CN117881428A - 用于mRNA递送的可电离脂质、脂质纳米颗粒和其制备方法 - Google Patents

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Abstract

提供了包括可电离脂质的组合物。还提供了形成脂质纳米颗粒的组合物，其中所述组合物包括可电离脂质、辅助脂质、固醇和PEG化的脂质偶联物。还提供了制造可电离脂质的方法。可电离脂质可以包括2AEOAP2、2AEOAP4、2AELAP2、2AELAP4、脂质16A、脂质16B、脂质16C、脂质16B和脂质20B。

Description

用于mRNA递送的可电离脂质、脂质纳米颗粒和其制备方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年7月12日提交的美国临时申请号63/220,817和2022年7月20日提交的美国临时申请号63/390,747的优先权，其整个内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明通常涉及可电离脂质、脂质纳米颗粒以及制造和使用可电离脂质、脂质纳米颗粒的方法。
背景技术
生物活性物质靶向递送领域的主要挑战之一是它们的不稳定性和低的细胞穿透潜力，以及它们对酶降解的易感性。这给利用核酸分子、特别是RNA分子的疗法的开发带来了挑战。
在这方面，基于脂质的纳米颗粒组合物，例如DNA/阳离子脂质体复合物(lipoplexes)和脂质体，已被用作生物活性物质的包装载体，以允许运输到细胞和/或细胞内隔室中。这些基于脂质的纳米颗粒组合物通常包括不同脂质的混合物，例如可电离脂质、辅助脂质、结构脂质(例如固醇或胆固醇)和脂质偶联物。
新兴的临床疗法，特别是基于核酸的疫苗，需要药物递送系统，诸如脂质纳米颗粒，其可以包封和递送各种货物(cargo)分子。因此，需要开发新的脂质和/或纳米颗粒以更好地提供治疗。
发明概述
在一个实施方案中，提供了包含至少一种根据式(I)的可电离脂质或其药学上可接受的盐的组合物，其中a)R1独立地选自 并且R2选自 在实施方案中，可电离脂质可以选自：2AEOAP2、2AEOAP4、2AELAP2和2AELAP4。
在其他实施方案中，提供了包含至少一种根据式(II)的可电离脂质或其药学上可接受的盐的组合物，其中a)R1独立地选自 并且b)R2选自 在实施方案中，可电离脂质可以选自脂质16A、脂质16B、脂质16C和脂质16D。
在其他实施方案中，提供了包含脂质20B的组合物。
在实施方案中，上述组合物中的任一种的组合物可以进一步包括辅助脂质、固醇、PEG化的脂质偶联物，其中所述组合物形成脂质纳米颗粒。在实施方案中，可电离脂质选自：2AEOAP2、2AEOAP4、2AELAP2、2AELAP4、脂质16A、脂质16B、脂质16C、脂质16B和脂质20B。在实施方案中，辅助脂质可以选自：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(DOPG)。在实施方案中，辅助脂质是DOPE。在实施方案中，固醇是胆固醇或其衍生物。在实施方案中，PEG化的脂偶联物为PEG化的肉豆蔻酰甘油二酯(PEG-DMG)。在实施方案中，脂质纳米颗粒至少部分地包封核酸。在实施方案中，核酸为mRNA。在实施方案中，组合物可以进一步包括药学上可接受的赋形剂。在实施方案中，组合物被配制用于通过注射或输注施用。在实施方案中，可电离脂质可以占约40摩尔％至60摩尔％，辅助脂质占约10摩尔％至20摩尔％，固醇占约30摩尔％至50％摩尔％；并且所述偶联脂质占约1摩尔％至5摩尔％。
参考以下描述、所附权利要求书和附图，本发明的这些和其他特征、方面和优点将变得更容易理解。
附图说明
虽然说明书以特别指出并明确要求保护本发明的权利要求书结尾，但据信通过结合附图的以下描述可以更好地理解本发明，其中：
图1示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的合成可电离咪唑脂质的说明性实施方案；
图2示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的在合成图1的可电离脂质中的第一中间产物(产物1)的1H NMR光谱；
图3示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的在合成图1的可电离脂质中的第二中间产物(产物2)的1H NMR光谱；
图4示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的图1的可电离脂质的ESI-MS光谱，其具有782.59的理论质量和785.59的实测质量；
图5A示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的各种脂质纳米颗粒的颗粒大小的图示；
图5B示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的各种脂质纳米颗粒的表面电荷的图示；
图6示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的各种脂质纳米颗粒在HeLa细胞中的体外细胞摄取和转染效率的图示；
图7示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的各种脂质纳米颗粒在Jurkat细胞中的体外细胞摄取和转染效率的图示；
图8示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的合成产物4的说明性实施方案；
图9示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的在合成图8的产物4中的中间产物(产物3)的1H NMR光谱；
图10示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的产物4的1H NMR光谱；
图11示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的合成产物5可电离脂质2AEOAP2的说明性实施方案；
图12示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的合成产物6的说明性实施方案；
图13示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的合成产物7的说明性实施方案；
图14示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的合成产物8的说明性实施方案；
图15示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的合成具有亚麻醇尾部的脂质的说明性实施方案；
图16示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的在合成图15的具有亚麻醇尾部的脂质中的中间产物(产物9)的1H NMR光谱；
图17示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的图15的具有亚麻醇尾部的脂质的1H NMR光谱；
图18示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的合成脂质(产物11)的说明性实施方案；
图19示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的合成脂质(产物12)的说明性实施方案；
图20示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的合成脂质(产物13)的说明性实施方案；
图21示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的合成脂质(产物14)的说明性实施方案；
图22A示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的各种脂质纳米颗粒的颗粒大小的图示；
图22B示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的各种脂质纳米颗粒的表面电荷的图示；
图23示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的各种脂质纳米颗粒制剂在Jurkat细胞中的细胞摄取和转染效率的图示；
图24A示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的合成环状脂质的说明性实施方案；
图24B示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的用图24A的方案合成的命名为脂质16A至脂质16D的四种环状脂质的说明性实例；
