JP2014510907A - 診断方法及び治療方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、トランスサイレチンアミロイドーシスを治療又は予防するための方法、前記治療又は予防において使用するための医薬組成物、並びに診断方法及びキットに関する。
Description
本発明は、トランスサイレチンアミロイドーシスを治療又は予防するための方法、前記治療又は予防において使用するための医薬組成物、並びに診断方法及びキットに関する。
トランスサイレチン(TTR)は、4つの14kDaサブユニットから構成される機能的血漿タンパク質である。TTRは、肝臓によって主に合成され、レチノール及びチロキシンに対するトランスポーターとして機能する。その生理学的機能に加えて、TTRは、家族性アミロイド多発ニューロパチー(FAP)、家族性心アミロイドーシス(familial cardiac amyloidosis)、及び散発性老人性全身性アミロイドーシス(sporadic senile systemic amyloidosis)(SSA)を含むアミロイドーシスのいくつかの異なる臨床型において、アミロイド線維の主成分として見いだされる。SSAは、心組織における野生型(WT)TTR線維の選択的な沈着によって引き起こされ、80歳を超える人口のほぼ25%が罹患している。
TTRの約100のアミノ酸突然変異が、家族型TTRアミロイドーシスに関連づけられている。四量体の不安定化によって開始されるプロセスによってTTRがアミロイドを形成することが、研究により示された。不安定化は、ミスフォールドし凝集して線維状構造になり得る、単量体の蓄積をもたらす。大多数のTTR関連性アミロイドーシスは、他の点では安定なWTタンパク質の凝集及び沈着によって引き起こされる散発性の症例によって代表されるが、家族型疾患に関係するTTR突然変異のアミロイド原性(amyloidogenicity)の研究に相当な努力が傾注されてきた。
ヘパラン硫酸(HS)は、グルコサミン及びグルクロン酸の繰り返し単位からなる硫酸化多糖であり、多くのアミロイドーシスにおいてアミロイド沈着物に結合している。HSがアミロイド沈着において重要な役割を果たすということを示唆する証拠が蓄積されているが、アミロイドーシスの病態におけるHSの明確な役割は、未解明のままである。
したがって、TTRアミロイドーシスにおけるHSの役割を詳細に説明する必要性、そして医薬を開発する必要性も当技術分野において残っている。
本発明は、心筋症の心臓におけるTTRとのHSの同時沈着が免疫組織化学的染色によって検出されたという研究に基づく。インビトロにおける研究によって、HS及びヘパリンが、多糖の硫酸化の程度と相関してTTR原線維発生を促進し、そしてTTR上の特異的な結合配列を通じて働くことが明らかになった。この促進作用は、ヒトTTRを発現するショウジョウバエモデルでさらに検討された。したがって、TTRのヘパリン/HSとの相互作用は、サイズ依存性及びサイズ選択的であり、硫酸化の程度がより高い多糖が好まれる。
本発明は、TTRアミロイドーシスを診断するための方法を提供する。方法は、(a)ヒト対象由来の体液試料を準備するステップ、(b)前記体液におけるTTRの濃度を決定するステップ、(c)ステップ(b)において決定されるTTR濃度が対照試料よりも高い場合、前記ヒト対象がTTRアミロイドーシスに罹患している又はそれを発症する危険性が高いことを決定するステップを含む。
本発明はまた、体液試料におけるTTRの発現レベルを検出するための抗TTR抗体及び1つ又は複数の試薬を含む、上記の診断方法において使用するためのキットをも提供する。
本発明は、TTRとヘパラン硫酸(HS)との相互作用を妨害することができる有効量の薬剤を投与することによって、その必要のある患者においてトランスサイレチン(TTR)アミロイドーシスを予防、軽減、及び/又は治療するための方法をさらに提供する。
さらに、本発明は、TTRアミロイドーシスを予防、軽減、及び/又は治療するための、HSとTTRとの間の相互作用を妨害することができる薬剤の医学的用途にも関する。
さらに、本発明は、HSとTTRとの間の相互作用を妨害することができる薬剤並びに薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明の詳細な実施形態は、従属請求項に記載される。
本発明の他の目的、実施形態、細部、及び利点は、以下の図面、詳細な説明、及び実施例から明らかになるであろう。
以下において、本発明を、添付の図に関連して、好ましい実施形態によって、より詳細に説明することとする。
本発明は、ヘパリン/ヘパラン硫酸(HS)が、トランスサイレチン(TTR)関連性のアミロイドーシスの病因において役割を果たすかどうかを決定することを目的とする研究に基づく。
アミロイド心筋症と診断された患者由来の心臓検体の免疫組織学的検査は、TTRアミロイド沈着物を伴う実質的なHS蓄積を明らかにしたが(図1)、TTRポジティブシグナルのうちのいくつかは、大部分は血管壁において、HSと重複しなかった。高程度のHS−TTR共局在についてのこの発見は、TTRアミロイドーシスにおいてHSが機能している可能性を検討する動機付けとなった。この問題について検討するために、本発明者らは、インビトロ及びインビボ実験によって、ヘパリン/HSの非存在下又は存在下においてその凝集を評価するために、組換えヒトWT TTRを用いた。
TTR凝集/アミロイドーシスが、オリゴマーを自発的に形成する不安定な単量体を生成する、未変性四量体の解離によって開始されることが証明された。以前の報告と一致して、本発明者らは、ゲル電気泳動によって分析されるように、pH2.7でのインキュベーションで組換えWT TTRの解離を確認した。アミロイド様線維の形成は、ThT蛍光染色によって定量化し、オリゴマーの形成は、native−PAGEによって評価した。本発明者らは、WT TTRが、pH2.7での48時間37℃でのインキュベーションに際してある程度まで自発的に凝集することを発見したが、より高いpHでは凝集しなかった(図2)。しかしながら、やや酸性の条件下での長期間のインキュベーションは、TTRの凝集をもたらし(図6C)、異なるpH条件でのTTR凝集の動態の変化を示した。いかなる理論にも制限されるものではないが、これは、心筋症の心臓における酸素供給のたび重なる不足が、TTR凝集を促し得る酸性化環境生じさせるインビボにおける状況を反映している可能性がある。
HSの一般に使用される類似体であるヘパリンの追加は、pH2.7及び5.0でTTR線維化を非常に促進した(図3A及び6C)。特に、ヘパリンの包含は、native−PAGE分析によって実証されるように、特異なパターンのTTR凝集体をもたらした。実質的な量の高分子が、ゲルの一番上にとどまり、オリゴマー種の低下又は不在を反映した(図3C)。ヘパリンが単量体/オリゴマー線維構築の割合を変化させる又は凝集経路の方向を変える可能性がある。
ヘパリンがTTR線維の中に組み込まれるという発見(図4)は、HS/ヘパリンが、足場の役割を果たし、ミスフォールドしたTTR単量体を「集め」、線維の中に組み込まれ得ることを示唆する。いかなる理論にも制限されるものではないが、これは、細胞表面上の又は細胞外マトリックスにおけるHSが、アンフォールドTTR単量体の蓄積及び凝集を促進するように足場/触媒として機能するインビボにおけるTTR−HS凝集を反映し得る。図15中の図解は、HS媒介性のTTR線維化についてのこの仮説を示す。
HSもまた、最近の報告と一致して、TTR原線維発生を促進したが、ヘパリンと比較して程度が低かった(図3A及び3B)。興味深いことには、HSの促進能力は、硫酸化の程度と関連する。5%の三硫化二糖を含有するHS Iは、TTR凝集に対してわずかな効果しか有していなかったが、45%の三硫化構成成分を含有する高度に硫酸化されたHS IIは、TTR凝集に対してより強い効果を有した。ヘパリン又は2つのHS調製物に対するTTR結合の比較は、親和性の差異が硫酸化の程度と相関することを明らかにした。TTRは、HS IIと比較した場合、ヘパリンに対して10倍高い親和性を示し、低硫酸化HS Iと比較した場合、1000倍を超えるより高い親和性を示した(図7)。しかしながら、以前の結果は、コンドロイチン硫酸が、アミロイドペプチドの凝集を促進せず、HSの微細構造もまたその効果にとって重要であることを示唆することを示した。
