WO2021132703A1 - 脂質蓄積病を治療するための医薬組成物 - Google Patents

脂質蓄積病を治療するための医薬組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2021132703A1
WO2021132703A1 PCT/JP2020/049046 JP2020049046W WO2021132703A1 WO 2021132703 A1 WO2021132703 A1 WO 2021132703A1 JP 2020049046 W JP2020049046 W JP 2020049046W WO 2021132703 A1 WO2021132703 A1 WO 2021132703A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cyd
pharmaceutical composition
brain
lac
lactose
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/049046
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
敬一 本山
大志 東
理沙子 小野寺
龍馬 横山
拓実 西田
徹美 入江
洋一 石塚
Original Assignee
国立大学法人熊本大学
日本食品化工株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/JP2019/051421 external-priority patent/WO2020138421A1/ja
Application filed by 国立大学法人熊本大学, 日本食品化工株式会社 filed Critical 国立大学法人熊本大学
Priority to JP2021567755A priority Critical patent/JPWO2021132703A1/ja
Publication of WO2021132703A1 publication Critical patent/WO2021132703A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
    • A61K31/724—Cyclodextrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating a lipid accumulation disease.
  • NPC Niemann-Pick's disease type C
  • lipids such as free cholesterol are transferred to the late endosome / lysosome system (endolysosome) due to abnormalities in NPC1 which is a membrane protein or NPC2 which is a soluble protein. It is characterized by accumulating.
  • NPC1 which is a membrane protein or NPC2 which is a soluble protein. It is characterized by accumulating.
  • the incidence of NPCs is about 1 in 150,000 and about 95% of patients are due to the NPC1 gene. Mutations in the NPC1 gene have been found in about 500 families worldwide. There are an estimated 150 patients in Japan.
  • the main symptoms of NPC vary depending on the time of onset, but neurological symptoms and hepatosplenomegaly are observed in all age groups. That is, the target tissues are the brain and the liver.
  • Non-Patent Document 1 Liu B. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009; 106 (7): 2377-82
  • Non-Patent Document 2 Ory DS et al., Lancet. 2017; 390 (10104): 1758-1768).
  • Non-Patent Document 3 Yin-Hsiu Chien et al., Mol Genet Metab. 2013; 109 (2): 231-2
  • Patent Document 2 Yin-Hsiu Chien et al., Mol Genet Metab. 2013; 109 (2): 231-2
  • Patent Document 4 Matsuo M. et al., Mol. Genet. Metab.
  • the present inventors further synthesized lactose-modified HP- ⁇ -CyD (Lac-HP- ⁇ -CyD) and evaluated the blood-brain barrier (BBB) permeability in vitro and the brain transferability in vivo. As a result, it was found that BBB permeability and the amount of blood-brain transfer were observed, and a patent application was filed (Japanese Patent Application No. 2018-2455538).
  • Alzheimer's disease is known as a lipid accumulation disease, and it has been reported that an increase in cholesterol occurs in brain cells, inhibits autophagosome-lysosomal fusion, and lowers the clearance of amyloid ⁇ (non-patent literature).
  • 6 Nixon RA et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 2005, 64, 113-122
  • Non-Patent Document 7 Barbero-Camps E. et al., Autopagy, 2018, 14, 1129-1154).
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating a lipid accumulation disease. More specifically, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for treating a lipid accumulation disease showing a therapeutic effect by at least improving lipid accumulation in the brain.
  • the present invention includes the following.
  • a pharmaceutical composition for this purpose wherein the compound is at least transferred into the brain when administered in vivo.
  • the pharmaceutical composition according to the above [1], wherein the transfer of the compound into the brain includes the transfer of the compound into nerve cells in the brain in addition to the permeation of the blood-brain barrier. ..
  • [12] Treatment of lipid accumulation in the brain containing a compound selected from the group consisting of lactose-modified hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin and lactose-modified hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition according to the above [12] which is administered intravenously or subcutaneously.
  • a method for treating lipid accumulation disease which is a therapeutically effective amount of lactose-modified hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin or lactose-modified hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin for patients with lipid accumulation disease. , At least in the brain.
  • the therapeutic method according to the above [21], wherein the administration of the compound into the brain is performed via the passage of the compound through the blood-brain barrier.
  • the therapeutic method according to the above [21] or [22], wherein the compound is administered intravenously or subcutaneously.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for lipid accumulation diseases.
  • Each value is the average of 3 experiments ⁇ S. E. is shown. This is the result of confirming the transferability of Lac-HP- ⁇ -CyD intravenously injected into mice to each organ. This is the result of observing the fluorescence of each excised organ with an in vivo imaging system (IVIS) (Ex: 535 nm, Em: DsRed). It shows a typical image of three experiments. This is the result of confirming the transferability of Lac-HP- ⁇ -CyD subcutaneously administered to an AD model mouse (App NL-GF mouse) to each organ. This is the result of observing the fluorescence of each excised organ by IVIS. The figure on the left shows a typical image of the three experiments.
  • IVIS in vivo imaging system
  • the figure on the right is a graph showing the results of the fluorescence intensity of each organ.
  • the figure on the left is the result observed by IVIS, and the figure on the right is the result of measuring the fluorescence intensity with a microreader. It shows a typical image of four experiments.
  • Each number is the average of 15-17 mice per group ⁇ S. E. is shown.
  • * Indicates p ⁇ 0.05 when compared with saline, and + indicates p ⁇ 0.01 when compared with HP- ⁇ -CyD. It is the result of the Burns maze test using the AD model mouse.
  • A is the time spent on the target up to the 4th day
  • B is the time stayed in each area (TQ, LQ, OQ, RQ) on the 5th day
  • C is the time stayed on the target on the 5th day.
  • Time indicates the time spent in each region (TQ, LQ, OQ, RQ) on the 9th day
  • E indicates the time spent on the target on the 9th day.
