JP5424885B2 - 両性リポソームにおけるまたは両性リポソームに関する改善、両性リポソームを処方する方法および両性リポソームに充填する方法 - Google Patents

Description

本発明は、両性リポソームにおけるまたは両性リポソームに関する改善に関する。特に、本発明は、そのようなリポソームを処方するための新規の方法およびそれらに充填するための方法、ならびにそのような方法によって生成されるリポソームを提供する。

両性リポソームは、優れた生体内分布を示すこと、および動物において良好な忍容性を呈することが見出されている。それらは、高い効率で、核酸分子を含む活性剤をカプセル化することができる。

両イオン性構造とは対照的に、両性リポソームは、等電点を有利に有し、そしてより高いｐＨ値で負に荷電し、そしてより低いｐＨ値で正に荷電する。両性リポソームは、（非特許文献１）によって紹介されたｐＨ−感受性リポソームのより大きなグループに属する。ｐＨ−感受性リポソームにおける典型的なｐＨ−応答性エレメントは、コレステロールヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）、パルミトイルホモシステイン、ジオレオイルグリセロールヘミスクシネート（ＤＯＧ−Ｓｕｃｃ）などである。ＣＨＥＭＳは、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（好適に、１０℃を超える温度で逆ヘキサゴナル相の形をとる脂質）を、ｐＨ７．４でラメラ相に安定化することができる。ラメラＣＨＥＭＳ／ＤＯＰＥシステムは、中性または弱アルカリ性ｐＨで調製することができるが、しかし、これらのシステムは不安定になり、そして酸性ｐＨで融合する（非特許文献２）。

膜融合リポソームは、特に、薬物、例えば、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドのような核酸の細胞内送達のための薬学的適用において極めて有用である。エンドサイトーシスによるリポソームの細胞への取り込み後、エンドソームからの薬物の放出は、細胞のサイトゾルへの薬物の送達に極めて重要な工程である。エンドソーム内のｐＨは弱酸性であり、従って、ｐＨ感受性リポソームは、エンドソーム膜と融合することができ、それによってエンドソームからの薬物の放出を可能にする。これは、例えば、増強された膜融合性による脂質相の不安定化は、エンドソームエスケープおよび細胞内送達を容易にすることを意味する。また、低いｐＨの他の環境、例えば、腫瘍または炎症の部位において見出される低いｐＨは、そのようなリポソームの融合を誘発することができる。

非特許文献３は、そのような融合が生じるｐＨを超えるｐＨでの限定された制御には満足せず、そしてカチオン性脂質を添加することによって融合ポイントを微調整するための合理的なアプローチを実証した。そのような混合物は、それらが、低いｐＨではカチオン状態で、そしてより高いｐＨ、典型的には生理学的ｐＨではアニオン性粒子として存在する真の両性特性を有する。Hafezらに従えば、融合は、粒子の正味の荷電が０（それらの等電点）であるｐＨ値で開始し、そして一旦、そのようなポイントを横切ると（ｐＨは、任意の程度でより低い）、融合は連続的なプロセスである。このような見解は、数理モデルを使用して両性脂質混合物の融合傾向を解析した（非特許文献４）によっても認められている。

非特許文献５は、脂質分子の全体の形が水和した脂質膜の構造を決定することを想定する分子形状概念を紹介した。これは、脂質ジオメトリー、より具体的には、極性ヘッド基と疎水性膜アンカーとの間のサイズ比が、脂質相を決定する重要なパラメータであることを意味する（非特許文献６）。しかし、本来の理論は、極性ヘッド基の立体部分である対イオンを考慮していなかったが、これについては、非特許文献４が提案した。ＤＯＤＡＣ／ＣＨＥＭＳシステムについての彼らの説明では、ナトリウムイオンは、中性ｐＨにおけるＣＨＥＭＳのヘッド基を大きくするが、ｐＨが低下する場合解離し、それ故、ヘッド基容積を最小限にし、そしてヘキサゴナル相を促進し；強力なカチオンとしてのＤＯＤＡＣは、ｐＨにかかわらず、そのそれぞれの対イオンと一定の会合状態にあることが想定される。モデルは、あるｐＨおよびそれ以下での融合を推定する。

中性脂質を両性脂質混合物に添加しても、両性リポソームの等電点はほとんど影響を受けないことが見出されている。特許文献１（Panznerら）は、低いおよび中性ｐＨの両方において安定なサイズの中性脂質を含んでなる所定の両性リポソームを開示している。特許文献１はまた、低いｐＨから開始して、そのような粒子に核酸を充填する方法についても開示している。

両性リポソームは複雑な構造であり、そして少なくとも、荷電した脂質の相補的な対を含んでなる。１つもしくはそれ以上のそのような中性脂質の封入は、特に、成分の個々の量が変動し得るため、混合物の複雑性を顕著に増加させる。（非特許文献３）および特許文献１は、真の両性特性を伴う脂質混合物を選択する仕方、ならびにさらに具体的には、それらの等電点および融合の発生を決定する仕方についてのいくつかの指針を提供している。それにもかかわらず、脂質の可能な組合せは極めて多く、両性リポソームをより迅速に最適化するのは実際的に困難であり、そして中間のｐＨにおいて膜融合性のヘキサゴナル相を形成する一方、高いおよび低いｐＨで満足できる安定なラメラ相を脂質のどのような混合物が形成するかについて推定または解析する方法の必要性が当該分野では依然として存在する。

WO 02/066012

Straubinger, et al. (FEBS Lett., 1985, 179(1), 148-154) Hafez and Cullis, Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1463, 107-114 Hafez, et al. (Biophys. J. 2000, 79(3), 1438-1446) Li and Schick (Biophys. J., 2001, 80, 1703-1711) Israelachvili and Mitchell in 1975 , (Biochim. Biophys. Acta, 1975, 389, 13-19) Israelachvili, et al. Biochim Biophys Acta. 1977 17;470 (2) : 185-201 Israelachvili et al., 1980, Q. Rev. Biophys., 13(2), 121-200

従って、本発明の目的は、そのような膜融合両性リポソームを処方するための改善された方法を提供することがである。中性ｐＨで安定な脂質相および低いｐＨで膜融合相を形成する両性リポソームは、本発明の別の目的を示す。本発明のなお別の目的は、低いｐＨおよび中性ｐＨの両方において安定な脂質相を形成するが、中間のｐＨにおいて融合を経験する両性リポソームを提供することである。本発明者らは、そのカーゴが放出されることが所望のエンドソーム環境へのいくつかの適用において、リポソームがより良好に標的化されるように、両性リポソームが膜融合性であるｐＨを制御することが所望されることを認識している。従って、本発明のなお別の目的は、そのような両性リポソームの融合が発生するｐＨを制御する方法を提供することである。

従って、本発明の態様に従えば、以下を含んでなる両性リポソームを処方する方法が提供される：
（ｉ）アニオン性両親媒性物質、カチオン性両親媒性物質（前記アニオン性およびカチオン性両親媒性物質のそれぞれは、それぞれ極性ヘッドおよび無極性テール基を、前記アニオン性およびカチオン性両親媒性物質に対しそれぞれカチオン性およびアニオン性対イオンを有する）、ならびに場合により、１つもしくはそれ以上の中性両親媒性物質（前記アニオン性およびカチオン性両親媒性物質のうち少なくとも１つは荷電性である）を選択すること；
（ｉｉ）前記アニオン性およびカチオン性両親媒性物質（荷電していない場合、および荷電し、そして、それぞれ、前記カチオン性およびアニオン性対イオンと会合する場合）、および前記１つもしくはそれ以上の随意的な中性両親媒性物質のそれぞれのκ値、ならびに荷電した形の前記アニオン性およびカチオン性両親媒性物質を含んでなる脂質塩のκ_ｓａｌｔ値を計算することであって、κは、それぞれの種の極性ヘッド基Ｖ_ｈｅａｄの分子容対無極性テール基Ｖ_{ａｐｏｌａｒ}の分子容の比であり、荷電したアニオン性およびカチオン性両親媒性物質の極性ヘッド基の分子容はそれぞれのイオン対を含み、κ_ｓａｌｔは以下のように定義される：

［式中、Ｖ_ｈｅａｄ（ｃａｔ）は、それぞれの対アニオンを伴わないカチオン性両親媒性物質の極性ヘッド基の分子容であり、Ｖ_ｈｅａｄ（ａｎ）は、それぞれの対カチオンを伴わないアニオン性両親媒性物質の極性ヘッド基の分子容であり、Ｖ_{ａｐｏｌａｒ}（ｃａｔ）は、カチオン性両親媒性物質の無極性テール基の分子容であり、そしてＶ_{ａｐｏｌａｒ}（ａｎ）は、アニオン性両親媒性物質の無極性テール基の分子容である］；
（ｉｉｉ）前記アニオン性およびカチオン性両親媒性物質および前記１つもしくはそれ以上の随意的な中性両親媒性物質の脂質混合物の関数κ_{ｔｏｔａｌ}（ＰＨ）をモデル化し、荷電している場合、前記脂質混合物における前記両親媒性物質のそれぞれの量は、脂質の前記混合物が、第１のより低いｐＨと第２のより高いｐＨとの間の等電点を有し、そして前記第１のｐＨで化学量論的過剰量の正に荷電したカチオン性両親媒性物質および前記第２のｐＨで化学量論的過剰量の負に荷電したアニオン性両親媒性物質を有するように選択され、κ_{ｔｏｔａｌ}（ｐＨ）は以下のように定義される：

［式中、ｃ_ａｎ（ｐＨ）、ｃ_ｃａｔ（ｐＨ）、ｃ_ａｎ−（ｐＨ）、ｃ_ｃａｔ＋（ｐＨ）およびｃ_ｓａｌｔ（ｐＨ）は、ｐＨの関数としての荷電していないアニオン性、荷電していないカチオン性、荷電したアニオン性および荷電したカチオン性両親媒性物質ならびに前記脂質塩の脂質混合物におけるそれぞれの濃度であり、ｃ_ｎは、前記または各随意的な中性両親媒性物質の脂質混合物における濃度であり、そしてκ_ａｎ、κ_ｃａｔ、κ_ａｎ−、κ_ｃａｔ＋、κ_ｓａｌｔおよびκ_ｎは、荷電していないアニオン性、荷電していないカチオン性、荷電したアニオン性および荷電したカチオン性両親媒性物質、前記脂質塩および前記または各随意的な中性両親媒性物質のそれぞれのκ値である］；
（ｉｖ）κ_{ｔｏｔａｌ}（ｐＨ）が前記等電点において最小値を示すことを決定すること；
（ｖ）前記脂質混合物からなるリポソームを作製すること、および経験的に、前記混合物が、前記第２のｐＨ、および場合により、前記第１のｐＨにおいて安定なラメラ相を、および前記等電点またはその付近で膜融合性のヘキサゴナル相を示すことを確認すること；ならびにその後
（ｖｉ）前記脂質混合物からなる両性リポソームを製造すること。

適切には、分子モデリングによって前記分子容を計算してもよい。

前記混合物は、ｐＨ４〜ｐＨ８の範囲、好ましくは、ｐＨ５〜ｐＨ７の範囲の等電点を有し得る。

適切には、前記第１のｐＨは、ｐＨ４〜ｐＨ５の範囲またはｐＨ２〜ｐＨ４の範囲であり得る。前記第２のｐＨは、ｐＨ７〜ｐＨ８の範囲であり得る。有利なことに、前記第２のｐＨは、およそ生理学的ｐＨ（約ｐＨ７．４）である。

本発明の別の態様に従えば、脂質の混合物からなる両性リポソームが提供され、前記混合物は、カチオン性両親媒性物質、アニオン性両親媒性物質および場合により、１つもしくはそれ以上の中性両親媒性物質を含んでなり、前記カチオン性およびアニオン性両親媒性物質のうちの少なくとも１つは荷電性であり、そして前記カチオン性およびアニオン性両親媒性物質のそれぞれの量は、第１のより低いｐＨにおいて化学量論的過剰量の正に荷電したカチオン性両親媒性物質が存在し、第２のより高いｐＨにおいて化学量論的過剰量の負に荷電したアニオン性両親媒性物質が存在し、そして前記混合物が前記第１および第２のｐＨの中間の等電点を有するように選択され；前記正に荷電したカチオン性および負に荷電したアニオン性両親媒性物質が適用されて、前記等電点において相互が共に脂質塩を形成することを特徴とする。

アニオン性およびカチオン性両親媒性物質は、それぞれ極性ヘッドおよび無極性テール基を有する。本発明に従えば、アニオン性およびカチオン性両親媒性物質の極性ヘッドおよび無極性テール基ならびに前記対イオンは、混合物のκ_{ｔｏｔａｌ}（ｐＨ）が前記等電点で最小値を示し、それによって、前記混合物が、前記第２のｐＨおよび場合により、前記第１のｐＨにおいて安定なラメラ相を、ならびに前記等電点またはその付近で融合性のヘキサゴナル相を示すように選択され得る。

従って、適切には、本発明に従う両性リポソームの（上記で規定した）κ_{ｔｏｔａｌ}（ｐＨ）は、前記等電点において最小値を示す。

従って、以下の想定の組合せは、脂質相の挙動の適切な説明を可能にすることを見出した：
１）説明のための基礎としての形状理論；
２）荷電状態の極性ヘッド基について、対イオンは、ヘッド基容積の部分になる；および
３）脂質−脂質塩形成は、膜において生じる。

従って、本発明の方法は、膜融合両性リポソームの同定、脂質組成と融合ｐＨとの間の関係ならびに両性リポソームの安定性および融合挙動に対する対イオンの影響に関するそれらの融合挙動の説明を容易にする。

本発明の両性リポソームは、二重層内に脂質−脂質塩を形成することが可能である脂質対を含んでなる。いくつかの実施形態では、脂質対が脂質−脂質塩を形成する能力は、リポソームを双安定にし得る。あるいは、リポソームは、前記第２のｐＨにおいてのみ安定であり、そして前記等電点またはその付近において膜融合性であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明の前記両性リポソームは、適用されて、相互が共に脂質塩を形成する荷電性アニオン性両親媒性物質および荷電性カチオン性両親媒性物質を含んでなる脂質混合物であって、ここで、κ_ｓａｌｔ＜０．３４である脂質混合物を含んでなり得る。

前記アニオン性両親媒性物質は、Ｃｈｅｍｓ、ＤＭＧＳ、ＤＭＧＭ、ＤＭＧＧ、ＤＭＧＡ、ＤＭＡＳ、ＤＭＡＭ、ＤＭＡＧ、ＤＭＡＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＧＭ、ＤＯＧＧ、ＤＯＧＡ、ＤＯＡＳ、ＤＯＡＭ、ＤＯＡＧ、ＤＯＡＡ、ＤＭＳ、ＤＭＭ、ＤＭＧ、ＤＭＡ、ＤＯＳ、ＤＯＭ、ＤＯＧ、ＤＯＡ、Ｃｈｏｌ−Ｃ３、Ｃｈｏｌ−Ｃ５およびＣｈｏｌ−Ｃ６から選択され得る。前記カチオン性両親媒性物質は、コレステロールベースであるか、またはジアシルグリセロールに基づき得、そしてＭｏＣｈｏｌ、Ｃｈｉｍ、ＨｉｓＣｈｏｌおよびＤｅｓｈ４から選択され得る。

あるいは、前記両性リポソームは、適用されて、相互が共に脂質塩を形成する荷電性アニオン性両親媒性物質および荷電性カチオン性両親媒性物質を含んでなり得、ここで、κ_ｓａｌｔ＜０．４５であり；ならびにここで、前記荷電性カチオン性両親媒性物質は、ＤｍＣ４Ｍｏ２、ＤｍＣ３Ｍｏ２、Ｃ４Ｍｏ４、Ｃ３Ｍｏ３、Ｃ３Ｍｏ２、Ｃ５Ｍｏ２、Ｃ６Ｍｏ２およびＣ８Ｍｏ２から選択され；そして前記荷電性アニオン性両親媒性物質は、Ｃｈｅｍｓ、ＤＭＧＳ、ＤＭＧＭ、ＤＭＧＧ、ＤＭＧＡ、ＤＭＡＳ、ＤＭＡＭ、ＤＭＡＧ、ＤＭＡＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＧＭ、ＤＯＧＧ、ＤＯＧＡ、ＤＯＡＳ、ＤＯＡＭ、ＤＯＡＧ、ＤＯＡＡ、ＤＭＳ、ＤＭＭ、ＤＭＧ、ＤＭＡ、ＤＯＳ、ＤＯＭ、ＤＯＧ、ＤＯＡ、Ｃｈｏｌ−Ｃ３、Ｃｈｏｌ−Ｃ５およびＣｈｏｌ−Ｃ６から選択される。

さらに別の代替物では、前記両性リポソームは、適用されて、相互が共に脂質塩を形成する荷電性アニオン性両親媒性物質および安定なカチオン性両親媒性物質を含んでなり得、前記荷電性アニオン性両親媒性物質は過剰に存在し；ここで、κ_ｓａｌｔ＜０．３４そしてＣ／Ａ＝０．５のκ_{ｔｏｔａｌ}（ｐＨ８）とκ_ｓａｌｔ＞０．０８との間の差異である。

そのような場合、前記荷電性アニオン性両親媒性物質は、Ｃｈｅｍｓ、ＤＭＧＳ、ＤＭＧＭ、ＤＭＧＧ、ＤＭＧＡ、ＤＭＡＳ、ＤＭＡＭ、ＤＭＡＧ、ＤＭＡＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＧＭ、ＤＯＧＧ、ＤＯＧＡ、ＤＯＡＳ、ＤＯＡＭ、ＤＯＡＧ、ＤＯＡＡ、ＤＭＳ、ＤＭＭ、ＤＭＧ、ＤＭＡ、ＤＯＳ、ＤＯＭ、ＤＯＧ、ＤＯＡ、Ｃｈｏｌ−Ｃ３、Ｃｈｏｌ−Ｃ５またはＣｈｏｌ−Ｃ６および脂肪酸から選択され得る。

さらに別の代替物では、前記両性リポソームは、適用されて、相互が共に脂質塩を形成する荷電性アニオン性両親媒性物質および安定なカチオン性両親媒性物質を含んでなり得、前記脂質混合物は、過剰の前記荷電性アニオン性両親媒性物質を含んでなり、そしてκ_ｓａｌｔ＜０．３４であり；ここで、前記安定なカチオン性両親媒性物質は、ＤＤＡＢ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＤＡＰ、Ｎ−メチル−ＰｉｐＣｈｏｌ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣおよびＣＴＡＢから選択され；そして前記荷電性アニオン性脂質は、ＤＭＧＳ、ＤＭＧＭ、ＤＭＧＧ、ＤＭＧＡ、ＤＭＡＳ、ＤＭＡＭ、ＤＭＡＧ、ＤＭＡＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＧＭ、ＤＯＧＧ、ＤＯＧＡ、ＤＯＡＳ、ＤＯＡＭ、ＤＯＡＧ、ＤＯＡＡ、ＤＭＳ、ＤＭＭ、ＤＭＧ、ＤＭＡ、ＤＯＳ、ＤＯＭ、ＤＯＧ、ＤＯＡ、Ｃｈｏｌ−Ｃ３、Ｃｈｏｌ−Ｃ５およびＣｈｏｌ−Ｃ６から選択される。

さらになお別の代替物では、前記両性リポソームは、過剰の荷電性カチオン性両親媒性物質および安定なアニオン性両親媒性物質を含んでなる脂質混合物を含んでなり得、ここで、前記カチオン性脂質は、ＭｏＣｈｏｌ、Ｃｈｉｍ、ＨｉｓＣｈｏｌまたはＤｅｓｈ４、ＤｍＣ４Ｍｏ２、ＤｍＣ３Ｍｏ２、Ｃ４Ｍｏ４、Ｃ３Ｍｏ３、Ｃ３Ｍｏ２、Ｃ５Ｍｏ２、Ｃ６Ｍｏ２およびＣ８Ｍｏ２、ＤＯＩＭおよびＤＰＩＭから選択される。

適切には、前記両性リポソームは、１つもしくはそれ以上の中性または両イオン性両親媒性物質を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、前記中性両親媒性物質は、コレステロールであってもよい。あるいは、前記中性または両イオン性脂質は、ホスファチジルコリン類、スフィンゴミエリン類、セラミド類、ホスファチジルエタノールアミン類、コレステロールおよびそれらの混合物から選択され得る。

いくつかの実施形態では、前記中性または両イオン性脂質は、ホスファチジルコリン類、スフィンゴミエリン類またはセラミド類であってもよく、そして４０ｍｏｌ％未満の量で脂質混合物中に存在してもよい。

あるいは、前記中性または両イオン性脂質は、ＤＯＰＥもしくはコレステロールまたはそれらの混合物であってもよく、そして６５ｍｏｌ％未満の量で脂質混合物中に存在してもよい。

さらなる代替物では、前記中性または両イオン性脂質は、ホスファチジルコリン類（ＰＣ）、スフィンゴミエリン類もしくはセラミド類およびホスファチジルエタノールアミン類（ＰＥ）の混合物、またはホスファチジルコリン類（ＰＣ）、スフィンゴミエリン類もしくはセラミド類およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）の混合物を含んでなり得、ここで、中性脂質の前記混合物は、８０ｍｏｌ％以下の量で脂質混合物中に存在する。

本発明の別の態様では、リポソームは、以下の特定の組合せの両親媒性物質ＤＯＤＡＣ／ＣＨＥＭＳ；ＤＤＡＢ／ＣＨＥＭＳ；ＤＯＴＡＰ／ＤＯＧＳ；ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ；ＤＯＴＡＰ／ＤＰＧＳ；ＤＯＴＡＰ／ＣＨＥＭＳ；ＣＨＩＭ／ＣＨＥＭＳ；ＣＨＩＭ／ＤＭＧＳ；ＣＨＩＭ／ＤＯＧＳ；ＨｉｓＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳ；ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＭＧＳ；ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＰＧＳ；ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ；ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＰＰＳ；ＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳ；ＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧＳ；ＭｏＣｈｏｌ／ＤＰＧＳ；ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ；ＭｏＣｈｏｌ／セチル−Ｐ；ＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＰＳ；ＭｏＣｈｏｌ／ＤＰＰＳ；ＤＣ−ＣＨＯＬ／ＤＯＰＡ；ＤＯＴＡＰ＋ＣＨＩＭ／ＣＨＥＭＳ；ＤＣ−Ｃｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓ；ＤＯＩＭ／ＤＭＧＳ；ＤＯＩＭ／ＤＯＧＳ；ＤＯＴＡＰ／オレイン酸のもの以外の脂質塩を含んでなり得る。

ほとんどまたは全く融合を示さず、そして脂質塩を形成し得ない多くの両性脂質の組合せが存在する。そのような脂質の組合せは：
ＭｏＣＨＯＬ／ＰＯＰＧ；ＭｏＣＨＯＬ／ＤＰＰＧ；ＨｉｓＣＨＯＬ／ＰＯＰＧ；ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＰＰＧである。