興味深いことに、高齢者の個人の大動脈におけるHSが若い対象由来のHSよりもより硫酸化されていることが分かったように、HS硫酸化の程度は、年齢依存性であることが報告されている。同時に、アミロイドの大動脈沈着は、80歳を超えるすべての調査した対象において見つけられた。これは、大動脈アミロイドーシスとのHS硫酸化における年齢依存性の変化の関連を示唆し得る。高齢者の心臓におけるWT TTRアミロイドーシスの高い発生率がHS構造の同様の変化と関連するかどうかは、未だ確認されていない。
長い間問われてきた疑問は、WT TTRが、十分に実証されている熱力学的安定性にもかかわらず、なぜアミロイドを形成するのかということである。WT TTR中のアミノ酸24〜35の配列がヘパリンに有効に結合することを示す本発明者らの結果は、この目的のために説明を与え得る。TTRの未変性形態では、このペプチドは隠れており(図13)、HSと相互作用することができない。タンパク質が解離すると、この配列は露出するようになり、HSとの相互作用が促される。近接する3つの塩基性アミノ酸を有するペプチド(31−HVFRK−35)の塩基性特性は、静電的相互作用による、負電荷HS/ヘパリンへの結合に適合する。このことは、同様のHS/ヘパリン結合モチーフが、アミロイド−ベータ(13−HHQK−16)及び血清アミロイドA(34−KYFHARGN−41)のような他のアミロイドペプチドについて同定されたので、興味深い。
さらに、V30M突然変異(家族性アミロイド多発ニューロパチーと関連する)を含有する対応するペプチドよりも、WTペプチド(アミノ酸24〜35)にヘパリンがより結合するという本発明者らの発見(図8B)は、今までによく理解されていないV30M突然変異体及びWT TTRが組織特異的沈着において差異を示すという事象についての、可能性のあるメカニズムを示唆し得る。この異なる沈着パターンが、突然変異体TTRと比較したWTのHS結合特性に相関するかどうか、さらに調査されるべきである。WT及びV30M TTRのアミロイド沈着物由来のHS構造の検査は、組織特異的HS発現とのTTR沈着の相関を確立するのに有益であり得る。
さらに、本発明者らは、TTR線維化に対するHS/ヘパリンの効果を細胞モデルにおいて再現することができるかどうかについての知見を得たかった。HSを発現するWT CHO細胞とのTTRのインキュベーションにより、実質的な量のアミロイド様線維が生成された、また、それに比べて、HS欠損CHO−pgsD−677細胞は、わずかな量の線維しか産生しなかった(図11)。この結果は、CHO−WT細胞における強いTTR免疫染色と組み合わせて、TTR線維化における細胞性のHSについての可能性のある役割を明確に示す。この効果は、さらにアミロイド形成的TTRを発現するショウジョウバエモデルにおいて実証された。ヘパリンを動物に給餌することにより、TTRアミロイド様線維の形成が促進され、これは、ヘパリン断片(Klexane(登録商標))を給餌したハエにおいて観察されない結果であった。同様に、TTR及びHSに対する抗体による免疫組織染色により、TTR及びヘパリンの同時沈着が確認された。
18量体のヘパリン断片(4,500DaのMr)は、完全長ヘパリンよりもよくインビトロにおけるTTR凝集を促進したが(図3A)、Klexane(登録商標)(4,500Daの平均Mrを有する)は、インビボにおいてTTR線維化を促進しなかったことに注目すべきである。いかなる理論にも制限されるものではないが、この明らかな相違は、Klexane(登録商標)の分子の不均一性によるものであるかもしれない。調製物中のより小さな断片は、ハエモデルにおいてTTR凝集を妨害し得るが、インビトロにおける実験において使用されるヘパリン18量体は、均質の調製物である。実際に、低分子量ヘパリン及びヘパリン様の断片は、SAA及びアミロイド−ベータペプチドのアミロイド形成を阻害することが以前に示された。これは、最適なサイズのヘパリンがTTR−HS相互作用を妨害し、TTR凝集を減じ得る可能性を高める。
この発見は、TTR代謝を調整する際に、HSが二重の役割を果たし得ることを示唆する。マクロファージのような細胞表面上で発現されたHSが、TTRの単量体形態の内部移行を促進して、その凝集を予防し(図19)、また、細胞外マトリックス上で発現されたHSは、より安定した線維に形成される毒性オリゴマーを運ぶための足場として機能し得る(図20)。
要約すれば、WT TTR線維化におけるアミロイド前駆体生成性の(pro−amyloidogenic)因子に関する情報は乏しい。大多数のTTR関連性アミロイドーシスが、WT TTR沈着によって引き起こされる散発性の症例であるので、WT TTR沈着の病理学的なメカニズムの理解は、SSAの予防及び治療にとって有益なことである。本発明者らのデータは、心筋症の心臓におけるWT TTRとのHSの同時沈着の最初の証拠を提供し、TTRの特異的なドメインに対する選択的な結合を通した、TTR凝集におけるHS/ヘパリンのアミロイド前駆体生成性機能を例示する。結果は、HSが、高齢者集団の心臓においてTTR凝集/アミロイドーシスに影響を及ぼす、可能性のあるメカニズムを示唆する。結果は、他のアミロイド前駆体に関係する報告と一致しており、総合的に、アミロイド関連性の疾患についての効力のある治療剤の設計を支援し得る。
本発明の結果に基づいて、家族性アミロイド多発ニューロパチー(FAP)、家族性心アミロイドーシス、及び散発性老人性全身性アミロイドーシス(SSA)を含むが、これらに限定されないTTRアミロイドーシスは、TTRとのHSの相互作用を妨害することにより、予防されてもよい、軽減されてもよい、回復させられてもよい、及び/又は治療されてもよい。これは、そのような予防、軽減、回復、及び/又は治療を必要とするヒト患者に、HSとTTRとの相互作用を妨害する能力を有する、有効量のHS/ヘパリン由来断片若しくはミメティック、TTR由来ペプチド若しくは修飾ペプチド、又は抗TTR抗体を投与することによって達成されてもよい。
HSとTTRとの相互作用を妨害することができる薬剤の「有効量」とは、TTRの有害な効果が少なくとも改善するレベルを意味する。言いかえれば、そのような薬剤の有効量は、TTRとのHSの結合、そのような結合は有害である又は望まれない、を遮断する又は部分的に遮断するのに十分な量である。HSとTTRとの相互作用を妨害することができる薬剤の投与量及びレジメンは、アミロイドーシスを治療する臨床技術分野における当業者らによって容易に決定することができる。一般的に、そのような干渉薬剤の投薬量は、治療される患者の年齢、性別、及び健康状態;もしあれば併用療法の種類;治療の頻度及び望まれる効果の性質;組織損傷の程度;症状の継続期間;並びに個々の医師によって調整される他の変動要素などに依存して変動するであろう。望まれる用量は、望まれる結果を得るために1つ又は複数の使用において投与することができる。
HSとTTRとの物理的な相互作用を妨害する薬剤は、1つ又は複数の薬学的に許容できる担体及び/又は賦形剤を含む医薬組成物として製剤されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物が、単位剤形として提供される。
本発明の医薬組成物は、経口送達、静脈内、腹腔内、皮下、経皮的、局所的、及び局所投与を含むが、これらに限定されない様々なルートによって投与されてもよい。