  • Each number is the average of 15 mice per group ⁇ S. E. is shown. * Indicates p ⁇ 0.05 when compared with saline, and + indicates p ⁇ 0.01 when compared with HP- ⁇ -CyD. This is the result of confirming the effect of Lac-HP- ⁇ -CyD on cholesterol in the brain using AD model mice. Each value is the average of 3 experiments ⁇ S. E. is shown. * Indicates p ⁇ 0.05 when compared with saline. This is the result of confirming the effect of Lac-HP- ⁇ -CyD on free cholesterol in the brain using AD model mice. Each value is the average of 3 experiments ⁇ S. E. is shown. * Indicates p ⁇ 0.05 when compared with saline.
  • X to Y when used, it is used as a lower limit to include Y with X as the upper limit, or as an upper limit to include Y with X as the lower limit.
  • the term "about” is used to mean that ⁇ 10% is allowed.
  • Lactose-modified hydroxyproprucyclodextrin ⁇ -cyclodextrin ( ⁇ -CyD) and ⁇ -cyclodextrin ( ⁇ -CyD) are oligosaccharides in which 7 or 8 glucoses are cyclically linked.
  • Hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (HP- ⁇ -CyD) hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (HP- ⁇ -CyD) (Hereinafter, unless the context clearly indicates which one is used herein).
  • hydroxypropyl-cyclodextrin HP-CyD
  • ⁇ -cyclodextrin or ⁇ -cyclodextrin ⁇ -cyclodextrin
  • the hydroxyl groups at positions 2, 3 and 6, preferably the hydroxyl groups at positions 2 and 6 of the glucose skeleton of "cyclodextrin (CyD)" are randomly substituted with hydroxypropyl groups, preferably 2-hydroxypropyl groups. ..
  • the number of modifications of the hydroxypropyl group is expressed as the average degree of substitution per molecule of HP-CyD.
  • the average degree of substitution is not particularly limited, and examples thereof include 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, and 9, and in general, the average degree of substitution is 4. It is about 8 pieces.
  • CyD in which an average of 4 hydroxyl groups is substituted with a hydroxypropyl group is referred to as HP-CyD (DS 4). Modification of CyD with a hydroxypropyl group can be carried out by appropriately referring to a known method. Also, since HP-CyD is commercially available, you can purchase it and use it.
  • Lactose-modified HP- ⁇ -CyD (Lac-HP- ⁇ -CyD) or lactose-modified HP- ⁇ -CyD (Lac-HP- ⁇ -CyD) that can be used in the present invention (hereinafter referred to as the present invention).
  • lactose-modified hydroxypropyl cyclodextrin (Lac-HP-CyD)) is collectively referred to as HP- ⁇ -CyD or HP- ⁇ -CyD, unless the context clearly indicates which one.
  • Lac-HP-CyD Randomly one, two or more hydroxyl groups at the 2, 3 and 6 positions of glucose or hydroxyl groups at the hydroxypropyl group, preferably 2- or 6-position hydroxyl groups of glucose, more preferably 6-position hydroxyl groups of glucose. It has been replaced with lactose.
  • the number of lactose modifications is expressed as the average degree of substitution per molecule of Lac-HP-CyD.
  • the average degree of substitution of lactose is not particularly limited, but is at least 2 or more, preferably 4 or more, and more preferably 8 or more.
  • Lac-HP-CyD is preferably Lac-HP- ⁇ -cyclodextrin.
  • FIG. 1 schematically shows an example of HP-CyD modified with lactose.
  • Lac-HP-CyD having a hydroxypropyl group substitution degree of 4 and a lactose substitution degree of 2, 4 and 8 is exemplified.
  • HP-CyD with lactose can be performed with reference to known reports.
  • ethylenediamine is added to HP- ⁇ -CyD dissolved in DMSO and reacted with CDI to form a urethane bond between the hydroxyl group of glucose or hydroxypropyl group and ethylenediamine to form NH.
  • 2- HP- ⁇ -CyD (ethylenediamine) is obtained. It is dissolved in DMSO again, sodium cyanoborohydride and lactose are added and reacted, and it is modified with lactose by performing a reductive amination reaction between the amino group of ethylenediamine and the hydroxyl group at the 1-position of lactose.
  • HP- ⁇ -CyD can be obtained.
  • lactose can be attached to HP-CyD using any other linker.
  • lactose modification can be easily performed on highly reactive functional groups such as amino groups and carboxyl groups present in cyclodextrin, and even when those groups are used, an arbitrary linker can be used.
  • HP-CyD can also be bound to lactose.
  • lactose-modified hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin or lactose-modified hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin is referred to as a group contained in HP- ⁇ -CyD or HP- ⁇ -CyD.
  • a group contained in HP- ⁇ -CyD or HP- ⁇ -CyD it means that the lactose molecule is directly bonded to (hydroxyl group), the lactose molecule is bonded via an atomic group for bonding, and the lactose molecule is bonded via a linker.
  • lactose is bonded to HP-CyD by modifying HP-CyD with an arbitrary group and lactose is bonded via the group is mentioned, for example, via an atomic group for bonding. be able to.
  • the lactose-modified HP-CyD can also be modified with PEG or the like, which is also included in the lactose-modified HP-CyD of the present invention.
  • Modification with PEG can be performed by binding PEG to HP-CyD using a known method. By modifying PEG, improvement of blood retention can be expected.