图25A示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的合成基于哌啶的脂质的说明性实施方案；和
图25B示出了根据本文所示和描述的一个或多个方面的用图25A的方案合成的命名为脂质20A至脂质20B的基于哌啶的脂质的说明性实例。
本文所述的示例说明了本公开内容的至少一个实施方案，并且这样的示例不应被解释为以任何方式限制本公开内容的范围。
详细描述
现在将偶尔参考具体实施方案来描述本发明的特征和优点。然而，本发明可以以不同的形式体现，并且不应被解释为限于本文所阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案使得本公开内容将是全面和完整的，并将本发明的范围完全传达给本领域技术人员。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在本文的说明书中使用的术语仅用于描述特定的实施方案，而不旨在进行限制。
如本文所使用的，单数形式“一个(a/an)”、“一种(a/an)”和“所述(the)”旨在包括复数形式，包括“至少一个”，除非内容明确地另有说明。“或”的意思是“和/或”。如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关列出项目的任何和所有组合。应进一步理解的是，当在本说明书中使用术语“包含(comprises)”和/或“包含(comprising)”或“包括(includes)”和/或“包括(including)”指定了所述特征、区域、整体、步骤、操作、要素和/或组分的存在，但不排除一个或多个其他特征、区域、整体、步骤、操作、要素、组分和/或其组的存在或添加。应进一步理解，在各种实施方案的描述使用术语“包含”和/或“包括”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可以使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”替代地描述实施方案。术语“或其组合”是指至少包括上述要素中的至少一种的组合。
除非另有说明，否则说明书和权利要求书中使用的所有表示成分数量、性质(如分子量、反应条件等)的所有数字应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非另有说明，否则说明书和权利要求书中所述的数值性质是近似值，其可以根据在本发明的实施方案中寻求获得的期望的性质而变化。尽管阐述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但具体实例中列出的数值是尽可能精确地报告的。本领域普通技术人员将理解，任何数值固有地包含可归因于用于确定该值的测量技术的某些误差。
应当理解，贯穿本说明书给出的每个数值范围将包括落入这种更宽的数值范围内的每个更窄的数值范围，就好像这种更窄的数值范围都被明确地写入本文一样。范围在本文中可以表示为从“约”一个具体值和/或至“约”另一个具体值。当表示这种范围时，实例包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将会理解具体值形成另一个方面。还将理解每一个范围的端点相对于另一个端点并且独立于另一个端点都是重要的。
本文提供的范围应被理解为该范围内所有值的简写。例如，1到25的范围被理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25组成的组的任何数、数的组合或子范围，以及上述整数之间的所有中间十进制值，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，特别考虑从范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。例如，示例性范围1至25的嵌套子范围可以包括一个方向的1至5、1至10、1至15和1至20，或者另一方向的25至20、25至15、25至10和25至5。
如本文所使用的术语“改善”、“增加”、“抑制”、“减少”或其语法等同物表示相对于基线或其他参考测量的值。在一些实施方案中，合适的参考测量可以是或包括在不存在(例如，在...之前和/或在...之后)特定试剂或治疗的情况下，或在存在合适的可比较参考试剂的情况下，在其他可比较条件下在特定系统(例如，单个受试者)中的测量。在一些实施方案中，合适的参考测量可以是或包括已知或预期在相关试剂或治疗存在的情况下以特定方式响应的可比系统中的测量。
如本文所用，核酸序列的术语“表达”是指从核酸序列产生任何基因产物。在一些实施方案中，基因产物可以是转录物。在一些实施方案中，基因产物可以是多肽。在一些实施方案中，核酸序列的表达涉及以下中的一种或多种：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'端形成)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
除非另有明确说明，否则本文所述的任何方法绝不旨在被解释为要求以特定顺序执行其步骤。因此，如果方法权利要求实际上没有列举其步骤所遵循的顺序，或者在权利要求或说明书中没有以其他方式具体说明将步骤限定为特定顺序，则决不旨在推断任何特定顺序。任何一项权利要求中的任何所述单个或多个特征或方面可以与任何其他权利要求中的任何其他所述特征或方面组合或置换。
本文使用的术语“独立地选自”旨在表示所引用的基团可以是相同的、不同的或其混合物，除非上下文清楚地另有说明。因此，在这个定义下，短语“X1、X2、X3独立地选自惰性气体”包括其中X1、X2和X3都是相同的情况，其中X1、X2和X3都是不同的情况，其中X1和X2是相同的，但X3是不同的情况。
本文中使用的术语“受试者”是指可以施用药物的任何活生物体。术语“受试者”包括但不限于人类、非人类灵长类动物诸如黑猩猩以及其他类人猿和猴子；农场动物，诸如牛、羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，诸如如狗和猫；实验室动物包括啮齿动物诸如小鼠、大鼠和豚鼠等。该术语并不表示特定的年龄或性别。因此，成人、儿童和新生儿受试者，以及胎儿，无论是男性还是女性，都应被包括在内。
如本文所用，术语“药学上可接受”是指经联邦或州政府监管机构批准或可批准，或在美国药典或其他公认药典中列出的可用于动物、包括人类。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂”等是指可与药剂一起施用于受试者的赋形剂、载体或稀释剂，其不破坏药剂的药理活性，并且当以足以递送治疗量的药剂的剂量施用时是无毒的。
本文使用的术语“药学上可接受的盐”是指本公开内容的可电离脂质的药学上可接受的有机盐或无机盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、过磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐，酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐，抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、延胡索酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐“甲磺酸盐”(methanesulfonate“mesylate,”)、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、双羟萘酸盐(即1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸))盐、碱金属(如钠和钾)盐、碱土金属(如镁)盐和铵盐。药学上可接受的盐可以包括另一分子，例如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他反离子。反离子可以是稳定母体化合物上电荷的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可以具有一个以上的带电原子。其中多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的实例可以具有多个反离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电荷的原子和/或一个或多个反离子。
如本文所用，术语“脂质包封”是指提供活性剂或治疗剂的脂质颗粒，例如具有完全包封、部分包封或两者兼有的核酸(例如，反义寡核苷酸(ASO)、mRNA、siRNA、封闭端DNA(ceDNA)、病毒载体等)。在优选的实施方案中，核酸被完全包封在脂质颗粒中(例如，以形成含有核酸的脂质颗粒)。