非経口又は局所的投与の目的のために、医薬組成物は、たとえば溶液、懸濁液、又はエマルションとして製剤されてもよい。製剤は、滅菌水性又は非水性溶媒、共溶媒、可溶化剤、分散剤若しくは湿潤剤、懸濁化剤、及び/又は粘性の薬剤を必要に応じて含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、HSとTTRとの相互作用を妨害する薬剤が、注射用滅菌水中に溶解され、pHは、好ましくは、約6〜8に調整され、溶液は、好ましくは、等張となるように調整される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物が、要望に応じて還元されることとなる濃縮形態又は粉末の形態で提供されてもよい。凍結乾燥の場合には、ポリマー(ポビドン、ポリエチレングリコール、デキストラン)、糖(スクロース、グルコース、ラクトース)、アミノ酸(グリシン、アルギニン、グルタミン酸)、及びアルブミンを含むある種の凍結保護剤が、好ましい。還元用の溶液がパッケージングに追加される場合、それは、たとえば、注射用の純水又は塩化ナトリウム溶液又はデキストロース又はグルコース溶液からなってもよい。
経口投与のための固体剤形は、カプセル、錠剤、丸剤、トローチ、ロゼンジ、粉末、及び顆粒剤を含む。そのような固体剤形では、活性化合物は、スクロース、ラクトース、又はデンプンのような少なくとも1つの不活性賦形剤と混合されてもよい。そのような剤形はまた、通常の手段であるように、医薬補助物質、たとえばステアレート潤滑35薬剤又は香味料を含んでいてもよい。固体経口製剤はまた、活性成分の放出を調整する腸溶性又は他のコーティングと共に調製することもできる。
経口投与のための液体剤形は、水及びアルコールのような当技術分野において一般に使用される不活性で無毒性の希釈剤を含有する薬学的に許容できるエマルション、溶液、懸濁液、シロップ剤、及びエリキシル剤を含む。そのような組成物はまた、湿潤剤、バッファー、乳化剤、懸濁化剤、甘味料、及び香味料のような補助剤を含んでいてもよい。
本発明の医薬製剤を製剤化するための手段及び方法は、当業者らに知られており、それ自体知られている様式で、たとえば、従来の混合、造粒、溶解、凍結乾燥、又は同様のプロセスの手段によって、製造されてもよい。
いくつかの実施形態では、HSとTTRとの相互作用を妨害することができる薬剤は、ヘパリン/HS断片又はそのミメティックである。適したヘパリン/HS分子は、非抗凝血性ヘパリンの二糖、四量体、六量体、八量体、十量体、12量体、14量体、16量体、及び18量体を含むが、これらに限定されない。しかしながら、いくつかの実施形態では、完全長非抗凝血性ヘパリンが、使用されてもよい。さらに、ヘパリン/HSポリマー、オリゴマー、又は断片の硫酸化の程度は、三硫化及び一硫化単糖の間で変動してもよい。いくつかの実施形態では、非凝固薬ヘパリンの治療上の効率が、硫酸化の程度が高くなるほど、治療上の効率が高くなるように、変動してもよい。
用語「ヘパリン/HSミメティック」は、ヘパリン/HSと類似しているが、異なる硫酸化オリゴ糖を指す。そのようなオリゴ糖は、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、硫酸化K5多糖、硫酸化天然多糖及びオリゴ糖(植物及び海由来の)、並びに合成硫酸化オリゴ糖を含むが、これらに限定されない。さらに、構造は、長さ及び硫酸化のレベルを含めて、本発明の様々な実施形態において変動してもよい。
他の実施形態では、HSとTTRとの相互作用を妨害することができる薬剤が、TTR由来ペプチド又はその修飾ペプチドである。そのようなペプチドは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるもの、配列番号1のアミノ酸24〜35を含む又はそれからなるペプチド、配列番号1のアミノ酸50〜61又は10〜24を含む又はそれからなるもの、アミノ酸配列KVLDAVRGSPAINVAVHVFRK(配列番号2)を含む又はそれからなるもの、好ましくは、アミノ酸配列AVHVFRKAA(配列番号3)を含む又はそれからなるもの、より好ましくは、アミノ酸配列VHVFRK(配列番号4)を含む又はそれからなるもの、及び前記ペプチドの任意の組み合わせを含む。本発明において使用するに適した修飾ペプチドは、配列番号1又はその断片において示される配列と比較して、それらのアミノ酸配列中に少なくとも1つの修飾を有し、HSとTTRとの相互作用を妨害する能力を保持するものを含む。言いかえれば、本発明において使用するのに適したペプチドは、それらがTTRとHSとの相互作用を妨害する能力をなお有することを条件として、配列番号1に示されるTTRのアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するものを含む。
さらに他の実施形態では、HSとTTRとの相互作用を妨害することができる薬剤が、遮断抗体、好ましくは、配列番号1に示されるようなTTRのアミノ酸24〜35に又は配列番号1のアミノ酸50〜61若しくは10〜24又はその任意の組み合わせに特異的に結合する抗体である。治療用抗TTR抗体は、当技術分野において知られている任意の標準的な方法によって産生されてもよい。そのような抗体は、キメラ、ヒト化、完全ヒト、又は組換え抗体であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体である。他のいくつかの好ましい実施形態では、Fab、Fab’、F(ab’)2、FV、又は単鎖FV断片のような抗体断片が使用されてもよい。
本発明において使用するための抗TTR抗体は、化学的に又は遺伝子操作によって、望まれる作用部位に対する抗体のターゲティングをもたらす他の薬剤にコンジュゲートされてもよい。その代わりに、他の化合物が、化学的に又は遺伝子操作によって、抗体に対してさらなる特性、とりわけ、HSとTTRとの相互作用によって媒介される有害な効果の軽減を促進する抗体の能力を増強する特性を拡張する又は提供するために、本発明による抗体にコンジュゲートされてもよい。
いくつかの態様では、本発明は、TTRアミロイドーシスの予測及び/又は早期診断法のための診断方法に関する。いくつかの実施形態では、抗TTR抗体が、FAP、家族性心アミロイドーシス、及びSSAのようなTTRアミロイドーシスに罹患していることが疑われる又は罹患する危険性がある患者の血漿又は脊髄液中の、未変性TTR濃度を検出するために使用されてもよい。現時点では、TTRアミロイドーシスの原因は、十分に理解されていない。いかなる理論にも制限されるものではないが、SSAについての1つの可能性のある原因は、肝臓におけるTTRの産生の増加及び血漿への放出であるかもしれない。他のいくつかの実施形態では、抗TTR抗体、とりわけ、配列番号1に示されるTTRのアミノ酸24〜35又は配列番号1のアミノ酸50〜61若しくは10〜24又はその任意の組み合わせに選択的に結合するものが、TTRアミロイドーシスに罹患していることが疑われる又は罹患する危険性がある患者の血漿又は脊髄液中の、TTR単量体濃度を検出するために使用されてもよい。一般的に、未変性TTR四量体は、病的であると見なされない。さらに、いかなる理論にも制限されるものではないが、未変性四量体が解離し、これはおそらく低pHによって引き起こされ、配列番号1のアミノ酸24〜35から構成される隠れた部位を露出する単量体がもたらされると考えられる。その後、これらの隠れた部位は、HSと相互作用し、病的な単量体凝集に至る可能性がある。未変性TTR四量体の濃度の増加及びTTR単量体の濃度の増加は、したがって、TTRの早期診断又はTTRの発病の予測に使用されてもよい。
血漿又は脊髄液のような体液中のTTR四量体又は単量体の濃度は、当技術分野において知られている従来の方法によって決定されてもよい。たとえば、抗TTR抗体、とりわけ、配列番号1に示されるTTRのアミノ酸24〜35又は配列番号1のアミノ酸51〜60若しくは10〜24又はその任意の組み合わせに結合するものが、ELISAアッセイ又は単量体TTRの検出のための他の免疫学的技術に使用されてもよい。さらに、抗HS抗体及び抗TTR抗体の組み合わせは、TTR−HSの複合体を検出するために使用されてもよい。これは、たとえば、商業的に入手可能なDuolink技術によって、好ましくは血漿若しくは脊髄液において又は固定組織若しくは細胞において、HSとTTRとの相互作用/複合体を検出することによって、達成されてもよい。他の適した方法は、当業者に利用可能である。
