JP5419334B2

JP5419334B2 - 生化学反応装置

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Publication number: JP5419334B2
Application number: JP2007190704A
Authority: JP
Inventors: 明久飯尾
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2007-07-23
Filing date: 2007-07-23
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2027-07-23
Also published as: JP2009022241A

Description

本発明は、コンタミネーションを防止可能な生化学反応装置に関するものである。

テーラーメード医療において、診断をバックアップする手段の一つとして遺伝子検査がある。的確な診断につながる検査結果を出すために、遺伝子検査の信頼性は非常に重要である。

遺伝子検査に適用する生化学反応装置として、たとえば、DNAチップを用いたDNA検査装置がある。DNAチップとはガラスなどの基板上に多種類のＤＮＡ断片などをプローブＤＮＡとして貼り付けたもので、たくさんの種類のDNAを一度に調べることができる。そのプロセスは、例えば、検体から核酸を抽出する抽出工程、核酸を増幅する増幅工程、核酸とプローブのハイブリダーゼーション反応を行うハイブリダイゼーション工程、ハイブリダイゼーション反応を検出する検出工程、結果判定の工程を順に行うものである。

一例として、血液のDNAを検査する場合について、抽出、増幅、ハイブリダイゼーション、検出、結果判定の各工程について詳細に述べる。

抽出工程では、血液検体からDNAを抽出・分離精製する。抽出溶液にピペットで血液を分注したのち約５０℃で数分間インキュベーションを行う。インキュベーションの結果、細胞からDNAが抽出される。抽出したDNA抽出溶液からDNAを分離精製するための手段として磁性ビーズやカラムフィルタが一般的に用いられる。自動化に適した磁性ビーズによる精製は、ＤＮＡ抽出溶液を磁性ビーズ溶液に分注し、ピペットによる溶液攪拌を数分行い、所定時間静かに放置し、磁性ビーズにＤＮＡを結合させる。磁性ビーズにＤＮＡが結合したら磁力により磁性ビーズをトラップし、ピペットにより溶液を排出する。次に、洗浄工程を数回実施する。洗浄工程では、洗浄液をピペットにより磁性ビーズに加え、ピペットによる溶液攪拌を行い、磁性ビーズに付着している不用な物を洗い落とす。そして、磁力により磁性ビーズをトラップし、ピペットにより不要な溶液を排出する。洗浄工程の後、ＤＮＡ溶出液をピペットで磁性ビーズに分注し、分注後ピペットによる溶液攪拌を行い、磁性ビーズに付着しているＤＮＡを溶出液中に溶出する。そして、磁力により磁性ビーズをトラップし、ピペットによりＤＮＡ溶出液を吸引して次工程に渡す。

次に、増幅工程では、所望のDNAを指数関数的に増加させる。分離精製した微量なＤＮＡを効率的に増幅する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応法(polymerase chain reaction, ＰＣＲ法)が知られている。この方法は、目的の２本鎖ＤＮＡを熱変性して解離させ、得られた１本鎖のＤＮＡに２種類のプライマをアニーリングし、その後、ＤＮＡポリメラーゼを作用させて２本鎖ＤＮＡを合成する。さらにこの２本鎖ＤＮＡを熱変性して１本鎖ＤＮＡを得た後にプライマのアニーリング及びＤＮＡポリメラーゼによる相補的ＤＮＡの伸長というサイクルを繰り返すことにより、指数関数的に目的ＤＮＡを増幅させることができる方法である。ＰＣＲ法は、例えば、約９４℃で２本鎖ＤＮＡを解離させる工程、プライマを約５５℃でアニーリングする工程、及び耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを使用して約７２℃で相補鎖の伸長を行う工程を含むサイクルを繰り返すことにより行われる。増幅された核酸量を示す指標として、２本鎖ＤＮＡを増幅するための２種類のプライマの一方のプライマに標識が結合されている。また、２種類のプライマの標識が付いたプライマの量を多くすることにより、増幅後、標識が付いた片鎖ＤＮＡ（標識されたターゲットＤＮＡ）が多くなり、標識が付いた片鎖ＤＮＡが支配的になる。増幅する手段としては、加熱冷却する容器にＤＮＡ抽出溶液と増幅溶液をピペットで加えて、容器を密閉してＰＣＲを行う。

次に、増幅したＤＮＡとその他の不要物との分離精製を行う。増幅したＤＮＡを分離精製するための手段としては、抽出工程で説明した分離精製と同様であるので詳細な説明は省略する。

