〜10%自己血漿を含むRPMI1640, AIM-Vまたはダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's modified eagle medium)が望ましく、末梢血単核球と該CTLエピトープペプチドを混合2日後に終濃度が10 IU/mLになるようにIL-2を加え、その後、2-3日おきにIL-2の濃度を2倍づつ高めながら前記培地を用いると尚効果的である。培養中の炭酸ガス濃度、温度及び培養日数はそれぞれ5%、37℃、14-21日間が好ましい。また、細胞濃度としては、106〜2x106個/mLが好ましい。さらに細胞同士を密着させながら培養することが効率的な抗原提示にとって重要であり、そのためには、底がU字状となった培養容器中で培養することが好ましい。
CD137分子(4-1BB, ILAともいう)はKwon BSらにより同定された分子で、CTLの分化、増殖に関連し、TCRを介した刺激によりCTL上に選択的に発現することが知られている。従ってHCMV特異的CTLを含むT細胞集団にエピトープペプチドを加えることにより、培地中に含まれるT細胞上には、HLAクラスI分子とエピトープペプチドから成る複合体が発現する。この複合体とHCMV特異的CTL上のTCRが接触し、HCMV特異的CTL上に選択的にCD137分子が発現する。このHCMV特異的CTLは、例えばCD137抗体をコートした磁性微粒子のように、CD137分子を認識する物質と反応させた後、適当な分離装置(例えば、磁気分離装置)を用いて、HCMV特異的CTLを単離することができる。
上記の工程を経ることにより、HCMV特異的CTLを誘導、単離、及び増殖することができる。次に、実施例を説明することにより、本発明を更に詳細に説明する。
なお、本実施例においては、HCMV特異的CTLとは、HCMV特異的CD8+CTLを意味している。
〔実施例1〕HCMV特異的CTLの誘導工程
HLA-A24分子保持者、またはHLA-A2保持者由来の末梢血より分離した末梢血単核球(PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cell)を5%自己血漿、2-メルカプトエタノール、L-グルタミン、抗生物質としてペニシリンとストレプトマイシンを含むHEPES緩衝RPMI1640培地(以下、「CTL誘導用培地」という)1mL中に細胞数が2x106個となるように縣濁させ、ポリプロピレン製14mLの丸底チューブ(Becton Dickinson社製)に1mL分注した。4μg/mLのHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLエピトープペプチドQYD(配列番号2:以下、「QYDペプチド」という)、若しくは2μg/mLのHLA-A2拘束性HCMV特異的CTLエピトープペプチドNLV(配列番号1:以下、「NLVペプチド」という)を含むCTL誘導用培地1 mLを添加後、2日間、5%CO2インキュベータ内において、37℃で培養した。その後、IL-2を10 IU/mLとなるように添加した後、3日おきに、培地1mLを、50 IU/mL のIL-2を含むCTL誘導用培地と入れ替えながら12日間、5% CO2インキュベータ内において、37℃で培養した。こうして、HCMV特異的CTLを誘導し、HCMV特異的CTLラインとした。
実施例1の方法によるHCMV特異的CTLの誘導効率を誘導前後のHCMV特異的CTLの数を比較することにより検討した。HCMV特異的CTLの数は培養中に含まれる総細胞数とHCMV特異的MHC-tetramerにより測定したHCMV特異的CTL陽性率を乗ずることにより算出した。HCMV特異的CTL陽性率のHCMV特異的MHC-tetramerによる測定は、以下のように行った。
測定に用いる細胞を、0.1%BSAを含むPBS(以下、「細胞洗浄緩衝液」という)で洗浄後、細胞濃度が2x106個/mLとなるように細胞洗浄緩衝液に縣濁させ、その100μLにフィコエリトリン(Phycoerythrin;以下「PE」という)を標識したHCMV特異的MHC-tetramer 10 μLとPC5標識したCD8モノクローナル抗体10μLを同時に混合させた後、4℃で30分間反応させた。PBSで2回洗浄後、細胞を500μLの細胞洗浄緩衝液に縣濁させ、フローサイトメーターを用いて測定した。
1.CD137モノクローナル抗体を感作した培養プレートによる単離
(1)CD137モノクローナル抗体感作培養プレートの作製