いくつかの実施形態では、抗TTR抗体が、検出可能な抗体を提供するために、化学的に又は遺伝子操作によって標識されてもよい。そのような標識抗体は、TTRの診断において使用されてもよく、画像処理目的にとって有用なツールとなる。
本発明のさらなる態様は、TTRアミロイドーシスに罹患していることが疑われる又は罹患する危険性がある患者の、血漿又は脊髄液のような体液中のTTRの量を評価するための1つ又は複数の試薬を含む、TTRアミロイドーシスの予測及び/又は早期診断法において使用するためのキットに関する。その量又は濃度が評価されることとなるTTRは、TTR四量体又は単量体形態をしていてもよい。評価において使用されることとなる試薬は、本明細書において記載される任意の実施形態による抗TTR抗体、とりわけ、配列番号1に示されるTTRのアミノ酸24〜35、アミノ酸51〜60、アミノ酸10〜24、又はその任意の組み合わせに結合するモノクローナル抗体であってもよい。キットは、たとえば免疫学的方法、放射線、若しくは酵素法、又は当技術分野において知られている他の方法によって、TTR、とりわけ単量体TTRが体液中に存在する場合、それに対する前記抗体の結合を検出するための1つ又は複数の試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットが、ELISAアッセイによって、前記抗体への結合がもしあれば、それを検出するための手段を含む。いくつかのさらなる実施形態では、キットが、TTR−HSの複合体を検出するための抗HS抗体を含んでいてもよい。上記の構成成分のいずれも、マイクロタイタープレートのような固体支持体上に固定されて提供されてもよい。
以下の実施例は、より詳細に本発明をさらに明らかにするために示されるが、本発明の範囲を制限するようには意図されない。さらなる適用及び用途は、当業者、すなわち、炎症性障害及びその治療に精通している臨床医によって容易に理解される。
技術が進歩するにつれて、様々な方法で本発明の概念を実施することができることは当業者にとって明白であろう。本発明及びその実施形態は、下記に記載される実施例に制限されず、請求項の範囲内で変更されてもよい。
材料及び方法
TTRの凝集
組換え野生型TTRを、以前に記載されるように細菌中で発現し、精製した(Furuya et al.(1991)Biochemistry 30:2415−2421)。精製タンパク質を、チオフラビンT蛍光については50μM又はnative−PAGEについては500μMの最終濃度まで、20mMリン酸バッファー−クエン酸(pH2.7、3.5、4.5、又は7.4)中に溶解した。ヘパリン(3H標識又は非標識)及びHSを、それぞれの図の説明文中に示される濃度までTTR溶液に追加した。試料を、指定する時間、37℃でインキュベートした。
TTRの凝集
組換え野生型TTRを、以前に記載されるように細菌中で発現し、精製した(Furuya et al.(1991)Biochemistry 30:2415−2421)。精製タンパク質を、チオフラビンT蛍光については50μM又はnative−PAGEについては500μMの最終濃度まで、20mMリン酸バッファー−クエン酸(pH2.7、3.5、4.5、又は7.4)中に溶解した。ヘパリン(3H標識又は非標識)及びHSを、それぞれの図の説明文中に示される濃度までTTR溶液に追加した。試料を、指定する時間、37℃でインキュベートした。
TTRペプチド
TTRの様々なセグメントに対応する合成ペプチドは、民間の供給者から購入した又は専門家によって合成された。ペプチドの純度及び配列は、MS/MS分析によって検証した。
TTRの様々なセグメントに対応する合成ペプチドは、民間の供給者から購入した又は専門家によって合成された。ペプチドの純度及び配列は、MS/MS分析によって検証した。
ヘパリン及びHS
ヘパリンは、Superose 12カラム(GE Healthcare Biosciences)上でゲルクロマトグラフィーによって分析されるように、14kDaの平均分子量を有する。HS試料は、ブタ組織から単離し、HS/ヘパリンリアーゼによる酵素学的切断の後にRPIP−HPLCによって特徴付けた。HS Iは、5%の三硫化二糖(IdoA2S−GlcNS6S)種を含有し、HS IIは、45%のその種を含有した。3H標識ヘパリンは、ヘパリンのN−脱アセチル化、その後に続くN−[3H]無水酢酸による再N−アセチル化によって調製した。ヘパリンオリゴ糖は、ヘパリンの部分的な脱アミノ切断、その後に続くNaBH4による還元によって生成した。断片化ヘパリン試料は、Bio−gel P−10カラム(Bio−Rad)上での分離の後に収集した。糖の量は、カルバゾール試薬反応によって定量化した。
ヘパリンは、Superose 12カラム(GE Healthcare Biosciences)上でゲルクロマトグラフィーによって分析されるように、14kDaの平均分子量を有する。HS試料は、ブタ組織から単離し、HS/ヘパリンリアーゼによる酵素学的切断の後にRPIP−HPLCによって特徴付けた。HS Iは、5%の三硫化二糖(IdoA2S−GlcNS6S)種を含有し、HS IIは、45%のその種を含有した。3H標識ヘパリンは、ヘパリンのN−脱アセチル化、その後に続くN−[3H]無水酢酸による再N−アセチル化によって調製した。ヘパリンオリゴ糖は、ヘパリンの部分的な脱アミノ切断、その後に続くNaBH4による還元によって生成した。断片化ヘパリン試料は、Bio−gel P−10カラム(Bio−Rad)上での分離の後に収集した。糖の量は、カルバゾール試薬反応によって定量化した。
TTR凝集体の検出
チオフラビンT(ThT)蛍光アッセイ−インキュベーションの後に、5μlの試料を、20μM ThTの最終濃度まで、水中でThTと混合した。混合物を、平底黒色96ウェルプレート(Grainer)に移し、蛍光は、それぞれ、440及び480nmの励起波長及び発光波長で測定した(ゲイン=55、FARcyte機器)。様々なpHで凝集した試料は、ThT染色前の、インキュベーションの終了後に中性のpHに調整した。実験は、二つ組又は三つ組で実行した。
チオフラビンT(ThT)蛍光アッセイ−インキュベーションの後に、5μlの試料を、20μM ThTの最終濃度まで、水中でThTと混合した。混合物を、平底黒色96ウェルプレート(Grainer)に移し、蛍光は、それぞれ、440及び480nmの励起波長及び発光波長で測定した(ゲイン=55、FARcyte機器)。様々なpHで凝集した試料は、ThT染色前の、インキュベーションの終了後に中性のpHに調整した。実験は、二つ組又は三つ組で実行した。
Native−PAGE−インキュベーションの後に、10μlの試料を、2.5μlの5×試料バッファー(0.3M Tris−HCl、pH6.8、0.05%ブロモフェノールブルー、50%グリセロール)と混合し、SDSなしの10%ポリアクリルアミドゲル上にロードした。2.5時間、100Vでの電気泳動の後に、ゲルをクーマシーブルーにより染色し、スキャンした。ヘパリンの検出については、ゲルは、アルシアンブルーにより染色した。3H標識ヘパリンの定量については、ゲル中の対応するレーンを、濃縮用ゲルを含む6つの切片に切断し、シンチレーションバイアルに移し、3mlのH20に入れた(図4Aを参照されたい)。2時間のインキュベーションの後に、2mlのシンチレーションカクテルを追加し、放射活性を測定した。
表面プラズモン共鳴(SPR)分析