次に、ハイブリダイゼーション工程では、増幅したＤＮＡとＤＮＡチップのプローブＤＮＡとハイブリダイゼーション反応させる。従って、標識された所望のＤＮＡがＤＮＡチップの所定のプローブと特異な２本鎖の結合を行うので検体のＤＮＡを特定可能となる。

その後、検出工程では、ＤＮＡチップの特定プローブに結合された蛍光物資などで標識されたＤＮＡを光学的に検出する。

最後に、結果判定で検出のデータをもとに病気などの判定を行う。

上記のプロセスでは、コンタミネーションが起こる可能性がある。ＤＮＡを試料とする生化学反応では、コンタミネーションとは、一般的には、抽出工程や増幅工程において、増幅させる対象である検査試料ＤＮＡに他のＤＮＡが混入することである。抽出工程や増幅工程で、ＤＮＡを含んだ液をピペットで加えるときに、または、ピペットで攪拌するときに、ミストや飛散りが発生して、他のＤＮＡが入っている液に混入する場合がある。また、ＤＮＡを含んだ液を加熱冷却するときに、容器の密閉は行っているが、一部蒸気漏れが発生して、気流などによって他のＤＮＡが入っている液に混入する場合がある。さらに、装置外から、検査対象外の細菌ＤＮＡなどを含んだ浮遊物が気流に乗って、他の検体が入った容器に混入する場合がある。特に、増幅工程の増幅後の分離精製では、増幅したＤＮＡが入った、ＤＮＡ濃度が高い液をピペットで攪拌動作させるので、ＤＮＡを含んだミストや飛散りによる影響度が一番高く、コンタミネーションが一番起こりやすい。

従来コンタミネーションを防止する手段として、一般的に、コンタミネーションの発生原因である飛散り、ミスト、蒸気を排除したり、それらを影響を受ける箇所に寄せ付けないようにすることが行われている。そのようなコンタミネーション防止の従来技術として、遮蔽手段と雰囲気パージ手段を組み合わせたものがある（例えば、特許文献１参照）。この技術では、遮蔽手段により、ミストや蒸気が外部から伝達するのを防ぎ、雰囲気パージ手段により、装置外から混入したり、装置内で発生するミストや蒸気をパージガスにより外部に流すことにより排出する。
特開平０６−１４８１９８号公報

特許文献１に開示される装置では扉形状の遮蔽部材を手動で開閉するため、液体のハンドリングにピペットを用いる場合、ピペットの搬送を妨害しないように、ピペット動作に合わせて、搬送口の遮蔽部材を開閉する必要がある。しかし、シャッターのような可動開閉式遮蔽部材だと開閉機構が必要になり、構成が複雑になる。また、ピペットの搬送口が複数ある場合、その分の可動開閉式遮蔽部材が必要になり、より複雑になる。さらに、ピペットが容器に液体を分注するときに発生するミストを迅速に、かつ効率的に雰囲気パージしないと容器内にミストが混入する恐れがある。

そこで、本発明の目的は、複雑な機構を設けることなく、装置に収容される検査試料へのコンタミネーションを防止できる生化学反応装置を提供することである。

上記課題を解決するために研究を重ねた結果、次のような構成でコンタミネーションを防止可能な生化学反応装置を見いだすに至った。

本願発明の生化学反応装置は、前記装置内に物質を搬送する少なくとも一つの搬送部と、前記装置内を遮蔽板で覆うことで形成した少なくとも第一および第二の二つの隔室と、前記第一および第二の隔室にそれぞれ設けた少なくとも一つの搬送口と、前記搬送口を遮蔽する遮蔽部材と、前記隔室内の雰囲気をパージするために前記隔室に設けた雰囲気パージ手段と、を有し、前記第一および第二の隔室は並んで配置されており、前記第一および第二の隔室で共用するように、前記遮蔽部材が前記搬送部に設けられており、該遮蔽部材により、前記第一の隔室内への前記物質の搬送の際には該第一の隔室の搬送口が遮蔽され、前記第二の隔室内への前記物質の搬送の際には該第二の隔室の搬送口が遮蔽され、前記雰囲気パージ手段が、前記隔室を遮蔽中は前記隔室内の雰囲気をパージすることを特徴とする生化学反応装置である。

本発明により、搬送口の遮蔽部材の開閉駆動が不要になり、構成が比較的単純になり、廉価な装置を提供できる。開閉する遮蔽部材が多ければ多い装置ほど構成がより単純になり、効果が更にアップする。

また、液体ハンドリング中に遮蔽部材で遮蔽されたエリア内でミストや蒸気を迅速に、かつ、効率的に雰囲気パージを行うことにより、コンタミ原因の発生物質の排除が可能となり、信頼性の高い装置の提供が可能となる。