  • Lac-HP-CyD used in the pharmaceutical composition or therapeutic method of the present invention is characterized by being transferred to nerve cells in the brain through the blood-brain barrier and reducing intracellular lipids. Have. Because of these characteristics, the pharmaceutical composition of the present invention containing Lac-HP-CyD as an active ingredient can be used as a pharmaceutical for the treatment of lipid accumulation diseases, preferably sphingolipidoses and Alzheimer's diseases. Sphingolipidoses include, but are not limited to, Niemann-Pick's disease, GM1 and GM2 gangliosidosis, Fabry's disease, Gaucher's disease, Farber's disease, Clave's disease, and allogenic leucodistrophy. The composition is particularly preferably used for the treatment of Niemann-Pick's disease type C disease or Alzheimer's disease.
  • Lac-HP-CyD drugs having a medicinal effect in the brain that can be used together with Lac-HP-CyD are Lac as an active ingredient in the pharmaceutical composition for the treatment of lipid accumulation disease.
  • HP-CyD it means a drug showing a medicinal effect that assists the use.
  • a substance in which the drug itself has a physiological activity in the brain hereinafter, may be simply referred to as a physiologically active substance
  • the physiologically active substance include, but are not limited to, low molecular weight compounds, polypeptides, oligopeptides, proteins and nucleic acids.
  • drugs that can be used to treat sphingolipidosis and Alzheimer's disease can be mentioned.
  • a drug that can improve the condition in the brain in addition to reducing the accumulation of lipids for example, a drug having an anti-inflammatory effect for suppressing inflammation in the brain, an antibacterial drug for treating infectious diseases in the brain.
  • drugs that are the active ingredients of antiviral drugs for example, a drug having an anti-inflammatory effect for suppressing inflammation in the brain, an antibacterial drug for treating infectious diseases in the brain.
  • drugs that are the active ingredients of antiviral drugs are the active ingredients of antiviral drugs.
  • low-molecular-weight compound examples include low-molecular-weight drugs that can be used for the treatment of sphingolipidosis and Alzheimer's disease.
  • low-molecular-weight drugs that can be used for the treatment of sphingolipidosis and Alzheimer's disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when used for the treatment of Niemann-Pick disease type C, miglustat, curcumin, vorinostat, and arimochromol can be mentioned.
  • a complex of these low molecular weight compounds and Lac-HP-CyD can be formed using known methods and can be administered as a single pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used for the treatment of Alzheimer's disease, donepezil, rivastigmine, galantamine, and memantine can be mentioned.
  • a complex of these low molecular weight compounds and Lac-HP-CyD can be formed using known methods and can be administered as a single pharmaceutical composition. Since Lac-HP-CyD, which is the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, crosses the blood-brain barrier and is transferred into nerve cells in the brain, low molecular weight compounds which are other drugs used together are also included. It can be expected to be efficiently transported to nerve cells in the brain and exhibit enhanced drug efficacy.
  • Examples of the above-mentioned peptides include bioactive peptides that can be used for the treatment of sphingolipidoses and Alzheimer's disease.
  • a complex of these peptides and Lac-HP-CyD can be formed using known methods and can be administered as a single pharmaceutical composition. Since Lac-HP-CyD, which is the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, crosses the blood-brain barrier and is transferred into nerve cells in the brain, peptides, which are other drugs used together, can also be efficiently used. It is expected to be transported to nerve cells in the brain and exhibit enhanced drug efficacy.
  • nucleic acid examples include nucleic acids used for the treatment of sphingolipidosis and Alzheimer's disease.
  • examples include, but are not limited to, nucleic acids for the treatment of diseases by gene knockdown method or using RNA interference, such as antisense nucleic acids (DNA and RNA), heteroduplex nucleic acids, siRNA and shRNA. Can be done.
  • nucleic acids used for the therapeutic purpose of heterozygous muscular dystrophy can be mentioned.
  • a complex of these nucleic acids and Lac-HP-CyD can be formed using known methods and can be administered as a single pharmaceutical composition.
  • Lac-HP-CyD which is the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, crosses the blood-brain barrier and is transferred into nerve cells in the brain, nucleic acids, which are other drugs used together, can also be efficiently used. It is expected to be transported to nerve cells in the brain and exhibit enhanced drug efficacy.
  • proteins used for the treatment of sphingolipidosis and Alzheimer's disease examples include, but are not limited to, enzymes, antibodies, transcription factors, or specific parts that make up them, that bind to a target and exert physiological activity in the brain.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used for Gaucher's disease and Fabry's disease, the enzyme used in enzyme replacement therapy for those diseases can be mentioned.
  • antibodies against amyloid ⁇ can be given.
  • a complex of these proteins and Lac-HP-CyD can be formed using known methods and can be administered as a single pharmaceutical composition.
  • the protein and / or Lac-HP-CyD may be chemically modified and optionally bound to each other via a spacer.
  • the protein and Lac-HP-CyD may be bound non-covalently, for example, electrostatically. Since Lac-HP-CyD, which is the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, crosses the blood-brain barrier and is transferred into nerve cells in the brain, proteins, which are other drugs used together, can also be efficiently used. It is expected to be transported to nerve cells in the brain and exhibit enhanced drug efficacy.
  • the pharmaceutical composition containing Lac-HP-CyD of the present invention as an active ingredient can be formulated and administered according to a known method. For example, it can be administered parenterally or orally to humans as a liquid or as a pharmaceutical composition of a suitable dosage form. Examples of the parenteral administration method include injections.
  • the pharmaceutical composition comprising the complex of the present invention is preferably administered parenterally.
  • the parenteral administration method is not limited to this, and examples thereof include intravenous administration and subcutaneous administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can appropriately contain any component as long as the medicinal effect is not impaired.
  • Optional ingredients include, but are not limited to, cross-linking agents, solubilizers, emulsifiers, moisturizers, refreshing agents, inorganic powders, antioxidants, preservatives, colorants, flavoring agents, pH adjusters, stables. You can give an agent.
  • the dose of Lac-HP-CyD, which is the active ingredient of the present invention, to humans is appropriately determined according to the age, body weight, condition, sex, administration method, and other conditions of the administration subject.