除非另有说明，否则本文所描绘和描述的结构包括该结构的所有同分异构体(例如，对映体、非对映体和几何异构体)形式；例如，互变异构体，每个不对称中心的R构型和S构型，Z和E双键异构体，以及Z和E构象异构体。此外，除非另有说明，否则本文所描绘和描述的结构包括仅在存在一个或多个同位素富集的原子时不同的化合物。例如，具有本发明结构的化合物(包括用氘或氚代替氢，或用富含13C-或14C的碳代替碳)都在本发明的范围内。这类化合物例如可用作分析工具或可用作治疗剂。
可电离脂质
如这里所用，术语“可电离脂质”是指脂质，例如具有至少一个可质子化或可去质子化的基团的阳离子脂质，使得该脂质在处于或低于生理pH(例如pH7.4)的pH下带正电荷，并且在处于或高于生理pH的第二pH下呈中性。本领域普通技术人员将理解，作为pH的函数的质子的添加或去除是一个平衡过程，并且提及带电或中性脂质是指主要物质的性质，并且不需要所有脂质都以带电或中性形式存在。在一些方面，可电离脂质的特征在于三个部分：胺基头部、连接基和疏水尾部。
在一些方面，通过使酰氯或甲磺酰氯与在二氯甲烷和脂肪醇中的三甲胺反应以产生第一反应产物来合成本公开内容的可电离脂质。该反应可以在搅拌或不搅拌的情况下进行。反应可以在监测或不监测的情况下进行任何适当的时间量。在一些方面，时间量包括例如约0至96小时，包括1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时、63小时、64小时、65小时、66小时、67小时、68小时、69小时、70小时、71小时、72小时、73小时、74小时、75小时、76小时、77小时、78小时、79小时、80小时、81小时、82小时、83小时、84小时、85小时、86小时、87小时、88小时、89小时、90小时、91小时、92小时、93小时、94小时、95小时、和96小时，或者具有由上述值中的任意两个定义的端点的任何范围。
示例性酰氯包括但不限于，丙烯酰氯、乙酰氯、己二酰氯、茴香酰氯、壬二酰氯、苯甲酰氯、丁酰氯、氯乙酰氯、戊二酰氯、庚酰氯(hepatnoyl chloride)、己酰氯、异丁酰氯、月桂酰氯、丙二酰氯、甲基丙烯酰氯、辛酰氯、草酰氯、戊酰氯、庚二酰氯、三甲基乙酰氯、丙酰氯、亚硫酰氯、硫代酰氯等，尽管任何合适的酰氯都是可以考虑的和可能的。
示例性脂肪醇包括但不限于油醇、亚麻醇、叔丁醇、叔戊醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、棕榈油醇、十七烷醇、十八烷醇、十九烷醇、二十烷醇、二十一烷醇、二十二烷醇、瓢儿菜醇、二十四烷醇和二十六烷醇，尽管任何合适的脂肪醇都是可以考虑的和可能的。
在一些方面，可以使用合适的溶剂提取第一反应产物。溶剂的示例性实例包括但不限于极性非质子溶剂(例如二氯甲烷(DCM)、二甲基亚砜(DMSO)、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、硝基甲烷、碳酸亚丙酯等)、非极性烃溶剂(例如戊烷、己烷、苯、庚烷、甲苯等)，非极性醚溶剂(例如乙醚、四氢呋喃等)、非极性氯碳溶剂(例如氯仿等)、极性质子溶剂(例如氨、甲酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇、乙醇、甲醇、乙酸、水等)或其组合。
反应的监测可以包括，例如，薄层色谱法、傅立叶变换红外光谱法(FTIR)、紫外可见光谱法(UV-Vis)、核磁共振(NMR)、温度监测、pH监测等，尽管本领域已知的任何监测方法都是可以考虑的和可能的。
在一些方面，使第一反应产物在提取后干燥。在一些方面，产物的干燥通过任何可接受的方法进行，包括但不限于在环境温度下蒸发、使用热源(例如，蒸汽浴、热板、砂浴、烘箱等)、旋转蒸发或气体吹扫。
在一些实施方案中，第一反应产物是2-丙烯酸(9Z)-9-十八碳烯-1-基酯或2-丙烯酸,9,12-十八碳二烯基酯,(Z,Z)-(9CI)。
在一些方面，第一反应产物与氨基醇反应以产生第二反应产物。在一些方面，反应是在搅拌的情况下进行的。在其他方面，它是不搅拌的情况下进行的。在一些方面，反应可发生在高于环境温度的温度下发生，所述温度包括但不限于约30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃。在一些方面，这种反应可以在约环境温度下发生。在一些方面，反应可以在低于环境温度的温度下发生，所述温度包括但不限于约20℃、15℃、10℃、5℃或0℃。在监测或不监测的情况下，反应可以进行任何合适的时间量。示例性氨基醇包括但不限于乙醇胺(即2-氨基乙醇)、甲醇胺、二甲基乙醇胺、N-甲基乙醇胺和氨基甲基丙醇。
加入一种或多种溶剂提取第二反应产物。在一些方面，将第二反应产物干燥。在一些实施方案中，第二反应产物为β-丙氨酸,N-(2-羟乙基)-N-[3-(9-十八烯基氧基)-3-氧代丙基]-9-十八烯基酯(Z,Z)-(9CI)(产物4)或产物10，其结构为：
在一些方面中，第二反应产物用于可电离脂质的合成。第二反应产物可以溶解在一种或多种溶剂的溶液中。在实施方案中，溶剂是DCM和DMF。在一些方面，将羧基活化剂，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，和酯化催化剂，例如4-二甲氨基吡啶(DMAP)添加到溶液中。该反应可以在搅拌或不搅拌的情况下进行。反应可以在监测或不监测的情况下进行任何适当的时间量。
在一些方面中，在加入羧基活化剂和酯化催化剂之后加入羧酸衍生物。示例性的羧酸衍生物包括但不限于1-甲基哌啶-2-羧酸盐酸盐、1-甲基-4-哌啶羧酸、3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐、4-二甲基氨基丁酸盐酸盐或1H-咪唑-1-基乙酸。羧酸衍生物反应可在搅拌或不搅拌的情况下进行。反应可以在监测或不监测的情况下进行任何适当的时间量。蒸发溶剂以得到可电离脂质。
在其他方面，反应产物可以通过将羧基活化剂诸如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，和酯化催化剂诸如4-二甲基氨基吡啶(DMAP)混合到一种或多种溶剂和环醇诸如环己烷-1,3,5-三醇的溶液中来合成。在一些方面中，还添加了羧酸衍生物。该反应可以在搅拌或不搅拌的情况下进行。反应可以在监测或不监测的情况下进行任何适当的时间量。所需的反应产物可以通过本领域已知的任何方法分离，例如柱色谱法，以分离反应产物。
在实施方案中，反应产物为产物15：
其中R1是/>
在一些方面中，反应产物用于合成可电离脂质。在一些方面，反应产物与羧基活化剂和酯化催化剂混合。可以将脂肪醇加入到溶液中。该反应可以搅拌或不搅拌的情况下进行。反应可以在监测或不监测的情况下进行任何适当的时间量。反应混合物可以用溶剂提取。可以使用任何合适的分离方法，例如柱色谱法等，从提取的混合物中分离出所需的可电离脂质。
在其他方面，第一反应产物是通过脂肪醇与甲磺酰氯(例如甲基磺酰氯)在三乙胺的存在下在二氯甲烷溶液中反应合成的。第一反应产物可以使用溶剂提取。
在实施方案中，第一反应产物为产物17：
可以将第一反应产物溶解在溶剂诸如乙醚中，并且可以将乙醚溴化镁添加到该溶液中。第二反应产物可以用一种或多种溶剂提取。
在实施方案中，第二反应产物为产物18：
第二反应产物可以滴加到镁屑(magnesium turnings)在溶剂中的混合物中，引起放热反应。在一些方面，可以加入碘来引发反应。完成后，可以将甲酸乙酯滴加到溶液中。反应混合物可以使用任何合适的溶剂提取，并用柱色谱法分离。反应系统可以用氮气脱气并回流冷凝，以产生第三反应产物。
在实施方案中，第三反应产物为产物19：
在一些方面，第三反应产物可以与羧基活化剂、酯化催化剂和羧酸衍生物反应以合成可电离脂质。
在实施方案中，可电离脂质具有根据式(I)的结构：
在实施方案中，R1独立地选自
在实施方案中，R2独立地选自
在实施方案中，可电离脂质具有根据式(II)的结构：
在实施方案中，R1独立地选自
在实施方案中，R2独立地选自
在实施方案中，可电离脂质具有根据式(III)的结构：
在实施方案中，R1独立地选自
在实施方案中，R1为
根据本文所述的方面或实施方案中的任一个的一些实施方案，可电离脂质选自表1中的任何一种脂质或其药学上可接受的盐。
表1
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脂质纳米颗粒
在本公开内容的一些方面中，本文公开的可电离脂质，特别是表1所示的那些可电离脂质可以被掺入到脂质纳米颗粒(LNP)中。在一些方面，脂质纳米颗粒可用于递送单独的或作为包装在可递送药物组合物诸如疫苗中的货物分子(例如多肽、核酸、小分子等)。脂质纳米颗粒可以包括一种或多种可电离脂质、辅助脂质、固醇和/或偶联的脂质组分以及感兴趣的核酸或多肽货物。