ヘパリン/HSとのTTRの相互作用は、Biosensor system(Biacore2000)を使用して評価した。TTRは、酸性バッファー(pH2.7)中で解離させ、その後、50mM NaAc(pH5.0)カップリングバッファー中に希釈し、アミンカップリングキット(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)を使用して、3000RUのレベルまでCM5センサーチップ上に固定した。結合及び反応速度分析については、ヘパリン又はHSを、表面上にインジェクトし(図の説明文中に示される濃度)、様々なpHで平衡化した。表面は、それぞれの試料の後に、0.5M NaClによる30秒間の洗浄ステップにより再生した。得られたセンサーグラムはすべて、基準フローセル及びバッファーブランク試料を使用して、Biacore evaluation software 2.0においてダブルリファレンスサブトラクションを行った(double-reference subtracted)。
ヘパリン/HSとのTTRの相互作用は、Biosensor system(Biacore2000)を使用して評価した。TTRは、酸性バッファー(pH2.7)中で解離させ、その後、50mM NaAc(pH5.0)カップリングバッファー中に希釈し、アミンカップリングキット(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)を使用して、3000RUのレベルまでCM5センサーチップ上に固定した。結合及び反応速度分析については、ヘパリン又はHSを、表面上にインジェクトし(図の説明文中に示される濃度)、様々なpHで平衡化した。表面は、それぞれの試料の後に、0.5M NaClによる30秒間の洗浄ステップにより再生した。得られたセンサーグラムはすべて、基準フローセル及びバッファーブランク試料を使用して、Biacore evaluation software 2.0においてダブルリファレンスサブトラクションを行った(double-reference subtracted)。
細胞培養におけるTTR凝集
野生型チャイニーズハムスター卵巣(CHO−WT)細胞及びHS欠損CHO−pgsD−677細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシン(それぞれ60及び50μg/ml)を補足したF12培地(Gibco)中で培養した。細胞は、8ウェルLabTecチャンバー(Nunc)において6000細胞/ウェルの密度で接種し、48時間培養した。TTRは、酸性バッファー(pH2.7)中で解離させ、細胞に追加する前に中性のpHにNaOHにより中和し(最終濃度5μM)、これらを、餓死培地(0.1%FBS)中で培養した。48時間後に、培地を除去し、細胞をPBS中で十分に洗浄した。細胞は、その後、1% NaOHにより溶解した。溶解産物を遠心分離し(10000rpmで10分間)、上清を、20μM ThTの最終濃度まで水中でThTと混合した。蛍光を上記に記載されるように測定した。TTRを追加していない培養細胞は、バックグラウンド蛍光を引き算するために対照として使用した。免疫細胞染色(immunocytostaining)については、細胞を、氷冷95%エタノール及び5%酢酸中で固定し、PBSにより洗浄した。細胞を、0.4% TritonX−100により透過処理し、抗TTR抗体(1μg/ml、HPA002550、Atlas Antibodies)と共にインキュベートし、1時間、Alexa flour 488抗ウサギIgG(8μg/ml、Molecular probes)と共にインキュベーションした。スライドに、DAPI対比染色剤を含有するVectashield(Vector Labs)をマウントした。TTR免疫シグナルは、Carl Zeiss、AxioCam機器により取った。
野生型チャイニーズハムスター卵巣(CHO−WT)細胞及びHS欠損CHO−pgsD−677細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシン(それぞれ60及び50μg/ml)を補足したF12培地(Gibco)中で培養した。細胞は、8ウェルLabTecチャンバー(Nunc)において6000細胞/ウェルの密度で接種し、48時間培養した。TTRは、酸性バッファー(pH2.7)中で解離させ、細胞に追加する前に中性のpHにNaOHにより中和し(最終濃度5μM)、これらを、餓死培地(0.1%FBS)中で培養した。48時間後に、培地を除去し、細胞をPBS中で十分に洗浄した。細胞は、その後、1% NaOHにより溶解した。溶解産物を遠心分離し(10000rpmで10分間)、上清を、20μM ThTの最終濃度まで水中でThTと混合した。蛍光を上記に記載されるように測定した。TTRを追加していない培養細胞は、バックグラウンド蛍光を引き算するために対照として使用した。免疫細胞染色(immunocytostaining)については、細胞を、氷冷95%エタノール及び5%酢酸中で固定し、PBSにより洗浄した。細胞を、0.4% TritonX−100により透過処理し、抗TTR抗体(1μg/ml、HPA002550、Atlas Antibodies)と共にインキュベートし、1時間、Alexa flour 488抗ウサギIgG(8μg/ml、Molecular probes)と共にインキュベーションした。スライドに、DAPI対比染色剤を含有するVectashield(Vector Labs)をマウントした。TTR免疫シグナルは、Carl Zeiss、AxioCam機器により取った。
心組織におけるTTR沈着の検出
心筋症及び対照の心組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片(15μm)を、キシレン中で脱パラフィンし(30分間)、エタノールバス(99.9%〜70%)によって10分間の間隔で再水和した。コンゴレッド染色については、切片は、最初に、飽和NaCl溶液(80%エタノール/0.1% NaOH;30分間)中でインキュベートし、その後、ろ過した0.4%コンゴレッド(Sigma Aldrich)飽和NaCl溶液に移した(30分間)。硫酸化グリコサミノグリカンの染色については、切片は、最初に、95%エタノール/10% AcOHにおいてインキュベートし(1〜2分間)、その後、硫酸化アルシアンブルー(0.45%アルシアンブルー8GX Sigma Aldrich)溶液(0.45% Na2SO4/45%エタノール/10% AcOH;45分間)により染色した。TTR及びHSの免疫染色については、切片は、抗原性賦活化のためにマイクロ波で加熱し、その後、0.4% Triton X−100中で透過性にした(15分間)。一次抗体インキュベーションは、4℃で一晩実行した(抗TTR:上記に記載;抗HS、1:250 10E4:Dr.Guido David、Center for Human Genetics、University of Leuven、Belgiumからの寄贈)。蛍光検出については、切片は、室温で、30分間、4μg/mlの適切な二次Alexa fluor 488又は594(Molecular probes、USA)抗体と共にインキュベートし、核は、DAPIにより対比染色した。発色性の検出については、適切なMach 3 Alkaline Phosphatase Polymer検出キット(Biocare Medical)は、Vulcan Fast Red(Biocare Medical)により発色させた。蛍光明視野画像は、Nikon DXM1200F機器(Nikon、Melville、NY、USA)により撮影した。