  • the dose may be from about 0.1 g / kg to about 20 g / kg, preferably from about 1 g / kg to about 10 g / kg per day.
  • the method of administering Lac-HP-CyD which is the active ingredient of the present invention, is appropriately determined according to the condition of the subject to be administered, the purpose of administration, and the method of administration.
  • the administration interval is not limited to this, and examples thereof include daily, every other day, every two days, once a week, and twice a week, preferably once or twice a week.
  • the administration period is not limited to this, and examples thereof include administration for several weeks to one or two months, several months to half a year, or several years. In the case of long-term administration, it is preferable to administer once or twice a week for several weeks to one or two months, followed by a drug holiday, and then again.
  • Example 1 Production of Lac-HP- ⁇ -CyD
  • HP- ⁇ -CyD 10 g
  • DMSO DMSO
  • CDI 9.8 g
  • 10 g of the obtained NH 2- HP- ⁇ -CyD (ethylenediamine) was dissolved in DMSO
  • sodium cyanoborohydride 100 g
  • lactose monohydrate 472 g
  • the lactose molar ratio to NH 2- HP- ⁇ -CyD is 1: 100. After freeze-drying, this product was obtained. The MALDI-TOF MS spectrum and 1 H-NMR spectrum of the obtained sample were measured. The results are shown in FIG. When calculated from the results of 1 1 H-NMR using their integrated values, Lac-HP- ⁇ -CyD having an average lactose substitution degree of about 8 was obtained. Similarly, however, the lactose molar ratio to NH 2 -HP- ⁇ -CyD is arbitrarily adjusted between 1:50 and 1: 200 to produce Lac-HP- ⁇ -CyD with various lactose substitution degrees. did.
  • Lac-HP- ⁇ -CyD having a lactose substitution degree of 2, 4, and 8 could be obtained.
  • the following experiments were performed using Lac-HP- ⁇ -CyD with lactose substitutions of 2, 4, and 8.
  • Example 2 Confirmation of permeability of Lac-HP- ⁇ -CyD in an in vitro blood-brain barrier model Using an in vitro blood-brain barrier model, the time-dependent permeation amount of Lac-HP- ⁇ -CyD is as follows. I confirmed it in this way. Lac-HP- ⁇ -CyD with lactose substitutions of 2, 4, and 8 and the control HP- ⁇ -CyD were labeled with a HiLyte fluorescent dye according to the manufacturer's manual. The following experiments were carried out using these.
  • HCMEC / D3 cells which are human cerebral vascular endothelial cells, are seeded at 1.0 ⁇ 10 5 cells / well in the upper layer of the transwell, while SH-SY5Y cells, which are human neuroblasts, are 1.0 ⁇ 10 in the lower layer. Seed at 5 cells / well and cultured at 37 ° C. in a CO 2 incubator for 7 days to prepare an in vitro BBB model. The barrier function of BBB was confirmed by measuring the intradermal electrical resistance (TEER value). After adding fluorescently labeled Lac-HP- ⁇ -CyD (0.1 mM) to the upper layer, the medium on the lower layer side is sampled over time (5, 15, 30, 60 minutes) and the fluorescence is measured.
  • TEER value intradermal electrical resistance
  • the membrane permeability of Lac-HP- ⁇ -CyD was evaluated.
  • the results of the permeability of the hCMEC / D3 cell monolayer are shown in FIG.
  • the permeation amount of Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL8) increased significantly with time.
  • the results are shown in the figure on the right. It was shown that the membrane permeability coefficient of Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL8) was about 30 times higher than that of HP- ⁇ -CyD.
  • Example 3 Confirmation of competitive inhibition by lactose Whether or not the permeation of the hCMEC / D3 cell monolayer of Lac-HP- ⁇ -CyD in the in vitro BBB model is specifically competitively inhibited by lactose is as follows. I confirmed it. Using the in vitro BBB model described in Example 2, fluorescently labeled Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL8) was added to glucose (4 mM), the GLUT inhibitor floretin (1 mM), or at a temperature of 37 ° C. The membrane permeability was evaluated by adding lactose (4 mM) to the upper layer, sampling the medium on the lower layer side over time (5, 15, 30, 60 minutes), and measuring the fluorescence.
  • DSL8 fluorescently labeled Lac-HP- ⁇ -CyD
  • Example 4 Confirmation of intraneuronal uptake of Lac-HP- ⁇ -CyD after BBB permeation Using the in vitro BBB model described in Example 2, after permeating the hCMEC / D3 cell monolayer, the lower SH- Lac-HP- ⁇ -CyD taken up into SY5Y cells was observed with a confocal laser scanning microscope and confirmed by flow cytometry. As a result of observation with a microscope, it was confirmed that Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL8) had a remarkable uptake as compared with HP- ⁇ -CyD and Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL2 and DSL4). The amount of uptake was DSL2 ⁇ DSL4 ⁇ DSL8. The results of flow cytometry are shown in FIG.
  • Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL8) having a lactose substitution degree of 8 was used as the Lac-HP- ⁇ -CyD.
  • Example 5 Confirmation of cytotoxicity and effect on blood-brain barrier tight junction
  • hCMEC / D3 cell monolayers were equilibrated in EBM-2 medium (37 ° C., 2.0 mL on the apical side, 2.0 mL on the basic side).
  • EBM-2 medium 37 ° C., 2.0 mL on the apical side, 2.0 mL on the basic side.
  • Each of the labeled HP- ⁇ -CyD or Lac-HP- ⁇ -CyD was dissolved in the medium to a concentration of 10 ⁇ M, preheated to 37 ° C., and then replaced with the upper medium.
  • the effect on tight junctions was evaluated by measuring the intradermal electrical resistance (TEER) of the single layer. As shown in FIG. 7B, none of them reduced the tight junctions of the cells. From the above, it was confirmed that Lac-HP- ⁇ -CyD does not cause cell damage at the blood-brain barrier and is superior to HP- ⁇ -CyD in safety.