PBSで10 μg/mLに希釈したCD137モノクローナル抗体(クローン4B4)を6ウェルプレートに1 mL分注し、4℃で18時間、静置反応させた。抗体溶液をアスピレーターで除去後、5%ヒトアルブミンを含むPBSを2 mL分注し、37℃で1時間インキューベートし、抗体が感作された培養プレート表面をブロッキングした。PBSで3回プレート表面を洗浄した後、CD137モノクローナル抗体感作培養プレートとして用いた。
実施例1で誘導したHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLライン培養中にQYDペプチドを終濃度10 ng/mLで加え、18時間培養した。細胞の一部を採取し、HCMV特異的CTL上に選択にCD137が発現していることを確認するため、PC5標識CD137モノクローナル抗体とPE標識HCMV特異的MHC-tetramerを用いて二重染色を行い、フローサイトメーターにより解析した。図2に示すように、HCMV特異的CTL(MHC-tetramer 陽性細胞として示された細胞集団)上にCD137分子の選択的発現を認めた。
QYDペプチドにより再刺激したHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLラインを、CD137モノクローナル抗体を感作した培養プレートに移し、1時間、5% CO2インキュベータ内において、37℃で反応させ、CD137分子を発現したHCMV特異的CTLをCD137モノクローナル抗体を介して、培養プレート表面に接着させた。培養プレートを軽く揺らした後、ピペットを用いて、培養プレート表面に接着していない細胞を除去した。その後、0.5%ヒトアルブミンを含むHEPES緩衝RPMI培地で洗浄をゆっくりと1mL加え、軽く揺らした後、再度、ピペットを用いて、培養プレート表面に接着していない細胞を除去した。さらにこの操作を2回繰り返した後、50 IU/mL のIL-2 を含むCTL誘導用培地を1 mL加え、5% CO2インキュベータ内において、37℃で24時間培養した。さらにALyS505N-1000培地を1 mL 添加し、5% CO2インキュベータ内において、37℃で6日間培養した。
単離、及び培養したHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLを、106/mL の細胞濃度で細胞洗浄緩衝液に浮遊させ、その100μLにPEを標識したHCMV特異的MHC-tetramer 10μLとFITC標識したCD8モノクローナル抗体10μLを同時に混合させた後、4℃で30分間反応させた。PBSで2回洗浄後、細胞を500μLの細胞洗浄緩衝液に縣濁させ、フローサイトメーターを用いて測定した。
図2に示すように、単離前10.28%であったHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLの純度が、単離直後では56.03%に、また、培養一週間後97.14%に上昇した。また、単離直後において48.7%のHCMV特異的CTLが回収され、その後1週間の培養で、2.9倍に増殖した(表1)。
(1)CD137モノクローナル抗体を用いた単離
上記1(2)の方法に従い、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLラインをQYDペプチドにより再刺激した後、細胞洗浄緩衝液100μLに懸濁した後、100μg/mL CD137モノクローナル抗体(クローン4B4)を10μL加え、攪拌の後、室温で15分間反応させた。細胞洗浄緩衝液で2回洗浄し、細胞を0.5%ヒトアルブミン、2 mM EDTAを含むPBS(以下、「細胞分離緩衝液」という)80μLに細胞を懸濁させた後、抗マウスIgG結合マイクロ磁性ビーズ(ミルテニ社製)を20μL加え、攪拌後、4℃で15分間反応させた。細胞分離緩衝液で2回洗浄後、500μLの細胞分離緩衝液に懸濁させた後、細胞自動分離装置(AutoMACS:ミルテニ社製)を用いて、CD137陽性細胞、すなわちHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLを分離した。
HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLラインを細胞洗浄緩衝液100μLに懸濁した後、HCMV特異的HLA-A24-tetramer((株)ベックマンコールター社製)を10μL加え、攪拌の後、室温で15分間反応させた。細胞洗浄緩衝液で2回洗浄し、細胞を0.5%ヒトアルブミン、2 mM EDTAを含むPBS(以下細胞分離緩衝液という)80μLに細胞を懸濁させた後、抗PE抗体結合マイクロ磁性ビーズ(ミルテニ社製)を20μL加え、攪拌後、4℃で15分間反応させた。細胞分離緩衝液で2回洗浄後、500μLの細胞分離緩衝液に懸濁させた後、細胞自動分離装置(AutoMACS:ミルテニ社製)を用いて、HCMV特異的HLA-A24-tetramer陽性細胞、すなわちHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLを分離した。
図3に細胞自動分離装置を用いた単離の結果を示した。CD137モノクローナル抗体を用いた単離においては、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLの回収率74.1%、純度80.82%であった。一方、MHC-tetramer を用いた単離においては回収率34.0%、純度80.15%であった。純度については両者の間で差はみられなかったが、回収率の点ではCD137モノクローナル抗体を用いた方法が MHC-tetramer を用いた方法に比べて優れていた。
1.OKT3-T細胞の調製
HCMV特異的CTLの誘導の際に分離したPBMCの一部(2X106個)を1μg/mLの濃度でOKT3を含むCTL誘導用培地10mLに懸濁させ、5% CO2インキュベータ内で2日間、37℃で培養した。ALyS505N-1000培地を10 mL添加後、5% CO2インキュベータ内で12日間、37℃で培養し、OKT3-T細胞を得た。
上記1で調製したOKT3-T細胞107個を細胞洗浄緩衝液で2回洗浄の後、1 μg/mL HCMV特異的CTLエピトープペプチドを含む1 mL HEPES緩衝RPMI1640培地に懸濁させ、25℃で30分間反応させた。細胞洗浄緩衝液で2回洗浄し、HCMV抗原提示細胞とした。
3.HCMV抗原提示細胞との共培養によるHCMV特異的CTLの増殖
〔実施例3〕1に示した方法で単離したHLA-A24拘束性HCMV特異的CTL 4x106個を4 mL の50IU/mL IL-2を含むCTL誘導用培地に懸濁させ、上記2で調製したHCMV抗原提示細胞2x106個を添加した後、5% CO2インキュベータ内で24時間、37℃で培養した。ALyS505N-1000培地を4 mL加えた後、さらに8日間培養した。培養後、一部を採取し、総細胞数を血球計算版にて測定し、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLの割合を実施例2と同様に、フローサイトメーターにより計測した。また、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLの数は総細胞数とフローサイトメーターを用いて計測した割合を掛けることにより求めた。
図4には、増殖前後のフローサトメトリー像を示した。HCMV特異的CTLの割合は、増殖前98.5%、増殖後97.68%とほとんど変わらなかった。一方、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTL数は、4x106個から、4.1x107個とほぼ10倍に増殖した。
HCMV特異的CTLをヒトCMV患者に投与することにより、症状の改善が認められることが複数の論文によって示されている(例えば、非特許文献1、非特許文献3、BLOOD 2002;99:3916-3922)。HCMV特異的CTLは、HCMV感染細胞を特異的に認識し、かつ極めて強力な細胞傷害活性を有しているので、これを用いることにより、安全で効果的なHCMV特異的CTLによるHCMV予防薬、治療薬、及びこれを簡便で安価に調製する技術を提供することができる。
Claims (10)
- ウイルス特異的CTLを単離する方法であって、下記ウイルス特異的CLT誘導方法、すなわち、HTLV-1、インフルエンザ、アデノウィルス、エイズウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルス、及びヒトサイトメガロウイルスからなる群から選択される一つのウイルス特異的CTLを誘導する方法であって、末梢血単核球とウイルス特異的CTLエピトープペプチドを混合培養し、この混合培養において、エピトープペプチドの培地中での終濃度が0.01μg/mL-10μg/mLであり、前記混合培養に用いる培地として、5%-10%自己血漿を含むRPMI1640を用い、エピトープペプチドを添加後、2日後に終濃度が10 IU/mLとなるようにIL-2を加え、その後IL-2濃度を2-3日ごとに2倍づつ上げながら12日間-19日間培養することにより誘導されたウイルス特異的CTLを、誘導に用いたエピトープペプチドと同じエピトープペプチドと培地中で接触させることにより再刺激後、新たに発現するCD137抗原を標的として、ウイルス特異的CTLを単離することを特徴とするウイルス特異的CTLの単離方法。