本発明のなお別の態様では、リポソームは、両親媒性物質の以下の特定の組合せの１つを有するもの以外の脂質混合物を含んでなり得る：

本発明の別の態様では、リポソームは、両親媒性物質の以下の特定の組合せの１つを有するもの以外の脂質混合物を含んでなり得る。

本発明のなお別の態様では、リポソームは、両親媒性物質の以下の特定の組合せの１つを有するもの以外の脂質混合物を含んでなり得る：

本発明のなお別の態様に従えば、本発明に従う両性リポソームに負に荷電したカーゴ部分を充填する方法が提供され、前記方法は、アニオン性対イオンを含んでなる第１の溶媒を使用して、前記第１のｐＨにおいて前記負に荷電したカーゴ部分の存在下で前記リポソームを作製すること、およびその後、カチオン性対イオンを含んでなる第２の溶媒を使用して、前記リポソームを前記第２のｐＨに暴露することを含んでなる。

好ましくは、そのようなリポソームは双安定性であり、前記第１のｐＨならびに前記第２のｐＨにおいて安定なラメラ相を示す。

適切には、前記溶媒の変更は、前記リポソームが迅速に所望のｐＨにもたらされるように、それぞれの第２の溶媒の一段混合によって達成される。前記第１のｐＨは、約ｐＨ２〜５、好ましくは、ｐＨ２〜４であってもよい。前記第２のｐＨは、約ｐＨ７．４であってもよい。前記第１のｐＨにおいてリポソームを安定化するために、好ましくは、前記対アニオンは、少なくとも５０Ａ^３の分子容を有し得る。それ故、前記対アニオンは、シトレート、ピロホスフェート、バルビツール酸およびメチルサルフェートから選択され得る。

前記第２のｐＨにおいてリポソームを安定化するために、好ましくは、前記対カチオンは、少なくとも５０Ａ^３の分子容を有し得る。

本発明の別の態様に従えば、リポソームは、少なくとも１つの活性剤をカプセル化し得る。いくつかの実施形態では、前記活性剤は核酸を含んでなり得る。特に、前記活性剤は、オリゴヌクレオチドを含んでなり得る。

そのような使用に限定されなければ、本発明に従う両性リポソームは、例えば、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡプラスミドのような核酸ベースの薬物のキャリアとしての使用に良好に適合される。これらの薬物は、タンパク質、ポリペプチドまたはＲＮＡに対する１つもしくはそれ以上の特異的配列をコードする核酸、およびタンパク質発現レベルを特異的にレギュレートするかまたは特に、スプライシングへの干渉および人工的な切断を介してタンパク質構造に影響を及ぼすことができるオリゴヌクレオチドに分類される。

従って、本発明のいくつかの実施態様では、核酸に基づく治療薬は、脊椎動物細胞において１つもしくはそれ以上のＲＮＡに転写されることが可能である核酸を含んでなり得、前記ＲＮＡはｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはリボザイムであり得、ここで、そのようなｍＲＮＡは１つもしくはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドをコードする。そのような核酸治療薬は、環状ＤＮＡプラスミド、WO98/21322もしくはDE19753182において開示されているようなＭＩＤＧＥベクター(Minimalistic Immunogenically Defined Gene Expression)と同様な線状ＤＮＡ構築物、または翻訳のために準備されるｍＲＮＡ（例えば、EP1392341）であってもよい。

本発明の別の実施態様では、存在する細胞内核酸またはタンパク質を標的化することができるオリゴヌクレオチドを使用してもよい。前記オリゴヌクレオチドは、転写を減弱もしくはモジュレートする、転写物のプロセシングを改変するまたはそうでなければタンパク質の発現を干渉するために適応されるように、前記核酸は特定の遺伝子をコードし得る。用語「標的核酸」は、特定の遺伝子をコードするＤＮＡ、ならびにプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡであるそのようなＤＮＡから誘導されるすべてのＲＮＡを包含する。標的核酸とそのような配列に対して指向される１つもしくはそれ以上のオリゴヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションは、タンパク質発現の阻害またはモジュレーションを生じ得る。そのような特異的標的を達成するために、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の配列に実質的に相補的であるヌクレオチドの連続ストレッチを適切に含んでなるべきである。

上記の基準を満たすオリゴヌクレオチドは、異なる多くの化学およびトポロジーにより構成され得る。オリゴヌクレオチドは、一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよい。

オリゴヌクレオチドは、８〜６０個の電荷を有するポリアニオン構造である。従って、オリゴヌクレオチドは、本発明の充填方法において、負に荷電したカーゴとしての使用に良好に適応される。ほとんどの場合、これらの構造は、ヌクレオチドを含んでなるポリマーである。本発明は、オリゴヌクレオチドの特定の作用機序に限定されず、そして機序を理解することは、本発明を実践するのに必要ではない。

オリゴヌクレオチドの作用機序は変動し得、そして特に、スプライシング、転写、核−細胞質間輸送および翻訳に対する効果を含んでなり得る。

本発明の好適な実施形態では、一般にアンチセンスオリゴヌクレオチドとして公知であるＤＮＡに基づくオリゴヌクレオチド、ロックド核酸、２’−修飾オリゴヌクレオチドなどを含むがそれらに限定されない一本鎖オリゴヌクレオチドを使用してもよい。骨格または塩基または糖修飾として、ホスホチオエートＤＮＡ（ＰＴＯ）、２’Ｏ−メチルＲＮＡ（２’Ｏｍｅ）、２’フルオロＲＮＡ（２’Ｆ）、２’Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホアミデート（ＮＰ）、２’フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリンホスホアミデート（モルホリノ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）などを挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、混合された化学は当該技術分野において公知であり、コポリマー、ブロック−コポリマーもしくはギャップマーのような２つ以上のシングルヌクレオチド種からまたは他の配列で構築される。上記のオリゴヌクレオチドに加えて、タンパク質発現はまた、相補配列モチーフを含有する二本鎖ＲＮＡ分子を使用して、阻害することができる。そのようなＲＮＡ分子は、当該技術分野においてｓｉＲＮＡ分子として公知である（例えば、WO 99/32619またはWO 02/055693）。他のｓｉＲＮＡは、１つの非連続的な鎖を有する一本鎖ｓｉＲＮＡまたは二本鎖ｓｉＲＮＡを含んでなる。さらに、多様な化学が、このクラスのオリゴヌクレオチドに適応された。また、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドシステムも当該技術分野において公知である。

本発明の別の実施形態では、デコイオリゴヌクレオチドを使用することができる。従って、これらの二本鎖ＤＮＡ分子および化学修飾は、核酸を標的化するが、転写因子を標的化しない。これは、デコイオリゴヌクレオチドが配列特異的ＤＮＡ結合性タンパク質に結合し、そして転写を干渉することを意味する（例えば、Cho-Chung,et al.in Curr.Opin.Mol.Ther.,1999）。

本発明のさらなる実施形態では、生理学的条件下で遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズすることによって、転写に影響を及ぼし得るオリゴヌクレオチドを使用し得る。さらに、多様な化学がこのクラスのオリゴヌクレオチドに順応し得る。

本発明のなおさらなる代替物では、ＤＮＡザイムを使用してもよい。ＤＮＡザイムは、酵素活性を伴う一本鎖オリゴヌクレオチドおよびその化学修飾である。「１０〜２３」モデルとして公知の典型的なＤＮＡザイムは、生理学的条件下で特異的部位において一本鎖ＲＮＡを切断することが可能である。ＤＮＡザイムの１０〜２３モデルは、ＲＮＡ上の標的配列に相補的な２基質認識ドメインによって隣接される１５の高度に保存されたデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。標的ｍＲＮＡの切断は、それらの破壊を生じ得、ＤＮＡザイムは再循環し、そして複数の基質を切断する。

本発明のなお別の実施形態では、リボザイムを使用することができる。リボザイムは、酵素活性を伴う一本鎖オリゴリボヌクレオチドおよびその化学修飾である。それらは、２つの成分、触媒コアを形成する保存されたステム−ループ構造および所定のＲＮＡ転写物において標的部位を囲む配列に逆相補的であるフランキング配列に作動可能に分割することができる。フランキング配列は特異性を付与し得、そして一般的に、合計で１４〜１６ｎｔを構成し得、選択される標的部位の両方の部位上に延在する。

本発明のなおさらなる実施形態では、タンパク質を標的化するためにアプタマーを使用してもよい。アプタマーは、ＲＮＡまたはＤＮＡのような核酸、および特異的分子標的に緊密に結合するその化学修飾からなる高分子であり、そして典型的に１５〜６０ｎｔ長である。ヌクレオチドの鎖は、分子を複雑な３次元の形状に折り畳む分子内相互作用を形成し得る。アプタマーの形状は、それが、酸性タンパク質、塩基性タンパク質、膜タンパク質、転写因子および酵素を含んでなるがそれらに限定されないその標的分子の表面に対して緊密に結合することを可能にする。アプタマー分子の結合は、標的分子の機能に影響を及ぼし得る。

上記のオリゴヌクレオチドのすべては、短くて１０、好ましくは１５およびさらにより好ましくは１８〜５０、好ましくは３０およびより好ましくは２５ヌクレオチドの間の長さで変動し得る。オリゴヌクレオチドと標的配列との間の適合は、オリゴヌクレオチドの各塩基と好ましくは完全であり、上記の数のオリゴヌクレオチドの連続ストレッチにわたる標的核酸上のその相補的塩基と塩基対を形成する。これはそれほど好適ではないが、配列の対は、塩基対の前記連続ストレッチ内に１つもしくはそれ以上のミスマッチを含有してもよい。一般に、そのような核酸のタイプおよび化学組成は、それがインビボであってもまたはインビトロであっても、ビヒクルとしての本発明のリポソームの性能にほとんど影響を及ぼさず、そして当業者は、本発明のリポソームとの組み合わせに適切な他のタイプのオリゴヌクレオチドまたは核酸を見出し得る。

本発明のなお別の態様に従えば、本発明に従う活性剤充填両性リポソームおよびそれらのための薬学的に許容可能なビヒクルを含んでなる医薬組成物が提供される。

図１は、アニオン性およびカチオン性モデル脂質の間の異なる比についてのκの計算値のグラフ図である。左側のパネル：アニオン性脂質のｐＨおよび百分率に応答するκの表面プロット。右側のパネル：選択された量のアニオン性脂質に対するｐＨ応答の詳細な解析。 図２は、アニオン性およびカチオン性モデル脂質の間の異なる比についてのκの計算値のグラフ図である。左側のパネル：アニオン性脂質のｐＨおよび百分率に応答するκの表面プロット。右側のパネル：選択された量のアニオン性脂質に対するｐＨ応答の詳細な解析。 図３は、両性物質ＩＩＩシステムにおけるアニオン性およびカチオン性モデル脂質の間の異なる比についてのκの計算値のグラフ図である。左側のパネル：アニオン性脂質のｐＨおよび百分率に応答するκの表面プロット。右側のパネル：選択された量のアニオン性脂質に対するｐＨ応答の詳細な解析。 図４は、両性物質ＩＩＩシステムにおけるアニオン性およびカチオン性モデル脂質の間の異なる比についてのκの計算値のグラフ図である。左側のパネル：塩橋モデル；右側のパネル：独立イオンモデル。 図５は、多様なイオン対サイズを介する両性物質ＩＩ混合物のアニオンまたはカチオン状態の安定化を示す。左側のパネル：等しいイオン対サイズの解析。右側のパネル：より大きなカチオンイオン対を介するアニオン状態の排他的安定化。ＣＡ−対アニオン；ＣＣ−対カチオン；説明文中の数字はÅ^３での分子容を示す。 図６は、多様な対アニオンを介するカチオン性両性物質ＩＩ脂質相の非対照的安定化を例示する。生成中、カチオン性脂質相は、より大きなアニオン（ＣＡ１２０）で安定化する。リポソームを中性ｐＨに調整し、そして緩衝液の組成を、より小さな対アニオン（ＣＡ２１）に変更する。脂質相は、かなり低いκの値を有するため、ここで酸性ｐＨに遭遇するリポソームは、融合する傾向がある。ＣＡ−対アニオン；ＣＣ−対カチオン；説明文中の数字はÅ^３での分子容を示す。 図７は、κおよびイオン対サイズの所定の値についての絶対的な分子容の影響を例示する。両性物質ＩＩシステムにおけるカチオン性およびアニオン性脂質では、κを０．１７５に調整したが、絶対的な脂質サイズにはばらつきがあった；説明文の数字は、カチオン性およびアニオン性脂質の両方についての分子ヘッドおよびテール容積をÅ^３で示す。 図８は、κおよびイオン対サイズの所定の値についての絶対的な分子容の影響を例示する。両性物質ＩＩシステムにおけるカチオン性およびアニオン性脂質に対し、κを０．１７５に調整したが、アニオン性脂質はカチオン性脂質より小さな分子容を有した。 図９は、中性脂質をさらに含んでなる両性物質ＩＩシステムにおける外部ｐＨに応答するκの計算値のグラフ図である。５０％の中性脂質を、図の説明文に記載のκ値を伴うシステムに添加した。 図１０は、ＣｉＰ緩衝液におけるｐＨ−ジャンプ後のＤＯＴＡＰ／ＣＨＥＭＳリポソームのサイズを示す。６６ｍｏｌ．％ＣＨＥＭＳ（十字）、７５ｍｏｌ．％ＣＨＥＭＳ（アスタリスク）または１００ｍｏｌ．％ＣＨＥＭＳ（点線）を含有するＤＯＴＡＰリポソームを、ｐＨ８において生成し、示されたｐＨにジャンプさせ、そしてより低いｐＨにおいて１時間のインキュベーション後、中和した。サイクルの終了時にサイズを測定した。 図１１は、ＭｏＣＨｏｌおよびＣＨＥＭＳを含んでなる両性物質ＩＩシステムの融合挙動を示す。左−システムのκ値の計算値。右−ＣｉＰ緩衝液におけるＣＨＥＭＳおよびＭｏＣｈｏｌの異なる混合物のｐＨジャンプ後の実験的融合の結果。説明文中の百分率は、混合物におけるＣＨＥＭＳの量を表す。 図１２は、ＭｏＣＨｏｌおよびＤＯＰＡを含んでなる両性物質ＩＩＩシステムの融合挙動を示す。左−システムのκ値の計算値。右−ＣｉＰ緩衝液におけるＤＯＰＡおよびＭｏＣｈｏｌの異なる混合物のｐＨジャンプ後の実験的融合の結果。説明文中の百分率は、混合物におけるＤＯＰＡの量を表す。 図１３は、モノアルキル脂質を含んでなる両性物質ＩＩシステムの融合挙動を示す。左−システムのκ値の計算値。右−ＣｉＰ緩衝液におけるオレイン酸およびＭｏＣｈｏｌの異なる混合物のｐＨジャンプ後の実験的融合の結果。説明文中の百分率は、混合物におけるオレイン酸の量を表す。 図１４は、ＰＯＰＣの存在下における融合挙動を例示する：リポソームをｐＨ７．５において生成し、そして酸性条件に調整して、凝集または融合を促進した。２０ｍｏｌ．％ＰＯＰＣを添加すると、融合の傾向が顕著に減少し、そしてリポソームは、より低いｐＨであっても安定であった。説明文中の組成は、ＤＯＴＡＰおよびＣＨＥＭＳの百分率を表し；残りはＰＯＰＣである。ｐＩは、混合物の計算された等電点を表す。 図１５は、ＤＯＰＥの存在下における融合挙動を例示する：リポソームをｐＨ７．５において生成し、そして酸性条件に調整して、凝集または融合を促進した。２０ｍｏｌ．％ＤＯＰＥの添加は、両性膜の融合傾向を維持する。説明文中の組成は、ＤＯＴＡＰおよびＣＨＥＭＳの百分率を表し；残りはＤＯＰＥである。ｐＩは、混合物の計算された等電点を表す。 図１６は、多様な対カチオンの存在下で２０ｍｏｌ％ＤＯＴＡＰおよび８０ｍｏｌ％ＣＨＥＭＳを含んでなる両性物質Ｉシステムの融合挙動を示す。Ｙ軸上のサイズ比を使用して、リポソームサイズをｐＨ８において見出される値に正規化する。すべてのリポソームは、これらの条件下で１７０ｎｍ〜２２０ｎｍのサイズ範囲内にあった。 図１７は、多様な対カチオンの存在下で２０ｍｏｌ％ＭｏＣＨＯＬおよび８０ｍｏｌ％ＣＨＥＭＳを含んでなる両性物質ＩＩシステムの融合挙動を示す。Ｙ軸上のサイズ比は、Ｘ軸軸上に示すｐＨ値への暴露後のリポソームサイズを示し、そして値をｐＨ８での擬似(mock)処置に正規化した。すべてのリポソームサイズは、これらの条件下で１４０〜３００ｎｍの間であった。 図１８は、多様な対カチオンの存在下で５０ｍｏｌ％ＭｏＣＨＯＬおよび５０ｍｏｌ％ＤＯＰＡを含んでなる両性物質ＩＩＩシステムの融合挙動を示す。Ｙ軸上のサイズ比は、Ｘ軸軸上に示すｐＨ値への暴露後のリポソームサイズを示し、そして値をｐＨ８での擬似処置に正規化した。すべてのリポソームサイズは、これらの条件下で２２０〜２６０ｎｍの間であった。 図１９ａは、コレステロールベースのｐＨ感受性カチオン性脂質（ＤｍＣ４Ｍｏ２を除く）および異なるｐＨ感受性アニオン性脂質から形成される両性物質ＩＩシステムの融合強度（Ｃ／Ａ＝０．３３−３対ｐＨのマトリックスにおけるΣＦＲＥＴとして表される）とｋ（ｓａｌｔ）との間の逆相関関係を示す。 図１９ｂは、コレステロールベースのｐＨ感受性カチオン性脂質（ＤｍＣ４Ｍｏ２を除く）および異なるｐＨ感受性アニオン性脂質から形成される両性物質ＩＩシステムの融合強度（Ｃ／Ａ＝０．７−１．５対ｐＨのマトリックスにおけるΣＦＲＥＴとして表される）とｋ（ｓａｌｔ）との間の逆相関関係を示す。 図１９ｃは、異なるアニオン性ｐＨ感受性脂質との組合せでカチオン性脂質ＤｍＣ４Ｍｏ２を含んでなる両性物質ＩＩシステムの融合強度（Ｃ／Ａ＝０．３３−３対ｐＨのマトリックスにおけるΣＦＲＥＴとして表される）とｋ（ｓａｌｔ）との間の逆相関関係を例示する。 図２０は、ＤＯＴＡＰまたはＤＯＤＡＰおよび多様なｐＨ感受性アニオンを含んでなる両性物質Ｉシステムの融合強度（Ｃ／Ａ＝０．４−０．７５対ｐＨのマトリックスにおけるΣＦＲＥＴとして表される）とｋ（ｓａｌｔ）との間の逆相関関係を示す。 図２１ａは、ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ由来のリポソームの融合の強度（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳのＣ／Ａ＝０．１７〜０．７５；ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳのＣ／Ａ＝０．３３−３対ｐＨのマトリックスにおける％ΣＦＲＥＴとして表される）の０％〜５０％ＰＯＰＣとの混合物のｋ（ｍｉｎ）に対するプロットを示す。参照ｋ（ｍｉｎ）を、Ｃ／Ａ＝０．６６（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ）またはＣ／Ａ＝１（ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ）についてモデル化した。０％ＰＯＰＣの％ΣＦＲＥＴを１００に設定する。 図２１ｂは、ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ由来のリポソームの融合の強度（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳのＣ／Ａ＝０．１７〜０．７５；ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳのＣ／Ａ＝０．３３−３対ｐＨのマトリックスにおける％ΣＦＲＥＴとして表される）の０％〜５０％ＰＯＰＣとの混合物のｋ（ｍｉｎ）に対するプロットを示す。参照ｋ（ｍｉｎ）を、Ｃ／Ａ＝０．６６（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ）またはＣ／Ａ＝１（ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ）についてモデル化した。０％ＰＯＰＣの％ΣＦＲＥＴを１００に設定する。 図２２ａは、ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ由来のリポソームの融合の強度（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳのＣ／Ａ＝０．１７〜０．７５；ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳのＣ／Ａ＝０．３３−３対ｐＨのマトリックスにおける％ΣＦＲＥＴとして表される）の０％〜５０％ＤＯＰＥとの混合物のｋ（ｍｉｎ）に対するプロットを示す。参照ｋ（ｍｉｎ）を、Ｃ／Ａ＝０．６６（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ）またはＣ／Ａ＝１（ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ）についてモデル化した。０％ＤＯＰＥの％ΣＦＲＥＴを１００に設定する。 図２２ｂは、ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ由来のリポソームの融合の強度（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳのＣ／Ａ＝０．１７〜０．７５；ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳのＣ／Ａ＝０．３３−３対ｐＨのマトリックスにおける％ΣＦＲＥＴとして表される）の０％〜５０％ＤＯＰＥとの混合物のｋ（ｍｉｎ）に対するプロットを示す。参照ｋ（ｍｉｎ）を、Ｃ／Ａ＝０．６６（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ）またはＣ／Ａ＝１（ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ）についてモデル化した。０％ＤＯＰＥの％ΣＦＲＥＴを１００に設定する。 図２３ａは、ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ由来のリポソームの融合の強度（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳのＣ／Ａ＝０．１７〜０．７５；ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳのＣ／Ａ＝０．３３−３対ｐＨのマトリックスにおける％ΣＦＲＥＴとして表される）の０％〜５０％コレステロールとの混合物のｋ（ｍｉｎ）に対するプロットを示す。参照ｋ（ｍｉｎ）を、Ｃ／Ａ＝０．６６（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ）またはＣ／Ａ＝１（ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ）についてモデル化した。０％コレステロールの％ΣＦＲＥＴを１００に設定する。 図２３ｂは、ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ由来のリポソームの融合の強度（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳのＣ／Ａ＝０．１７〜０．７５；ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳのＣ／Ａ＝０．３３−３対ｐＨのマトリックスにおける％ΣＦＲＥＴとして表される）の０％〜５０％コレステロールとの混合物のｋ（ｍｉｎ）に対するプロットを示す。参照ｋ（ｍｉｎ）を、Ｃ／Ａ＝０．６６（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ）またはＣ／Ａ＝１（ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ）についてモデル化した。０％コレステロールの％ΣＦＲＥＴを１００に設定する。 図２４ａは、ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ由来のリポソームの融合の強度（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳのＣ／Ａ＝０．１７〜０．７５；ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳのＣ／Ａ＝０．３３−３対ｐＨのマトリックスにおける％ΣＦＲＥＴとして表される）の０％〜５０％のＰＯＰＣ／コレステロール１：１混合物との混合物のｋ（ｍｉｎ）に対するプロットを示す。参照ｋ（ｍｉｎ）を、Ｃ／Ａ＝０．６６（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ）またはＣ／Ａ＝１（ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ）についてモデル化した。０％ＰＯＰＣ／コレステロールの％ΣＦＲＥＴを１００に設定する。 図２４ｂは、ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ由来のリポソームの融合の強度（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳのＣ／Ａ＝０．１７〜０．７５；ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳのＣ／Ａ＝０．３３−３対ｐＨのマトリックスにおける％ΣＦＲＥＴとして表される）の０％〜５０％のＰＯＰＣ／コレステロール１：１混合物との混合物のｋ（ｍｉｎ）に対するプロットを示す。参照ｋ（ｍｉｎ）を、Ｃ／Ａ＝０．６６（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ）またはＣ／Ａ＝１（ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ）についてモデル化した。０％ＰＯＰＣ／コレステロールの％ΣＦＲＥＴを１００に設定する。 図２５は、ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳおよび１０％〜５０％の異なる中性または両イオン性脂質を含んでなるリポソームの融合の強度（Ｃ／Ａ＝０．３３−３対ｐＨのマトリックスにおけるΣＦＲＥＴとして表される）を示す。点線は、０％の中性または両イオン性脂質を伴うリポソームの融合の強度を示す。 図２６は、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓを含んでなるリポソームの融合域と等電点との間の相関関係を示す。ｄ（ｐＨ−ＩＰ）は、ＦＲＥＴが測定されたｐＨと適切なＣ／Ａ比の等電点との間の差異である。