本発明の生化学反応装置が有する搬送部は装置内に物質を搬送するために備えられている。隔室は装置内の少なくとも一部の空間を遮蔽板で覆うことで形成されており、少なくとも一つの搬送口を有する。搬送部には搬送口を遮蔽する遮蔽部材が設けられている。遮蔽部材が搬送部に設けられることで、搬送部が隔室内に物質を搬送する際に、遮蔽部材が遮蔽口を遮蔽することができる。また、隔室には隔室内の雰囲気をパージするために隔室に設けられた雰囲気パージ手段が備えられている。雰囲気パージ手段は、隔室が遮蔽中に作動することで、分注操作や反応処理を実行している間の隔室内をコンタミネーションの生じない環境とすることができる。

本生化学反応装置の好ましい態様として、装置内に設置された容器に液体をハンドリングする液体ハンドリング部を有する装置が挙げられる。この装置は、搬送部として、装置に設置する容器を装置内に搬送する第一の搬送部と、液体ハンドリング部を装置内に搬送する第二の搬送部とを有する。そして、この装置の隔室は、第一、第二の搬送部のそれぞれを隔室内に挿入可能とする第一、第二の搬送口を有する。第一の搬送部には、第一の遮蔽口を遮蔽するための第一の遮蔽部材が設けられており、第二の搬送部には、第二の遮蔽口を遮蔽するための第二の遮蔽部材が設けられている。さらにこの装置は、液体ハンドリング部が装置に設置された容器内の液体を吸引もしくは排出する位置にある時に、第一の遮蔽部材は第一の搬送口を遮蔽する位置にあり、かつ第二の遮蔽部材は第二の搬送口を遮蔽する位置にあるように設定した構成とすることができる。液体ハンドリング部としてはピペットなどを使用することができる。

下記の実施例は、本発明をより詳細に説明するものである。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。

本発明を適用できるＤＮＡ検査装置では、少なくとも一つの検体の生化学反応を同時に行う。ＤＮＡ検査装置の模式図を図２に示す。図２（ａ）は上面図で、図２（ｂ）は正面図である。このＤＮＡ検査装置は、抽出工程、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程、検出工程の４つの工程処理を行う装置である。検体から核酸を抽出する抽出工程、核酸を増幅する増幅工程、核酸とプローブとのハイブリダーゼーション反応を行うハイブリダイゼーション工程、ハイブリダイゼーション反応を検出する検出工程、結果判定の工程を順に行うものである。

工程処理部は、抽出工程を行う抽出部１ａ、増幅工程の増幅処理を行う増幅部１ｂ、増幅工程の精製処理を行う精製部１ｃ、ハイブリダイゼーション工程と検出工程を行うハイブリダイゼーション検出部１ｄの４つから構成される。また、検体や各処理工程で使用する検査試薬や反応溶液をウェルに充填した容器を収容する容器待機部２と、検査処理終了後に廃棄するための廃棄部３をそれぞれ配置する。さらに、それぞれの工程処理部内の反応場（不図示）への容器の搬送や容器の廃棄を行う搬送部であるハンド部１１を設置する。さらに、各ウェルの間で液体の移動や攪拌を複数検体同時に行う液体ハンドリング部であるピペットと、ピペットを搬送する搬送部とを合わせた、ピペット部８を設置する。

ハンド部１１は図２（ａ）に示すように、各処理部や容器待機部２、廃棄部３にアクセスできるよう、X方向およびY方向に動作が可能なステージ上に配置する。ハンド部１１の動作方向を矢印Ａ、Ｂ（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６）で示す。

ピペット部８は図２（ｂ）に示すように、各処理部にアクセスできるよう、また、同一容器内の各ウェルにアクセスできるよう、X方向およびZ方向に動作が可能なステージ上に配置する。ピペット部８の動作方向を矢印Ｃ、Ｄ（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）で示す。

抽出部１ａと増幅部１ｂと精製部１ｃをそれぞれ遮蔽板で遮蔽する。ただし、ハイブリダイゼーション検出部１ｄ、容器待機部２、廃棄部３も遮蔽板で遮蔽してもよいし、１つか２つの工程処理部のみを遮蔽してもよい。本発明を適用できる遮蔽手段の構成の斜視図を図３に示す。