  • Example 6 Confirmation of organ migration of Lac-HP- ⁇ -CyD (1)
  • the Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL8) and HP- ⁇ -CyD produced in Example 1 were labeled with a HiLyte fluorescent dye according to the manufacturer's manual and used in the following experiments.
  • Labeled Lac-HP- ⁇ -CyD or HP- ⁇ -CyD were intravenously injected into the tails of 8-week-old male BALB / c mice at 7.2 ⁇ mol / kg, respectively. After 60 minutes, the mice were euthanized and perfused with PBS to recover each organ (brain, heart, lungs, liver, kidneys, spleen). Each excised organ was observed in an in vitro image spectrum (IVIS).
  • IVIS in vitro image spectrum
  • Example 7 Confirmation of organ migration of Lac-HP- ⁇ -CyD (2)
  • App NL-GF male mouse 7 months old, 30 g
  • the labeled Lac-HP- ⁇ -CyD or HP- ⁇ -CyD was subcutaneously administered so as to be 7.2 ⁇ mol / kg, respectively, and the transferability to each organ was confirmed.
  • FIG. Similarly, in Alzheimer's disease model mice, it was confirmed that Lac-HP- ⁇ -CyD was accumulated in the brain and liver, and that Lac-HP- ⁇ -CyD was significantly accumulated in the brain.
  • Example 8 Confirmation of brain migration (1)
  • accumulation of Lac-HP- ⁇ -CyD in the brain 10 minutes after administration was confirmed.
  • the results are shown in FIG. A is an image observed by IVIS, and B is a result of measuring the fluorescence intensity with a microreader.
  • the brain transfer rate of Lac-HP- ⁇ -CyD was 20 times that of HP- ⁇ -CyD, and was about 5.2% of the dose.
  • Example 9 Confirmation of brain migration (2)
  • the accumulation of HF647-labeled Lac-HP- ⁇ -CyD in the brain was confirmed. Early transfer to the brain was confirmed, and transfer to the brain was maximum 1 minute after administration.
  • Example 10 Confirmation of localization in the brain (1) Mice were euthanized 60 minutes after dosing and perfused with PBS to recover the brain in a similar manner to Example 6. The brain was stained with DAPI (blue: stained nuclei), NeuN (green: stained Neuron), and DyLight488 (green: stained cerebral vascular endothelial cells) and used with a confocal laser scanning microscope with HiLyte (red). I observed it.
  • FIG. 11 shows the results of observing fluorescence in tissues including cerebrovascular endothelial cells, cerebral cortex, and hippocampus.
  • HyLyte-HP- ⁇ -CyD fluorescence of HyLyte-HP- ⁇ -CyD was not observed in any of the tissues, but HyLyte-Lac-HP- ⁇ -CyD was confirmed in all tissues. Furthermore, when Lac-HP- ⁇ -CyD was administered, green and red fluorescence were not co-localized, and red fluorescence was observed in addition to vascular endothelial cells. It was confirmed that it significantly penetrated the cerebral blood vessels and transferred to the brain parenchyma.
  • the brain was dipped in the compound and snap frozen on dry ice. Then, it was frozen at ⁇ 80 ° C. After freezing, the brain was sliced to a thickness of 20 mm using a CM3050 Cryostat and immersed in PBS. It was washed with PBS and blocked with 0.3% PBST solution containing 3% Donkey Serum for 1 hour. In the following examples, the steps up to this point may be referred to as a "brain slice preparation step". The cells were washed with PBS, 0.3% PBST solution containing MAP2 (1: 1,000) was added, and the cells were stained at 37 ° C. in the dark for 12 hours.
  • the cells were washed with PBS, treated with a secondary antibody (1: 1,000), and then stained at 37 ° C. in the dark for 3 hours.
  • the cells were washed with PBS, a DAPI (300 nM) solution was added, and the cells were stained at 37 ° C. in the dark for 10 minutes.
  • the cells were washed with PBS, each section was attached to a slide glass, embedded in a marinol solution, and then observed with a confocal laser scanning microscope.
  • the results are shown in FIG.
  • the left figure is the result of the cerebral cortex, and the right figure is the result of the hippocampus.
  • fluorescence of HF647-HP- ⁇ -CyD was not observed in any of the tissues, but HF647-Lac-HP- ⁇ -CyD was confirmed in the cerebral cortex and hippocampus.
  • Example 12 Confirmation of brain transferability of a complex of Lac-HP- ⁇ -CyD and another compound Lac-HP- ⁇ -CyD, which is an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, is used together with other drugs in the brain. It was confirmed as follows whether the transition to the inside was efficient.
  • the Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL8) or HP- ⁇ -CyD produced in Example 1 together with the fluorescent substance TPPS was added to BALB / of an 8-week-old male to a concentration of 5.8 ⁇ mol / kg, respectively.
  • TPPS fluorescent substance
  • the removed brain was observed with IVIS, and the fluorescence intensity was measured with a microreader. The results are shown in FIG. Compared with HP- ⁇ -CyD, it was confirmed that Lac-HP- ⁇ -CyD translocates to the brain together with other substances.
  • the brain transfer rate of Lac-HP- ⁇ -CyD was about 9 times that of HP- ⁇ -CyD, and was about 4.0% of the dose.
  • Example 13 Confirmation of blood biochemical test values after intravenous administration of Lac-HP- ⁇ -CyD (Example 13-1) Effect on wild-type mice Lac-HP- ⁇ -CyD produced in Example 1 (DSL8) and HP- ⁇ -CyD were intravenously injected into the tails of 8-week-old male BALB / c mice at 0.7 mmol / kg, respectively. Twenty-four hours later, blood was collected and measurements were taken for various biochemical test items. Saline was administered as a control. The results are shown in FIG. The group administered with Lac-HP- ⁇ -CyD showed no effect on the blood biochemical test values as compared with the group administered with physiological saline, confirming that it was safe.