「荷電性」は、両親媒性物質がｐＨ４〜ｐＨ８の範囲のｐＫを有することを意味する。従って、荷電性両親媒性物質は、弱酸性であってもまたは塩基性であってもよい。「安定な」両親媒性物質は、強酸性または塩基性であり、ｐＨ４〜ｐＨ８の範囲で実質的に安定な電荷を有する。

本明細書における「両性」は、アニオン性およびカチオン性の両方の特徴の荷電した基を含んでなる物質、物質の混合物または超分子複合体（例えば、リポソーム）を意味し、ここで：
１）カチオンおよびアニオン性両親媒性物質の少なくとも１つ、および場合により、両方ともが荷電性であり、４〜８の間のｐＫを伴う少なくとも１つの荷電した基を有し、
２）カチオン性の電荷はｐＨ４において広がり、そして
３）アニオン性の電荷はｐＨ８において広がる。

結果として、物質または物質の混合物は、ｐＨ４〜ｐＨ８の間の中性の実効電荷の等電点を有する。両性イオンは上記範囲のｐＫを有さないため、両性特徴は、両性イオンの特徴とは異なるこのような規定による。結果として、両性イオンは、ｐＨ値の範囲にわたって本質的に中性に荷電しており；ホスファチジルコリン類およびホスファチジルエタノールアミン類は、両性イオン特徴を伴う中性脂質である。

本明細書における「Ｃ／Ａ」または「Ｃ／Ａ比」または「Ｃ／Ａモル比」は、両親媒性物質の混合物におけるカチオン性両親媒性物質対アニオン性両親媒性物質のモル比を意味する。

本明細書における「κ（ｍｉｎ）」は、関数κ_{ｔｏｔａｌ}（ｐＨ）の最小値を意味する。

脂質については以下の略称が本明細書において使用されるが、略称の大部分は文献における標準的用途内にある：
ＰＣ ホスファチジルコリン（不特定の膜アンカー）
ＰＥ ホスファチジルエタノールアミン（不特定の膜アンカー）
ＳＭ スフィンゴミエリン
ＤＭＰＣ ジミリストイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＤＳＰＣ ジステアロイルホスファチジルコリン
ＰＯＰＣ パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン
ＤＯＰＣ ジオレオイルホスファチジルコリン
ＤＯＰＥ ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＭＰＥ ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＰＰＥ ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
ＣＨＥＭＳ コレステロールヘミスクシネート
Ｃｈｏｌ−Ｃ３ コレステロールヘミマロネート
Ｃｈｏｌ−Ｃ５ コレステロールヘミグルタレート
Ｃｈｏｌ−Ｃ６ コレステロールヘミアジペート
ＤＧＳまたはＤＧ−Ｓｕｃｃ ジアシルグリセロールヘミスクシネート（不特定の膜アンカー）
ＤＯＧＳまたはＤＯＧ−Ｓｕｃｃ ジオレオイルグリセロールヘミスクシネート
ＤＭＧＳまたはＤＭＧ−Ｓｕｃｃ ジミリストイルグリセロールヘミスクシネート
ＤＰＧＳまたはＤＰＧ−Ｓｕｃｃ ジパルミトイルグリセロールヘミスクシネート
ＤＳＧＳまたはＤＳＧ−Ｓｕｃｃ ジステアロイルグリセロールヘミスクシネート
ＰＯＧＳまたはＰＯＧ−Ｓｕｃｃ パルミトイルオレオイルグリセロールヘミスクシネート
ＤＯＧＭ ジオレオイルグリセロールヘミマロネート
ＤＯＧＧ ジオレオイルグリセロールヘミグルタレート
ＤＯＧＡ ジオレオイルグリセロールヘミアジペート
ＤＭＧＭ ジミリストイルグリセロールヘミマロネート
ＤＭＧＧ ジミリストイルグリセロールヘミグルタレート
ＤＭＧＡ ジミリストイルグリセロールヘミアジペート
ＤＯＡＳ ４−｛（１，２−ジオレオイル−エチル）アミノ｝−４−オキソブタン酸
ＤＯＡＭ ４−｛（１，２−ジオレオイル−エチル）アミノ｝−４−オキソプロパン酸
ＤＯＡＧ ４−｛（１，２−ジオレオイル−エチル）アミノ｝−４−オキソペンタン酸
ＤＯＡＡ ４−｛（１，２−ジオレオイル−エチル）アミノ｝−４−オキソヘキサン酸
ＤＭＡＳ ４−｛（１，２−ジミリストイル−エチル）アミノ｝−４−オキソブタン酸
ＤＭＡＭ ４−｛（１，２−ジミリストイル−エチル）アミノ｝−４−オキソプロパン酸
ＤＭＡＧ ４−｛（１，２−ジミリストイル−エチル）アミノ｝−４−オキソペンタン酸
ＤＭＡＡ ４−｛（１，２−ジミリストイル−エチル）アミノ｝−４−オキソヘキサン酸
ＤＯＳ ５，６−ジオレオイル−ヘキサン酸
ＤＯＭ ４，５−ジオレオイル−ペンタン酸
ＤＯＧ ６，７−ジオレオイル−ヘプタン酸
ＤＯＡ ７，８−ジオレオイル−オクタン酸
ＤＭＳ ５，６−ジミリストイル−ヘキサン酸
ＤＭＭ ４，５−ジミリストイル−ペンタン酸
ＤＭＧ ６，７−ジミリストイル−ヘプタン酸
ＤＭＡ ７，８−ジオレオイル−オクタン酸
ＤＯＰＳ ジオレオイルホスファチジルセリン
ＤＰＰＳ ジパルミトイルホスファチジルセリン
ＤＯＰＧ ジオレオイルホスファチジルグリセロール
ＤＰＰＧ ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
Ｃｈｏｌ−ＳＯ４ コレステロールスルフェート
ＤＯＰＡ ジオレオイルホスファチジン酸
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＣＨＩＭ コレステロール−（３−イミダゾール−１−イルプロピル）カルバメート
ＤＤＡＢ ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド
ＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ：
１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン
ＤＯＤＡＰ、ＤＭＤＡＰ、ＤＰＤＡＰ、ＤＳＤＡＰ：
１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン
ＤＯＥＰＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＰＥＰＣ、ＤＳＥＰＣ：
１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン
ＤＯＴＭＡ Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド
ＤＯＴＩＭ １−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド
ＴＭＡＧ Ｎ−（ａ−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド
ＢＣＡＴ Ｏ−（２Ｒ−１，２−ジ−Ｏ−（１９Ｚ，９９Ｚ−オクタデカジエニル）−グリセロール）−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）カルバメート
ＤＯＤＡＣ ジオレイルジメチルアンモニウムクロリド
ＤＯＲＩＥ １，２−ジオレオイル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド
ＤＭＲＩＥ １，２−ジミリストイル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド
ＤＯＳＣ １，２−ジオレオイル−３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル
ＤＯＲＩ １，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド
ＤＨＭＨＡＣ Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド
ＤＨＤＥＡＢ Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ−メチル，Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムクロリド
ＤＭＨＭＡＣ Ｎ，Ｎ−ミリスチル−Ｎ−（１−ヒドロキシプロプ−２−イル）−Ｎ−メチルアンモニウムクロリド
ＤＯＴＢ １，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール
ＳＡＩＮＴ脂質 学際的研究のための合成両親媒性物質（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ ＩＮＴｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ）
ＤＰＩＭ、ＤＯＩＭ ４，（２，３−ビス−アシルオキシ−プロピル）−１−メチル−１Ｈ−イミダゾール（不特定の膜アンカー）
ＤＰＡＰｙ ２，３−ビス−パルミトイル−プロピル−ピリジン−４−イル−アミン
ＤＣ−Ｃｈｏｌ ３ｂ−［Ｎ−（Ｎ９，Ｎ９−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール
ＴＣ−Ｃｈｏｌ ３ｂ−［Ｎ−（Ｎ９，Ｎ９−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール
ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ ３ｂ（Ｎ−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール
ＰｉｐＣ２Ｃｈｏｌ ４｛Ｎ−２−エチルアミノ［（３’−β−コレステリル）カルバモイル］｝ピペラジン
ＭｏＣ２Ｃｈｏｌ ｛Ｎ−２−エチルアミノ［（３’−β−コレステリル）カルバモイル］｝モルホリン
ＭｏＣ３Ｃｈｏｌ ｛Ｎ−２−プロピルアミノ［（３’−β−コレステリル）カルバモイル］｝モルホリン
Ｎ−メチル−ＰｉｐＣｈｏｌ Ｎ−メチル｛４−Ｎ−アミノ［（３’−β−コレステリル）カルバモイル］｝ピペラジン
ＰｙｒｒｏＣ２Ｃｈｏｌ ｛Ｎ−２−エチルアミノ［（３’−β−コレステリル）カルバモイル］｝ピロリジン
ＰｉｐｅＣ２Ｃｈｏｌ ｛Ｎ−２−エチルアミノ［（３’−β−コレステリル）カルバモイル］｝ピペリジン
ＩｍＣ３Ｃｈｏｌ ｛Ｎ−２−プロピルアミノ［（３’−β−コレステリル）カルバモイル］｝イミダゾール
ＰｙＣ２Ｃｈｏｌ ｛Ｎ−２−エチルアミノ［（３’−β−コレステリル）カルバモイル］｝ピリジン
ＣＴＡＢ セチルトリメチルアンモニウムブロミド
ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎ^ＴＭ カチオン性カルジオリピン類（例えば、［１，３−ビス−（１，２−ビス−テトラデシルオキシ−プロピル−３−ジメチルエトキシアンモニウムブロミド）−プロパン−２−オール］
ＨｉｓｔＣｈｏｌ Ｎα−ヒスチジニル−コレステロール−ヘミスクシネート
ＭｏＣｈｏｌ ４−（２−アミノエチル）−モルホリノ−コレステロールヘミスクシネート：

ＨｉｓＣｈｏｌ ヒスタミニル−コレステロールヘミスクシネート：

ＤｍＣ４Ｍｏ２ ４−（２−アミノエチル）−モルホリノ−コレステロール−２，３−ジメチルヘミスクシネート

ＤｍＣ３Ｍｏ２ ４−（２−アミノエチル）−モルホリノ−コレステロール−２，２−ジメチルヘミマロネート

Ｃ３Ｍｏ２ ４−（２−アミノエチル）−モルホリノ−コレステロール−ヘミマロネート

Ｃ３Ｍｏ３ ４−（２−アミノプロピル）−モルホリノ−コレステロール−ヘミマロネート

Ｃ４Ｍｏ４ ４−（２−アミノブチル）−モルホリノ−コレステロール−ヘミスクシネート

Ｃ５Ｍｏ２ ４−（２−アミノエチル）−モルホリノ−コレステロール−ヘミグルタレート

Ｃ６Ｍｏ２ ４−（２−アミノエチル）−モルホリノ−コレステロール−ヘミアジペート

Ｃ８Ｍｏ２ ４−（２−アミノエチル）−モルホリノ−コレステロール−ヘミアジペート

分子容
脂質形状理論は、２つの分子部分の絶対的な値ではなく、所定の両親媒性物質の疎水性部分と極性ヘッド基との間の形状バランスに基づく。本発明に従って、κは、脂質の極性および無極性セクションの間の容積比である。
κ＝分子容（ヘッド）／分子容（テール）

分子容を計算するための多様な異なる方法が当業者に利用可能であり、そして代替的方法および入手先については、例えば、Connolly, M. J. Am. Chem. Soc. (1985) 107, 1118-1124および本明細書に記載の参考文献において考察されているか、またはhttp://www.ccl.net/cca/documents/molecular-modeling/node5. htmlに示されている。

分子容は、所定の原子対、ｉおよびｊについてのこれらの量の合計が、それらの可能な最短距離（ｄｉｊ）に等しくなるように、ファンデルワールス半径、ｒ^ｉ _ｖｄＷと呼ばれる値を、各原子タイプに割り当てることによって、一般に計算される：
ｒ^ｉ _ｖｄＷ＋ｒ^ｊ _ｖｄＷ≦ｄｉｊ

異なる著者由来の対応する原子の値が類似するにもかかわらず、「最良の」ファンデルワールス半径の異なる多くの表が存在する。幾何学的には、ファンデルワールス半径は、原子を囲む球状の「シールド」としてイメージすることができ、そして結合していない２つの原子間の最短距離は、それらのそれぞれのシールドが接触する場合に認められる。しかし、結合の長さは、係わる原子のファンデルワールス半径の合計より短いため、共有結合している原子のシールドは相交わる。分子のファンデルワールス表面はファンデルワールスエンベロープ(van der Waals envelope)とも呼ばれ、それらの相交わるセクションが取り出された個々の原子の球体からなる。

単一の分子（即ち、共有結合に沿った任意の２つの原子間に通路が存在する分子）について、ファンデルワールスエンベロープは閉じた面であり、従って、それは容積を含有する。この容積は分子容、またはファンデルワールスと呼ばれ、そして通常、Å^３で与えられる。コンピュータ上で分子容を計算する直接的な方法は、数値積分による。

いくつかの実施形態では、脂質分子ならびにそれぞれのヘッドおよびテールフラグメントの分子容は、DS Viewer Pro5.0（アクセルリス・インク(Accelrys Inc.)、サンディエゴ(San Diego)、カリフォルニア州）を使用して計算し得、そしてそれぞれのファンデルワールス半径内の容積を計算した。

典型的な膜フラグメントは、共通のリン脂質の疎水性セクションを表す１，２−ジアシル−エチレングリコール類であり、本来のグリセロールの３’炭素原子をホスホコリンヘッド基に残している。同じフラグメントは、共通のカチオン性脂質ＤＯＴＡＰおよびその誘導体においても、またさらにジミリストイルグリセロールヘミスクシネートなどのような他の極性ヘッド基を伴うジアシルグリセロール類においても見出される。

コレステロール誘導体では、ステロール全体（但し、３’酸素(oxygene)ではない）は、疎水性セクションとして定義され、そしてヘッド基はそれに相補的である。

同様に、カチオン性またはアニオン性アルキル誘導体では、極性ヘッド基は、アルキル鎖のＣ１炭素に関与する極性フラグメントとして定義される。結果的に、ｎ−１炭素原子内の残りの鎖は、疎水性無極性部分を表す。

分子容は、計算に使用される定数に依存し、そして分子のコンホメーションの影響を受け得る。疎水性無極性フラグメントについて得られる典型的な値は、さらなる計算のために現在使用され、そして過去においても使用された：

ほとんどの対アニオンの分子容が同じ方法で誘導されたが、Ｎａ＋またはＫ＋については、強度に束縛された水和球体を考慮する。以下の値をさらなる計算のために使用した：

１）Gerald H. Pollack: Cells, Gels and the Engines of Life, Ebner and Sons Publishers, 2001
２）http: //www.bbc.co.uk/dna/h2g2/A1002709#footnotel

荷電した極性ヘッド基については記述方法が異なり、この基のいくつかの個々のメンバーの分子容を以下に示す。これらの値をさらなる計算のために使用した：

脂質の分子容を決定するための他の方法を使用することも可能である。また、方法の一般的な適用性に影響を及ぼすことなく、膜のテールおよび極性ヘッド間の正確な分割ポイント；水和ケージ内の水分子の数またはファンデルワールス半径のようないくつかのパラメータを変動することができる。同様に理解して、分子容におけるより微細な変化、特に、陽子の解離またはコンホメーションの変化から生じる変化を無視してもよい。いくつかの実施形態では、上記の表２および３において列挙した分子容を、本発明の方法において使用してもよい。

対イオンは、実際の極性ヘッド基と同じサイズカテゴリーに当てはまる。従って、対イオンの付加または脂質極性領域からの対イオンの回収は、全ヘッド基サイズ、およびその結果、ヘッド／テールバランスκに対して実質的な効果を有することが見出されている。例えば、ＣＨＥＭＳナトリウム塩は、１４１Ａ^３のヘッド基サイズを有し、これは、ｐＨ４では、解離していない形態で７６Ａ^３まで減少する。κは、それぞれ、０．４２〜０．２３の間で変動する。ＣＨＥＭＳは、ｐＨ７．５およびそれ以上でラメラ相を形成するが、低いｐＨでヘキサゴナル相の形をとる。

既知の相挙動を伴う他の脂質を使用して、ラメラとヘキサゴナル相との間の解離のκ値を選択することができる；例を以下の表４に示す。ＰＥヘッド基は、末端のアミノ基とホスホエステル基の酸素との間に水素結合を伴う分子内環式構造（ベタイン構造）を形成することができる（例えば、Pohle et al., J. Mol. Struct., 408/409, (1997), 273-277）。ＰＣヘッド基は立体障害を受けるが、その代わり、それらのそれぞれの荷電した基に対イオンを補充する。

両性脂質混合物における分子容のｐＨ誘導性変化
第１のモデルでは、本発明とは対照的に、荷電したアニオン性およびカチオン性脂質の間で生じる脂質塩形成が認められる。これは、LiおよびSchick（Biophys. J., 2001, 80, 1703-1711）の仮説に反映し、そして立体障害を受けて、脂質塩を形成する脂質の事例（独立イオンモデル）に該当し得る。

膜における脂質種は、解離していないアニオンおよびカチオンならびに解離したアニオンおよびカチオンを含んでなり、後者は、それらのそれぞれの対イオンと複合体を形成する。そのような混合物のκ値は、その成分の加重合計であることが想定される：
（１）κ＝κ（ａｎｉｏｎ^０）^＊ｃ（ａｎｉｏｎ^０）＋κ（ｃａｔｉｏｎ^０）^＊ｃ（ｃａｔｉｏｎ^０）＋κ（ａｎｉｏｎ⁻）^＊ｃ（ａｎｉｏｎ⁻）＋κ（ｃａｔｉｏｎ^＋）^＊ｃ（ｃａｔｉｏｎ^＋）；
［式中、ａｎｉｏｎ^０またはｃａｔｉｏｎ^０は、荷電していない種を示し、そしてａｎｉｏｎ⁻またはｃａｔｉｏｎ^＋は、それぞれの荷電した種を示し；そして式中、ここでのｃは濃度を示す］。

そのような仮定において存在する個々の種の量は、酸性または塩基解離の既知の平衡定数Ｋから計算することができる：
（２）ｃ（ａｎｉｏｎ⁻）＝ｃ（ａｎｉｏｎ^ｔｏｔ）／（ｃ_Ｈ＋／Ｋ＋１）
（３）ｃ（ａｎｉｏｎ^０）＝ｃ（ａｎｉｏｎ^ｔｏｔ）−ｃ（ａｎｉｏｎ⁻）
（４）ｃ（ｃａｔｉｏｎ^＋）＝ｃ（ｃａｔｉｏｎ^ｔｏｔ）／（Ｋ／ｃ_Ｈ＋＋１）
（５）ｃ（ｃａｔｉｏｎ^０）＝ｃ（ｃａｔｉｏｎ^ｔｏｔ）−ｃ（ｃａｔｉｏｎ^＋）
［式中、ａｎｉｏｎ^０は、解離していないアニオンであり、ａｎｉｏｎ⁻は負に荷電した分子であり、そしてａｎｉｏｎ^ｔｏｔは、それぞれのアニオンの全濃度である。カチオンは同じ命名法に従い、そしてｃ_Ｈ＋およびＫは、それぞれ陽子濃度および酸性または塩基の平衡定数を表す］。

しかし、本発明に従って、カチオン性およびアニオン性両親媒性物質の間の可能な相互作用を考慮すると、脂質塩は、混合物において、第５の種として生じる：
（６） κ＝κ（ａｎｉｏｎ^０）^＊ｃ（ａｎｉｏｎ^０）＋κ（ｃａｔｉｏｎ^０）^＊ｃ（ｃａｔｉｏｎ^０）＋κ（ａｎｉｏｎ⁻）^＊ｃ（ａｎｉｏｎ⁻）＋κ（ｃａｔｉｏｎ^＋）^＊ｃ（ｃａｔｉｏｎ^＋）＋κ（ｓａｌｔ）^＊ｃ（ｓａｌｔ）

脂質塩では、カチオン性両親媒性物質はアニオン性両親媒性物質に対する対イオンとして役立ち、そして逆もまた同様であり、それ故、ヘッド基由来のナトリウムまたはホスフェートのような小さな対イオンを置き換える。脂質塩は、正味では荷電しておらず、そしてそのジオメトリーは、小さな対イオンを伴わずに両方の部分の合計であると想定されるべきである。従って：
（７） κ（ｓａｌｔ）＝（Ｖ_ｈｅａｄ（ｃａｔｉｏｎ）＋Ｖ_ｈｅａｄ（ａｎｉｏｎ））／（Ｖ_{ａｐｏｌａｒ}（ｃａｔｉｏｎ）＋Ｖ_{ａｐｏｌａｒ}（ａｎｉｏｎ））

塩の形成は、最も低い濃度で存在する荷電した両親媒性物質によって制限される：
（８） ｃ（ｓａｌｔ）＝ＭＩＮ（ｃ（ｃａｔｉｏｎ^＋）；ｃ（ａｎｉｏｎ⁻））

２つの荷電した両親媒性物質の間の塩形成は、このモデル内で完全であると想定されるが、もちろん、不完全な塩形成も想定され得る。以下の計算は、塩が２つの脂質分子を含んでなるという事実にさらに反映する。もちろん、脂質塩形成時のさらなるいくらの膜収縮を想定すること、およびｋ（ｓａｌｔ）の寄与に対して異なるウエートを置くことも可能である。

モデル計算
脂質混合物の両性特徴を達成するために、脂質イオンの少なくとも１つは、ｐＨ−感受性の弱酸性または塩基性（「荷電性」）である必要がある。詳細な開示内容については、WO 02/066012に見出され、その内容は、本明細書において参考として援用される。特徴が異なるが、これらの基本システムは可能であり、そしてここで解析する：
「両性物質Ｉ」強カチオンおよび弱アニオン
「両性物質ＩＩ」弱カチオンおよび弱アニオン
「両性物質ＩＩＩ」弱カチオンおよび強アニオン