心筋症及び対照の心組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片(15μm)を、キシレン中で脱パラフィンし(30分間)、エタノールバス(99.9%〜70%)によって10分間の間隔で再水和した。コンゴレッド染色については、切片は、最初に、飽和NaCl溶液(80%エタノール/0.1% NaOH;30分間)中でインキュベートし、その後、ろ過した0.4%コンゴレッド(Sigma Aldrich)飽和NaCl溶液に移した(30分間)。硫酸化グリコサミノグリカンの染色については、切片は、最初に、95%エタノール/10% AcOHにおいてインキュベートし(1〜2分間)、その後、硫酸化アルシアンブルー(0.45%アルシアンブルー8GX Sigma Aldrich)溶液(0.45% Na2SO4/45%エタノール/10% AcOH;45分間)により染色した。TTR及びHSの免疫染色については、切片は、抗原性賦活化のためにマイクロ波で加熱し、その後、0.4% Triton X−100中で透過性にした(15分間)。一次抗体インキュベーションは、4℃で一晩実行した(抗TTR:上記に記載;抗HS、1:250 10E4:Dr.Guido David、Center for Human Genetics、University of Leuven、Belgiumからの寄贈)。蛍光検出については、切片は、室温で、30分間、4μg/mlの適切な二次Alexa fluor 488又は594(Molecular probes、USA)抗体と共にインキュベートし、核は、DAPIにより対比染色した。発色性の検出については、適切なMach 3 Alkaline Phosphatase Polymer検出キット(Biocare Medical)は、Vulcan Fast Red(Biocare Medical)により発色させた。蛍光明視野画像は、Nikon DXM1200F機器(Nikon、Melville、NY、USA)により撮影した。
形質転換ショウジョウバエTTRモデルの分析
突然変異体TTRを過剰発現する形質転換キイロショウジョウバエ株(Dhet TTR−A)は、記載されるように生成した(7)。TTR形質転換(w;GMR−Gal4/+;UAS−TTR−A/+)及び非TTR形質転換対照ハエ(w;GMR−Gal4/+;+/+)を研究に使用した。TTR発現は、GMR−Gal4ドライバーの制御下にあり、これは、眼の発達段階の間に光受容体細胞に対してTTR発現を指示する。動物は、標準的なマッシュポテト/酵母/寒天培地上で室温で培養した。卵は、培地と混合したヘパリン(Kabivitrum AB、Sweden)又は低分子量ヘパリン(Klexane(登録商標))10mg/mlを補足した標準的な飼料により飼育した。9〜17日後に、動物を分析のために収集した。ThT染色については、それぞれのグループの15の頭部を75μl 0.15M NaCl中でホモジナイズした。ホモジナイゼーションの後に、試料を遠心分離し(10,000rpmで10分間)、結果として生じる上清を、ThTと混合した(20μM ThTの最終濃度)。蛍光を上記に記載されるように測定した。非TTR形質転換ハエは、バックグラウンド蛍光を引き算するために対照として使用した。免疫染色については、ショウジョウバエ(10〜14日齢)の頭部から調製したクライオスタット切片(15μm)を空気乾燥し、PFA(4%)中で固定した。PBS中で洗浄した後に、切片をメタノールバス(25%〜100%)によって10分間の間隔で脱水した。H2O2−処理(2%)の後にメタノールバスによる再水和を続け、切片をPBT(0.2% Triton−X 100)中5% BSAにより遮断した。一次抗体(上記に記載される抗TTR及び抗HS/ヘパリン)を遮断溶液中で一晩インキュベートした。蛍光検出については、切片は、遮断溶液中で1時間、2μg/mlの適切な二次Alexa fluor 555及び633抗体と共にインキュベートした。PBS中で洗浄した後に、切片を、封入剤中のDAPIにより染色した。画像は、PlanApochromat 20x/0.16又はC−Apochromat 63x/1.2対物レンズを使用して、倒立共焦点顕微鏡(LSM 700、Carl Zeiss)により撮影した。
突然変異体TTRを過剰発現する形質転換キイロショウジョウバエ株(Dhet TTR−A)は、記載されるように生成した(7)。TTR形質転換(w;GMR−Gal4/+;UAS−TTR−A/+)及び非TTR形質転換対照ハエ(w;GMR−Gal4/+;+/+)を研究に使用した。TTR発現は、GMR−Gal4ドライバーの制御下にあり、これは、眼の発達段階の間に光受容体細胞に対してTTR発現を指示する。動物は、標準的なマッシュポテト/酵母/寒天培地上で室温で培養した。卵は、培地と混合したヘパリン(Kabivitrum AB、Sweden)又は低分子量ヘパリン(Klexane(登録商標))10mg/mlを補足した標準的な飼料により飼育した。9〜17日後に、動物を分析のために収集した。ThT染色については、それぞれのグループの15の頭部を75μl 0.15M NaCl中でホモジナイズした。ホモジナイゼーションの後に、試料を遠心分離し(10,000rpmで10分間)、結果として生じる上清を、ThTと混合した(20μM ThTの最終濃度)。蛍光を上記に記載されるように測定した。非TTR形質転換ハエは、バックグラウンド蛍光を引き算するために対照として使用した。免疫染色については、ショウジョウバエ(10〜14日齢)の頭部から調製したクライオスタット切片(15μm)を空気乾燥し、PFA(4%)中で固定した。PBS中で洗浄した後に、切片をメタノールバス(25%〜100%)によって10分間の間隔で脱水した。H2O2−処理(2%)の後にメタノールバスによる再水和を続け、切片をPBT(0.2% Triton−X 100)中5% BSAにより遮断した。一次抗体(上記に記載される抗TTR及び抗HS/ヘパリン)を遮断溶液中で一晩インキュベートした。蛍光検出については、切片は、遮断溶液中で1時間、2μg/mlの適切な二次Alexa fluor 555及び633抗体と共にインキュベートした。PBS中で洗浄した後に、切片を、封入剤中のDAPIにより染色した。画像は、PlanApochromat 20x/0.16又はC−Apochromat 63x/1.2対物レンズを使用して、倒立共焦点顕微鏡(LSM 700、Carl Zeiss)により撮影した。
結果
心筋症の心臓におけるHS及びTTRアミロイドの同時沈着
心筋症と診断された患者由来の心臓の15μm厚切片のコンゴレッド染色は、偏光(図1A)下で観察した場合に、青りんご色の複屈折を明らかにし(図1A)、検体におけるアミロイド沈着を実証した。隣接する切片の硫酸化アルシアンブルー染色は、コンゴレッドポジティブ形態に類似するパターンを明らかにした(図1B)。二重免疫染色により、TTR沈着が、大部分、HSと共局在していることを確認した(図1C、D、及びE)。それに比べて、年齢が一致する対照由来の心臓切片の染色は、TTRについての免疫シグナルを生成しなかった(図1F)。TTR及びHSの同時沈着は、細胞外空間において目立ち、筋細胞膜に密接に結合しているように見えたが、血管系における同時沈着は、より多様であり、いくつかの血管壁は、HSポジティブ染色されなかった(図1C及びE)。TTR沈着もHS蓄積も、対照組織において検出されなかった(図1F)。
心筋症の心臓におけるHS及びTTRアミロイドの同時沈着
心筋症と診断された患者由来の心臓の15μm厚切片のコンゴレッド染色は、偏光(図1A)下で観察した場合に、青りんご色の複屈折を明らかにし(図1A)、検体におけるアミロイド沈着を実証した。隣接する切片の硫酸化アルシアンブルー染色は、コンゴレッドポジティブ形態に類似するパターンを明らかにした(図1B)。二重免疫染色により、TTR沈着が、大部分、HSと共局在していることを確認した(図1C、D、及びE)。それに比べて、年齢が一致する対照由来の心臓切片の染色は、TTRについての免疫シグナルを生成しなかった(図1F)。TTR及びHSの同時沈着は、細胞外空間において目立ち、筋細胞膜に密接に結合しているように見えたが、血管系における同時沈着は、より多様であり、いくつかの血管壁は、HSポジティブ染色されなかった(図1C及びE)。TTR沈着もHS蓄積も、対照組織において検出されなかった(図1F)。
ヘパリン及びHSは、WT TTRの線維化を促進する