在一些方面，脂质纳米颗粒包含一种或多种如本文所述的可电离脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含本文所述的一种或多种辅助脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含本文所述的一种或多种固醇。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含本文所述的一种或多种偶联物-连接基脂质。
LNP可以在一些方面用于将货物运送和/或递送至受试者或其一部分，诸如细胞或细胞区室。利用这种LNP的DNA和RNA疫苗有很多相似之处，但每种疫苗都针对不同的细胞环境。例如，DNA疫苗靶向细胞核并在细胞核中使用，而RNA疫苗靶向细胞溶质并在细胞溶质中表达。这使得mRNA疫苗更容易递送，但两者都可以利用LNP制剂的最新进展的成功，有时还可以对核酸货物本身进行可以提高整体功能的其他修改。
如本文所用，术语“纳米颗粒”是指具有小于约1000nm的尺度上的尺寸的颗粒。通常，纳米颗粒具有小于约500nm、小于约400nm、小于约300nm、小于约200nm或小于约100nm的尺度上任何一种结构特征。在示例性实施方案中，纳米颗粒是具有约10nm至500nm量级的一个或多个尺寸的颗粒。在其他示例性实施方案中，纳米颗粒是具有约10nm至1000nm量级的一个或多个尺寸的颗粒。球形纳米颗粒的直径例如为10nm至100nm或10nm至1000nm。
术语“颗粒大小”或“粒径”是指通过动态光散射(DLS)、多角度光散射(MALS)、纳米颗粒跟踪分析或类似技术测量的样品中颗粒的平均直径。应当理解，本文所述的脂质纳米颗粒的分散不是均匀大小的，而是可以通过平均直径和任选的多分散性指数来描述。
在一些实施方案中，本文所描述的脂质纳米颗粒可以具有30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、155nm、160nm、165nm、170nm、175nm、180nm、185nm、190nm、195nm、200nm、205nm、210nm、215nm、220nm、225nm、230nm、235nm、240nm、245nm、250nm、255nm、260nm、265nm、270nm、275nm、280nm、285nm、290nm、295nm、300nm、305nm、310nm、315nm、320nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm、350nm、355nm、360nm、365nm、370nm、375nm、380nm、385nm、390nm、395nm、400nm、405nm、410nm、415nm、420nm、425nm、430nm、435nm、440nm、445nm、450nm、455nm、460nm、465nm、470nm、475nm、480nm、485nm、490nm、495nm、500nm的或者具有由上述值中的任意两个定义的端点的任何范围的平均粒径。例如，在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒的平均粒径为100nm至200nm。
纳米颗粒组合物的ζ电位可用于指示该组合物的动电电位。例如，ζ电位可以描述纳米颗粒组合物的表面电荷。具有相对低的正或负电荷的纳米粒子组合物通常是需要的，因为更高电荷的物质可以与体内的细胞、组织和其他元素不期望地相互作用。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的ζ电位可以为约-20mV至约+20mV、约-20mV至约+15mV、约-20mV至约+10mV、约-20mV至约+5mV、约-20mV至约0mV、约-20mV至约-5mV、约-5mV至约+20mV、约-5mV至约+15mV、约-5mV至约+10mV、约-5mV至约+5mV、约-5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV、或约+5mV至约+10mV。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含可电离和/或阳离子脂质与用于形成脂质纳米颗粒的任何上述可电离脂质的组合的混合物。合适的阳离子脂质包括但不限于N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、5-羧基spermyl甘氨酸双十八烷基酰胺(DOGS)2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-羧酰胺)乙基]-N,N-二甲基-l-丙铵(DOSPA)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂酰基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亚麻氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基(dilinolenyloxy)-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)、N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式，顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式，顺式-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或(DOcarbDAP、2,3-二亚麻酰基氧基(dilinoleoyloxy)-N,N-二甲基丙胺(DLinDAP)、1,2-N,N′-二亚麻基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亚麻酰基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinCDAP)、2,2-二亚麻基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-DMA)、2,2-二亚麻基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-XTC2-DMA)、2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊环-4-基)-N,N-二甲基乙胺(DLin-KC2-DMA)、DLin-MC3-DMA，(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)或其混合物。
在一些实施方案中，可电离脂质按重量计或按摩尔计占合适的脂质溶液中总脂质的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些实施方案中，可电离脂质按重量或按摩尔计占总脂质混合物的约30％至70％(例如，约30％至65％、约30％至60％、约30％至55％、约30％至50％、约30％至45％、约30％至40％、约35％至50％、约35％至45％、约35％至40％、约40％至60％、约45％至60％、约50％至60％、约55％至60、约40％至65％、约45％至65％、约50％至65％、约55％至65％、约60％至65％)。
在实施方案中，LNP可以进一步包含非阳离子辅助脂质。辅助脂质可用于在形成过程中增加融合性(fusogenicity)和/或增加LNP的稳定性。辅助脂质包括两亲性脂质、中性脂质和阴离子脂质。如本文所用，短语“辅助脂质”是指任何中性脂质、两性离子脂质或阴离子脂质。因此，非阳离子脂质可以是中性不带电的脂质、两性离子脂质或阴离子脂质。如本文所用，术语“中性脂质”是指在选定pH下以不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质物质中的任何一种。在生理pH下，这样的脂质包括但不限于，例如，二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂基乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。
如本文所用，术语“阴离子脂质”是指在生理pH下带负电的任何脂质。这些脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇酰胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)和连接到中性脂质的其他阴离子改性基团。