抽出部１ａ、増幅部１ｂ、精製部１ｃの３つの工程処理部を囲むように、前後上下左右６面を遮蔽板１４で遮蔽する。遮蔽板４ａで抽出部１ａと増幅部１ｂを区切り、遮蔽板４ｂで増幅部１ｂと精製部１ｃを区切る。このようにして、３隔室を形成する。正面の遮蔽板１４の抽出部１ａにハンド搬送口１２ａを設け、増幅部１ｂにハンド搬送口１２ｂを設け、精製部１ｃにハンド搬送口１２ｃを設ける。上面の遮蔽板１４の抽出部１ａにピペット搬送口５ａを設け、増幅部１ｂにピペット搬送口５ｂを設け、精製部１ｃにピペット搬送口５ｃを設ける。雰囲気パージを行うための部材として、上面の遮蔽板１４の抽出部１ａに排気用ファン９ａを設け、増幅部１ｂに排気用ファン９ｂを設け、精製部１ｃに排気用ファン９ｃを設ける。また、底面の遮蔽板１４の抽出部１ａに吸気用ファン１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１５ｄを設け、増幅部１ｂに吸気用ファン１５ｅ、１５ｆ、１５ｇ、１５ｈを設け、精製部１ｃに吸気用ファン１５ｉ、１５ｊ、１５ｋ、１５ｌを設ける。

ピペット搬送口とハンド搬送口を遮蔽された工程処理部の隔室は密閉状態になる。それぞれの工程処理部の隔室の密閉手段の構成は同じである。工程処理部の隔室を密閉にした後は、雰囲気パージを行い、ミスト等コンタミの原因となるＤＮＡを含む浮遊物を排除する。本発明を適用できる、コンタミ防止のための密閉手段の構成、および、雰囲気パージ手段の構成の側面図を図１（ａ）、図１（ｂ）に示す。図１を用いて、密閉と雰囲気パージについて説明する。なお、図３と同一符号は同一部材で同一作用効果であるので説明を省略する。符号１４は遮蔽板である。符号５はピペット搬送口である。符号１２はハンド搬送口である。符号１は工程処理部（抽出部、増幅部、精製部）である。符号８はピペット部である。符号１１はハンド部である。符号９は排気用ファン、符号１５は吸気用ファンである。

図１（ａ）に示すように、工程処理部１内には反応場１３がある。また、遮蔽部材７がピペット部８に取り付けられ、ピペット部８と一緒に動く。さらに、遮蔽部材１０がハンド部１１に取り付けられ、ハンド部１１と一緒に動く。

図１（ｂ）に示すように、工程処理部１において、矢印Ｅのようにハンド部１１が移動して容器６を反応場１３に設置するとき、ハンド部１１に取り付けられた遮蔽部材１０はハンド搬送口１２を遮蔽する位置にある。また、矢印Ｆのようにピペット部が移動して操作（吸引、分注、攪拌など）する位置にあるとき、ピペット部８に取り付けられた遮蔽部材７はピペット搬送口５を遮蔽する位置にある。また、ピペット搬送口５とハンド搬送口１２を遮蔽すると、工程処理部１は密閉状態になる。さらに、密閉状態で排気用ファン９と吸気用ファン１５をＯＮにすることにより、雰囲気パージを行うことができる。

本発明を適用できる、ＤＮＡ検査装置のシーケンスのうち、工程処理部の隔室内のシーケンスのフローチャートを図４に示す。図４のフローチャートにおいて、ハンド部が工程処理部の隔室内の反応場に容器を設置し終え、同時にハンド搬送口が遮蔽される時点をスタートとする。また、ハンド部が工程処理部の隔室から廃棄部へ容器を搬送開始する時点をエンドとする。図４を用いて、ピペット部のシーケンスを説明する。

まず、ピペット部を容器上の液操作する位置へ移動する（Ｓ１）。移動終了時、ピペット搬送口も遮蔽され、工程処理部の隔室は密閉される。

次に、雰囲気パージをＯＮにする（Ｓ２）。

次に、液操作をする（Ｓ３）。ここでは、液の吸引、排出、攪拌などを行う。

次に、液操作以外の各工程特有な処理を行う（Ｓ４）。例えば、抽出部では抽出処理を行い、増幅部では増幅処理を行い、精製部では分離精製処理を行う。

次に、雰囲気パージをＯＦＦにする（Ｓ５）。このとき、工程処理部内においてミスト等コンタミの原因となるＤＮＡを含む浮遊物は排除されているので、工程処理部内は清浄化されている。