両性物質Ｉシステム
両性物質Ｉシステムは、両性特徴を達成するために、過剰のｐＨ−感受性アニオンを必要とする。ｐＨ７〜８では、アニオン性脂質は十分に荷電し、そしてすべてのカチオン性脂質が消費されるまで、塩形成が生じる。７０ｍｏｌ．％アニオン性脂質および３０ｍｏｌ．％カチオン性脂質による例では、すべてのカチオン性脂質および対応する３０ｍｏｌ．％のアニオン性脂質は脂質塩として存在する一方、４０ｍｏｌ．％のアニオン性脂質は非結合型であり、そしてヘッド基に対してその対イオンを補充する。

中性条件から開始して、ｐＨの低下によりアニオン性脂質を放出し、κ値は、対イオンの消失のためにより小さくなり、そしてなお荷電しているアニオン性脂質の部分がカチオン性脂質の量に等しい場合、最小値に到達する。従って、κは、両性脂質混合物の等電点で最小である。ｐＨをさらに低下させる場合、アニオン性脂質のさらに小さな部分が荷電した状態で保持する。これは、脂質塩の解離、およびここで脂質塩から遊離したカチオン性脂質への対イオンの補充を意味する。

添付の図面の図１の左側のパネルは、ｐＨおよび混合物におけるアニオン性脂質の量に依存するκの複雑な挙動を例示する。「膜融合性の谷(valley)」が出現し、そして５５ｍｏｌ．％を超えるおよび８５ｍｏｌ．％未満のアニオン性脂質を有する任意の両性混合物が、弱酸性条件下で融合するが、中性およびより酸性の条件下の両方において安定であることが予想される。

アニオンは、カチオン性脂質上の電荷をモジュレートすることができるが、過補償しないため、５０ｍｏｌ．％未満のアニオン性脂質を伴う両性物質Ｉ混合物は、もはや両性ではない。これらの混合物は、ｐＨ−依存的融合を経験し得るが、低いｐＨでは第２の安定な相を提供しない。１：１複合体は、低いｐＨにおいてのみラメラ相の形をとり、そして中性において融合を経験する。

図１に例示した計算に使用したパラメータを、以下の表５に示す；容積をÅ^３で示す。

両性物質ＩＩシステム
両性物質ＩＩシステムは、アニオン：カチオン比の範囲全体にわたって両性であるという異なる利点を有し、そして両性物質Ｉまたは両性物質ＩＩＩシステムについては、強イオンに対する過補償は必要ない。モデルシステムの計算を図２に示す。

計算に使用するパラメータを以下の表６に示す；すべての容積をÅ^３で示す。

さらに、脂質塩モデルは、中性〜弱アルカリ性ｐＨ、但しまた、弱酸性ｐＨにおける安定な状態、およびその間の不安定性または膜融合性の顕著な谷を推定する。

両性物質Ｉシステムとは対照的に、膜融合状態には、アニオン性およびカチオン性成分の間の広範な異なる脂質比に及んで、到達することができる。即ち、膜融合性の谷は、より広範なアニオン／カチオン比に及んで延在し、所定のシステムが膜融合性であるｐＨにわたって、より大きな程度の制御を可能にする。

両性物質ＩＩＩ混合物
このｐＨでは、荷電したカチオン性脂質はほとんどまたは全く存在しないため、安定なアニオンおよびｐＨ−感受性カチオンを含んでなる両性物質ＩＩＩ混合物は、中性ｐＨでは脂質塩を形成することができない。最初に、カチオンを作製し、次いで、これが塩形成を経験し得るためには、継続した酸性化が必要である。モデルシステムの計算を図３に示す。

計算に使用するパラメータを以下の表７に示す；すべての容積をÅ^３で示す。

図１および３から認められ得るように、両性物質ＩＩＩシステムは、両性物質Ｉシステムの鏡像のように挙動する。弱い脂質イオンが、過剰に存在し、そして対向イオン(opposite ion)上の一定の電荷を過補償する限り、それらは、膜融合性の谷を提供する。両性物質Ｉシステムとは対照的に、融合のためのｐＨは、ｐＨ−感受性脂質イオンのｐＫより高い位置にある。

融合の谷についての実験的証拠を実施例１〜４に示すが、これによって、両性リポソームにおける脂質塩形成の中心的仮説が確認される。実施例はまた、密接に関連する２つの両性物質ＩＩＩシステム（ＭｏＣｈｏｌ／ＰＯＰＧおよびＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＰＡ）を提供し、ここで、融合は、２つのうちの一方、即ち、ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＰＡにおいてのみ観察される。ＭｏＣｈｏｌのプロトン化された第三級窒素は、モルホリノ環の下端側に配置され、従って、容易にアクセスできないため、これは、立体障害によるものであり得る。加えて、ＰＯＰＧのホスフェートは、正に脂質／水の界接面に位置し、そして水相に対してグリセロールで保護されている。対照的に、ＤＯＰＡのホスフェート基は、容易にアクセスすることが可能である。場合により、モデル構築の想定（上記の式（１）〜（５）のみ）から脂質塩形成を取り出す場合、上記のモデルを使用して、両方の状況を説明することができる。２つのシナリオの間の比較を図４に示す。図４の計算に使用したパラメータを以下の表８に示すが、Ｎａ／Ｈ_２ＰＯ_４のＤＯＰＡおよびＭｏＣｈｏｌをモデル化合物として使用した；そして容積をÅ^３で表す。

脂質塩モデルは、より低いｐＨによる融合を推定するが、一方、塩形成の欠失は、カチオン性脂質がプロトン化される場合にκの増加が観察されるシステムをもたらす。たとえ生じるとしても、そのような状況は、なおさらなるラメラおよび究極的に膜のミセル状態をもたらす。しかし、このモデルに関しては、ミセル形成の限界は決定されていない。

ＭｏＣｈｏｌがイオン化される（ｐＫａ＝６．５）場合、ＤＯＰＡはモノアニオンとして存在するため、ＤＯＰＡのモノアニオン状態（ｐＫａ１＝３、ｐＫａ２＝８）をモデルに使用した。モデルは、３３ｍｏｌ．％アニオンにおいて膜融合性をほとんどまたは全く推定せず、５０ｍｏｌ．％アニオンにおいて谷型の融合挙動を推定し、そして６６ｍｏｌ．％およびそれ以上のアニオンにおいて単相の融合挙動を推定する以下の実施例４において例示されるように、モデルの複雑性全体は、膜の実際の挙動に反映される。

本発明に従うアルゴリズムは、広範な両性脂質混合物の融合挙動の推定を可能にする。推定の規則は、相互作用する脂質の単純な幾何学的説明から誘導され、そして分子の実際の化学的表現に依存しない。従って、当業者は、現存するおよび新規の脂質の組合せを容易に試験することができ、そして合理的な方法で意図される融合挙動を推定することができる。以下の重要なパラメータは、そのような選択プロセスを例示し得るが、他の優先事項は、アプリケーションのそれぞれの目的に依存して設定され得る。

１．脂質塩のκ
脂質塩のκは、上記の式（７）において計算され、そして膜融合性ヘキサゴナル相を合理的に推定するために、適切には、０．３４または０．３５未満であり得る。いくつかの実施形態では、κは０．３未満；好ましくは、０．２５未満であってもよい。組み合わされた極性ヘッド基が小さく、そして組み合わされた疎水性部分が大きい場合、κ（ｓａｌｔ）は低い。ヘッド基容積の好適な合計は約３００Å^３またはそれ以下であり；より好適な実施形態では、この容積は２２０Å^３未満であり、そしてなおより好適な値は、１７０Å^３未満である。上記で作成される選択に従えば、テール基容積の好適な合計は、６５０Å^３より大きく、そして約１０００Å^３のように大きくてもよく、ここで、適切なヘッドおよびテール基の組合せは、好適なｋ（ｓａｌｔ）値によって管理される。

２．変化（ｄ（κ）／ｄ（ｐＨ））の振幅
本発明の好適な実施形態では、低い値のκ値を伴う脂質塩を、対イオンの補充によって、その等電点未満またはそれを超えて安定化させる。本発明の好適な実施形態では、より大きな対イオンを使用して、両性脂質混合物のカチオンまたはアニオン状態のいずれかに安定化する。図５は、両性物質ＩＩシステムの対イオンサイズのそのような依存性を例示している。図５の計算に使用したパラメータを以下の表９に示す。

そのような安定化は、非対称的であり得、例えば、カチオン相のむしろ制限された安定化および両性脂質混合物のアニオン相のさらなる安定化を提供することが、図５の右側のパネルから明らかになっている。また、生理学的体液中に天然には存在しない対イオンを使用して、貯蔵中の安定性を改善してもよく；そのような貯蔵イオンの体液中に存在するナトリウムイオンとの交換は、インビボでリポソームからカーゴを放出するのに遊離であり得る。従って、脂質相の個々または共通の安定化のための適切なイオン容積の選択は、本発明の好適なアプリケーションである。そのような安定化は、両性リポソームを製造するのに、および貯蔵に特に有用である。

本発明のいくつかの実施形態では、より大きな対カチオンを使用して、中性条件で両性リポソームを安定化する。好適な実施形態では、そのような対カチオンは、５０Å^３もしくはそれ以上の分子容を有し、より好適な実施形態では、この容積は７５Å^３を超え、そして前記中性ｐＨは、ｐＨ７〜ｐＨ８の間、より好適には、７．４の生理学的ｐＨ付近である。

薬学的目的で両性リポソームを生成する場合、使用するイオンのアプリケーション経路との適合性に従う必要がある。適切な対カチオンは、イオンサイズについて説明した上記の表２から選択することができる。医薬組成物のための好適な対カチオンは、ナトリウム、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス−ヒドロキシエチルアミノメタン、トリエチルアミン、アルギニン、特に、Ｌ−アルギニンなどのそれぞれのイオン化された形態である。

本発明の実施形態では、両性リポソームを、低いｐＨで、それらのカチオン状態で製造してもよい。これらの条件下では、リポソームは、タンパク質、ペプチドまたは（大きなプラスミドもしくは小さなオリゴヌクレオチドのいずれにせよ）核酸のようなポリアニオンと結合することができる。そのような結合は、前記材料の両性リポソームへのカプセル化効率の改善に有用である。

酸性ｐＨで低いκを伴う脂質相を使用することは有利である。大きな対アニオンの選択は、例えば、そのようなリポソームの生成およびこれらの条件下におけるカーゴのカプセル化のための前記脂質相の安定化を容易にする。

適切な大きな対アニオンは、５０Å^３を超える分子容を有し、好適な大きな対イオンは、７５Å^３を超える分子容を有する。適切な対アニオンは、上記の表２から選択することができる。適切な対アニオンは、シトレート、ピロホスフェート、バルビツレート、メチルサルフェートなどである。

脂質相と、酸性条件下でカプセル化しようとするカーゴとを接触させた後、リポソームを中和し、そしてカプセル化されていないカーゴを、場合により、取り出すことができる。典型的に、カプセル化されていないカーゴおよび脂質膜は、両方とも中性条件下で同じ電荷を担持するため、カプセル化されていないカーゴは、脂質膜から脱離する。両性リポソームは、それらの等電点付近、例えば、７〜８のｐＨで負に荷電し、そしてカーゴ分子は、そのようなｐＨにおいてポリアニオンとして存在する。これは、特に、１つの核酸塩基あたり１つの負に荷電した電荷を担持する核酸の場合に当てはまる。より小さな対アニオンとの組合せで低いｐＨに暴露される場合、そのようなリポソームは、有効な不安定化を経験することができる。これは、例えば、そのようなリポソームの全身投与および細胞内取り込みおよびエンドサイトーシス後の場合に当てはまる。クロリドまたはホスフェートは、動物（いずれの動物であってもよい）、哺乳動物またはヒトの体液における最も一般的な対アニオンである。ホスフェート（但し、クロリドではさらにそうであるが）は、水和殻をほとんどまたは全く伴わず、そして＜６０Ａ^３の分子容を伴う小さな対イオンである。

図６は、リポソーム作製および使用のサイクルを例示し、非対称的な対イオン使用を介する酸性条件下における脂質相の選択的安定化および不安定化を例示する。図６の計算に使用したパラメータを以下の表１０に示す；容積をÅ^３で示す。

３．等電点
両性リポソームの等電点についての数理的な説明については、WO 02/066012に示されている。本発明に従って、両性リポソームの等電点を、広範な条件に調整することができ、そして当業者が両性リポソームの作製のための有用な成分および組合せを選択することを可能にする異なるｐＫ解離定数を伴う個々の脂質の十分な化学的表現が存在する。加えて、Hafez et al., Biophys. J., 79, (2000), 1438-1446において提示されるように、所定の両性脂質組成物の等電点は、アニオン性およびカチオン性脂質との間のモル比を介して容易に調整することができる。

４．κ（脂質塩）と対イオンとの間の関係
κおよび対イオンサイズの好適な値については、上記に示した。これらの基準に加えて、脂質分子の絶対的な分子容は重要である。大きな絶対的な容積のため、対イオン結合の相対的な影響は小さくなる。このことは、同一のκを伴う、但し、異なる絶対的な容積をも伴う脂質について、図７において例示されている。図７の計算に使用した他のパラメータを以下の表１１に示す；容積をÅ^３で示す。

本発明の好適な実施形態では、アニオン性およびカチオン性脂質の組み合わされた容積について、脂質の絶対的な分子容は小さく、例えば、＜１０００Å^３である。約７００Å^３の分子容を伴う脂質対がより好適である。

異なる容積の対イオンの場合がそうであったように、カチオン性およびアニオン性脂質相の非対称的安定性もまた、異なる絶対的な分子容を伴う脂質が等しいκ値を有する場合であっても、前記脂質の選択によって、達成することができる。図８の例は、より小さなアニオン性脂質が酸性条件下で選択的不安定化をもたらすような設計変種を例示する。図８の計算に使用したパラメータを以下の表１２に示す；容積をÅ^３で示す。

従って、本発明に従う上記で示したアルゴリズムは、特に、環橋のｐＨに応答して、得られる膜の脂質化学および安定性の間の構造活性相関を提供する。実験データは、本発明をさらに例示し、そしてモデル推定を正当化する。以下のことを明確に立証する証拠が存在する：
１．両性リポソームは、中性ｐＨで安定な二重相を形成するが、中間のｐＨにおいて膜融合性である。いくつかの両性リポソームは、低いおよび中性ｐＨで安定な相に存在する双安定性のリポソームを形成するが、中間のｐＨにおいて融合を経験する。実施例２、３、５および６ならびに対応する図１０、１１、１２および１３は、異なる両性システムおよび脂質ジオメトリー、例えば、ジアルキル−またはコレステロール−またはモノアルキル膜アンカーを伴う脂質についてこれを示す。

２．実施例８および９ならびに対応する図１６および１７に示されるように、融合の強度は、異なるサイズの対イオンの使用を介して増大または低減させてもよい。

３．κ（ｓａｌｔ）は、異なる両性システムの融合強度と逆相関する。これは、より低いκ（ｓａｌｔ）を伴うシステムが増強された融合を示すことを意味する。実験的証拠を実施例１２および１３に示す。図１９ａおよび１９ｂは、多数の両性物質ＩＩシステムについて、融合強度（ΣＦＲＥＴとして表される）とκ（ｓａｌｔ）との間の逆相関関係を示し、前記システムは、コレステロールベースのｐＨ感受性カチオン性脂質およびｐＨ感受性アニオン性脂質から形成される。図１９ｃは、異なるアニオン性ｐＨ感受性脂質との組合せでカチオン性脂質ＤｍＣ４Ｍｏ２のそのようなプロットを例示する。同様に、図２０は、ＤＯＴＡＰまたはＤＯＤＡＰおよび多様なｐＨ感受性アニオンを含んでなる両性物質Ｉシステムのそのような逆相関関係を示す。両性システムのκ（ｓａｌｔ）の値と膜融合性との間の明確な相関関係は、これらの実験から明らかになる。

４．モデルはまた、中性脂質をさらに含んでなる両性脂質混合物にも当てはまり、そしてそのような混合の量的影響を、実施例１５および対応する図２１〜２４に示す。κ（中性脂質混合物）とκ（ｍｉｎ）との間の関係は、モデル推定に含まれており、そして下記においてさらに説明する。簡単に説明すると、κ（ｎｅｕｔｒａｌ）がκ（ｍｉｎ）より高い場合は常に、中性脂質を含めると、所定の両性システムの融合強度が減少し得る。図２１ａ、ｂおよび２４ａ、ｂは、実験的にこれを実証する。また、図２３ａ、ｂにおいて実証されるように、その逆の事例を見出すこともできる。結局、図２２ａ、ｂにおいて示されるように、いくつかのシステムは、中性脂質の導入の影響をそれほど受けない。より多くの成分を伴うシステムの実験的最適化では、難易度および労力が増大するため、本発明に従う多数の推定可能性は、なおより重要になり、そして迅速かつ有効な推定を可能にする。

５．モデルは、脂質混合物の等電点付近の融合を推定する。そのような相関関係は、実験で実証することができ、そして図２６において解析する。

上記で提供したデータは、モデル計算からの高い程度の推定可能性を示す。分子容の考慮および電荷のむしろ長い範囲の相互作用から開始するアルゴリズムは、成分の立体的適合性または不適合性に反映せず；それはまた、特別な場合に生じ得る相転移温度および関連する分子運動を考慮していない。場合によって、減損された融合挙動（例えば、ＭｏＣｈｏｌとＰＯＰＧとの間であって、上記のようにＭｏＣｈｏｌとＤＯＰＡとの間ではない）または増強された融合挙動を観察することができる（例えば、ＤｍＣ４Ｍｏ２および多様なアニオン性脂質）。増強された融合挙動が観察される場合では、脂質塩のｋ（ｓａｌｔ）は、０．３５より高いが、０．４５未満であり得る。

以下は、広範な両性システムのリポソーム融合およびさらなる実践的用途のための選択された好適なシステムの評価である。

本発明によって教示される量的構造活性相関は、インシリコスクリーニングを容易にし、そして合理的な選択および最適化を支持する。そのようなスクリーニングは、例えば、一連の脂質ホモログ内の選択されたデータポイントを含めることによって、それ自体または経験的実証との組合せで使用してもよい。以下のセクションは、次のものを含んでなる：
セクションＩ：両性システムのインシリコスクリーニング
セクションＩＩ：中性脂質をさらに含んでなる、両性システムのインシリコスクリーニング
セクションＩＩＩ：両性システムの実験的スクリーニング
セクションＩＶ：中性脂質をさらに含んでなる、両性システムの実験的スクリーニング

セクションＩ：両性脂質のインシリコスクリーニング
本発明は、多くの技術的目的のための両性リポソームの選択を可能にする。薬学的アプリケーションにおけるそのような両性リポソームの使用についてのより詳細な解析を以下に示す。そのような薬学的アプリケーションのうち、非経口投与およびヒトまたは非ヒト動物、好ましくは、哺乳動物の血流への直接投与は、特に重要である。両性リポソームは、特に、カーゴ分子の細胞内送達における特異的適用性を有する。上記のように、細胞への取り込み中、リポソームは、細胞のエンドソームまたはリソソームにおける酸性環境に暴露される。例えば、増強された膜融合性による脂質相の不安定化は、エンドソームエスケープおよび細胞内送達を容易にすることが公知である。低いｐＨの他の環境、例えば、腫瘍または炎症の部位において見出される低いｐＨ条件もまた、前記融合を誘発することが可能である。

好適に低い値のκ（ｓａｌｔ）を伴う本発明に従う両性リポソームは、意図される膜融合相の不安定化または形成によって、酸性化に有利に応答することを見出した。

貯蔵条件下または一方で血流中において安定であるために、中性ｐＨにおけるκ（ｔｏｔａｌ）とκ（ｓａｌｔ）との間の所定の際が必要である。好適な実施形態では、そのような差異は、本明細書においてｄκ（ｐＨ８）と称され、０．０８より大きいかまたは等しくあり得る。上記のように、κ（ｓａｌｔ）は、膜融合性の優勢な推定変数である一方、ｄκ（ｐＨ８）＞＝０．０８が必要であるが、十分条件ではない。計量としての１／κ（ｓａｌｔ）を使用して、選択されシステムの評価を行った。高い値は、良好な融合および十分な安定性振幅を伴うシステムを示す。

酸性条件下での不安定な脂質相は、細胞内取り込みを妨害しないため、酸性条件のためのκ（ｓａｌｔ）とκ（ｔｏｔａｌ）との間の差異は、それほど重要ではない。加えて、生成のためにそのような脂質相を安定化するための方法については、上記で説明した。

解析は、対カチオンサイズおよび混合物におけるアニオン性脂質の割合に対して感度がある。上記のように、このパラメータは、ｄκ（ｐＨ８）を直接改善し、これは、低い振幅を伴うシステムがより機能的になることを意味するため、より大きな対カチオンは、選択をそれほど厳格にしない。それはまた、低いκ（ｓａｌｔ）を伴うシステムを十分に安定化して、中性ｐＨで安定な相を得ることができることを意味する。多かれ少なかれ厳格な選択が生じるが、対カチオンサイズは、選択されたシステムの観察された全体のパターンを変更しない。この事実は、文献において見出すことができる対カチオンサイズの可変性を効果的に補償する。

４０〜１９０Ａ^３の間の脂質ヘッド基サイズおよび３４０、４１０または５００Ａ^３の脂質疎水性テールサイズを伴う両性脂質システムを、対カチオン、具体的には、ナトリウム（６５Ａ^３）の存在下で解析した。イオン（１）は、脂質塩に参加せず、そして（２）は、本質的にｐＨ８で膜に結合しないため、対アニオンは、提示されたスクリーニングにそれほど関連しない。

両性物質Ｉならびに両性物質ＩＩおよびＩＩＩシステムの以下のインシリコスクリーニングは、膜融合性両性リポソームのより一般的かつ実験的な不偏的選択を提供する。計算は、当業者が、好適なヘッドおよびテールサイズを伴う両親媒性物質を推測し、続いて、改善された両性脂質混合物を同定することを可能にする。

κ（ｓａｌｔ）＜０．３４およびｄκ（ｐＨ８）＜＝０．０８、ならびに好適な脂質システムの同定された限界値に従って、以下の選択を行った。選択のための他の限界値を使用して、所望する両性脂質システムのより広いまたはより狭い範囲の検索を可能にすることができる。

両性物質Ｉシステム
両性物質Ｉシステムでは、ｐＨ８において、アニオン性両親媒性物質の完全解離を想定した。Ｃ／Ａ＝０．５を有する３２４種の両性物質Ｉ脂質システムのライブラリーを構築し、そしてκ（ｓａｌｔ）＜０．３４およびｄκ（ｐＨ８）＜＝０．０８を有する好適な脂質システムを、母集団全体から選択した。