  • Example 13-2 Effect on NPC model mice 20 ⁇ L / kg of physiological saline containing HP- ⁇ -CyD or Lac-HP- ⁇ -CyD was added to 4-week-old wild-type mice (WT) and BALB / c Nctr. -Npc1 m1N (Npc1 -/- ) mice were subcutaneously administered every other week to 8 weeks of age so that the dose was 1.4 mmol / kg. Blood was collected from the subabdominal aorta 72 hours after the fifth administration. Blood was collected by centrifugation. Each blood biochemical parameter was quantified by Fuji Drychem 7000 "Z". The results are shown in FIG. Lac-HP- ⁇ -Cy for NPC model mice
  • Example 14 Confirmation of uptake of Lac-HP- ⁇ -CyD into NPC cell-like neurons U18666A (progesterone), a steroid derivative, inhibits intracellular cholesterol transport and is a free cholesterol similar to NPC cells. Causes accumulation.
  • SH-SY5Y cells treated with U18666A the intracellular uptake of Lac-HP- ⁇ -CyD was measured as follows. Lac-HP- ⁇ -CyD with lactose substitutions of 2, 4, and 8 and the control HP- ⁇ -CyD synthesized in Example 1 were labeled with the HF647 fluorescent dye according to the manufacturer's manual. The following experiments were carried out using these.
  • SH-SY5Y cells ( 5x10 5 cells) were cultured in U18666A (1.25 ⁇ M) -containing medium at 37 ° C. for 48 hours. Thereafter, the addition SH-SY5Y cells (1x10 4 cells) HF647-Lac-HP- ⁇ -CyD treated with U18666A (DSL2,4, and 8) or HF647-HP- ⁇ -CyD at a concentration of 0.1mM, respectively In the culture medium, the cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours. The fluorescence intensity in the cells was measured using a BZ-II analyzer. The results are shown in FIG. The figure on the right shows the average fluorescence intensity. The amount of uptake increased as the degree of lactose substitution increased, and remarkable uptake was confirmed in DSL8.
  • Example 17 Confirmation of effect on the amount of free cholesterol in endolysosomes Using SH-SY5Y cells treated with U18666A, the effect of Lac-HP- ⁇ -CyD on the free cholesterol accumulated in the cells was confirmed.
  • SH-SY5Y cells (1x10 4 cells) treated with U18666A were treated with Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL2, 4, and 8) or HP-.
  • the cells were fixed with 4% PFA for 10 minutes.
  • FIG. 20 shows the observation results with a confocal microscope
  • FIG. 21 shows the amount of cholesterol in the endolysosome calculated from the fluorescence intensity measured using the BZ-II analyzer. From the observation with a confocal microscope, it was confirmed that Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL8) showed a remarkable decrease in the amount of accumulated cholesterol as compared with Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL2 and DSL4). The effect of reducing accumulated cholesterol was DSL2 ⁇ DSL4 ⁇ DSL8.
  • Example 18 Confirmation of competitive inhibition by lactose on reduction of free cholesterol amount in endolysosome by Lac-HP- ⁇ -CyD Endolysosome by Lac-HP- ⁇ -CyD using SH-SY5Y cells treated with U18666A It was confirmed whether or not the effect of reducing the amount of internal free cholesterol was competitively inhibited by lactose.
  • SH-SY5Y cells (1x10 4 cells) Lac-HP- ⁇ -CyD ( DSL8) treated with U18666A or HP- ⁇ -CyD, respectively
  • the culture medium added at a concentration of 0.1 mM, the cells were cultured at 37 ° C.
  • FIG. 22 shows the observation results with a confocal microscope
  • FIG. 23 shows the amount of cholesterol in the endolysosome calculated from the fluorescence intensity measured using the BZ-II analyzer.
  • lactose inhibited the effect of reducing the accumulated cholesterol amount of Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL8).
  • Example 19 Confirmation of cytotoxicity to nerve cells Cytotoxicity was confirmed by culturing SH-SY5Y cells treated with U18666A in the presence of various concentrations of Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL8). As a control, HP- ⁇ -CyD was used. The results are shown in FIG. 24A. It was found that Lac-HP- ⁇ -CyD has significantly lower cytotoxicity to NPC-like nerve cells than HP- ⁇ -CyD, and is excellent in safety. In addition, using SH-SY5Y cells, the effect on cholesterol leakage from the cell plasma membrane was confirmed.
  • SH-SY5Y cells treated with U18666A were cultured for 1 hour in the presence of 30 mM Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL8), and then using cholesterol E-test Wako (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the manufacturer. Cholesterol leakage was measured according to the manual. As controls, saline (control) and HP- ⁇ -CyD (30 mM) were used. The result is shown in FIG. 24B. It was shown that Lac-HP- ⁇ -CyD has a significantly lower cholesterol-leaving effect from the cytoplasmic membrane in NPC-like neurons than HP- ⁇ -CyD.
  • Example 20 Confirmation of the effect of Lac-HP- ⁇ -CyD using an NPC mouse model
  • the therapeutic effect of Lac-HP- ⁇ -CyD was confirmed using an NPC mouse model as follows. Using NPC model mice (Npc1 -/- ) (BALB / c, 4 weeks old, donated by Dr. Kosaku Ohno and Dr. Katsumi Higaki of Tottori University, and bred at Kumamoto University), Lac-HP- ⁇ -CyD ( 1.4 nmol / kg, 6,079 mg / kg) or HP- ⁇ -CyD (1.4 nmol / kg, 2,000 mg / kg) was subcutaneously administered once a week from 4 to 9 weeks of age (6 in total). Dosing).