次に、まだピペット部での液操作が残っているならＳ１に戻り、Ｓ１〜Ｓ５を繰り返す。

なお、本実施形態では３隔室だったが、１隔室、２隔室、４隔室以上でもよい。また、本実施形態では、横方向に並んだエリアの他に、縦方向に並んだエリアでもよい。また、動作は他の手順でもよい。また、ピペット部８において、搬送部が遮蔽口を遮蔽する位置にあるときでも、液体ハンドリング部であるピペットが上下方向に動くことを可能にしてもよい。さらには、ハンド系（ハンド部、遮蔽部材）、あるいは、ピペット系（ピペット部、遮蔽部材）を略して、開閉可能な遮蔽部材で遮蔽して手動による搬送を行ってもよい。

本発明の実施形態であるＤＮＡ検査装置の工程処理部の隔室の模式的側面図である。本発明の実施形態であるＤＮＡ検査装置の全体構成の模式的上面図（ａ）、模式的正面図（ｂ）である。本発明の実施形態であるＤＮＡ検査装置の遮蔽手段の構成の模式的斜視図である。本発明の実施形態であるＤＮＡ検査装置のプロセス一部のフローチャートである。

符号の説明

１ａ抽出部
１ｂ増幅部
１ｃ精製部
１ｄハイブリダイゼーション検出部（ハイブリ検出部）
２容器待機部
３廃棄部
４ａ、４ｂ遮蔽板
５ピペット搬送口
５ａ〜５ｃピペット搬送口
６容器
７遮蔽部材
８ピペット部
９排気用ファン
９ａ〜９ｃ排気用ファン
１０遮蔽部材
１１ハンド部
１２ハンド搬送口
１２ａ〜１２ｃハンド搬送口
１３反応場
１４遮蔽板
１５吸気用ファン
１５ａ〜１５ｌ吸気用ファン

Claims

生化学反応装置において、
前記装置内に物質を搬送する少なくとも一つの搬送部と、
前記装置内を遮蔽板で覆うことで形成した少なくとも第一および第二の二つの隔室と、
前記第一および第二の隔室にそれぞれ設けた少なくとも一つの搬送口と、
前記搬送口を遮蔽する遮蔽部材と、
前記隔室内の雰囲気をパージするために前記隔室に設けた雰囲気パージ手段と、
を有し、
前記第一および第二の隔室は並んで配置されており、
前記第一および第二の隔室で共用するように、前記遮蔽部材が前記搬送部に設けられており、該遮蔽部材により、前記第一の隔室内への前記物質の搬送の際には該第一の隔室の搬送口が遮蔽され、前記第二の隔室内への前記物質の搬送の際には該第二の隔室の搬送口が遮蔽され、
前記雰囲気パージ手段が、前記隔室を遮蔽中は前記隔室内の雰囲気をパージする
ことを特徴とする生化学反応装置。
生化学反応装置において、
前記装置内にて容器を搬送する第一の搬送部と、
前記容器に対して液体をハンドリングする液体ハンドリング部と、
前記液体ハンドリング部を搬送する第二の搬送部と、
前記装置内を遮蔽板で覆うことで形成した少なくとも第一および第二の二つの隔室と、
前記第一および第二の隔室にそれぞれ設けた第一、第二の搬送口と、
前記第一、第二の搬送口をそれぞれ遮蔽する第一、第二の遮蔽部材と、
前記隔室内の雰囲気をパージするために前記隔室に設けた雰囲気パージ手段と、
を有し、
前記第一および第二の隔室は並んで配置されており、
前記第一および第二の隔室で共用するように、前記第一、第二の遮蔽部材がそれぞれ前記第一、第二の搬送部に設けられており、
前記第一の搬送部に設けられた第一の遮蔽部材により、前記第一の隔室内への前記容器の搬送の際には該第一の隔室の第一の搬送口が遮蔽され、前記第二の隔室内への前記容器の搬送の際には該第二の隔室の第一の搬送口が遮蔽され、
前記第二の搬送部に設けられた第二の遮蔽部材により、前記第一の隔室内への前記液体ハンドリング部の搬送の際には該第一の隔室の第二の搬送口が遮蔽され、前記第二の隔室内への前記液体ハンドリング部の搬送の際には該第二の隔室の第二の搬送口が遮蔽され、
前記雰囲気パージ手段が、前記隔室を遮蔽中は前記隔室内の雰囲気をパージする
ことを特徴とする請求項１に記載の生化学反応装置。
前記液体ハンドリング部が前記容器内の液体を吸引もしくは排出する位置にある時に、前記第一、第二の遮蔽部材はそれぞれ前記第一、第二の搬送口を遮蔽する位置にあること
を特徴とする請求項２に記載の生化学反応装置。
前記液体ハンドリング部がピペットであることを特徴とする請求項２または３に記載の生化学反応装置。