表１３：高度に機能的な両性物質Ｉシステム（Ｃ／Ａ＝０．５、ｋ（ｓａｌｔ）＜０．３４、ｄｋ（ｐＨ８）＞＝０．０８）、値は１／ｋ（ｓａｌｔ）を表す。

表１３
６０頁を参照のこと。

表は、ポジティブスクリーニングしたシステムを示し、そして脂質テール基の特定の組み合わせ内のそのようなシステムの不変のパターンを表す。

両性物質Ｉシステムにおける脂質アニオン内容物の効果は、いくらかさらに複雑である。まず第１に、脂質アニオン（例えば、Ｃ／Ａ ０．６６６もしくは６０ｍｏｌ％）の存在量が低いほど、選択はより厳格になるが、これは、そのようなシステムの振幅がより小さくなるためである。従って、より多量の脂質アニオンが存在すると、選択はそれほど厳格でなくなる。それぞれの計算の結果を以下に示す。

表１４：高度に機能的な両性物質Ｉシステム（Ｃ／Ａ＝０．６６６、ｋ（ｓａｌｔ）＜０．３４、ｄｋ（ｐＨ８）＞＝０．０８）、値は１／ｋ（ｓａｌｔ）を表す。

表１４
６１頁を参照のこと。

アニオン性脂質がより少ない量で存在すると、任意のテールサイズのカチオン性脂質と組み合わされた大きなヘッド基を伴うステロールベースの脂質アニオンに対して選択圧が生じるが、但し、これらの脂質は、４０〜７０Ａ^３の間の分子容を伴う最小のヘッド基を有する。

アニオン性脂質がより多量に存在すると、前記選択圧が緩和され、そして一般的に組成物の自由度が増す。以下の表に示されるように、それはまた、脂質アニオンヘッド基の至適サイズを１００〜１３０Ａ^３の間の中程度の値に移行する。

表１５：高度に機能的な両性物質Ｉシステム（Ｃ／Ａ＝０．３３３、ｋ（ｓａｌｔ）＜０．３４、ｄｋ（ｐＨ８）＞＝０．０８）、値は１／ｋ（ｓａｌｔ）を表す。

表１５
６２頁を参照のこと。

好適な両性物質Ｉシステムは、上記の手順によって迅速に同定することができ、前記システムは、以下によって特徴付けられる
・κ（ｓａｌｔ）は０．３４より小さい
・ｄκ（ｐＨ８）は０．０８より大きい。

より好適なシステムは、以下を有する
・ステロール類またはジミリストイルエチレングリコール類の群から選択される４２０Ａ^３より小さな分子容を伴うより小さな脂質アニオンテール基であって、最も好適には、この群はステロールである。

別の実施形態では、より好適なシステムは以下を有する
・７０Ａ^３〜１９０Ａ^３の間の分子容を伴うアニオン性ヘッド基であって、前記群は、ヘミマロネート類、ヘミスクシネート類、ヘミグルタレート類、ヘミアジペート類、シクロヘキサン二酸類(cyclohexanoic diacids)、グルクロン酸類およびそれらのホモログから選択されるが、それらに限定されない。
４０〜１００Ａ^３の間、最も好ましくは、４０〜７０Ａ^３の間の小さな分子容を伴うカチオン性ヘッド基であって、前記群は、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン類、テトラメチルアンモニウム塩類、Ｎ−メチルピリジニウム塩類、トリメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム塩類、Ｎ−ａトリメチルアンモニウムアセチル塩、ジメチルアミノエチルカルバメート類、Ｎ−メチル−モノ（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ−メチル−ビス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびそれらのホモログから選択されるが、それらに限定されない。

最も好適な両性物質Ｉシステムは、より多量の脂質カチオンの存在下で低いκ（ｓａｌｔ）および高いｄκ（ｐＨ８）値を有し、それ故、オリゴヌクレオチドのようなポリアニオン性カーゴ分子のより良好な結合およびカプセル化を容易にする。これらのシステムは、以下を有する
・１３０Ａ^３より大きい、最も好適には、約１６０〜１９０Ａ^３である極性ヘッド基を伴うステロールベースの脂質アニオン
・１００Ａ^３より小さい、最も好適には、７０Ａ^３より小さい極性ヘッド基を伴うジオレオイルグリセロールベースの脂質カチオン。

両性物質ＩＩおよびＩＩＩシステム
両性物質ＩＩシステムでは、ｐＨ８において、アニオン性両親媒性物質の完全解離を想定し、そして本質的に、このｐＨでは、カチオン性両親媒性物質の完全解離は想定されなかった。両性物質ＩＩＩシステムが５０％もしくはそれ以下のアニオン性両親媒性物質を含有する限り、そのような選択もまた、それらに当てはまる。

まず、Ｃ／Ａ＝３を有する３２４種の両性物質ＩＩ脂質システムのライブラリーを構築し、そしてκ（ｓａｌｔ）＜０．３４およびｄκ（ｐＨ８）＜＝０．０８を有する好適な脂質システムを、この母集団から選択した。

表１６：高度に機能的な両性物質ＩＩシステム（Ｃ／Ａ＝３、ｋ（ｓａｌｔ）＜０．３４、ｄｋ（ｐＨ８）＞＝０．０８）、値は１／ｋ（ｓａｌｔ）を表す。

表１６
６４頁を参照のこと。

好適なカチオンリッチ両性物質ＩＩ（または両性物質ＩＩＩ）システムは、上記の手順で同定することができ、前記システムは以下によって特徴付けられる
・κ（ｓａｌｔ）は０．３４より小さい
・ｄκ（ｐＨ８）は０．０８より大きい
・ステロール類またはジミリストイルエチレングリコール類の群から選択される４２０Ａ^３より小さな分子容を伴う脂質カチオンテール基であって、最も好適には、この群はステロールである
・ジアシルエチレングリコール類、最も好適には、ジパルミトイル−、ジステアロイル−、パルミトイルオレオイル−またはジオレオイルエチレングリコール類の群から選択される４００Ａ^３より大きな分子容を伴う脂質アニオンテール基

別の実施形態では、より好適なシステムは以下を有する
モルホリン類、プロピルイミダゾール類、３−イミダゾール−１−イル−プロピルカルバメート類、ピペラジン４−Ｎ−アミノエチルカルバモイル類、２−（４−イミダゾリル）エチルアミンヘミスクシネート類、１−［２−カルボキシエチル］２−メチル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウム塩類、エチルホスホコリン類、Ｎ−モルホリノエチルアミンヘミスクシネート類、１−メチル−４−コリン−コハク酸ジエステル類および前記化合物のホモログから選択されるが、それらに限定されない７０Ａ^３〜１６０Ａ^３の間の分子容を伴うカチオン性ヘッド基
４０〜１００Ａ^３の間、最も好適には、４０〜７０Ａ^３の間の小さな分子容を伴うアニオン性ヘッド基であって、前記群は、ヘミマロネート類、ヘミスクシネート類、ヘミグルタレート類およびそれらのホモログから選択されるが、それらに限定されない。約等モルのＣ／Ａを伴う両性物質ＩＩシステムは、より複雑な選択パターンを有するが、上記のカチオンリッチシステムを含む。従って、前記システムは、機能性を消失することなく、等電点を調整することを容易にする。以下の表１７は、上記で示した基準に従って選択したシステムを示す：

表１７
６５ａ頁を参照のこと。

表１７：高度に機能的な両性物質ＩＩシステム（Ｃ／Ａ＝１、ｋ（ｓａｌｔ）＜０．３４、ｄｋ（ｐＨ８）＞＝０．０８）、値は１／ｋ（ｓａｌｔ）を表す。

カチオンリッチ両性物質ＩＩシステムに使用される選択基準に加えて、両性物質ＩＩ（Ｃ／Ａ＝１）システムは、以下を選好する
・ステロール類またはジミリストイルエチレングリコール類の群から選択される４２０Ａ^３より小さな分子容を伴う脂質アニオンテール基であって、最も好適には、この群はステロールである。構造的拘束に関する限り、アニオンリッチ両性物質ＩＩシステムは、最も制限の少ないシステムである。しかし、この構造的自由度は、ポリアニオン、特に、オリゴヌクレオチドのような重要なカーゴタイプの制限されたカプセル化効率を犠牲にして生じる。選択スクリーニングを、両性物質ＩＩシステムに適用したが、ここで、Ｃ／Ａ＝０．５であり、以下のパターンの結果を得た：

表１８
６６ａ頁を参照のこと。

表１８：高度に機能的な両性物質ＩＩシステム（Ｃ／Ａ＝０．５、ｋ（ｓａｌｔ）＜０．３４、ｄｋ（ｐＨ８）＞＝０．０８）、値は１／ｋ（ｓａｌｔ）を表す。

アニオンを過剰に伴う両性物質ＩＩシステムは、以下を選好する
・１３０Ａ^３未満、好適には、１００Ａ^３未満の分子容を伴うカチオンヘッド基であって、イミダゾール類、メチルイミダゾール類、エチルイミダゾール類、モルホリン類、メチルモルホリン類、エチルモルホリン類、Ｎ−メチル−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン類、３−イミダゾール−１−イル−プロピルカルバメート類、ピペラジン４−Ｎ−アミノエチルカルバモイル類、Ｎ−メチル−モノ（ヒドロキシメチル）アミノメタン類、Ｎ−メチル−ビス（ヒドロキシメチル）アミノメタン類およびそれらのホモログから選択されるが、それらに限定されない。
１３０Ａ^３未満、好適には、約７０Ａ^３もしくはそれ以下の分子容を伴うアニオン性ヘッド基であって、ヘミマロネート類、ヘミスクシネート類、ヘミグルタレート類、ヘミアジペート類、シクロヘキサン二酸類およびそれらのホモログから選択されるが、それらに限定されない。

混合物中により多くの脂質アニオンを伴う場合、ポジティブに選択される候補のパターンは、両性物質Ｉシステムのパターンに類似する。しかし、脂質塩の一定の形成はこの振幅を減少するため、それらのｄｋ（ｐＨ８）値において、後者はいくらか損なわれる。

セクションＩＩ：中性脂質をさらに含んでなる、両性システムのインシリコスクリーニング
本発明によって教示されるアルゴリズムはまた、両性脂質システムへの中性脂質混合の影響に関する定量的推定を行うことを容易にする。そのような混合は、リポソームの改善された安定性を生じ得；それらは、血清タンパク質に対するより良好な耐性または細胞への増強された取り込みをさらに生じ得る。有用な成分が多量あるため、両性システムの最適化は、それ自体、労力を要する作業である。この作業は、さらなる成分が追加されることでなおさらに複雑になり、そして合理的なアプローチが緊急に必要とされている。

従って、上記の先のセクションにおいて展開した方法論を、中性脂質成分を含むより複雑なシステムに適用した。主なパラメータｋ（ｓａｌｔ）およびｄｋ（ｐＨ８）に関して、中性脂質の添加は、以下を生じ得る
・ｋ（ｎｅｕｔｒａｌ）がｋ（ｓａｌｔ）より高い、そして逆もまた同様である場合のｋ（ｍｉｎ）の増加であって、前記増加は、添加した中性脂質の量に比例する
・任意の中性脂質の添加によるシステム振幅ｄｋ（ｐＨ８）の圧縮（これらの脂質は、ｐＨの変更時にそれらのジオメトリーを変更しないため）。

なお、より複雑なシステムであっても、融合を達成するための所定のｋ（ｍｉｎ）および安定性を維持するための所定のｄｋ（ｐＨ８）を必要とする。セクション１の対応する値は、本明細書において提示した解析に使用されており、その値は、ｋ（ｓａｌｔ）に機能的に均等であるｋ（ｍｉｎ）、前記ｋ（ｍｉｎ）＜０．３４およびｄｋ（ｐＨ８）＞０．０８である。

中性脂質をさらに含んでなる両性物質Ｉシステム
両性物質Ｉシステム（Ｃ／Ａ＝０．３３３）のライブラリーを、先に記載のように構築し、そして基準としてｋ（ｍｉｎ）＜０．３４およびｄｋ（ｐＨ８）＞０．０８を使用して、高度に機能的なシステムを選択した。選択されたシステムの適性を、ライブラリーへの３０％コレステロールの添加について、以下の表に１／ｋ（ｍｉｎ）として提示する。

表１９
６８ａ頁を参照のこと。

表１９：３０％コレステロールを含んでなる高度に機能的な両性物質Ｉシステム。（Ｃ／Ａ＝０．３３３、ｋ（ｍｉｎ）＜０．３４およびｄｋ（ｐＨ８）＞０．０８、値は１／ｋ（ｍｉｎ）を表す。

セクションＩの対応する両性物質Ｉライブラリーについて提示されるデータと比較して、コレステロールの添加は、大きなヘッド基を伴うアニオン性脂質へさらに偏向するいくらか異なる選択を生じる一方、アニオン性脂質のテール領域としてのコレステロールまたはジミリストイルグリコールのための両性物質Ｉの選好のような他の特徴を維持する。

ＰＯＰＣまたはＤＯＰＣのような強力なラメラ脂質の添加は、先に提示した選択規則に対する量的影響を伴わないより厳格な選択を生じる。

中性脂質をさらに含んでなる両性物質ＩＩシステム
カチオンリッチ両性物質ＩＩシステム（Ｃ／Ａ＝３）のライブラリーを、先に記載のように構築し、そして基準としてｋ（ｍｉｎ）＜０．３４およびｄｋ（ｐＨ８）＞０．０８を使用して、高度に機能的なシステムを選択した。選択されたシステムの適性を、ライブラリーへの３０％コレステロールの添加について、以下の表２０に１／ｋ（ｍｉｎ）として提示する。

表２０
６９ａ頁を参照のこと。

表２０：３０％コレステロールを含んでなる高度に機能的な両性物質ＩＩシステム。（Ｃ／Ａ＝３、ｋ（ｍｉｎ）＜０．３４およびｄｋ（ｐＨ８）＞０．０８、値は１／ｋ（ｍｉｎ）を表す。

セクションＩの対応するカチオンリッチ両性物質ＩＩライブラリーについて提示されるデータと比較して、コレステロールの添加は、大きなヘッド基を伴うカチオン性脂質へ実質的に偏向するいくらか異なる選択を生じる一方、アニオン性脂質のジミリストイルグリコールまたはジオレオイルグリコールのような大きなテール領域のための両性物質Ｉの選好のような他の特徴を維持する。

ＰＯＰＣまたはＤＯＰＣのようなラメラ脂質の添加は、先に提示した選択規則に対する量的影響を伴わないより厳格な選択を生じる。

また、平衡化された両性物質ＩＩシステム（Ｃ／Ａ＝１）のライブラリーを構築し、そしてこのライブラリー中３０％コレステロールの存在下で、選択スキームに導入した。

表２１
７０ａ頁を参照のこと。

表２１：３０％コレステロールを含んでなる高度に機能的な両性物質ＩＩシステム。（Ｃ／Ａ＝１、ｋ（ｍｉｎ）＜０．３４およびｄｋ（ｐＨ８）＞０．０８、値は１／ｋ（ｍｉｎ）を表す。

セクションＩの対応する両性物質ＩＩライブラリー（Ｃ／Ａ＝１）は、多数のポジティブなシステムを有した一方、３０％コレステロールの添加は、極めて厳格な選択を生じた。これは、融合を促進する脂質の添加に対して一見反するが、選択基準としてｄｋ（ｐＨ８）の影響を例示する。以下を含んでなる緊密な基を同定することもできる：
・１００Ａ^３より大きなヘッド基容積を伴うステロールベースの脂質アニオン
・１６０Ａ^３より小さい、より好適には、７０Ａ^３より小さいヘッド基容積を伴うジアシルグリコールベースのカチオン

この基では、ＰＯＰＣまたはＤＯＰＣのようなラメラ脂質の添加は、コレステロールの添加に類似の影響を及ぼす。

また、アニオンリッチ両性物質ＩＩシステム（Ｃ／Ａ＝０．３３）のライブラリーを構築し、そしてこのライブラリー中３０％コレステロールの存在下で、選択スキームに導入した。

表２２
７１ａ頁を参照のこと。

表２２：３０％コレステロールを含んでなる高度に機能的な両性物質ＩＩシステム。（Ｃ／Ａ＝０．３３３、ｋ（ｍｉｎ）＜０．３４およびｄｋ（ｐＨ８）＞０．０８、値は１／ｋ（ｍｉｎ）を表す。

ここで、ポジティブ候補のより大きなアニオンヘッド基へのいくつかの偏向を観察することができる。しかし、融合活性は、小さなアニオン性ヘッド基の存在下で常に改善しているため、このことは注意深く解釈する必要がある。

ＰＯＰＣまたはＤＯＰＣのようなラメラ脂質の添加は、セクションＩにおけるシステムと比較して、より厳格な選択基準を要するが、ポジティブ候補のパターンを定性的に変更しない。

セクションＩＩＩ：両性脂質システムの実験的スクリーニング
荷電した両親媒性物質を含んでなる異なる両性リポソーム混合物の膜融合性は、脂質融合アッセイ、粒子成長または当該技術分野において公知の他の方法を使用して、調べることができ、それによって、好適な混合物の同定を可能にする。脂質混合は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって試験することができ、そして実験の詳細については、実施例１１において説明するが、ここで、両性脂質混合物の融合を、ｐＨ２．５〜ｐＨ７．５の間のｐＨ範囲内でモニターした。

荷電した両親媒性物質のみを含んでなる両性物質Ｉシステム
両性物質Ｉシステムは、過剰な荷電性アニオンと組み合わされた安定なカチオンによって特徴付けられる。荷電した両親媒性物質を単独で含んでなる好適な両性物質Ｉシステムは、ｐＨ７〜ｐＨ８で安定なラメラ相を形成し、そしてｐＨ３〜ｐＨ６の間、好ましくは、ｐＨ４〜ｐＨ６の間で融合する。所定の両性物質Ｉシステム内で、カチオン性対アニオン性脂質の異なる比（Ｃ／Ａ比、常に＜１）について、融合をモニターした。

ｐＨ７〜ｐＨ８で安定であり、そしてｐＨ３〜ｐＨ６の間、好ましくは、ｐＨ４〜ｐＨ６の間で融合する両性物質Ｉシステムは、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＰＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＥＰＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＰＥＰＣ、ＤＳＥＰＣ、ＰＯＥＰＣ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＤＡＰ、ＤＭＤＡＰ、ＤＰＤＡＰ、ＤＳＤＡＰ、ＰＯＤＡＰ、Ｎ−メチル−ＰｉｐＣｈｏｌ、ＣＴＡＢ、ＤＯＴＭＡから選択される１つもしくはそれ以上のカチオン性両親媒性物質と、ジアシルグリセロールスクシネート類、例えば、ＤＯＧＳ、ＤＭＧＳ、ＰＯＧＳ；ジアシルグリセロールマロネート類、例えば、ＤＯＧＭまたはＤＭＧＭ；ジアシルグリセロールグルタレート類、例えば、ＤＯＧＧ、ＤＭＧＧ；ジアシルグリセロールアジペート類、例えば、ＤＯＧＡ、ＤＭＧＡ；４−｛（１，２−ジアシル−エチル）アミノ｝−４−オキソ酸類、例えば、ＤＯＡＳ、ＤＯＡＭ、ＤＯＡＧ、ＤＯＡＡ、ＤＭＡＳ、ＤＭＡＭ、ＤＭＡＧ、ＤＭＡＡ；ジアシル−アルカン酸類、例えば、ＤＯＳ、ＤＯＭ、ＤＯＧ、ＤＯＡ、ＤＭＳ、ＤＭＭ、ＤＭＧ、ＤＭＡ；Ｃｈｅｍｓおよびそれらの誘導体、例えば、Ｃｈｏｌ−Ｃ３、Ｃｈｏｌ−Ｃ５またはＣｈｏｌ−Ｃ６；脂肪酸類から選択される１つもしくはそれ以上のアニオン性両親媒性物質との混合物から形成してもよい。

本発明の一実施形態では、カチオン性両親媒性物質は、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ、Ｎ−メチル−ＰｉｐＣｈｏｌ、ＤＤＡＢ、ＤＯＥＰＣ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＡＣ−ＣｈｏｌまたはＴＣ−Ｃｈｏｌから選択され、そしてＣｈｅｍｓ、ＤＭＧＳ、ＤＭＧＭ、ＤＭＧＧ、ＤＭＧＡ、ＤＭＡＳ、ＤＭＡＭ、ＤＭＡＧ、ＤＭＡＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＧＭ、ＤＯＧＧ、ＤＯＧＡ、ＤＯＡＳ、ＤＯＡＭ、ＤＯＡＧ、ＤＯＡＡ、ＤＭＳ、ＤＭＭ、ＤＭＧ、ＤＭＡ、ＤＯＳ、ＤＯＭ、ＤＯＧ、ＤＯＡ、Ｃｈｏｌ−Ｃ３、Ｃｈｏｌ−Ｃ５またはＣｈｏｌ−Ｃ６から選択されるアニオン性両親媒性物質と組み合わされる。

本発明のいくつかの実施形態では、荷電した両親媒性物質のみを含んでなり、ｐＨ７〜ｐＨ８で安定であり、そしてｐＨ３〜ｐＨ６の間、好ましくは、ｐＨ４〜ｐＨ６の間で融合する以下の両性物質Ｉ混合物が好適である（表２３）：

ｐＨ７〜ｐＨ８で安定でない両性物質Ｉシステム、例えば、Ｃ／Ａ＞０．３３での両性物質Ｉシステム、ＤＯＴＡＰ／ステアリン酸またはＤＯＴＡＰ／オレイン酸はそれほど好適ではない。

表２３のより多能な両性物質Ｉシステムは、広範なＣ／Ａ比にわたって膜融合性であるシステムであり、それ故、システムの化学の変更を伴わない融合ｐＨの調整を可能にする。いくつかの多能なシステムは、≧０．４だけ異なるＣ／Ａ比にわたって膜融合性であり、さらに多能なシステムは、＞０．６だけ異なるＣ／Ａ比について膜融合性を保持し、そしていくつかのシステムは、全範囲のＣ／Ａ比にわたって膜融合性である。例えば、両性物質ＩシステムＤＤＡＢ／ＤＭＧＳは、Ｃ／Ａ＞０からＣ／Ａ＝０．５までに融合を示す。このシステムが膜融合性であるＣ／Ａ比の範囲は、約０．５である。

表２３の好適な両性混合物は、より高いＣ／Ａ比において、好ましくは、Ｃ／Ａ≧０．４において、より好ましくは、Ｃ／Ａ比≧０．５において膜融合性であり、それ故、核酸のようなより多量のポリアニオン性カーゴのカプセル化を容易にする。

本発明の別の実施形態では、両性物質Ｉシステムは、ｐＨ７〜ｐＨ８における上記の安定なラメラ相に加えて、ｐＨ２〜ｐＨ４の間の酸性ｐＨにおいて、第２の安定な相を形成してもよい。しかし、先に記載のように、低いｐＨにおける安定なラメラ相は必須ではなく、そして例えば、両性リポソーム生成および酸性条件下におけるカーゴのカプセル化のために、大きな対アニオンが、このｐＨ範囲で脂質相を安定化してもよい。

荷電した両親媒性物質のみを含んでなり、そしてｐＨ７〜ｐＨ８およびｐＨ２〜ｐＨ４において安定なラメラ相を有し、そしてｐＨ３〜ｐＨ６の間、好ましくは、ｐＨ４〜ｐＨ６の間で融合する好適な膜融合性両性物質Ｉシステムは、以下の特定の混合物を含んでなり得る（表２４）：