辅助脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DPSC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、2-二植酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DPyPE)、二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、双油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOP-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、鸡蛋磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、鞘磷脂(SM)、鸡蛋鞘磷脂(ESM)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、dielaidoyl-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)、l,2-二植酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPHyPE)；卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇或其组合。
在一些实施方案中，一种或多种辅助脂质选自DSPC(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPC(1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)、DPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油))。
在一些实施方案中，可电离脂质按重量计或按摩尔计占合适的脂质溶液中总脂质的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％。在一些实施方案中，辅助脂质按重量计或按摩尔计占合适的脂质溶液中的总脂质的约5％至25％(例如，约5％至20％、约5％至15％、约5％至10％、约10％至25％、约10％至20％、约10％至15％、约15％至25％、约15％至20％或约20％至25％)。
在一些实施方案中，LNP可进一步包含组分，例如固醇，以提供脂质颗粒的膜完整性和稳定性。固醇的示例性实例包括但不限于胆固醇、麦角固醇、菜油固醇、氧化固醇、antrosterol、链固醇、nicasterol、谷固醇、豆固醇、其衍生物和变体，以及上述的混合物。在一些实施方案中，固醇是胆固醇或其衍生物或变体。胆固醇衍生物的非限制性例子包括5a-胆固醇、5P-粪固醇、胆固醇基-(2'-羟基)-乙醚、胆固醇基-(4'-羟基)-丁醚、6-酮胆固烷醇；5a-胆固烷、胆固烯酮、5a-胆固烷酮、5P-胆固烷酮、癸酸胆固醇酯、25-羟基胆固醇(25-OH)、20a-羟基胆固醇(20a-OH)、27-羟基胆固醇、6-酮-5a-羟基胆固醇、7-酮胆固醇、7-羟基胆固醇、7-a-羟基胆固醇、7-25-二羟基胆固醇、β-谷固醇、豆固醇、菜籽固醇、菜油固醇或其组合。
在一些实施方案中，固醇按重量计或按摩尔计占合适的脂质溶液中总脂质的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在一些实施方案中，固醇按重量计或按摩尔计占合适的脂质溶液中总脂质的约30％至50％(例如约30％至45％、约30％至40％、约35％至50％、约35％至45％、约35％至40％)。
在一些实施方案中，LNP可以进一步包括脂质偶联物。如本文所用，术语“脂质偶联物”是指抑制LNP的聚集的偶联的脂质。此类脂质偶联物包括但不限于聚乙二醇(PEG)-脂质偶联物，例如，偶联至二烷基氧基丙基的PEG(例如，PEG-DAA偶联物)、偶联至二酰基甘油的PEG(例如，PEG-DAG偶联物)、偶联至胆固醇的PEG、偶联至磷脂酰乙醇胺的PEG、和偶联至神经酰胺的PEG、可电离的PEG脂质、聚唑啉(POZ)-脂质偶联物、聚酰胺低聚物(例如，ATTA-脂质偶联物)及其混合物。PEG或POZ可以直接偶联到脂质上，也可以通过连接基部分与脂质连接。可以使用任何适合于将PEG或POZ偶联到脂质上的连接基部分，包括例如不含酯的连接基部分和含酯的连接基部分。在某些优选的实施方案中，使用不含酯的连接基部分，诸如酰胺或氨基甲酸酯。
在一些实施方案中，脂质偶联物包括PEG修饰的脂质。在实施方案中，PEG化的脂质可用于增强脂质纳米颗粒在体外的胶体稳定性和体内循环时间。用于LNP的例示性PEG-脂包括但不限于PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPE、PEG-DSG、PEG-DSPE、二肉豆蔻酰基甘油(DMG)、1,2-二棕榈酰基-rac-甘油、甲氧基聚乙二醇(DPG-PEG)、1,2-二硬脂酰丙基-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯(DSG-PEG)。在一些实施方案中，脂质偶联物具有约500Da至约5000Da的平均分子质量。
脂质偶联物按重量计或按摩尔计可占合适的脂质溶液中的总脂质的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％。在一些实施方案中，脂质偶联物按重量计或按摩尔计占合适的脂质溶液中总脂质的约1％至5％(例如，约1％至2％、约1％至3％、约1％至4％、约2％至5％、约2％至4％、约2％至3％、约3％至5％、约3％至4％或约4％至5％)。
合适的脂质溶液可以含有不同浓度的所需的脂质的混合物。例如，合适的脂质溶液可以含有的所需的脂质的混合物的总浓度为或大于约0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml、5.0mg/ml、6.0mg/ml、7.0mg/ml、8.0mg/ml、9.0mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml或100mg/ml。在一些实施方案中，合适的脂质溶液可以含有的所需的脂质的混合物的总浓度的范围为约0.1mg/ml至100mg/ml、0.25mg/ml至50mg/ml、1.0mg/ml至20mg/ml、1.0mg/ml至70mg/ml、1.0mg/ml至60mg/ml、1.0mg/ml至50mg/ml、1.0mg/ml至40mg/ml、1.0mg/ml至30mg/ml、1.0mg/ml至20mg/ml、1.0mg/ml至15mg/ml、1.0mg/ml至10mg/ml、1.0mg/ml至9mg/ml、1.0mg/ml至8mg/ml、1.0mg/ml至7mg/ml、1.0mg/ml至6mg/ml、或1.0mg/ml至5mg/ml。在一些实施方案中，合适的脂质溶液可以含有的所需的脂质的混合物的总浓度高达约100mg/ml、90mg/ml、80mg/ml、70mg/ml、60mg/ml、50mg/ml、40mg/ml、30mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、4mg/ml、3mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml或0.1mg/ml/。
在一些实施方案中，可电离脂质以约30摩尔％至60摩尔％的摩尔百分比被包含在脂质溶液中，包括30摩尔％、31摩尔％、32摩尔％、33摩尔％、34摩尔％、35摩尔％、36摩尔％、37摩尔％、38摩尔％、39摩尔％、40摩尔％、41摩尔％、42摩尔％、43摩尔％、44摩尔％、45摩尔％、46摩尔％、47摩尔％、48摩尔％、49摩尔％、50摩尔％、51摩尔％、52摩尔％、53摩尔％、54摩尔％、55摩尔％、56摩尔％、57摩尔％、58摩尔％、59摩尔％和60摩尔％，或具有由上述值中的任意两个定义的端点的任何范围。在实施方案中，辅助脂质以约0摩尔％至30摩尔％的摩尔百分比被包含在脂质溶液中，包括1摩尔％、2摩尔％、3摩尔％、4摩尔％、5摩尔％、6摩尔％、7摩尔％、8摩尔％、9摩尔％、10摩尔％、11摩尔％、12摩尔％、13摩尔％、14摩尔％、15摩尔％、16摩尔％、17摩尔％、18摩尔％、19摩尔％、20摩尔％、21摩尔％、22摩尔％、23摩尔％、24摩尔％、25摩尔％、26摩尔％、27摩尔％、28摩尔％、29摩尔％和30摩尔％，或具有由上述值中的任意两个定义的端点的任何范围。在实施方案中，固醇以约25摩尔％至50摩尔％的摩尔百分比被包含在脂质溶液中，包括25摩尔％、26摩尔％、27摩尔％、28摩尔％、29摩尔％、30摩尔％、31摩尔％、32摩尔％、33摩尔％、34摩尔％、35摩尔％、36摩尔％、37摩尔％、38摩尔％、39摩尔％、40摩尔％、41摩尔％、42摩尔％、43摩尔％、44摩尔％、45摩尔％、46摩尔％、47摩尔％、48摩尔％、49摩尔％和50摩尔％，或具有由上述值中的任意两个定义的端点的任何范围。在实施方案中，脂质偶联物以约0摩尔％至10摩尔％的摩尔百分比被包含在脂质溶液中，包括1摩尔％、2摩尔％、3摩尔％、4摩尔％、5摩尔％、6摩尔％、7摩尔％、8摩尔％、9摩尔％和10摩尔％，或具有由上述值中的任意两个定义的端点的任何范围。