チオフラビンT蛍光分析は、細菌系において発現された組換えヒトWT TTRが、低pH(2.7)条件でさえ、48時間の37℃でのインキュベーションに際して非常に低い自発的な線維化を示すことを明らかにした(図2)。しかしながら、この条件でヘパリン(HSの類似体)を追加すると、TTR凝集を促し、実質的な量のアミロイド様線維が形成された(図3A)。18糖残基未満の断片(12量体及び6量体)が、より長いポリマーよりも効果がかなり低かったので、ヘパリン由来オリゴマーとのTTRのインキュベーションにより、ヘパリンのサイズ依存性の効果が明らかにされた。特に、18量体と共にインキュベートしたTTRは、完全長ヘパリン(約50量体)とのTTRインキュベーションと比較して、より多くのアミロイド様線維をもたらした。硫酸化の程度がより高いHS(HS II)は、ヘパリンと比較して低い程度とはいえ、TTRの線維化を有効に増強したが、低硫酸化HS(HS I)は、TTR凝集に対する効果がわずかであった(図3B)。
チオフラビンT蛍光分析は、細菌系において発現された組換えヒトWT TTRが、低pH(2.7)条件でさえ、48時間の37℃でのインキュベーションに際して非常に低い自発的な線維化を示すことを明らかにした(図2)。しかしながら、この条件でヘパリン(HSの類似体)を追加すると、TTR凝集を促し、実質的な量のアミロイド様線維が形成された(図3A)。18糖残基未満の断片(12量体及び6量体)が、より長いポリマーよりも効果がかなり低かったので、ヘパリン由来オリゴマーとのTTRのインキュベーションにより、ヘパリンのサイズ依存性の効果が明らかにされた。特に、18量体と共にインキュベートしたTTRは、完全長ヘパリン(約50量体)とのTTRインキュベーションと比較して、より多くのアミロイド様線維をもたらした。硫酸化の程度がより高いHS(HS II)は、ヘパリンと比較して低い程度とはいえ、TTRの線維化を有効に増強したが、低硫酸化HS(HS I)は、TTR凝集に対する効果がわずかであった(図3B)。
native−PAGEによる、ヘパリンと共に又はヘパリンなしでインキュベートしたTTRの分析は、TTRヘパリン凝集体が異なる移動パターンを示したことを示した。ヘパリンなしのTTR凝集体の連続的なスミアの出現とは対照的に、ヘパリンとの同時インキュベーションは、単量体、二量体、及び四量体を示す、インキュベーション前に観察された非凝集バンドとは別に、ゲルの一番上に移動する実質的な高分子TTR凝集体をもたらした(図3C)。TTR凝集に対するヘパリンのこの効果は、より高濃度でより明白となり、用量依存性の効果を示唆する。TTRヘパリンインキュベーションは、蛍光及び偏光顕微鏡下で可視化されるように、コンゴレッドポジティブ線維を生成したが(図3D)、ヘパリンなしでインキュベートしたTTRは、コンゴレッドネガティブであった。
ヘパリンが、結果として生じるTTR線維の中に吸収され/一緒に線維化されたか又は原線維発生について触媒として単に作用したかどうかを決定するために、TTRを、3H標識及び非標識ヘパリンの混合物と共にインキュベートした。共インキュベートしたヘパリン−TTR及びヘパリン単独の試料を、native−PAGE上で分離した。アルシアンブルー染色は、2つの試料の間で区別できなかったヘパリン移動パターンを可視化した(図6A)。ゲル切片(図6Aにおいて示されるように切断した)中の放射活性を計算することによる3H標識ヘパリンの分析は、単独でインキュベートされたヘパリンが、アルシアンブルー染色と一致して、切片4、5、及び6において主に回収されたことを示す(図6B)。対照的に、TTRと共に共インキュベートしたヘパリンは、切片4、5、及び6に加えて、切片1(濃縮用切片)において実質的に回収された。特に、アルシアンブルーは、おそらく結果として生じるTTRアミロイド様線維によるマスキング効果により、ヘパリン−TTR共インキュベート試料について切片1におけるヘパリンを染色しなかった。
切片1において回収されたヘパリンが、凝集TTRと相互作用しているヘパリンの結果ではないことを検証するために、3H標識ヘパリンを、あらかじめ凝集させたTTRと共にインキュベートした。同じ方法による産物の分析は、ヘパリン単独のもの(図4B)とほぼ同一である、3H標識ヘパリンの分布パターンを示し(図5)、凝集TTRと相互作用したヘパリンが全く又はほとんどなかったことを示した。
TTRヘパリン/HS相互作用の特徴付け
TTRヘパリン/HS相互作用についてのメカニズムをさらに調査するために、本発明者らは、表面プラズモン共鳴(SPR)分光法を使用した。解離TTRを、Biacoreセンサーチップ上に固定し、ヘパリンを、中性(pH7.4)及びやや酸性(pH5.0)の条件でリガンドと相互作用させた。解離TTRに対するヘパリン結合は、やや酸性のpHにおいて観察されたが、中性の条件においては観察されず、相互作用についてのpH依存性を実証した(図6A)。pH依存性の相互作用はまた、pH5.0で実質的な結合を示したが、pH5.5での結合を著しく低下させたHS II(硫酸化の程度がより高いHS種)についても観察された(図6B)。SPR分光法による分析もまた、ヘパリンに対するTTRの親和性がHS IIに対してよりも10倍高く、低硫酸化HS Iに対してよりも1000倍以上高いので、HS/ヘパリンの硫酸化の程度が、この相互作用において役割を果たすことを示した(図7A、B、及びC)。このpH及び硫酸化の程度に依存性の相互作用は、7日間、pH5.0及び7.4で、ヘパリン及びHS IIと共にインキュベートしたTTRの線維形成を測定することによって、さらに確認した(図6C)。
TTRヘパリン/HS相互作用についてのメカニズムをさらに調査するために、本発明者らは、表面プラズモン共鳴(SPR)分光法を使用した。解離TTRを、Biacoreセンサーチップ上に固定し、ヘパリンを、中性(pH7.4)及びやや酸性(pH5.0)の条件でリガンドと相互作用させた。解離TTRに対するヘパリン結合は、やや酸性のpHにおいて観察されたが、中性の条件においては観察されず、相互作用についてのpH依存性を実証した(図6A)。pH依存性の相互作用はまた、pH5.0で実質的な結合を示したが、pH5.5での結合を著しく低下させたHS II(硫酸化の程度がより高いHS種)についても観察された(図6B)。SPR分光法による分析もまた、ヘパリンに対するTTRの親和性がHS IIに対してよりも10倍高く、低硫酸化HS Iに対してよりも1000倍以上高いので、HS/ヘパリンの硫酸化の程度が、この相互作用において役割を果たすことを示した(図7A、B、及びC)。このpH及び硫酸化の程度に依存性の相互作用は、7日間、pH5.0及び7.4で、ヘパリン及びHS IIと共にインキュベートしたTTRの線維形成を測定することによって、さらに確認した(図6C)。
TTR−ヘパリン相互作用を特徴付けるために、本発明者らは、3Hヘパリンと共にTTR及びそのペプチド断片をインキュベートした。結合は、ニトロセルロースフィルタートラップ法によって分析した(18)。試験した16のペプチドの中で、アミノ酸24〜35(PAINVAVHVFRK)のペプチドのみがヘパリンに結合した(図8B)。このヘパリンに結合するペプチドは、TTRヘパリン/HS相互作用において見られるpH依存性のおそらく一因となった、ヒスチジンを含む3つの塩基性アミノ酸を含有する。この選択的結合特性を、SPR分析によってさらに検証した(図9)。家族性アミロイドニューロパチーと関連するV30M突然変異を含有する24〜35ペプチドは、WTペプチドと比較して、ヘパリンに対して実質的により低い結合を示した(図8B)。
結合アッセイから、本発明者らは、ヘパリンが、解離TTRに優先的に結合することに気づいた(図8B)。検証のために、本発明者らは、Biacoreチップ上に解離TTR及び未変性TTRを固定し、pH5.0で表面上にHS IIをインジェクトした。得られたセンサーグラムは、解離TTRに対するHS IIのより強い結合を明らかにした(図10)。これらの結果は、TTRのヘパリン/HS結合ドメインが、未変性状態でフォールドされているタンパク質において隠れていることを示唆する。