  • saline was administered to NPC model mice and wild-type mice (BALB / c, 4 weeks old). As mice, 5-7 mice (2-4 males and 3 females) were used for each condition. Weight measurement, Beam Walking Test, and survival rate were evaluated.
  • the results of body weight measurement from the 4th week to the 10th week in the NPC model mouse are shown in FIG. Lac-HP- ⁇ -CyD was shown to significantly suppress weight loss in NPC model mice compared to HP- ⁇ -CyD.
  • the results of the beam walking test from the 4th week to the 7th week in the NPC model mouse are shown in FIG. Lac-HP- ⁇ -CyD was shown to significantly improve motor dysfunction in NPC model mice compared to HP- ⁇ -CyD.
  • the results of survival rate in NPC model mice are shown in FIG. 27. Lac-HP- ⁇ -CyD has been shown to significantly prolong survival in NPC model mice compared to HP- ⁇ -CyD.
  • Example 21 Effect of Lac-HP- ⁇ -CyD on intracellular accumulation of amyloid ⁇ Using SH-SY5Y cells treated with U18666A, which induces intracellular cholesterol accumulation, amyloid ⁇ accumulating in cells is used. It was measured. SH-SY5Y cells ( 5x10 5 cells) were cultured in a medium supplemented with HiLyte-labeled amyloid ⁇ (150 nM) and U18666A (7.5 ⁇ M) at 37 ° C. for 24 hours, and then the cells were washed with the medium.
  • HiLyte-labeled amyloid ⁇ 150 nM
  • U18666A 7.5 ⁇ M
  • SH-SY5Y cells 1x10 4 cells were cultured with HF647-Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL 8) or HF647-HP- ⁇ -CyD (DS 4.4) added at a concentration of 0.1 mM, respectively.
  • the cells were cultured in the medium at 37 ° C. for 24 hours.
  • PBS was used as a control.
  • cells were stained with cholesterol and endolysosomes using Filipin III and LysoTracker® Red L7528, respectively.
  • the fluorescence of 10 randomly selected cells was observed with a confocal laser scanning microscope. The results are shown in FIG. As shown in FIG.
  • Example 23 Effect of Lac-HP- ⁇ -CyD on autophagy flux p62 / SQSTM1 is degraded by autophagy when cells are normal, but accumulates inside cells when cells are abnormal.
  • SH-SY5Y cells treated with U18666A the effect of Lac-HP- ⁇ -CyD on autophagy flux was confirmed as follows. SH-SY5Y cells were seeded at 1x10 4 cells / dish, cultured at 37 ° C. for 24 hours, and then cultured in a medium containing U18666A (7.5 ⁇ M) for another 24 hours.
  • Cells were treated with 0.1 mM HP- ⁇ -CyD or Lac-HP- ⁇ -CyD (DSL 8) -containing medium for 24 hours, washed with PBS and fixed with 4% PFA for 10 minutes. After washing with PBS, it was treated with Triton X-100 (0.1%) for 10 minutes to perform membrane permeation treatment. Then, immunostaining was performed using an antibody (primary antibody: anti-p62 / SQSTM1 rabbit antibody, secondary antibody (Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG antibody). Then, the nucleus was stained with Hoechst 33342. After staining, confocal. The fluorescence of the secondary antibody and Hoechst 33342 was observed with a laser microscope.
  • FIG. 30 The results are shown in FIG. 30.
  • HP- ⁇ -CyD when HP- ⁇ -CyD was added, the intracellular accumulation of p62 / SQSTM1 was increased. There was no difference from the control.
  • Lac-HP- ⁇ -CyD when Lac-HP- ⁇ -CyD was added, p62 / SQSTM1 was decomposed and an increase in autophagy flux was confirmed.
  • Alzheimer's disease it has been reported that an increase in intracellular cholesterol inhibits autophagosome-lysosomal fusion and reduces the clearance of amyloid ⁇ . Therefore, from the above results, the effect of Lac-HP- ⁇ -CyD on the intracellular accumulation of amyloid ⁇ in Alzheimer's disease was confirmed.
  • Example 24 Confirmation of effect of Lac-HP- ⁇ -CyD using AD mouse model
  • a mouse behavior test was conducted using an AD model mouse (App NL-GF mouse). Behavioral tests were measured by the Y-maze test-short-term memory test and the Burns maze test. Each mouse (7 months old) was acclimatized to the laboratory for about 1 hour. To reduce the effects of circadian rhythms, all behavioral tests were performed on a test bench (100 cm from the floor) with two lights on at the same time intervals (09: 00-18: 00) each day. Each test was photographed by SMART V3.0. After each test, the mice were returned to their home cages, the maze was wiped with 70% ethanol, and then dry wiped. A total of 60-68 mice were used in the behavioral test.
  • Example 24-1 Y-shaped maze test (short-term memory test)
  • Y-shaped maze test short-term memory test
  • a mouse is placed in the center of a Y-shaped maze (length 22 cm, width 5 cm, height 15 cm) with three arms, and different arms are continuously placed for 8 minutes.
  • the rate of entry into was taken as the alternation behavior rate (Alternation, Eq. (2)).
  • Example 24-2 Burns maze test (spatial learning memory test) There are 20 holes on the circumference of the disk, and only one of them has a target (a deep hole with a diameter of 5 cm that the mouse can put inside). The disk was divided into four equal parts, and each area was designated as Target quadrant (TQ), Opposite quadrant (OP), Left quadrant (LP), and Right quadrant (RP). By training for 4 days, the position of the target is memorized and the target is directed from the center of the disk. In the 3-minute training, the mice that could not find the target were once returned to the starting position, guided from the center of the maze to the target, placed in the target box, and left as it was for 1 minute.
