JP5406501B2 - アミロイド線維形成抑制剤 - Google Patents
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Yukio Ando, (2005), Med Mol Morphol, 38: pp. 142-154
の化合物である。
の化合物である。
乾燥させたジメチル−β−シクロデキストリン(2,6−di−O−methyl−b−cyclodextrin)を無水ピリジンに溶解した後、室温で無水条件下で2〜3時間かけて無水酢酸を加え、80℃に加温し約12時間攪拌する。反応終了を薄層クロマトグラフィー(TLC;メタノール:クロロホルム=15:2)により確認した後、反応液に氷水を添加して反応を停止し、次いでクロロホルムにて抽出する。その後、2mM 炭酸水素ナトリウム水溶液で2回洗浄し、次いで水で洗浄する。得られた反応物を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、シリカゲルクロマトグラフィー(Kieselgel60;0.063〜0.2mm[70〜230mesh])で分離及び/又は精製する。クロロホルムからメタノールの比率を徐々に増加させた移動層を用い(クロロホルム:メタノール=15:2まで)、アセチル基置換度の低いジメチルアセチル−β−シクロデキストリンから順に溶出させた後、水で再結晶する。なお、ジメチルアセチル−β−シクロデキストリンは、NMRにより置換度が検討済みのジメチルアセチル−β−シクロデキストリン標品を用いてTLC(メタノール:クロロホルム=15:2)により確認する。
血清蛋白質であるトランスサイレチン(TTR)によるアミロイド線維は、次の3段階を経て形成される。まず、四量体の蛋白質として血清中に存在するトランスサイレチンは、なんらかの作用によって単量体に分解される。次いで、この単量体の大部分は分解され、一部は生体代謝経路を経て尿として体外に排出されるが、単量体の一部は組替えられてβ−シート構造となる。最終的には、このβ−シート構造が線状に重合して不溶化線維状のアミロイド線維が生成される。変異トランスサイレチンでは四量体の蛋白質が単量体へと乖離されやすい性質を有しており、その結果、アミロイド線維の生成が増加する。本発明者らは、トランスサイレチンのβ−シート構造化及び/又は安定化について鋭意研究した結果、疎水性分子を包接し得るシクロデキストリンを改良した本発明のシクロデキストリン誘導体を用いることによりアミロイド線維形成を抑制することができることを見出した。これは、トランスサイレチンのβ−シート化及び/又は安定化に疎水性アミノ酸(例えば、トリプトファンなど)が関与している可能性があり、本発明のシクロデキストリン誘導体がトランスサイレチンの疎水性アミノ酸に何らかの作用を及ぼして、アミロイド線維の形成過程において、トランスサイレチン単量体のβ−シート化を抑制することによりタンパク質の重合化を阻害し、結果としてアミロイド線維の形成を抑制することが予測される。したがって、本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、変異トランスサイレチンからのアミロイド線維の生成反応を抑制することができ、さらには本発明のアミロイド線維形成抑制剤を含む医薬はアミロイドーシスを予防及び/又は治療することができる。
本実施例で用いたトランスサイレチン(TTR)は、健常者ボランティアから得た血清より精製した。純度の検定は非加熱(非還元)SDS−PAGEを用いて行った。シクロデキストリン(cyclodextrin:CyD)誘導体である6−O−a−(4−O−a−Dglucuronyl)−D−glucosyl−b−CyD(GUG−b−CyD)及び6−O−a−maltosyl−b−CyD(G2−b−CyD)は、イシグロらの文献(Toshihiro Ishiguro et. al., (2001), Carbohydrate Research, 331, pp.423−430)に従って合成した。なお、比較対照として、Hydroxypropylated− b−CyD(HP−b−CyD)及びSulfobutyl ether-b−CyD(SBE−b−CyD)もまた上記文献に従って合成した。
TTRを100mM塩化ナトリウムを含む20mM酢酸バッファー(pH3.0−6.5)で0.2mg/mLの濃度になるように調製し、遮光して37℃でインキュベーションしアミロイド線維を形成させた。
作成したアミロイド線維は、重合したb−シートに選択的に結合する蛍光プローブであるチオフラビンTを用いて検出した。50mM グリシン溶液(pH9.5)に溶解した10mM チオフラビンT溶液1mLに、インキュベーションしたサンプル10mLを添加後混合し、測定用試料とした。日立蛍光分光光度計F−4500を用い、25℃で442nmの励起光で励起される489nmの蛍光強度を測定した。なお、励起側、蛍光側ともにスリット幅は5nmで測定した。
上記の方法を用いて、ヒト血清由来の野生型TTRを、10mM、20mM又は30mMのGUG−b−CyDの共存又は非共存下でアミロイド化させ、TTRのアミロイド線維形成の定量解析を行った(図1)。解析の結果、GUG−b−CyD共存下では、TTRのアミロイド線維形成能は用量依存的に有意に低下していた。さらに、40mMのGUG−β−CyDを初期投与(Day 0)し、経時的にサンプリングしてアミロイド線維を測定することにより、GUG−β−CyDのアミロイド線維形成抑制の維持効果を評価した(図7)。図7が示す通り、GUG−β−CyDの初期投与は、経時的なアミロイド線維形成を抑制することができた。
上記の方法を用いて、ヒト血清由来の野生型TTRを、1mM、10mM又は100mMのG2−b−CyDの共存又は非共存下でアミロイド化させ、TTRのアミロイド線維形成の定量解析を行った(図2)。解析の結果、G2−b−CyDを共存させると、TTRのアミロイド線維形成能は、比較的高濃度ではあるが、用量依存的に低下していた。
上記の方法を用いて、ヒト血清由来の野生型TTRを、各40mMのHP−b−CyD、GUG−b−CyD、G2−b−CyDの共存又はこれらの非共存下でアミロイド化させ、TTRのアミロイド線維形成の定量解析を行った(図3)。解析の結果、シクロデキストリン誘導体のアミロイド線維に対する抑制効果は、各種分岐b−CyD間の分岐糖鎖の差異により大きく変化し、GUG−b−CyDが最も強いアミロイド形成抑制効果を示した。
上記の方法を用いて、ヒト血清由来の野生型TTRを、各40mMのSBE−b−CyD、GUG−b−CyDの共存又はこれらの非共存下でアミロイド化させ、TTRのアミロイド線維形成の定量解析を行った(図4)。解析の結果、シクロデキストリン誘導体のアミロイド線維に対する抑制効果は、各種分岐b−CyD間の分岐糖鎖の差異により大きく変化し、SBE−b−CyDでは逆に増強された。
上記の方法を用いて、ヒト血清由来の野生型TTRを、各20mMのGUG−b−CyD及びβ−CyDの共存又はこれらの非共存下でアミロイド化させ、TTRのアミロイド線維形成の定量解析を行った(図5)。結果、GUG−b−CyDを共存させるとアミロイド線維形成の抑制効果が見られたのに対して、β−CyDを共存させても抑制効果は得られなかった。本結果から、β−CyDは、修飾されてはじめて、アミロイド線維形成を抑制することができることが示唆された。
Claims (3)
- 6−O−α−(4−O−α−D−グルクロニル)−D−グルコシル−β−シクロデキストリン又は6−O−α−マルトシル−β−シクロデキストリンを有効成分として含む、トランスサイレチンのアミロイド線維形成の抑制剤。
- 請求項1又は2に記載のトランスサイレチンのアミロイド線維形成の抑制剤を含む、トランスサイレチンによるアミロイドーシスの予防及び/又は治療のための医薬。
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