表１４の多能な両性物質Ｉシステムは、広範なＣ／Ａ比にわたって、好ましくは、≧０．４のＣ／Ａ比の範囲にわたって、より好ましくは、＞０．６のＣ／Ａ比の範囲にわたって、膜融合性である。

さらに加えて、より高いＣ／Ａ比、好ましくは、Ｃ／Ａ≧０．４、より好ましくは、Ｃ／Ａ比≧０．５において膜融合性である上記の表２４の両性混合物が好適である。

荷電した両親媒性物質のみを含んでなる両性物質ＩＩシステム
両性物質ＩＩシステムは、荷電性アニオンおよび荷電性カチオンを含んでなり、従って、全範囲のアニオン：カチオン比にわたって両性であるという利点を有する。両性物質Ｉまたは両性物質ＩＩＩシステムに関しては、強イオンの電荷過補償は必要ではない。

ｐＨ７〜ｐＨ８で安定であり、そしてｐＨ３〜ｐＨ６の間、好ましくは、ｐＨ４〜ｐＨ６の間で融合する両性物質ＩＩシステムは、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、Ｃｈｉｍ、ＭｏＣ３Ｃｈｏｌ、ＤｍＣ４Ｍｏ２、ＤｍＣ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ２、Ｃ５Ｍｏ２、Ｃ６Ｍｏ２、Ｃ８Ｍｏ２、Ｃ４Ｍｏ４、ＤＯＩＭまたはＤＰＩＭから選択される１つもしくはそれ以上のカチオン性両親媒性物質と、ＤＯＧＳ、ＤＭＧＳ、ＰＯＧＳのようなジアシルグリセロールスクシネート類；ＤＯＧＭまたはＤＭＧＭのようなジアシルグリセロールマロネート類；ジアシルグリセロールグルタレート類、例えば、ＤＯＧＧ、ＤＭＧＧ；ジアシルグリセロールアジペート類、例えば、ＤＯＧＡ、ＤＭＧＡ；４−｛（１，２−ジアシル−エチル）アミノ｝−４−オキソ酸類、例えば、ＤＯＡＳ、ＤＯＡＭ、ＤＯＡＧ、ＤＯＡＡ、ＤＭＡＳ、ＤＭＡＭ、ＤＭＡＧ、ＤＭＡＡ；ＤＯＳ、ＤＯＭ、ＤＯＧのようなジアシル−アルカン酸類、Ｃｈｅｍｓおよびそれらの誘導体、例えば、Ｃｈｏｌ−Ｃ３、Ｃｈｏｌ−Ｃ５またはＣｈｏｌ−Ｃ６；脂肪酸類から選択される１つもしくはそれ以上のアニオン性両親媒性物質との混合物を含んでもよい。

本発明の一実施形態では、カチオン性両親媒性物質は、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、Ｃｈｉｍ、ＭｏＣ３Ｃｈｏｌ、ＤｍＣ４Ｍｏ２、ＤｍＣ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ２、Ｃ５Ｍｏ２、Ｃ６Ｍｏ２、Ｃ８Ｍｏ２、Ｃ４Ｍｏ４、ＤＯＩＭまたはＤＰＩＭから選択され、そしてＣｈｅｍｓ、ＤＭＧＳ、ＤＭＧＭ、ＤＭＧＧ、ＤＭＧＡ、ＤＭＡＳ、ＤＭＡＭ、ＤＭＡＧ、ＤＭＡＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＧＭ、ＤＯＧＧ、ＤＯＧＡ、ＤＯＡＳ、ＤＯＡＭ、ＤＯＡＧ、ＤＯＡＡ、ＤＭＳ、ＤＭＭ、ＤＭＧ、ＤＭＡ、ＤＯＳ、ＤＯＭ、ＤＯＧ、ＤＯＡ、Ｃｈｏｌ−Ｃ３、Ｃｈｏｌ−Ｃ５またはＣｈｏｌ−Ｃ６から選択されるアニオン性両親媒性物質と組み合わされる。

本発明のいくつかの実施形態では、荷電した両親媒性物質のみを含んでなり、ｐＨ７〜ｐＨ８で安定であり、そしてｐＨ３〜ｐＨ６の間、好ましくは、ｐＨ４〜ｐＨ６の間で融合する両性物質ＩＩシステムが好適である（表２５）：

表２５のより多能な両性物質ＩＩシステムは、広範なＣ／Ａ比にわたって膜融合性であるシステムであり、それ故、システムの化学の変更を伴わない融合ｐＨの調整を可能にする。いくつかの多能なシステムは、≧０．７だけ異なるＣ／Ａ比にわたって膜融合性であり、さらに多能なシステムは、＞１だけ異なるＣ／Ａ比について膜融合性を保持し、そしていくつかのシステムは、全範囲のＣ／Ａ比にわたって膜融合性である。例えば、両性物質ＩシステムＤＤＡＢ／ＤＭＧＳは、Ｃ／Ａ＞０からＣ／Ａ＝０．５までに融合を示す。このシステムが膜融合性であるＣ／Ａ比の範囲は、約０．５である。例えば、混合物Ｃｈｉｍ／Ｃｈｅｍｓは、＞１のＣ／Ａ比の範囲を生じるＣ／Ａ＞０〜Ｃ／Ａ＝１．５の間で融合してもよい。

表２５の好適な両性物質ＩＩ混合物は、より高いＣ／Ａ比において、好ましくは、Ｃ／Ａ≧０．７において、より好ましくは、Ｃ／Ａ比≧１において膜融合性であり、それ故、核酸のようなより多量のポリアニオン性カーゴのカプセル化を容易にする。

本発明の別の実施形態では、両性物質ＩＩシステムは、ｐＨ７〜ｐＨ８における上記の安定なラメラ相に加えて、ｐＨ２〜ｐＨ４の間の酸性ｐＨにおいて、第２の安定な相を形成してもよい。しかし、先に記載のように、低いｐＨにおける安定なラメラ相は必須ではなく、そして例えば、両性リポソーム生成および酸性条件下におけるカーゴのカプセル化のために、大きな対アニオンが、このｐＨ範囲で脂質相を安定化してもよい。

荷電した両親媒性物質のみを含んでなり、そしてｐＨ７〜ｐＨ８およびｐＨ２〜ｐＨ４において両方共に安定なラメラ相を有し、そしてｐＨ３〜ｐＨ６の間、好ましくは、ｐＨ４〜ｐＨ６の間で融合する以下の膜融合性両性物質ＩＩシステムが、さらに好適である（表２６）：

表２６の多能な両性物質ＩＩシステムは、広範なＣ／Ａ比にわたって、好ましくは、≧０．７のＣ／Ａ比の範囲にわたって、より好ましくは、≧１のＣ／Ａ比の範囲にわたって、膜融合性である。

さらに加えて、より高いＣ／Ａ比、好ましくは、Ｃ／Ａ≧０．４、より好ましくは、Ｃ／Ａ比≧０．５において膜融合性である表２６の両性混合物が好適である。

単独での荷電した両親媒性物質の両性物質ＩＩＩシステム
両性物質ＩＩＩシステムは、安定なアニオンおよびｐＨ−感受性カチオンによって特徴付けられる。それ故、このｐＨでは、荷電したカチオン性脂質がほとんどまたは全く存在しないため、両性物質ＩＩＩシステムは、中性ｐＨで脂質塩を形成することができない。最初に、カチオンを作製し、次いで、これが塩形成を経験し得るためには、継続した酸性化が必要である。

ｐＨ７〜ｐＨ８で安定であり、そしてｐＨ３〜ｐＨ６の間、好ましくは、ｐＨ４〜ｐＨ６の間で融合する両性物質ＩＩＩシステムは、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、Ｃｈｉｍ、ＭｏＣ３Ｃｈｏｌ、ＤｍＣ４Ｍｏ２、ＤｍＣ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ２、Ｃ５Ｍｏ２、Ｃ６Ｍｏ２、Ｃ８Ｍｏ２、Ｃ４Ｍｏ４、ＤＯＩＭまたはＤＰＩＭから選択される１つもしくはそれ以上のカチオン性両親媒性物質と、ＤＯＰＡ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＰＯＰＡ、ＤＳＰＡ、Ｃｈｏｌ−ＳＯ４、ＤＯＰＧ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＳＰＧまたはＤＯＰＳ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＰＯＰＳおよびＤＳＰＳから選択される１つもしくはそれ以上のアニオン性両親媒性物質との混合物を含んでもよい。

立体障害のため融合を示さない両性物質ＩＩＩシステムは、それほど好適ではない。上記で説明した１つの例は、両性物質ＩＩＩシステムＭｏＣｈｏｌ／ＰＯＰＧである。

ｐＨ７〜ｐＨ８で安定であり、そしてｐＨ３〜ｐＨ６の間、好ましくは、ｐＨ４〜ｐＨ６の間で融合する荷電した両親媒性物質のみを含んでなる好適な両性物質ＩＩＩシステムは、以下の特定の混合物（表２７）を含む：

これらの両性物質ＩＩＩ混合物のうち、ｐＨ７〜ｐＨ８で安定なラメラ相ならびにｐＨ２〜ｐＨ４の間の酸性ｐＨで安定な相を有する以下の混合物がさらに好適である（表２８）：

セクションＩＶ：中性または両イオン性脂質さらにを含んでなる両性システム
中性脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質またはコレステロールなどのような構造を含んでなる。これらの脂質は、ｐＨ３〜８の間で反応するｐＨ応答エレメントを有さないため、この範囲で、分子ジオメトリーの変化は生じない。中性脂質の個々のκ値に依存して、両性脂質対の双安定性挙動の薄弱化が生じ、そして図９に示されるように、ｄ（κ）／ｄ（ｐＨ）の急勾配がより小さくなる。加えて、荷電した脂質の薄弱化のために使用される中性脂質に依存して、相図の曲線は、より低いまたはより高い値のκに移行する。図９の計算に使用したパラメータを以下の表２９に示す；容積をÅ^３で示す。

図９は、上記の両性物質ＩＩモデルシステムとの組合せで、それぞれ０．５、０．３または０．１９のκ値を伴う異なる中性脂質の添加のためのこのような挙動を例示する。システムの振幅がΔκ＝０．０８９から０．０４４へ減少する一方、最小値は、個々の中性成分のκに従う。

それ故、本発明のいくつかの実施形態では、６５ｍｏｌ．％もしくはそれ以下の中性脂質を、塩を形成する荷電した脂質に添加してもよい。５０ｍｏｌ．％もしくはそれ以下の添加がより好適であり、そして３５ｍｏｌ．％もしくはそれ以下の中性脂質の添加がなおさらに好適である。中性脂質の添加により、脂質二重層をさらに安定化してもよく、そしてそのような目的のための好適な脂質は、より高いκ値、例えば、κ＞０．４もしくはなお約０．５を有する。そのような脂質の典型的な例は、疎水性領域にＣ１４〜Ｃ１８アルキル鎖を伴うホスファチジルコリンである。脂質の最も極性な領域に関して、ホスファチジルコリンのヘッド基は対イオンを補充する。

また、中性脂質の添加により、膜融合性挙動の区域を拡大してもよく、この目的のために、低い値のκを伴う中性脂質を用いてもよい。そのような好適な脂質は、０．３もしくはそれ以下のκ値を有し；より好適な脂質は、約０．２のκ値を有する。そのような脂質の典型的な例には、ホスファチジルエタノールアミン類がある。ホスファチジルエタノールアミン類は、末端のアミノ基とホスフェートとの間に中間の塩橋（ベタイン構造）を形成することが想定され；従って、対イオンはヘッド基に補充されない。

Ｃ１４〜Ｃ１８アルキル鎖を伴うホスファチジルエタノールアミン類は、両性リポソームの膜融合性をモデレートするのに好適な脂質である。

コレステロールは、低いκを有する脂質の別の例であり、従って、両性脂質システムの膜融合性挙動を拡大し得る。

もちろん、異なる中性脂質の混合物を使用して、そのようなシステムの膜融合性と安定性との間のバランスを最適化することも可能である。

実際的には、両性リポソームの膜における中性脂質の存在は、リポソームの膜融合性に対して効果を有し、そして本発明の提示されたアルゴリズムによって推定されるように、リポソームの融合を改善または損傷し得る。そのような効果の性質は、中性システムのｋ（ｓａｌｔ）とｋ（ｎｅｕｔｒａｌ）（中性脂質または中性脂質の混合物の膜定数）との間の関係によって大いに影響されることがアルゴリズムから明らかである。例えば、ｋ（ｓａｌｔ）がｋ（ｎｅｕｔｒａｌ）より高い場合、そのような中性脂質の添加により、融合を刺激するかまたは融合域の幅を拡大してもよい。もちろん、ｋ（ｔｏｔａｌ）は、このための所定の最小値に到達しなければならない。いくつかの実施形態では、そのような最小値は、０．３４もしくは０．３５より小さく、より好適には、０．３より小さく、そしてなおより好適には、そのような最小値は０．２５より小さい。

実験的証拠を実施例１５および図２５に示すが、ここで、異なる量の異なる中性脂質を、両性物質ＩＩシステム（ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ）の膜に混合した。さらに加えて、他の両性システムの膜融合性に対する中性脂質の影響を、実施例１５において試験した。

中性脂質はまた、コロイド安定性または体液における安定性のような両性リポソームの他の特徴に対して影響を及ぼし得る。例えば、薬学的アプリケーションにおける両性リポソームの使用には、貯蔵および血流を介する移動中のリポソームの安定性が必要である。

両性脂質混合物の膜における単一の中性脂質としてのホスファチジルコリンの存在は、両性脂質混合物の融合能を低減することは明らかである。ホスファチジルコリンは、＞０．４の高いｋ値を有する両イオン性脂質である。

本発明の１つの実施形態では、単一の中性成分としてｋ＞０．４を伴う４０ｍｏｌ％未満、好ましくは、３０ｍｏｌ％未満、より好ましくは、２０ｍｏｌ％未満の中性または両イオン性脂質が、両性脂質混合物中に存在する。そのような中性または両イオン性脂質として、ホスファチジルコリン類、スフィンゴミエリン類またはセラミド類が挙げられるが、それらに限定されない。

中性脂質としてのコレステロールは、両性脂質システムの膜融合性に対して影響を及ぼさないか、または融合能の改善をなおもたらすかのいずれかである。同様の挙動が、脂質ＤＯＰＥについても観察された。コレステロールおよびホスファチジルエタノールアミン類は、０．３未満のｋ値を有し、そしてヘキサゴナル相の形をとる中性または両イオン性脂質である。

本発明のさらなる実施形態では、コレステロールもしくはホスファチジルエタノールアミン類または両方の脂質の混合物は、単一の中性または両イオン性脂質として両性脂質混合物中に存在してもよい。好ましくは、これらの脂質の６５ｍｏｌ％以下、より好ましくは、５０ｍｏｌ％以下、を、両性リポソーム中の単一の中性または両イオン性脂質として使用する。

膜融合性と安定性との間のバランスを最適化するために、中性または両イオン性脂質の混合物を両性リポソーム中の中性成分として使用することは有利であり得る。

本発明のなおさらなる実施形態では、ホスファチジルコリン類（ＰＣ）、スフィンゴミエリン類もしくはセラミド類およびホスファチジルエタノールアミン類（ＰＥ）のような中性脂質の混合物またはホスファチジルコリン類（ＰＣ）、スフィンゴミエリン類もしくはセラミド類およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）の混合物を、両性リポソーム中の中性成分として使用してもよい。好ましくは、ＰＣ／ＰＥまたはＰＣ／Ｃｈｏｌの比は、４〜０．２５の間、より好ましくは、３〜０．３３の間である。これらの中性脂質混合物は、８０ｍｏｌ％もしくはそれ以下、好ましくは、６５ｍｏｌ％もしくはそれ以下の量で、塩を形成する荷電した脂質に添加してもよい。５０ｍｏｌ％もしくはそれ以下の添加が最も好適である。

また、中性脂質は、荷電した両親媒性物質の単独の混合物と比較して、さらなるＣ／Ａ比まで融合能を拡大し得ることを見出した。例えば、４０ｍｏｌ％ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ＝０．３３のＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ混合物への添加は、Ｃ／Ａ＝＞０〜０．７からＣ／Ａ＝＞０〜１への膜融合性の範囲の拡大をもたらす。同様に、４０ｍｏｌ％コレステロールの添加は、融合が生じるためのＤＯＴＡＰ／ＣｈｅｍｓのＣ／Ａ比をＣ／Ａ＝＞０〜０．４からＣ／Ａ＝＞０〜０．６７まで拡大する。

要約すると、本明細書において開示したアルゴリズムは、両性リポソームにおける相転移を説明するのに適切である。アルゴリズムの必須要素は、（ｉ）脂質形状理論、（ｉｉ）対イオンがヘッド基容積の部分を形成する、および（ｉｉｉ）脂質塩形成が二重層で生じ得、対イオンの解離をもたらすという概念である。アルゴリズムの単純性は、当業者が計算を再現し、そして個々の目的に対してシステムを採用することを容易にする。示したもの以外の当業者に周知の他のツールを使用して、分子容を計算することも可能である。定性的推定は、容積の代わりに分子の断面積を使用した場合でも変化しない。もちろん、そのような場合、結果を再キャリブレーションしなければならない。

上記のように、立体障害は、特別な場合、塩形成を妨害することもある。そのような場合、相の挙動は、本明細書において先に記載したこととは異なり得る。さらに重要なことに、低いおよび中性ｐＨでは、双安定性は観察されない。その代わり、両性システムのタイプに依存して、一方またはいずれの側に対しても不安定性の区域を伴う中間のｐＨについて、安定性の鞍点が観察される。典型的な例が以下の実施例に含まれる。

本明細書において開示した分子容計算は、疎水性部分における鎖の飽和については触れていない。不飽和脂質を含んでなる脂質膜は、融合挙動を改善し得る周囲温度においてより高い流動性を有するため、そのような脂質の使用は特に有利であり得る。不飽和脂質は、膜において側圧を発揮することもまた公知であり、それ故、補正係数を挿入して、これらの成分の見かけ上の容積に反映させることもできる。そのような補正係数は１より大きい。

本発明のアルゴリズムは、２つの荷電したパートナーの間に１：１の化学量論を伴う脂質塩の形成を想定する。この概念は、より複雑な状況、例えば、１つの荷電した脂質（monocharged lipids)の多数を複数の荷電した基を伴う単一の他の脂質への結合に拡大することも可能である。ＣＨＥＭＳ、ＤＯＧＳまたはオレイン酸のスペルミンの両親媒性誘導体への結合は、この例を提供し得るが、他の多くの組合せも存在する。別の実施形態では、脂質上の荷電した基は、より複雑であり、そして例えば、ＨｉｓｔＣｈｏｌにおけるように異なる荷電した基を含んでなり得る。

そのような場合、他の脂質アニオンまたはカチオンのいずれかによって、１：１複合体が形成され得る。本発明の概念をこの例に適用すると、イミダゾリウムカチオンと個別の脂質アニオン、例えば、ＣＨＥＭＳ、ＤＯＧＳまたはオレイン酸アニオンとの間に対イオンの置き換えが生じ得；加えて、ヒスチジン部分のカルボキシルからの同様な対イオン解離は、ヘキサゴナル相の形成をさらに支持し得る。

脂質のそのようなより複雑な配置は、相互作用パートナーの立体適合性に余分な負担をかけ、実験の失敗または混合された形の可能な相互作用をもたらし得、ここで、可能なすべての結合部位が塩形成に関与しているわけではないことが、当業者に明らかであろう。

本明細書において開示した方法は、システムの最適化に関与する変数の数を実質的に減少させる。

詳細な説明では、多様な計算によって、本発明を例示してきた。以下の実施例では、さらなる実験的研究について説明する。実施例は、本発明を実践する所定の態様のさらなる詳述を理解することによって示される。実施例は、決して本開示内容の範囲を制限しない。

実施例１−リポソームの調製およびｐＨ依存的融合実験
緩衝系
１００ｍＭクエン酸ナトリウムおよび２００ｍＭリン酸水素ナトリウムをストック溶液として調製し、そして両溶液の多様な量を混合して、必要とするｐＨに調整した。例として、ＣｉＰ７．０は、７．０のｐＨを有するその系列由来の緩衝液を指し、そしてクエン酸塩およびリン酸塩から作製される。

リポソームの生成
リポソームは、乾燥した脂質フィルムから形成させた。簡単に説明すると、２０μｍｏｌのそれぞれの脂質組成物を、１ｍＬのクロロホルム／メタノール３：１に溶解し、そしてロータリーエバポレーターを使用して、減圧下で乾燥した。得られたフィルムを、４５分間、１ｍＬのＣｉＰ８．０において、穏やかに撹拌しながら水和させた。得られたリポソーム懸濁液を凍結し、融解後音波処理し、究極的に、２００ｎｍポリカーボネートフィルターを介して押し出した。

ｐＨ−ジャンプ実験
ＣｉＰ８．０中１０μｌのリポソームをガラス管に配置し、そして必要とするｐＨの１ｍＬのＣｉＰ緩衝液と共に迅速に混合した。サンプルを、１時間、室温で静置し、そして３ｍＬの２００ｍＭリン酸水素ナトリウムをサンプルと共に迅速に混合した。ＭＡＬＶＥＲＮ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳを使用して、リポソームのサイズを解析し、そしてサイズをＺ平均として記録した。

実施例２−両性物質Ｉ脂質混合物の融合
リポソームを、クエン酸ナトリウム／リン酸ナトリウムｐＨ８．０（ＣｉＰ８．０）中のＤＯＴＡＰおよびＣＨＥＭＳから調製し、そして少量を、より低いｐＨを伴うＣｉＰ緩衝液に注入した（詳細については実施例１を参照のこと）。より低いｐＨにおいて観察される任意のより大きな構造物は、凝集形成および多中心ハニカム構造の生成によるものであり得るか、またはそのような構造は、純粋な融合から生じ得るかのいずれかである。これらの２つの結果の間を区別するために、本発明者らは、２００ｍＭリン酸水素ナトリウムを使用して、ｐＨを中性に再調整した。静電反発は、多中心小胞を解離するが、融合生成物は解離しない。結果を図１０に例示する。

数学的塩橋モデルにおいて推定されるように、不安定性の谷が弱酸性条件で存在し、そしてｐＨ６．５から開始して、より大きな粒子への融合が観察された。しかし、いくらかのＤＯＴＡＰが混合物中に存在する限り、リポソームの低いｐＨへの迅速な添加は、粒子の安定化を生じた。１００ｍｏｌ．％ＣＨＥＭＳ由来のリポソームは、ｐＨ４．５未満で融合状態に入り、そしてより低いｐＨでは安定化しない。

注目すべきことに、ＤＯＴＡＰ／ＣＨＥＭＳの１：１混合物は、ＣｉＰ８．０中でリポソームを形成することができないが、これは、これらのパラメータについて、非ラメラ相を推定する数理モデルと良好に一致する。