在一些实施方案中，货物包括核酸(例如，DNA、RNA，例如，mRNA)。核酸在水溶液中的浓度可以为50μg/ml至200μg/ml(例如，约50μg/ml、约60μg/ml、约70μg/ml、约80μg/ml、约90μg/ml、约100μg/ml、约110μg/ml、约120μg/ml、约130μg/ml、约140μg/ml、约150μg/ml、约175μg/ml或约200μg/ml)。核酸的全部或部分可被包封在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，该方法产生至少80％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的核酸包封效率。在一些实施方案中，该方法产生至少90％的核酸包封效率。在一些实施方案中，该方法产生约90％至约97％的核酸包封效率。
通常，LNP是以约5∶1至60∶1的可电离脂质的胺基与mRNA的磷酸基的摩尔比制备的。在一些实施方案中，脂质与核酸比例(质量/质量比；w/w比)可以为约1:1至约60:1、约1:1至约20:1、约1:1至约19:1、约1:1至约18:1、约1:1至约17:1、约1:1至约16:1、约1:1至约15:1、约1:1至约14:1、约1:1至约13:1、约1:1至约12:1、约1:1至约10:1、约1:1至约9:1、约1:1至约8:1、约1:1至约7:1、约1:1至约6:1、约1:1至约5:1、约3:1至约15:1、约4:1至约15:1、约5:1至约15:1、约6:1至约15:1、约7:1至约15:1、约8:1至约15:1、约9:1至约15:1、约5:1至约10:1、约6:1至约10:1、约7:1至约10:1、约8:1至约10:1或约9:1至约10:1。
可以以一定体积比的货物和脂质溶液来制备LNP，使得脂质溶液与货物的比例为约1:1至10:1，包括1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1和10:1，或者具有由上述值中的任意两个定义的端点的任何范围。
实施例
以下实施例是为了说明而给出的，并且绝不意在限制本公开内容的范围。
实施例1：可电离咪唑脂质的合成
如图1所示，将1-溴十四烷和碳酸钾与2-巯基乙醇的乙腈溶液混合。将混合物在40℃下搅拌十二小时。将乙酸乙酯加入到混合物中以提取产物1。产物1通过在400MHz光谱仪上在CDCl3中的质子核磁共振进行表征，其结果如图2所示。特别地，报告的数据包括：化学位移(δppm)、多重性、积分和耦合常数(Hz)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.71(t,J＝6.0Hz,2H),2.73(t,J＝6.0Hz,2H),2.60–2.45(m,2H),2.32(s,1H),1.58(t,J＝7.6Hz,2H),1.26(s,22H),0.88(t,J＝6.7Hz,3H)。
无需进一步纯化，将产物1加入三甲胺的二氯甲烷溶液中并搅拌。将丙烯酰氯溶液滴加到所述溶液中。将所得混合物在0℃下搅拌十二小时。加入二氯甲烷以提取产物2。
产物2通过在400MHz光谱仪上在CDCl3中的质子核磁共振进行表征，其结果如图3所示。特别地，报告的数据包括：化学位移(δppm)、多重性、积分和耦合常数(Hz)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.43(dd,J＝17.4,1.4Hz,1H),6.13(dd,J＝17.3,10.5Hz,1H),5.85(dd,J＝10.4,1.4Hz,1H),4.31(s,2H),2.78(t,J＝7.0Hz,2H),2.57(t,J＝7.5Hz,2H),1.59(t,J＝7.5Hz,2H),1.26(s,22H),0.88(t,J＝6.7Hz,3H)。
在没有进一步纯化的情况下，将产物2加入到1-(3-氨基丙基)咪唑中，并在70℃下反应48小时，生成最终的Im脂质。所得Im脂质是通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)进行表征，其结果如图4所示。对于Im脂质[M+H]+计算的m/z比为782.59；实测值为782.59。
实施例2：脂质纳米颗粒的制备
六种脂质纳米颗粒由可电离脂质、DOPE、胆固醇和DMG-PEG配制而成。可电离脂质含有根据下表2所示的不同摩尔百分比的Im脂质和DLin-MC3-DMA(MC3)。
表2
Im％ MC3％
100 0
90 10
75 25
50 50
25 75
0 100
将可电离脂质、DOPE、胆固醇和DMG-PEG以2mg/ml的浓度溶解在乙醇中，并以40:10:48:2的摩尔比混合以产生脂质混合物。
使用可电离脂质的胺基和mRNA(Trilink Biotechnologies，L-7701)的磷酸基之间的8:1的摩尔比来确定要加入的mRNA的量。将mRNA在5mM柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)中稀释，并以3:1的体积比与脂质混合物混合。
将溶液在室温下孵育30分钟，并使用Amicon过滤器(MWCO:30000Da)浓缩溶液以除去乙醇。
使用RNA系统(Promega)确定包封效率。
使用动态光散射和ζ电位测量对LNP的颗粒大小和表面电荷进行了表征。如图5A所示的颗粒大小和如图5B所示的表面电荷是用Nanobrook Omni(Brookhaven Instruments,Holtsville,NY)测定的。LNP显示出约120nm至175nm的颗粒大小。LNP的表面电荷为+10mV至-10mV。由于这些LNP含有可电离脂质，当在7.4的生理pH下测量时，它们的表面电荷接近中性。
流式细胞术用于测定人JurkatT细胞和HeLa细胞的体外细胞摄取和转染效率。将细胞以40000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。将含有100ng的mRNA的不同制剂添加到每个孔中，并在37℃下孵育18小时至20小时。将细胞洗涤(对于悬浮细胞)或胰蛋白酶化(对于黏附细胞)，并以300×g离心。在PBS中稀释细胞后，使用FL-1和FL-4通道进行流式细胞术分析，以分别定量细胞摄取量和转染效率。
用不同组成的LNP测试针对HeLa和Jurkat细胞的细胞摄取和mRNA转染效率(图6和图7)。HeLa细胞相对容易用转染剂转染，因此被选为代表性细胞系。人类Jurkat细胞是具有代表性的T淋巴细胞，已知其难以转染。使用Cy5标记的eGFP mRNA测试LNP的细胞摄取。用Cy5荧光染料测定细胞摄取，而用eGFP荧光测定包封在不同LNP制剂中的mRNA的转染效率。孵育20小时后，通过流式细胞术测量荧光。在所有不同的LNP制剂中，在HeLa细胞中获得了约100％的细胞摄取。用Lipofectamine Messenger Max的阳性对照显示细胞摄取率为约82％(图6)。在Jurkat细胞中，阳性对照Lipofectamine Messenger Max的细胞摄取为约55％。LNP在不同的可电离脂质比率方面显示出细胞摄取效率的混合结果。即使是具有约55％细胞摄取的阳性对照也显示出约4％的转染效率。
值得注意的是，如图7所示，在Jurkat细胞中，25％ Im/75％MC3-LNP在细胞摄取效率(约70％)和转染效率(约45％)方面大大优于阳性对照。
实施例3：脂质2AEOAP2
如图8所示，将丙烯酰氯(1.5当量)滴加到2:1的三乙胺在二氯甲烷中的溶液和油醇中，并搅拌。将反应物搅拌过夜。向混合物中加入DCM以提取产物3，(9Z)-9-十八碳烯-1-基-2-丙烯酸酯。将产物3干燥以使溶剂蒸发。产物3通过在400MHz光谱仪上在CDCl3中的质子核磁共振进行表征，其结果如图9。特别地，报告的数据包括：化学位移(δppm)、多重性、积分和耦合常数(Hz)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.48–6.33(m,1H),6.14(d,J＝10.4Hz,1H),5.81(dd,J＝10.4,1.5Hz,1H),5.50–5.24(m,2H),4.15(t,J＝6.7Hz,2H),2.01(d,J＝6.2Hz,3H),1.67(s,2H),1.30(dt,J＝17.4,10.5Hz,22H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H)。
产物3(1eq.)与2-氨基乙醇(0.6eq.)在70℃下搅拌48小时。用薄层色谱法(TLC)对反应进行监测。加入水和DCM提取反应产物。蒸发溶剂得到产物4——β-丙氨酸，N-(2-羟乙基)-N-[3-(9-十八烯基氧基)-3-氧代丙基]-,9-十八烯基酯,(Z,Z)-(9CI)。