- ウイルス特異的CTLを単離する方法であって、下記ウイルス特異的CLT誘導方法、すなわち、HTLV-1、インフルエンザ、アデノウィルス、エイズウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルス、及びヒトサイトメガロウイルスからなる群から選択される一つのウイルス特異的CTLを誘導する方法であって、末梢血単核球とウイルス特異的CTLエピトープペプチドを混合培養し、この混合培養において、エピトープペプチドの培地中での終濃度が0.01μg/mL-10μg/mLであり、前記混合培養に用いる培地として、5%-10%自己血漿を含むRPMI1640を用い、エピトープペプチドを添加後、2日後に終濃度が10 IU/mLとなるようにIL-2を加え、その後IL-2濃度を2-3日ごとに2倍づつ上げながら12日間-19日間培養することにより誘導されたウイルス特異的CTLを、誘導に用いたエピトープペプチドと同じエピトープペプチドを提示した抗原提示細胞と培地中で接触させることにより再刺激後、新たに発現するCD137抗原を標的として、ウイルス特異的CTLを単離することを特徴とするウイルス特異的CTLの単離方法。
- ウイルス特異的CTLを単離する方法であって、下記ウイルス特異的CLT誘導方法、すなわち、HTLV-1、インフルエンザ、アデノウィルス、エイズウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルス、及びヒトサイトメガロウイルスからなる群から選択される一つのウイルス特異的CTLを誘導する方法であって、末梢血単核球とウイルス特異的CTLエピトープペプチドを混合培養し、この混合培養において、エピトープペプチドの培地中での終濃度が0.01μg/mL-10μg/mLであり、前記混合培養に用いる培地として、5%-10%自己血漿を含むRPMI1640を用い、エピトープペプチドを添加後、2日後に終濃度が10 IU/mLとなるようにIL-2を加え、その後IL-2濃度を2-3日ごとに2倍づつ上げながら12日間-19日間培養することにより誘導されたウイルス特異的CTLを、誘導に用いたエピトープペプチドと同じエピトープペプチドと複合体を形成するMHC分子と培地中で接触させることにより再刺激後、新たに発現するCD137抗原を標的として、ウイルス特異的CTLを単離することを特徴とするウイルス特異的CTLの単離方法。
- 前記再刺激に用いるエピトープペプチドの培地中での終濃度が0.1ng/mL-1000ng/mLであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一つに記載のウイルス特異的CTLの単離方法。
- 前記再刺激は、5%-10%自己血漿と10 IU/mL〜50 IU/mLのIL-2または10ng/mL IL-15のいずれかとを含むRPMI1640培地中で8時間〜15時間に渡って行うことを特徴とする請求項1〜4のいずれか一つに記載のウイルス特異的CTLの単離方法。
- CD137抗原を標的とする際に、磁気標識した抗CD137抗体を用いることを特徴とする請求項1〜5のいずれか一つに記載のウイルス特異的CTLの単離方法。
- CD137抗原を標的とする際に、抗CD137抗体を感作した固相を用いることを特徴とする請求項1〜5のいずれか一つに記載のウイルス特異的CTLの単離方法。
- 請求項1〜7のいずれか一つに記載の単離方法によりウイルス特異的CTLを単離する工程を含むウイルス特異的CTLの製造方法。
- 請求項8に記載のウイルス特異的CTLの製造方法によって製造されたウイルス特異的CTL。
- 請求項8に記載のウイルス特異的CTLの製造方法によって製造されたウイルス特異的CTLを含むウイルス感染症の治療剤及び/または予防剤。
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