実施例３−両性物質ＩＩシステムの融合
リポソームを、クエン酸ナトリウム／リン酸ナトリウムｐＨ８．０（ＣｉＰ８．０）中のＭｏＣｈｏｌおよびＣＨＥＭＳから調製し、そして少量を、より低いｐＨを伴うＣｉＰ緩衝液に注入した（詳細については実施例１を参照のこと）。より低いｐＨにおいて観察される任意のより大きな構造物は、凝集形成および多中心ハニカム構造の生成によるものであり得るか、またはそのような構造は、純粋な融合から生じ得るかのいずれかである。これらの２つの結果の間を区別するために、本発明者らは、２００ｍＭリン酸水素ナトリウムを使用して、ｐＨを中性に再調整した。静電反発は、多中心小胞を解離するが、融合生成物は解離しない。

実験的証拠は、塩橋モデルを支持する（図１１を参照のこと）。ＭｏＣＨｏｌの大きなヘッド基サイズのため、融合区域は、高いアニオン含有量の方向に傾く。結果的に、混合物中３３ｍｏｌ．％または５０ｍｏｌ．％ＣＨＥＭＳで融合は生じないが、一方、４〜６の間のｐＨに暴露される場合、６６ｍｏｌ．％または７５ｍｏｌ．％ＣＨＥＭＳを含有する混合物は、融合を経験する。推定されるように、融合の発生は、より多量のＣＨＥＭＳを伴うより低いｐＨ値の方に移行する。さらに、１００ｍｏｌ．％ＣＨＥＭＳは、低いｐＨで膜融合性であるが、低いｐＨでは安定な状態を有さない。

計算に使用するパラメータを、以下の表３０に示す；Ｎａ／Ｈ_２ＰＯ_４中のＣＨＥＭＳおよびＭｏＣｈｏｌをモデル化合物として使用した；すべての容積をÅ^３で示す。

実施例４−立体障害を伴う両性物質ＩＩＩシステムにおける融合
リポソームを、クエン酸ナトリウム／リン酸ナトリウムｐＨ８．０（ＣｉＰ８．０）中のＰＯＰＧおよびＭｏＣｈｏｌから調製し、そして少量を、より低いｐＨを伴うＣｉＰ緩衝液に注入した（詳細については実施例１を参照のこと）。より低いｐＨにおいて観察される任意のより大きな構造物は、凝集形成および多中心ハニカム構造の生成によるものであり得るか、またはそのような構造は、純粋な融合から生じ得るかのいずれかである。これらの２つの結果の間を区別するために、本発明者らは、２００ｍＭリン酸水素ナトリウムを使用して、ｐＨを中性に再調整した。静電反発は、多中心小胞を解離するが、融合生成物は解離しない。

実験的証拠は、塩橋形成が生じない状況のみを支持する。ＭｏＣｈｏｌとＰＯＰＧとの間の混合物は、ｐＨ−ジャンプ実験において融合を経験しない（データ示さず）。Ｍｏ−Ｃｈｏｌのプロトン化された窒素は、モルホリノ環の下端側に配置され、従って、容易にアクセスできないため、これは、立体障害による可能性が高い。加えて、ＰＯＰＧのホスフェートは、正に脂質／水の界接面に位置し、そして水相に対してグリセロールで保護されている。

実施例５−立体障害を伴わない両性物質ＩＩＩシステムにおける融合
ＰＯＰＧ／ＭｏＣｈｏｌ由来の両性物質ＩＩＩシステムは、融合を経験しない（上記の実施例４を参照のこと）。従って、グリセロール保護の脱離およびＰＯＰＧとＤＯＰＡとの交換が、そのような立体障害を回避するかどうかは問題であった。事実、図１２において例示されるように、そのようなシステムは融合を経験する。

詳細は上記の実施例１のとおりである。計算に使用したパラメータを以下の表３１に示す；Ｎａ／Ｈ_２ＰＯ_４のＤＯＰＡおよびＭｏＣｈｏｌをモデル化合物として使用したが、容積をÅ^３で表す。

モデル計算は、実験的融合挙動の完全な複雑性を反映する：５０％未満のＭｏＣＨｏｌを伴う混合物では融合は認められず、ＭｏＣｈｏｌ＝ＤＯＰＡでは強い融合、および過剰なＤＯＰＡを伴う混合物では酸性条件下で安定な相を伴わない継続した融合。

実施例６−モノアルキル脂質による脂質塩形成
オレイン酸を、既知かつ一般に普及しているｐＨ−感受性膜成分として選択した。脂質テールは、比較的容積が小さいため、ヘッド基の任意の変化は、膜安定性に対してより顕著な結果を有する。図１３に示されるように、モデリングは、オレイン酸が、ＭｏＣｈｏｌを伴う両性物質ＩＩシステムにおいて融合の強力な駆動体であることを推定する。これは、実験によって確認される。オレイン酸の混合物は、Ｍｏ−Ｃｈｏｌと共にリポソームを形成し、そして異なる条件に暴露される場合、粒子は迅速に融合を経験する。アルゴリズムから予想されるように、混合物中のＯＡの量がより少ないため、融合の程度が制限されるが、５０ｍｏｌ．％のアニオンが古典的な谷型の融合パターンを生じる。ＯＡでは融合の傾向がかなり強いため、混合物中のそのアニオンのより大きな部分が、広範なｐＨ値にわたって、広大な融合を生じる。なお、混合物は、常に、低いｐＨで安定化することができる。詳細は実施例１のとおりである。

実施例７−中性脂質の影響
ＤＯＴＡＰおよびＣＨＥＭＳを両性物質Ｉ荷電した脂質対として選択し、そしてＰＯＰＣ（κ約０．５）を中性脂質として添加した。予想されるように、荷電した成分の純粋な混合物は、等電点およびそれ未満で凝集または融合を経験する。しかし、図１４に示されるように、純粋なアニオンからもはや両性ではない１：１混合物までの範囲のすべてのカチオン：アニオン比について、僅か２０ｍｏｌ．％のＰＯＰＣの添加により、そのような凝集傾向が大いに改善された。

図１５に示されるように、ＤＯＴＡＰおよびＣＨＥＭＳ由来の両性物質Ｉ混合物への同じ量のＤＯＰＥ（κ約０．１９）の添加は、ＤＯＴＡＰとＣＨＥＭＳとの間の比に依存しない融合挙動を維持する。

実施例８−大きな対イオンは、両性物質Ｉシステムにおける融合を減少することができる。
両性物質Ｉシステムの融合挙動に対する異なるカチオンの影響を調べるために、２０ｍｏｌ％ＤＯＴＡＰおよび８０ｍｏｌ％ＣＨＥＭＳから脂質フィルムを調製した。２０ｍＭクエン酸および４０ｍＭリン酸から開始して一連の緩衝液を作製し、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨ、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ、遊離塩基）またはＬ−アルギニン（遊離塩基）を使用して、中和した。

脂質フィルムをｐＨ８．０で水和し、そして少量を、より低いｐＨを伴う対応する緩衝液に注入した（詳細については実施例１を参照のこと）。１時間のインキュベーション後、対応する塩基を使用して、ｐＨを中性に再調整した。結果を図１６に例示する。

モデルにおいて推定されるように、カリウムまたはナトリウムのようなむしろ小さな対イオンを使用する限り、２０ｍｏｌ％ＤＯＴＡＰおよび８０ｍｏｌ％ＣＨＥＭＳ由来のリポソームの融合を、約ｐＨ４〜５で観察することができる。Ｌ−アルギニンまたはＴＲＩＳのようなより大きな対イオンは、処方を効果的に安定化し、そしてリポソームの融合を減少または完全に抑制する。

実施例９−大きな対イオンは、両性物質ＩＩシステムにおける融合を減少することができる。
両性物質ＩＩシステムの融合挙動に対する異なるカチオンの影響を調べるために、２０ｍｏｌ％ＭｏＣＨＯＬおよび８０ｍｏｌ％ＣＨＥＭＳから脂質フィルムを調製した。２０ｍＭクエン酸および４０ｍＭリン酸から開始して一連の緩衝液を作製し、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨ、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ、遊離塩基）またはＬ−アルギニン（遊離塩基）を使用して、中和した。

脂質フィルムをｐＨ８．０で水和し、そして少量を、より低いｐＨを伴う対応する緩衝液に注入した（詳細については実施例１を参照のこと）。１時間のインキュベーション後、対応する塩基を使用して、ｐＨを中性に再調整した。結果を図１７に例示する。

モデルにおいて推定されるように、カリウムまたはナトリウムのようなむしろ小さな対イオンを使用する限り、２０ｍｏｌ％ＭｏＣｈｏｌおよび８０ｍｏｌ％ＣＨＥＭＳ由来のリポソームの融合を、ｐＨ３．５〜４．５の間で観察することができる。Ｌ−アルギニンまたはＴＲＩＳのようなより大きな対イオンは、処方を効果的に安定化し、そしてリポソームの融合を減少または完全に抑制する。

実施例１０−対イオンは、両性物質ＩＩＩシステムにおける融合に対してほとんどまたは全く効果を及ぼさない
両性物質ＩＩＩシステムの融合挙動に対する異なるカチオンの影響を調べるために、５０ｍｏｌ％ＭｏＣＨＯＬおよび５０ｍｏｌ％ＤＯＰＡから脂質フィルムを調製した。２０ｍＭクエン酸および４０ｍＭリン酸から開始して一連の緩衝液を作製し、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨ、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ、遊離塩基）またはＬ−アルギニン（遊離塩基）を使用して、中和した。

脂質フィルムをｐＨ８．０で水和し、そして少量を、より低いｐＨを伴う対応する緩衝液に注入した（詳細については実施例１を参照のこと）。１時間のインキュベーション後、対応する塩基を使用して、ｐＨを中性に再調整した。結果を図１８に例示する。

モデルにおいて推定されるように、５０ｍｏｌ％ＭｏＣｈｏｌおよび５０ｍｏｌ％ＤＯＰＡ由来のリポソームの融合を、ｐＨ３．５〜５の間で観察することができ、そして両性物質ＩＩＩシステムに対する多様なカチオンの影響はほとんど認められない。ＭｏＣＨＯＬおよびＤＯＰＡが低いｐＨ条件で脂質塩を形成し、それによって、膜から対イオンが除外されるため、このことは、モデルから予想される。結果的に、一旦、脂質膜から除外されると、対イオンは、膜の安定性または不安定性に寄与することができない。

実施例１１−蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく融合アッセイ
異なる両性脂質混合物の融合能について調べるために、ＦＲＥＴに基づく脂質混合アッセイを使用した。０．６ｍｏｌ％ＮＢＤ−ＰＥ（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン、トリエチルアンモニウム塩）またはローダミン−ＰＥ（Lissamine^TMローダミンＢ １，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩）でそれぞれ単一標識したリポソームを使用して、ＦＲＥＴシグナルの出現を介して、脂質融合をモニターした。

脂質をイソプロパノールに溶解し（最終脂質濃度１６ｍＭ）、そして混合した。緩衝液（酢酸１０ｍＭ、リン酸１０ｍＭ、ＮａＯＨ、ｐＨ７．５）をアルコール性脂質混合物に添加することによって、リポソームを生成し、１．９５ｍＭの最終脂質濃度および１２．２％の最終イソプロパノール濃度を得た。リポソームの調製のために、液体取り扱いロボット（パーキンエルマー(Perkin Elmer)、Multiprobe II Ex）を使用した。ＮＢＤ−標識およびＲｈ−標識両性リポソームを、１：１比で合わせ、続いて、上記の緩衝液で１：１希釈した。最後に、この混合したサンプルの小さなアリコートを、漸減する特定のｐＨ（ＨＡｃ ５０ｍＭ、リン酸５０ｍＭ、ＮａＯＨ、ｐＨ７．５〜２．５）に加え、そして３７℃で２時間、インキュベートした。この工程では、リポソームを再度、１：１で希釈した。

２組のフィルター：ＮＢＤ／ローダミン：４６０／５９０ｎｍおよびＮＢＤ／ＮＢＤ：４６０／５３０ｎｍを使用して、サンプルの蛍光を測定した。膜融合のシグナルとしてのＦＲＥＴを、発光（５９０ｎｍ）／発光（５３０ｎｍ）の比として表した。０．４のバックグランドはバックグランドの蛍光を示すので、これをＦＲＥＴシグナルから差し引いた。

融合と単なる凝集とを区別するために、懸濁液をｐＨ７．５に中和し、そしてＦＲＥＴシグナルを再度測定した。予備実験によって、リポソームの融合に対する３％の残留アルコール含有量の可能な障害を除外した。

実施例１２：荷電した両親媒性物質を単独で含んでなる両性物質Ｉ脂質混合物の融合アッセイ
実施例８に記載のように、融合アッセイを実施した。表３３において示される脂質対を、０．１７、０．３３、０．４０、０．５０、０．６７、０．７５のカチオン／アニオンモル比（Ｃ／Ａ比）で、融合について試験し、そして純粋なアニオン性リポソームをコントロールとして調製した。

表３３は、実験において試験した脂質対を示す。各脂質対について、ｐＨ７〜ｐＨ８における安定性およびｐＨ４〜ｐＨ６の間の融合を観察したＣ／Ａ比の範囲を表に示す。加えて、各脂質対について、ｐＨ７〜ｐＨ８およびｐＨ２〜ｐＨ４の両方における安定なラメラ相ならびにｐＨ４〜ｐＨ６の間の融合を有するＣ／Ａ比の範囲を示す。

融合は、ΣＦＲＥＴ、完全なマトリックスＣ／Ａ＝０．１７〜０．７５対ｐＨの測定したすべてのＦＲＥＴシグナルの合計として表すことができる。

以下の表３４ａ〜ｄは、マトリックスＣ／Ａ対ｐＨとして、４つの選択された両性物質Ｉシステムの融合プロファイルを示す。加えて、純粋なアニオン性脂質のリポソームの融合を示す（Ｃ／Ａ＝０）。例えば、１００％Ｃｈｅｍｓのリポソームは、約４．２のｐＨで融合することが公知である（Hafez et al, Biophys. J., 79, (2000), 1438-1446）。このことは、本実験によって確認される。加えて、融合プロファイルは、ｐＨ７〜ｐＨ８およびｐＨ２〜ｐＨ４の両方において安定なラメラ相を有し、ｐＨ４〜ｐＨ６の間で融合する両性物質Ｉ混合物を示す。

表３４ａ−９８ａ頁を参照のこと
表３４ｂ〜ｄ−９９頁を参照のこと

実施例１３：荷電した両親媒性物質を単独で含んでなる両性物質ＩＩ脂質混合物の融合アッセイ
実施例８に記載のように、融合アッセイを実施した。表３５において示される脂質対を、０．３３、０．５、０．６７、１、１．５、２、３のカチオン／アニオンモル比（Ｃ／Ａ比）で、融合について試験し、そして純粋なアニオン性リポソームをコントロールとして調製した。

表３５は、実験において試験した脂質対を示す。各脂質対について、ｐＨ７〜ｐＨ８における安定性およびｐＨ４〜ｐＨ６の間の融合を観察したＣ／Ａ比の範囲を表に示す。加えて、各脂質対について、ｐＨ７〜ｐＨ８およびｐＨ２〜ｐＨ４の両方における安定なラメラ相を有し、そしてｐＨ４〜ｐＨ６の間で融合するＣ／Ａ比の範囲を示す。

融合は、ΣＦＲＥＴ、マトリックスＣ／Ａ＝０．３３〜３対ｐＨの測定したすべてのＦＲＥＴシグナルの合計として表すことができる。

表３５：

以下の表３６ａ〜ｄは、４つの選択された両性物質ＩＩシステムについて、融合プロファイルのマトリックスを例示的に示す。加えて、純粋なアニオン性脂質のリポソームの融合を示す（Ｃ／Ａ＝０）。融合プロファイルは、ｐＨ７〜ｐＨ８およびｐＨ２〜ｐＨ４の両方において安定なラメラ相を有し、ｐＨ４〜ｐＨ６の間で融合する両性物質ＩＩ混合物を示す。

表３６ａ〜ｄ：
表３６ａ〜ｂ−１０２ａ頁を参照のこと
表３６ｃ〜ｄ−１０３頁を参照のこと

実施例１４：荷電した両親媒性物質を単独で含んでなる両性物質ＩＩＩ脂質混合物の融合アッセイ
実施例８に記載のように、融合アッセイを実施した。表３７において示される脂質対を、１．５、２、３のカチオン／アニオンモル比（Ｃ／Ａ比）で、融合について試験した。

表３７は、実験において試験した脂質対を示す。各脂質対について、ｐＨ７〜ｐＨ８における安定性およびｐＨ４〜ｐＨ６の間の融合を観察したＣ／Ａ比の範囲を表に示す。加えて、各脂質対について、ｐＨ７〜ｐＨ８およびｐＨ２〜ｐＨ４の両方における安定なラメラ相を有し、そしてｐＨ４〜ｐＨ６の間で融合するＣ／Ａ比の範囲を示す。

以下の表３７ａ〜ｄは、４つの試験した両性物質ＩＩＩシステムについて、融合プロファイルのマトリックスを例として示す。加えて、純粋なアニオン性脂質のリポソームの融合を示す（Ｃ／Ａ＝０）。融合プロファイルは、ｐＨ７〜ｐＨ８およびｐＨ２〜ｐＨ４の両方において安定なラメラ相を有し、ｐＨ４〜ｐＨ６の間で融合する両性物質ＩＩＩ混合物を示す。実施例４に記載のように、ＭｏＣｈｏｌとＰＯＰＧとの間の混合物は、立体障害のため融合を経験しない。このことは、本ＦＲＥＴ実験においても観察することができる。脂質対ＭｏＣｈｏｌ／ＣｈｏｌＳＯ４の場合についても同じであり得る。

表３７ａ〜ｄ：
表３７ａ−１０４ａ頁を参照のこと
表３７ｂ〜ｄ−１０５頁を参照のこと

実施例１５：両性脂質混合物の融合に対する中性または両イオン性脂質の影響
漸増する量の中性または両イオン性脂質を伴う両性リポソームを、実施例８に記載のように調製した。はじめに、両性物質Ｉシステム（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ）および両性物質ＩＩ（ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ）を、１０〜５０％の異なる中性もしくは両イオン性脂質またはそれらの混合物の添加によって、調製した。異なるＣ／Ａ比を有する一連のリポソームについて、融合を測定した。システムは、マトリックス全体におけるそのようなすべての測定値の合計を使用して、特徴付けることができる。次いで、中性または両イオン性脂質の効果を、この包括的パラメータ（ΣＦＲＥＴ）を使用して、解析した。

図２５は、両性脂質混合物ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳの膜融合性に対する異なる中性または両イオン性脂質の影響を示す。ＰＯＰＣもしくはＤＯＰＣのような高いκを有する中性脂質は、両性リポソームの膜融合性を減少するが、一方、ＤＯＰＥもしくはコレステロールのようなより低いκを有する脂質は、膜融合性に対してほとんど影響を及ぼさないか、または融合をなお改善し得ることが明らかである。ＰＯＰＣおよびＤＯＰＥの混合物、ならびにＰＯＰＣまたはＤＯＰＣおよびコレステロールの混合物は、ほとんど影響を及ぼさないか、または２つの脂質の比に依存して、融合能力を減少し得る。両性リポソームの膜におけるＤＯＰＥおよびコレステロールの存在は、膜融合性を変更しないか、またはその増加をなおもたらす。これらの所見は、中性脂質ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ＝１の混合物について、図２１〜２４に示されるようなモデルと極めて良好に相関する。図では、ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ（Ｃ／Ａ＝０．１７〜０．７５）またはＭｏＣＨｏｌ／ＤＯＧＳ（Ｃ／Ａ０．３３〜３）由来のリポソームのΣＦＲＥＴを、０％〜５０％中性脂質を伴う混合物のｋ（ｍｉｎ）に対してプロットした。参照Ｋ（ｍｉｎ）を、Ｃ／Ａ＝０．６６（ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ）またはＣ／Ａ＝１（ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ）についてモデル化した。

さらなる実験では、他の両性脂質システムの膜融合性に対する異なる中性または両イオン性脂質システム（ＰＯＰＣ、コレステロールまたはＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ＝０．３３）の効果を決定した。表３８および３９は、これらのデータを要約し、そして実験の第１の部分の結果を確認している。表３８および３９は、両性リポソームがｐＨ７〜ｐＨ８で安定であり、そしてｐＨ３〜ｐＨ６の間、好ましくは、ｐＨ４〜ｐＨ６の間で融合するΣＦｒｅｔおよびＣ／Ａ比の範囲を示す。

低い膜融合性を有する両性脂質システムは、中性または両イオン性脂質の添加によって、明確に改善することができることが明らかである。さらに加えて、結果は、中性または両イオン性脂質はまた、膜融合性の範囲に対して影響を及ぼし得ることを示す。これは、Ｃ／Ａ比の範囲を、混合物において使用した中性または両イオン性脂質に依存して、広くするまたは狭くすることができることを意味する。

表３８：

表３９：

実施例１６：カチオン性両親媒性物質の合成
ＤｍＣ４Ｍｏ２の合成
Ａ．２，３−ジメチル無水コハク酸の合成
Sutton, et al. OPPI 24 (1992) 39に記載のように、２，３−ジメチル無水コハク酸を調製した。簡単に説明すると、７．１ｇの２，３−ジメチルコハク酸および６．９ｍｌの無水酢酸を、５０℃まで、３時間、緩徐に加熱した。次いで、無水酢酸を、蒸留により取り出した。生成物を、無水エタノールから再結晶化し、そして融点により特徴付けした。

Ｂ．２，３−ジメチルコハク酸−モノコレステリルエステルの合成
２，３−ジメチルコハク酸−モノコレステリルエステルを、J.T.Kley et al., Monatshefte Chem 129 (1998) 319のＣｈｅｍｓ合成に従って調製した。２．９ｇの２，３−ジメチル無水コハク酸、６．３ｍｌのトリエチルアミン、０．０６ｇのジメチルアミノピリジンおよび５０ｍｌのクロロホルムを、丸底フラスコに合わせて、そして還流した。７．８ｇのコレステロールを、４５分間の間、２段階で、混合物に添加した。混合物を６日間、還流した。最後に、溶媒をエバポレートし、そして１００ｍｌのトルオールおよび１．８ｇのピリジンを添加した。混合物を１．５日間、再度、還流した。溶媒をロトバップ(rotovap)において取り出し、そして粗生成物を、まず、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン／メタノール９６：４）により、続いて、エーテルからの再結晶およびシリカゲル上での第２のカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチルエステル：石油エーテル１：１）によって精製した。生成物の純度を、薄層クロマトグラフィーによって判定した。