产物4通过在400MHz光谱仪上在CDCl3中的质子核磁共振进行表征，其结果如图10所示。特别地，报告的数据包括：化学位移(δppm)、多重性、积分和耦合常数(Hz)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.46–5.23(m,4H),4.05(q,J＝8.3,7.6Hz,2H),3.76–3.51(m,4H),2.80(t,J＝6.8Hz,4H),2.67–2.54(m,4H),2.45(t,J＝6.8Hz,2H),2.01(q,J＝6.5Hz,8H),1.65–1.17(m,49H),0.88(t,J＝6.6Hz,6H)。
如图11所示，将产物4(1eq.)溶解在DCM和二甲基甲酰胺(DMF)的溶液中。将1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(1.8eq.)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.4eq.)加入到溶液中并搅拌。加入1-甲基哌啶-2-羧酸盐酸盐(1.5eq.)。搅拌过夜后，使用旋转蒸发器减少溶剂以得到产物5——可电离脂质2AEOAP2。
实施例4：脂质2AEOAP4
如图12所示，将产物4(1eq.)溶解在DCM和DMF的溶液中。将EDC(1.8eq.)和DMAP(0.4eq.)加入到溶液中并搅拌。加入1-甲基-4-哌啶羧酸(1.5eq.)。搅拌过夜后，使用旋转蒸发器减少溶剂以得到产物6——可电离脂质2AEOAP4。
实施例5：脂质2AEOAD2
如图13所示，将产物4(1eq.)溶解在DCM和DMF的溶液中。将EDC(1.8eq.)和DMAP(0.4eq.)加入到溶液中并搅拌。加入3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐(1.5eq.)。搅拌过夜后，使用旋转蒸发器减少溶剂以得到产物7——可电离脂质2AEOAD2。
实施例6：脂质2AEOAD3
如图14所示，将产物4(1eq.)溶解在DCM和DMF的溶液中。将EDC(1.8eq.)和DMAP(0.4eq.)加入到溶液中并搅拌。加入4-二甲基氨基丁酸盐酸盐(1.5eq.)。搅拌过夜后，使用旋转蒸发器减少溶剂以得到产物8——可电离脂质2AEOAD3。
实施例7：脂质2AELAP2
如图15所示，将丙烯酰氯(1.5等量)滴加到2:1的三乙胺在二氯甲烷中的溶液和亚麻醇中并搅拌。将反应物搅拌过夜。在混合物中加入DCM以提取产物9——2-丙烯酸,9,12-十八碳二烯基酯,(Z,Z)-(9CI)。将产物9干燥以使溶剂蒸发。产物9通过在400MHz光谱仪上在CDCl3中的质子核磁共振进行表征，其结果如图16所示。特别地，报告的数据包括：化学位移(δppm)、多重性、积分和耦合常数(Hz)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.40(dd,J＝17.3,1.5Hz,1H),6.12(dd,J＝17.3,10.4Hz,1H),5.81(dd,J＝10.4,1.5Hz,1H),5.46–5.25(m,4H),4.15(t,J＝6.7Hz,2H),2.77(t,J＝6.5Hz,2H),2.05(q,J＝6.8Hz,4H),1.67(p,J＝6.8Hz,2H),1.31(qt,J＝13.7,5.4Hz,16H),0.89(t,J＝6.7Hz,3H)。
产物9(1eq.)与2-氨基乙醇(0.6eq.)在70℃下搅拌48小时。用薄层色谱法(TLC)对反应进行监测。加入水和DCM提取反应产物。将溶剂蒸发得到产物10：
产物10通过在400MHz光谱仪上在CDCl3中的质子核磁共振进行表征，其结果如图17所示。特别地，报告的数据包括：化学位移(δppm)、多重性、积分和耦合常数(Hz)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.35(tt,J＝11.1,4.7Hz,8H),4.05(d,J＝6.8Hz,2H),3.64(t,J＝6.7Hz,4H),2.96–2.31(m,14H),2.05(q,J＝6.9Hz,8H),1.65–1.25(m,37H),0.88(d,J＝7.0Hz,6H)。
如图18所示，将产物10(1eq.)溶解在DCM和DMF的溶液中。将EDC(1.8eq.)和DMAP(0.4eq.)加入到溶液中并搅拌。加入1-甲基哌啶-2-羧酸盐酸盐(1.5eq.)。搅拌过夜后，使用旋转蒸发器减少溶剂以得到产物11——可电离脂质2AELAP2。
实施例8：脂质2AELAP4
如图19所示，将产物10(1eq.)溶解在DCM和DMF的溶液中。将EDC(1.8eq.)和DMAP(0.4eq.)加入到溶液中并搅拌。加入1-甲基-4-哌啶羧酸(1.5eq.)。搅拌过夜后，使用旋转蒸发器减少溶剂以得到产物12——可电离脂质2AELAP4。
实施例9：脂质2AELAD2
如图20所示，将产物10(1eq.)溶解在DCM和DMF溶液中。将EDC(1.8eq.)和(DMAP)(0.4eq.)加入到溶液中并搅拌。加入3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐(1.5eq.)。搅拌过夜后，使用旋转蒸发器减少溶剂以得到产物13——可电离脂质2AELAD2。
实施例10：脂质2AELAD3
如图21所示，将产物10(1eq.)溶解在DCM和DMF的溶液中。将EDC(1.8eq.)和DMAP(0.4eq.)加入到溶液中并搅拌。加入4-二甲基氨基丁酸盐酸盐(1.5eq.)。搅拌过夜后，使用旋转蒸发器减少溶剂以得到产物14——可电离脂质2AELAD3。
实施例11：脂质16A-16D
如图24A所示，将N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶加入到环己烷-1,3,5-三醇的二氯甲烷溶液中。加入1-甲基哌啶-2-羧酸盐酸盐或1-甲基-4-哌啶羧酸的溶液并搅拌过夜。使用薄层色谱法监测反应混合物以确保反应物被完全消耗。使用乙酸乙酯提取反应物，并使用柱色谱法分离所需产物15。使用NMR和MS确认产物15的结构后，使用产物15合成产物16A至16D。
为了合成产物16，将产物15与N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲基氨基吡啶一起搅拌。加入油酸或亚麻酸，将反应物搅拌过夜。提取反应混合物，并用柱色谱法分离所需产物。将所得产物(产物16A至16D)描述在图24B中。
实施例12：脂质20A-20B
如图25A所示，为了合成产物17，在三乙胺(TEA)的存在下在二氯甲烷(DCM)中使亚麻醇与甲磺酰氯反应。提取反应混合物，并使用NMR和MS确定产物17。将乙醚溴化镁加入到产物17的乙醚溶液中。提取反应混合物以生成使用NMR和MS确定的产物18。
将镁屑入到干燥的烧瓶中，然后加入乙醚。逐滴加入产物18，产生放热反应。可以加入碘来引发反应。在反应完成后，逐滴加入甲酸乙酯。提取反应混合物，并通过柱色谱法分离产物19。
使用氮气和回流冷凝器对反应体系进行脱气。将产物19与N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶一起搅拌。加入1-甲基哌啶-2-羧酸盐酸盐以制得脂质20A。
将产物19与N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲基氨基吡啶一起搅拌。加入1-甲基-4-哌啶羧酸以制得脂质20B。
将产物19与N,N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲基氨基吡啶一起搅拌。加入1H-咪唑-1-基乙酸以制得脂质20C。
实施例13：用乙醇稀释法制备脂质纳米颗粒
通过掺入表1中不同的可电离脂质来配制不同的脂质纳米颗粒(LNP)。制备DLin-MC3-DMA(MC3)LNP作为对照。脂质由可电离脂质、DOPE、胆固醇和DMG-PEG配制而成。将每种脂质以2mg/ml的浓度溶解在乙醇中。可电离脂质的组成为40％至60％，DOPE为从10％至20％，胆固醇为30％至50％，并且DMG-PEG为1％至5％。使用的可电离脂质的胺基和mRNA的磷酸基之间的摩尔比为5:1至15:1。在5mM柠檬酸缓冲液(pH 5.0)中稀释的mRNA与脂质混合物以3:1的体积比混合。样品孵育30分钟后，使用过滤器(MilliporeSigma,Burlington,MA,MWCO:30000Da)浓缩溶液以去除乙醇。使用/>RNA system(Promega)测定mRNA的包封效率。使用nanobook Omni测定LNP的颗粒大小和表面电荷，结果如图22A至图22B所示。
使用动态光散射和ζ电位测量对LNP的颗粒大小和表面电荷进行了表征(图22A至图22B)。LNP显示出约100nm至约200nm的颗粒大小。LNP的表面电为-10mV至-20mV(图22B)。由于这些LNP含有可电离脂质，当在7.4的生理pH下测量时，它们的表面电荷接近中性。