HS/ヘパリンは、細胞培養において及びインビボにおいてTTRの線維化を促進する
TTR線維化におけるHS/ヘパリンの効果がまた細胞にも適用可能であるかどうかを調査するために、解離TTRを、48時間、チャイニーズハムスター卵巣WT(CHO−WT)細胞及びHS欠損(CHO−pgsD−677)細胞の培養物と共にインキュベートした(19)。インキュベーションの後に、細胞は、遊離TTRを除去するためにPBS中で十分に洗浄した。細胞溶解産物のThT蛍光分析は、HS欠損CHO−pgsD−677細胞と比較して、CHO−WT細胞における実質的な量のアミロイド様線維を明らかにし(図11A)、TTR線維化に対するHSの効果を実証した。抗TTR抗体による細胞の免疫細胞染色は、HS欠損細胞(CHO−pgsD−677)における極微量のポジティブ免疫シグナルを検出し、それに比べて、CHO−WT細胞において、強いポジティブシグナルが見られた(図11B)。
TTR線維化におけるHS/ヘパリンの効果がまた細胞にも適用可能であるかどうかを調査するために、解離TTRを、48時間、チャイニーズハムスター卵巣WT(CHO−WT)細胞及びHS欠損(CHO−pgsD−677)細胞の培養物と共にインキュベートした(19)。インキュベーションの後に、細胞は、遊離TTRを除去するためにPBS中で十分に洗浄した。細胞溶解産物のThT蛍光分析は、HS欠損CHO−pgsD−677細胞と比較して、CHO−WT細胞における実質的な量のアミロイド様線維を明らかにし(図11A)、TTR線維化に対するHSの効果を実証した。抗TTR抗体による細胞の免疫細胞染色は、HS欠損細胞(CHO−pgsD−677)における極微量のポジティブ免疫シグナルを検出し、それに比べて、CHO−WT細胞において、強いポジティブシグナルが見られた(図11B)。
TTR線維化に対するヘパリンの効果をインビボにおいて評価するために、発明者らは、ヒトTTRの遺伝子操作突然変異体形態を発現する形質転換ショウジョウバエモデルを用いた(16、20)。形質転換ハエは、ヘパリン又は低分子量ヘパリン(Klexane(登録商標)を補足した又は補足していない標準的な培地で飼育した。生理食塩水中に抽出したハエ頭部溶解産物のThT蛍光分析(方法を参照されたい)は、ヘパリンを補足して給餌したハエが、ThT−ポジティブアミロイド様線維を生成したが、添加剤を全く与えなかった又はKlexane(登録商標)を与えたハエは、いかなる線維をも生成しなかったことを示した(図12A)。ヘパリンを給餌したハエ頭部における実質的な線維形成の観察に確証を与えるために、頭部溶解産物を、アルシアンブルーにより染色したドットブロットによって分析した(図12B)。ヘパリンを給餌したハエ由来の頭部溶解産物における強い染色が観察されたが、対照のハエ又はKlexaneを給餌したハエ由来の対応する試料において染色は検出されなかった。ヘパリン補足培地上で培養したTTR形質転換ハエの頭部から調製した切片の免疫組織染色は、網膜におけるTTR及びヘパリンの同時染色を明らかにした(図15D;E、TTR及びヘパリンの同時沈着物質の3D画像)。通常の培地で飼育した形質転換ハエから調製した切片(図15F)も、ヘパリン補足培地で飼育した非形質転換ハエから調製した切片(図15G)も、網膜において、TTR及びヘパリンについての同時染色を示さなかった。
Claims (22)
- TTRアミロイドーシスを診断するための方法であって、
(a)ヒト対象由来の体液試料を準備するステップ、
(b)前記体液におけるTTRの濃度を決定するステップ、
(c)ステップ(b)において決定されるTTR濃度が対照試料よりも高い場合、前記ヒト対象がTTRアミロイドーシスに罹患している又はそれを発症する危険性が高いと決定するステップを含む、上記方法。 - 前記体液が、血漿及び脊髄液からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記体液中の前記TTRが、単量体形態である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記TTRが、四量体形態である、請求項1又は2に記載の方法。
- ステップa)及びb)の間にさらなるステップを含み、前記試料が、TTR四量体を単量体に解離させるために、pH2.7のような低pHにさらされる、請求項に記載の方法。
- TTRの濃度が、抗TTR抗体を使用することによって決定される、請求項3〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、配列番号1に示されるTTRのアミノ酸24〜35、50〜61、若しくは10〜24、又はその任意の組み合わせに選択的に結合する、請求項6に記載の方法。
- 前記TTRアミロイドーシスが、家族性アミロイド多発ニューロパチー、家族性心アミロイドーシス、及び散発性老人性全身性アミロイドーシスからなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- a)抗TTR抗体及び
b)体液試料中のTTRの発現レベルを検出するための1つ又は複数の試薬を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキット。 - 抗HS抗体をさらに含む、請求項9に記載のキット。
- 前記1つ又は複数の試薬が、二次抗体及びアルカリホスファターゼ(AP)、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、又は他の酵素レポーター系に対する比色定量基質、化学発光基質、又は化学蛍光基質からなる群から選択される、請求項9又は10に記載のキット。
- TTRとヘパラン硫酸(HS)との相互作用を妨害することができる有効量の薬剤を投与することによって、その必要のある患者においてトランスサイレチン(TTR)アミロイドーシスを予防、軽減、及び/又は治療するための方法。
- 前記薬剤が、ヘパラン硫酸オリゴ糖、ヘパラン硫酸多糖、非抗凝血性ヘパリンオリゴ糖、非抗凝血性ヘパリン多糖、及びそのミメティックからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記薬剤が、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むTTRペプチド又はその断片である、請求項12に記載の方法。
- 前記薬剤が、抗TTR抗体である、請求項12に記載の方法。
- 前記TTRアミロイドーシスが、家族性アミロイド多発ニューロパチー、家族性心アミロイドーシス、及び散発性老人性全身性アミロイドーシスからなる群から選択される、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
- TTRアミロイドーシスの予防、軽減、及び/又は治療において使用するための、HSとTTRとの間の相互作用を妨害することができる薬剤。
- 前記薬剤が、ヘパラン硫酸オリゴ糖、ヘパラン硫酸多糖、非抗凝血性ヘパリンオリゴ糖、非抗凝血性ヘパリン多糖、及びそのミメティックからなる群から選択される、請求項17に記載の薬剤。
- 前記薬剤が、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むTTRペプチド又はその断片である、請求項17に記載の薬剤。
- 前記薬剤が、抗TTR抗体である、請求項17に記載の薬剤。
- 前記TTRアミロイドーシスが、家族性アミロイド多発ニューロパチー、家族性心アミロイドーシス、及び散発性老人性全身性アミロイドーシスからなる群から選択される、請求項17〜20のいずれか一項に記載の薬剤。
- HSとTTRとの間の相互作用を妨害することができる薬剤並びに薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
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