ＤｍＣ４Ｍｏ２の合成
５．９ｇの２，３−ジメチルコハク酸−モノコレステリルエステルおよび３００ｍｌのテトラヒドロフランを、Ｎ_２雰囲気下で撹拌し、そして−１０℃まで冷却した。１．９ｍｌのＮ−メチルモルホリンを混合物に添加した。次いで、１．６ｍｌのイソブチルクロロホルミエートを、段階的に混合物に添加した。１時間後、混合物を０℃にし、そして約２時間後、室温にした。次いで、混合物を、再度、−１０℃まで冷却し、１．５ｍｌの４−（２−アミノエチル）モルホリンを段階的に添加し、そして反応物を、１晩、室温で撹拌した。混合物をろ過し、次いで、溶媒をエバポレートし、そして生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン／メタノール９６：４）およびヘキサンからの再結晶によって精製した。生成物を、薄層クロマトグラフィー、^１Ｈ−ＮＭＲおよびＨＰＬＣにより、特徴付けした。

ＤｍＣ３Ｍｏ２の合成
Ａ．２，２−ジメチル−マロン酸モノエチルエステルの合成
２５ｇの２，２−ジメチル−マロン酸ジエチルエステル、７．８ｇの水酸化カリウムおよび５００ｍｌのエタノールを、丸底フラスコにおいて混合し、そして３時間、還流した。次いで、再度、２．２ｇの水酸化カリウムを添加し、そして混合物を１晩、還流した。溶媒をロトバップ上で取り出し、２５０ｍｌのＨ_２Ｏを添加し、そして混合物をエーテルで洗浄した。水相を、ＨＣｌで酸性にして、ｐＨ３〜４とし、続いて、ジクロロメタンで２回抽出した。有機溶媒を乾燥し、そしてエバポレートし、そして得られた生成物を^１Ｈ−ＮＭＲによって特徴付けた。

Ｂ．２，２−ジメチル−Ｎ−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−マロンアミド酸エチルエステルの合成
１９ｇの２，２−ジメチル−マロン酸モノエチルエステルを丸底フラスコに秤量し、そしてＮ_２雰囲気下および室温で、２００ｍｌのテトラヒドロフラン、１５．６ｍｌの４−（２−アミノエチル）−モルホリンおよび３２．６ｍｌのＮ−メチルモルホリンを添加した。反応物を撹拌し、そして５℃に冷却した。次いで、４３．８ｇのＴＢＴＵを添加し、そして混合物をさらに１．５時間、撹拌した。最後に、溶媒を取り出し、そして残渣を４００ｍｌのジクロロメタンに溶解した。この有機相を、５００ｍｌのＮａＨＣＯ_３溶液で２回洗浄した。ジクロロメタン相を乾燥し、次いで、溶媒をエバポレートした。生成物の純度を、ガスクロマトグラフィーによって判定した。

Ｃ．２，２−ジメチル−Ｎ−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−マロンアミド酸（ＨＣｌ塩）の合成
３４．１ｇの２，２−ジメチル−Ｎ−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−マロンアミド酸エチルエステル、８．４ｇの水酸化カリウム、２００ｍｌのエタノールおよび４．５ｍｌのＨ_２Ｏを、８０℃で、６時間、撹拌した。次いで、溶媒のほとんどを取り出し、そして約１００ｍｌの２Ｎ ＨＣｌでｐＨをｐＨ３〜４に調整した。溶媒をエバポレートし、そしてトルオールを添加し、次いで、取り出した。最終残留物にメタノールを添加し、そして懸濁液をろ過して、塩を取り出した。溶媒を取り出し、そして残渣をＨ_２Ｏに溶解し、そして凍結乾燥した。生成物を^１Ｈ−ＮＭＲによって特徴付けた。

Ｃ．ＤｍＣ３Ｍｏ２の合成
１０．７ｇの２，２−ジメチル−Ｎ−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−マロンアミド酸（ＨＣｌ塩）および５０ｍｌのトルオールを、丸底フラスコ中、Ｎ_２雰囲気下で合わせた。次いで、１３．９ｍｌのチオニルクロリドを添加し、そして溶液を３時間、還流した。溶媒をエバポレートし、そして１５０ｍｌのクロロホルムを残渣に添加した。１４．７ｇのコレステロールおよび０．０２３ｇの４−ジメチルアミノピリジンの添加後、混合物を室温で撹拌し、そして１５分間後、１０．７ｍｌのトリエチルアミンを添加した。反応物を、室温で１．５日間、撹拌した。次いで、溶媒をロトバップにおいて取り出し、そして粗生成物を１００ｍｌの酢酸エチルエステルに溶解し、次いで、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチルエステル／メタノール９：１）およびエーテルからの再結晶により精製した。最終生成物を^１Ｈ−ＮＭＲおよびＨＰＬＣによって特徴付けた。

Ｃ３Ｍｏ３の合成
Ａ．マロン酸モノクロリドの合成
マロン酸モノクロリドを、Wilson, et al., J.Org.Chem 39 (1974) 3170に記載のように合成した。簡単に説明すると、１５０ｇのマロン酸および６００ｍｌのエーテルを、Ｎ_２雰囲気下、丸底フラスコに添加した。混合物を撹拌し、そして１５０．２ｍｌのチオニルクロリドを段階的に添加した。溶媒をロトバップにおいて取り出す前に、懸濁液を５時間、還流した。残渣を、音波処理下、および４０℃で、５００ｍｌのクロロホルム：ヘキサン１：２で３回処置した。３回分の抽出物を合わせ、そして−１５℃で、１晩、保持した。母液をデカントし、そして黄色結晶をヘキサンで洗浄し、そして乾燥した。母液を濃縮し、そして再度、−１５℃に保持し、さらなる生成物を得た。

Ｂ．マロン酸モノコレステリルエステルの合成
２６ｇのコレステロールおよび１２．４ｇのマロン酸モノクロリドを、Ｎ_２雰囲気下、丸底フラスコに秤量した。まず、３００ｍｌのベンゼンを添加し、続いて、１１ｍｌのピリジンを段階的に添加した。混合物を室温で撹拌し、そして１時間後、１００ｍｌのクロロホルムを添加した。３時間後、混合物を４０分間、音波処理し、続いて、再度、１００ｍｌのクロロホルムを添加し、そして混合物を、０．５日間、室温でさらに撹拌した。次いで、２５０ｍｌのＨ_２Ｏおよび１００ｍｌのクロロホルムを混合物に添加した。有機相を乾燥し、そして溶媒をロトバップにおいて取り出した。粗生成物を１００ｍｌのジクロロメタン／メタノール９：１に溶解し、続いて、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン／メタノール９：１）およびエーテルおよび石油エーテルからの再結晶によって精製した。最終生成物を１Ｈ−ＮＭＲによって特徴付けた。

Ｃ．Ｃ３Ｍｏ３の合成
６ｇのマロン酸モノコレステリルエステルを丸底フラスコに秤量し、そしてＮ_２雰囲気下および室温で、２００ｍｌのテトラヒドロフラン、２．２ｍｌの４−（２−アミノエチル）−モルホリンおよび２．８ｍｌのＮ−メチルモルホリンを添加した。混合物を撹拌し、そして０℃に冷却した。次いで、８．２ｇのＴＢＴＵを段階的に添加し、そして反応物を室温で１日間、撹拌した。シリカゲルを充填したフリット（溶離液：酢酸エチルエステル／メタノール１：１）を介して混合物をろ過することによって、懸濁液を予め精製した。最後に、粗生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール９：１）によって精製し、そして得られた生成物を、^１Ｈ−ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳによって特徴付けた。

Ｃ３Ｍｏ２の合成
６ｇのマロン酸モノコレステリルエステルを丸底フラスコに秤量し、そしてＮ_２雰囲気下および室温で、２００ｍｌのテトラヒドロフラン、２．０ｍｌの４−（２−アミノエチル）−モルホリンおよび２．８ｍｌのＮ−メチルモルホリンを添加した。混合物を撹拌し、そして０℃に冷却した。次いで、８．２ｇのＴＢＴＵを段階的に添加し、そして反応物を室温で２日間、撹拌した。シリカゲルを充填したフリット（溶離液：酢酸エチルエステル／メタノール１：１）を介して混合物をろ過することによって、懸濁液を予め精製した。最後に、粗生成物を、シリカゲル上でのクロマトグラフィー（１．クロマトグラフィー→溶離液：クロロホルム／メタノール９：１；２．クロマトグラフィー→溶離液：クロロホルム／０〜３％メタノール）によって精製した。得られた生成物を、^１Ｈ−ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳによって特徴付けた。

Ｃ４Ｍｏ４の合成
Ａ．４−モルホリン−４−イル−ブチロニトリルの合成
１９６．９ｍｌのモルホリン、５００ｍｌのトルオールおよび１００ｍｌのクロロホルムを、丸底フラスコにおいて、Ｎ_２雰囲気下および８０℃で撹拌した。１時間後、１００ｇの４−クロロブチロニトリルを、１時間以内に、段階的に添加した。反応物を、１日間、８０℃で、そしてさらに１日間、室温で撹拌した。混合物をフリットに通し、そして残渣をエーテルで２回洗浄した。ろ過物を濃縮し、最後に、減圧下で蒸留した。生成画分を、９５〜１００℃および１．２〜０．８９トルで回収した。無色のオイルの純度を、ガスクロマトグラフィーおよび^１Ｈ−ＮＭＲによって判定した。

Ｂ．４−モルホリン−４−イル−ブチルアミンの合成
１４．８ｇのリチウムアルミニウムヒドリドを、Ｎ_２雰囲気下、丸底フラスコに秤量した。物質を−５５℃に冷却し、そして１５０ｍｌのエーテルを段階的に添加した。懸濁液を撹拌し；次いで、３０ｇの４−モルホリン−４−イル−ブチロニトリルを２００ｍｌのエーテルに溶解し、そして溶液を反応混合物に段階的に添加した。再度、２００ｍｌのエーテルを混合物に添加し、そして反応物を室温で１晩、撹拌した。翌日、混合物を１０℃未満に冷却し、そして３５ｍｌのＨ_２Ｏを注意深く添加した。５時間後、混合物をフリットに通し、そして残渣を、３００ｍｌのエーテルで洗浄した。ろ過物を乾燥し、濃縮し、最後に、減圧下で蒸留した。生成画分を、７４〜７８℃および２．１〜１．６トルで回収した。無色のオイルの純度を、ガスクロマトグラフィー、ＧＣ−ＭＳおよび^１Ｈ−ＮＭＲによって判定した。

Ｃ．Ｃ４Ｍｏ４の合成
９．７ｇのコレステロールヘミスクシネートを、１００ｍｌのテトラヒドロフランに溶解し、そしてＮ_２雰囲気下および−１５℃で撹拌した。次いで、３．３ｍｌのＮ−メチルモルホリンを、段階的に、１０分間以内に添加し、続いて、２．９ｍｌのイソブチルクロロホルミエートを緩徐に添加した。次いで、３．２ｇの４−モルホリン−４−イル−ブチルアミンを、段階的に添加した。温度を室温にまで上昇させ、そして反応物を２．５時間、撹拌した。混合物をフリットに通し、そして残渣を２０ｍｌのテトラヒドロフランで洗浄した。ろ過物の溶媒をエバポレートし、そして残渣に、１００ｍｌの沸騰酢酸エチルエステルを添加した。さらなるろ過後、混合物を室温で２．５日間、保持した。溶媒を再度取り出し、そして粗生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン／メタノール９６：４および８３：１７）によって精製した。生成物を、薄層クロマトグラフィーおよび^１Ｈ−ＮＭＲにより、特徴付けした。

Ｃ５Ｍｏ２の合成
Ａ．ペンタン二酸モノコレステリルエステルの合成
３５ｇのコレステロールおよび１５．５ｇの無水グルタル酸を丸底フラスコに秤量した。Ｎ_２雰囲気下、５００ｍｌのクロロホルム、２５．４ｍｌのトリエチルアミンおよび０．２２ｇの４−ジメチルアミノピリジンを添加した。反応物を５日間、還流した。次いで、２５０ｍｌのＨ_２Ｏを添加し、そしてｐＨを、撹拌下、２Ｎ ＨＣｌでｐＨ４〜５に調整した。有機相を乾燥し、最後にエバポレートした。再度、残渣に、３１ｇの無水グルタル酸を、２５０ｍｌのトルオール、２２．１ｍｌのピリジンおよび０．２２ｇの４−ジメチルアミノピリジンと共に添加した。混合物を、１日間、還流した。次いで、溶媒をエバポレートし、そして残渣を、ジクロロメタン／酢酸エチルエステル（９６：４）に溶解し、そしてシリカゲル上でのフリット（溶離液：ジクロロメタン／メタノール９４：４）によって精製した。シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（溶離液：によるさらなる精製後、生成物を１Ｈ−ＮＭＲおよび薄層クロマトグラフィーによって特徴付けた。

Ｂ．Ｃ５Ｍｏ２の合成
Ｎ２窒素雰囲気下、６ｇのペンタン二酸モノコレステリルエステルを、２５０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解した。２．８ｍｌの４−（２−アミノエチル）モルホリンおよび２．６ｍｌのＮ−メチルモルホリンを添加し、そして混合物を１０℃に冷却した。最後に、７．７ｇのＴＢＴＵを段階的に添加し、そして反応物を室温で１日間、撹拌し、続いて、４℃で３日間、インキュベーションした。次いで、溶媒をエバポレートし、そして粗生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによって精製し、そして１Ｈ−ＮＭＲによって特徴付けた。

Ｃ６Ｍｏ２の合成
Ａ．オキセパン−２，７−ジオンの合成
１００ｇのアジピン酸および１００ｍｌの無水酢酸を、５時間、還流した。溶媒をロトバップにおいて取り出し、そして１００ｍｌのアセトニトリルを残渣に添加し、そして混合物を冷凍庫に１晩保持した。次いで、混合物をフリットに通し、そして得られた残渣を５０ｍｌのアセトニトリルで洗浄し、そして乾燥した。

Ｂ．ヘキサン二酸モノコレステリルエステルの合成
６５ｇのコレステロールおよび３３ｇのオキセパン−２，７−ジオンを丸底フラスコに秤量した。Ｎ_２雰囲気下、３００ｍｌのトルオール、２１．２ｍｌのピリジンおよび０．２１ｇの４−ジメチルアミノピリジンを添加した。反応物を２日間、還流した。次いで、溶媒をエバポレートし、そして残渣を、ジクロロメタン／酢酸エチルエステル（９６：４）に溶解し、そしてシリカゲル上でのフリット（溶離液：ジクロロメタン／酢酸エチルエステル（９６：４））によって精製した。生成物を、１Ｈ−ＮＭＲおよび薄層クロマトグラフィーにより、特徴付けした。

Ｃ．Ｃ６Ｍｏ２の合成
Ｎ_２窒素雰囲気下、１０ｇのヘキサン二酸モノコレステリルエステルを、２５０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解した。３．１ｍｌの４−（２−アミノエチル）モルホリンおよび３．２ｍｌのＮ−メチルモルホリンを添加し、そして混合物を１０℃に冷却した。さらなる１００ｍｌのテトラヒドロフランの添加後、９．４ｇのＴＢＴＵを段階的に添加し、そして反応物を室温で１晩、撹拌した。次いで、溶媒をエバポレートし、そして粗生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／０〜５％メタノール）によって精製し、そして^１Ｈ−ＮＭＲ、薄層クロマトグラフィーおよびＬＣ−ＭＳによって特徴付けた。

実施例１７：ｓｉＲＮＡをカプセル化する両性リポソーム
ｓｉＲＮＡ充填両性リポソームを、非標的スクランブルｓｉＲＮＡを使用して、製造した。脂質混合物Ａ（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＭＧＳ：Ｃｈｏｌ、２６：３９：３５ｍｏｌ％）またはＢ（ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＭＧＳ：Ｃｈｏｌ、２０：４０：４０ｍｏｌ％）を、エタノール中両方の混合物について３０ｍＭまたは６０ｍＭ（最終脂質濃度）の濃度で、溶解した。ｓｉＲＮＡストックの適切な容積を、２０ｍＭ ＮａＡｃ、３００ｍＭスクロース／ＮａＯＨ ｐＨ４．０に希釈した。有機および水溶液を３：７比で混合し、そしてリポソーム懸濁液を、１３６ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１００ｍＭ ＮａＣｌで直ちにｐＨ＞７．５に移行させた。

Centrisart（分子量カットオフ値３００ｋＤ（Sartorius、Goettingen、Germany）による限外ろ過を使用して、カプセル化されていないｓｉＲＮＡの量を決定した。ろ過物のｓｉＲＮＡ濃度を、分光学的（ＯＤ２６０ｎｍ）に測定した。カプセル化されたオリゴヌクレオチドの量を、ｓｉＲＮＡの全量からｓｉＲＮＡのカプセル化されていない量を差し引くことによって、決定した。

Claims (27)

1. 両性リポソームを処方する方法であって：
   アニオン性両親媒性物質、カチオン性両親媒性物質（前記アニオン性およびカチオン性両親媒性物質のそれぞれは、それぞれ極性ヘッドおよび無極性テール基を有する）、ならびに場合により、１つもしくはそれ以上の中性両親媒性物質を混合して両性リポソームを製造することを含んでなり、
   前記アニオン性両親媒性物質は荷電性アニオン性両親媒性物質を含んでなり、カチオン性両親媒性物質は荷電性カチオン性両親媒性物質を含んでなり、前記両親媒性物質の混合物はκ _ｓａｌｔ ＜０．４５を有し；ならびに前記荷電性カチオン性両親媒性物質は、ＤｍＣ４Ｍｏ２、ＤｍＣ３Ｍｏ２、Ｃ４Ｍｏ４、Ｃ３Ｍｏ３、Ｃ３Ｍｏ２、Ｃ５Ｍｏ２、Ｃ６Ｍｏ２およびＣ８Ｍｏ２から選択され；そして前記荷電性アニオン性両親媒性物質は、Ｃｈｅｍｓ、ＤＭＧＳ、ＤＭＧＭ、ＤＭＧＧ、ＤＭＧＡ、ＤＭＡＳ、ＤＭＡＭ、ＤＭＡＧ、ＤＭＡＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＧＭ、ＤＯＧＧ、ＤＯＧＡ、ＤＯＡＳ、ＤＯＡＭ、ＤＯＡＧ、ＤＯＡＡ、ＤＭＳ、ＤＭＭ、ＤＭＧ、ＤＭＡ、ＤＯＳ、ＤＯＭ、ＤＯＧ、ＤＯＡ、Ｃｈｏｌ−Ｃ３、Ｃｈｏｌ−Ｃ５およびＣｈｏｌ−Ｃ６から選択される、方法。
2. 前記アニオン性およびカチオン性両親媒性物質ならびにそれらのそれぞれの量は、前記両性リポソームがｐＨ４〜ｐＨ８の範囲で等電点を示すように選択される、請求項１に記載の方法。
3. ナトリウムまたはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス−ヒドロキシエチルアミノメタンおよびトリエチルアミンから選択される対カチオンをさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記両性リポソームがκ _ｓａｌｔ ＜０．３４を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記カチオン性両親媒性物質は、コレステロールベースであるか、またはジアシルグリセロールに基づく、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記コレステロールベースのカチオン性両親媒性物質は、ＭｏＣｈｏｌ、Ｃｈｉｍ、ＨｉｓＣｈｏｌおよびＤｅｓｈ４から選択される、請求項５に記載の方法。
7. 前記両性リポソームは、過剰の荷電性アニオン性両親媒性物質および安定なカチオン性両親媒性物質を含んでなり、κ_ｓａｌｔ＜０．３４、およびＣ／Ａ＝０．５のκ_{ｔｏｔａｌ}（ｐＨ８）とκ_ｓａｌｔ との間の差異＞０．０８を有し、ここに、前記Ｃ／Ａは、カチオン性両親媒性物質とアニオン性両親媒性物質との比である、請求項１に記載の方法。
8. 前記両性リポソームは、過剰の荷電性アニオン性両親媒性物質および安定なカチオン性両親媒性物質を含んでなり、κ_ｓａｌｔ＜０．３４を有し；ならびに前記安定なカチオン性両親媒性物質は、ＤＤＡＢ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＤＡＰ、Ｎ−メチル−ＰｉｐＣｈｏｌ、ＤＯＴＡＰ ＤＯＥＰＣおよびＣＴＡＢから選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記両性リポソームは、過剰の荷電性カチオン性両親媒性物質および安定なアニオン性両親媒性物質を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記随意的な中性両親媒性物質はコレステロールである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
11. １つもしくはそれ以上の中性または両イオン性両親媒性物質をさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記中性または両イオン性両親媒性物質は、ホスファチジルコリン類、スフィンゴミエリン類、セラミド類、ホスファチジルエタノールアミン類、コレステロールおよびその混合物から選択される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記中性または両イオン性両親媒性物質は、ホスファチジルコリン類、スフィンゴミエリン類、セラミド類であり、そして４０ｍｏｌ％未満の量で両性リポソーム中に存在する、請求項１１に記載の方法。
14. 前記中性または両イオン性両親媒性物質は、ＤＯＰＥもしくはコレステロールまたはそれらの混合物であり、そして６５ｍｏｌ％未満の量で両性リポソーム中に存在する、請求項１１に記載の方法。
15. 前記中性または両イオン性両親媒性物質は、ホスファチジルコリン類（ＰＣ）、スフィンゴミエリン類もしくはセラミド類およびホスファチジルエタノールアミン類（ＰＥ）の混合物、またはホスファチジルコリン類（ＰＣ）、スフィンゴミエリン類もしくはセラミド類およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）の混合物であり、そして前記中性または両イオン性両親媒性物質は、８０ｍｏｌ％以下の量で両性リポソーム中に存在する、請求項１１に記載の方法。
16. 前記リポソームは少なくとも１つの活性剤をカプセル化する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記活性剤は核酸である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記活性剤はオリゴヌクレオチドである、請求項１６または１７に記載の方法。
19. 請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法により作成された活性剤充填両性リポソームおよびその薬学的に許容可能なビヒクルを含んでなる医薬組成物。
20. アニオン性対イオンを含んでなる第１の溶媒で前記両性リポソームを第１のｐＨにまで酸性化すること、前記両性リポソームと負に荷電したカーゴ部分とを混合すること、およびその後、カチオン性対イオンを含んでなる第２の溶媒を使用して、前記両性リポソームのｐＨを第２のｐＨにまで上昇させることをさらに含み、前記負に荷電したカーゴ部分が充填された両性リポソームを処方する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記酸性化およびｐＨ上昇工程は、前記両性リポソームが迅速に所望のそれぞれのｐＨにもたらされるように、それぞれの溶媒の一段混合によって達成される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記第２のｐＨはｐＨ７．４である、請求項２０または２１に記載の方法。
23. 前記第１のｐＨは２〜５である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記第１の溶媒は、前記第１のｐＨにおける前記カーゴ部分のカプセル化のために、＞５０Ａ^３の分子容を有する対アニオンを含んでなる、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記対アニオンは、シトレート、ピロホスフェート、バルビツール酸およびメチルサルフェートから選択される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記カーゴ部分は核酸を含んでなる、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記中性両親媒性物質は、ＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＭＧＳ：Ｃｈｏｌ（２６：３９：３５ｍｏｌ％）またはＤＣ−Ｃｈｏｌ：ＤＭＧＳ：Ｃｈｏｌ（２０：４０：４０ｍｏｌ％）からなる、請求項１０に記載の方法。

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