实施例14：体外细胞摄取和转染效率
流式细胞术用于测定人Jurkat T细胞的体外细胞摄取和转染效率。将细胞以40000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。每孔中加入含有100ng mRNA的不同制剂，并在37℃孵育21小时。洗涤细胞，并在300×g下离心。在PBS中稀释细胞后，进行流式细胞术分析以定量细胞摄取量和转染效率。
测试了具有不同组成的LNP对Jurkat细胞的细胞摄取和mRNA转染效率，如图23所示。人类Jurkat细胞是具有代表性的T淋巴细胞，已知其难以转染。使用Cy5标记的eGFPmRNA测试LNP的细胞摄取。用Cy5荧光染料测定细胞摄取，而用eGFP荧光测定包封在不同LNP制剂中的mRNA的转染效率。孵育21小时后，使用流式细胞仪测量荧光。细胞摄取为约2％至约90％。作为阳性对照，MC3 LNP的细胞摄取为90％，转染效率为约92％。LNP在不同的可电离脂质比率方面显示出细胞摄取效率的混合结果。不同LNP的转染效率为约10％至最高约75％。具有最高转染效率的LNP被鉴定为2AEOAP2 LNP、2AEOAP4 LNP、2AELAP4 LNP。
其他实施例：
本公开内容的第一项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及包含至少一种根据式(I)的可电离脂质或其药学上可接受的盐的组合物，其中a)R1独立地选自并且R2选自/>
本公开内容的第二项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及第一项目的组合物，其中可电离脂质选自：2AEOAP2、2AEOAP4、2AELAP2和2AELAP4。
本公开内容的第三项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及包含至少一种根据式(II)的可电离脂质或其药学上可接受的盐的组合物，其中a)R1独立地选自并且R2选自/>
本公开内容的第四项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及第三项目的组合物，其中可电离脂质选自：脂质16A、脂质16B、脂质16C和脂质16D。
本公开内容的第五项目，单独或与本文的任何其他项组合，涉及包含脂质20B的组合物。
本公开内容的第六项目，单独或与本文的任何其他项组合，涉及前述组合物中的任一种的组合物，其还包括：辅助脂质；固醇；以及PEG化的脂质偶联物，其中所述组合物形成脂质纳米颗粒。
本公开内容的第七项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及第六项目的组合物，其中可电离脂质选自：2AEOAP2、2AEOAP4、2AELAP2、2AELAP4、脂质16A、脂质16B、脂质16C、脂质16B和脂质20B。
本公开内容的第八项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及第六项目的组合物，其中辅助脂质选自：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(DOPG)。
本公开内容的第九项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及第六项目的组合物，其中辅助脂质是DOPE。
本公开内容的第十项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及第六项目的组合物，其中固醇是胆固醇或其衍生物。
本公开内容的第十一项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及第六项目的组合物，其中PEG化的脂质偶联物是PEG化的肉豆蔻酰甘油二酯(PEG-DMG)。
本公开内容的第十二项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及第六项目的组合物，其中脂质纳米颗粒至少部分地包封核酸。
本公开内容的第十三项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及第十二项目的组合物，其中核酸为mRNA。
本公开内容的第十四项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及前述项目中任一项所述的组合物，其还包括药学上可接受的赋形剂。
本公开内容的第十五项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及前述项目中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于通过注射或输注施用。
本公开内容的第十六项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及第六项目的组合物，其中可电离脂质占约40摩尔％至60摩尔％，辅助脂质占约10摩尔％至20摩尔％，固醇占约30摩尔％至50摩尔％；且偶联物脂质占约1摩尔％至5摩尔％。
本公开内容的第十七项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及前述项目中任一项所述的组合物在受试者中的用途。
本公开内容的第十八项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及第七项目所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物。
本公开内容的第十九项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及第十七项目所述的用途，其中所述受试者为人。
本公开内容的第二十项目，单独或与本文的任何其他项目组合，涉及第十七项目作为疫苗组分的用途。
本文公开的尺寸和值不应理解为严格限于所述的精确数值。相反，除非另有说明，否则每个这样的尺寸旨在表示所述值和围绕该值的功能等效范围。例如，公开为“40mm”的尺寸意在表示“约40mm”。
除非明确排除或以其他方式限制，否则本文引用的每一份文件，包括任何交叉引用或相关的专利或申请，均通过引用的方式整体并入本文。任何文件的引用并不是承认其是关于本文公开或要求保护的任何发明的现有技术，也不是承认其单独或与任何其他参考文献的任何组合教导、建议或公开任何此类发明。此外，如果本文件中某一术语的任何含义或定义与通过引用并入的文件中相同术语的任何含义或定义相冲突，则以本文件中赋予该术语的含义或定义为准。
虽然已经说明和描述了本发明的特定实施例，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种其他的改变和修改。因此，在所附权利要求中旨在覆盖在本发明范围内的所有这样的改变和修改。

Claims (16)

1.一种组合物，其包含至少一种根据式(I)的可电离脂质，
或其药学上可接受的盐，其中：
R1独立地选自和
R2选自
2.权利要求1所述的组合物，其中所述可电离脂质选自：
3.一种组合物，其包含至少一种根据式(II)的可电离脂质，
或其药学上可接受的盐，其中：
R1独立地选自和
R2选自
4.权利要求3所述的组合物，其中所述可电离脂质选自：
5.一种组合物，其包含至少一种具有以下结构的可电离脂质：
6.权利要求1至5中的任一项所述的组合物，其还包含：
辅助脂质；
固醇；和
PEG化的脂质偶联物，其中所述组合物形成脂质纳米颗粒。
7.权利要求6所述的组合物，其中所述可电离脂质选自：2AEOAP2、2AEOAP4、2AELAP2、2AELAP4、脂质16A、脂质16B、脂质16C、脂质16B和脂质20B。
8.权利要求6所述的组合物，其中所述辅助脂质选自：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac甘油)(DOPG)。
9.权利要求6所述的组合物，其中所述辅助脂质是DOPE。
10.权利要求6所述的组合物，其中所述固醇是胆固醇或其衍生物。
11.权利要求6所述的组合物，其中所述PEG化的脂偶联物为PEG化的肉豆蔻酰甘油二酯(PEG-DMG)。
12.权利要求6所述的组合物，所述脂质纳米颗粒至少部分地包封核酸。
13.权利要求12所述的组合物，其中所述核酸是mRNA。
14.权利要求6所述的组合物，其还包括药学上可接受的赋形剂。
15.权利要求14所述的组合物，其中所述组合物被配制用于通过注射或输注施用。
16.权利要求6所述的组合物，其中所述可电离脂质占约40摩尔％至60摩尔％，所述辅助脂质占约10摩尔％至20摩尔％，所述固醇占约30摩尔％至50摩尔％；且所述偶联物脂质占约1摩尔％至5摩尔％。
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