  • TQ Target quadrant
  • OP Opposite quadrant
  • LP Left quadrant
  • RP Right quadrant
  • Example 25 Effect of Lac-HP- ⁇ -CyD on total cholesterol in the brain
  • the brain was collected from mice and the amount of cholesterol accumulated in the brain was evaluated. Specifically, it was carried out as follows. A 7-month-old mouse brain was removed and the weight of the brain was measured. The brain was placed in a tube, Cell Lysis Buffer M (1 mL) was added, and the homogenized solution was used as a sample solution. Equal amounts of the sample solution were added to two test tubes, one was filled with cholesterol esterase (TC measurement) and the other was filled with pure water (UC measurement) and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • TC measurement cholesterol esterase
  • UC measurement pure water
  • Example 26 Effect of Lac-HP- ⁇ -CyD on free cholesterol in the brain
  • the brain was collected from mice and the amount of cholesterol accumulated in the brain was evaluated. Specifically, it was carried out as follows. Using 7-month-old mice, the above-mentioned brain slice preparation step was performed to prepare brain slices. Then, the cells were washed with PBS, Filipin III solution (50 ⁇ g / mL) was added, and the cells were stained at 37 ° C. in the dark for 1 hour. After washing with PBS, each section was attached to a slide glass, embedded in a marinol solution, and observed with a confocal laser scanning microscope, free cholesterol was confirmed. The results are shown in FIG. The figure on the left is an image of a microscope, and the figure on the right is a graph showing the fluorescence intensity. Lac-HP- ⁇ -CyD significantly reduced the amount of free cholesterol.
  • Example 27 Effect of Lac-HP- ⁇ -CyD on A ⁇ in the brain (1)
  • the brain was collected from the mouse, and the amount of A ⁇ accumulated in the brain was evaluated. Specifically, it was carried out as follows. Using 7-month-old mice, the above-mentioned brain slice preparation step was performed to prepare brain slices. Then, the cells were washed with PBS, 0.3% PBST solution containing A ⁇ (1: 1,000) was added, and the cells were stained at 37 ° C. in the dark for 12 hours. The cells were washed with PBS, treated with a secondary antibody (Alexa Fluor 488, 1: 1,000), and then stained at 37 ° C. in the dark for 3 hours.
  • a secondary antibody Alexa Fluor 488, 1: 1,000
  • the cells were washed with PBS, a DAPI (300 nM) solution was added, and the cells were stained at 37 ° C. in the dark for 5 minutes.
  • the cells were washed with PBS, each section was attached to a slide glass, embedded in a marinol solution, and then observed with a confocal laser scanning microscope.
  • the result of the image of A ⁇ expression in the brain is shown in FIG.
  • the quantification of the number of A ⁇ plaques was visually counted using the acquired tissue image.
  • the results are shown in FIG.
  • An image confirming the accumulation of A ⁇ in the cerebral cortex and hippocampus is shown in FIG. 37. It was confirmed that Lac-HP- ⁇ -CyD significantly reduced the accumulation of A ⁇ in the cerebral cortex and hippocampus.
  • Example 28 Effect of Lac-HP- ⁇ -CyD on A ⁇ in the brain (2) After performing the behavioral experiment of Example 24, the brain was collected from the mouse, and the amount of A ⁇ accumulated in the brain was evaluated by ELISA. Specifically, it was carried out as follows. A 7-month-old mouse brain was removed and the weight of the brain was measured. The brain was placed in a tube, Cell Lysis Buffer M (1 mL) was added, and the homogenized solution was used as a sample solution. Sample solution (10 mL) was added to 96 well plate with coating buffer. The sample solution was incubated overnight at 4 ° C., washed with PBST, and blocking Buffer was added.
  • the cells were washed with PBST, a 0.05% PBST solution containing A ⁇ (1: 1,000, 50 mL / well) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour under shading.
  • the cells were washed with PBST, treated with secondary antibody (1: 5,000, 50 mL / well), and then incubated at 37 ° C. for 1 hour under shading.
  • the cells were washed with PBST, incubated with 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) solution for 1 hour, and then HCl solution was added.
  • TMB 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • Example 29 Effect of Lac-HP- ⁇ -CyD on glial cells in the brain
  • the brain was collected from mice and the accumulated amount of glial cells in the brain was evaluated. Specifically, it was carried out as follows. Using 7-month-old mice, the above-mentioned brain slice preparation step was performed to prepare brain slices. Then, the cells were washed with PBS, 0.3% PBST solution containing Iba1 and GFAP (1: 1,000) was added, and the cells were stained for 12 hours under shading at 37 ° C. The cells were washed with PBS, treated with a secondary antibody (Alexa Fluor 488, 1: 1,000), and then stained at 37 ° C. in the dark for 3 hours.
  • a secondary antibody Alexa Fluor 488, 1: 1,000
  • the cells were washed with PBS, DAPI solution was added, and the cells were stained at 37 ° C. in the dark for 5 minutes.
  • the cells were washed with PBS, each section was attached to a slide glass, embedded in a marinol solution, and then observed with a confocal laser scanning microscope. The results are shown in FIG. It was confirmed that Lac-HP- ⁇ -CyD significantly reduced the accumulation of microglia.
  • Example 30 Effect of Lac-HP- ⁇ -CyD on hearing
  • a therapeutic dose (2.9 mmol / kg) of Lac-HP- ⁇ -CyD was subcutaneously administered to mice, and the auditory brainstem response of the mice (auditory brainstem response: ABR) inspection was performed.
  • the auditory threshold was measured using ABR System 3 (Tucker-Davis Technologies, FL, USA).
  • ABR was measured in mice under anesthesia.
  • a measurement electrode was placed just below the skin near the head, and a ground electrode was placed just below the back skin.
  • the frequencies were measured at 4, 8, 12, 20 and 32 kHz included in the audible range of the mouse.
  • the auditory threshold at each frequency was defined as the lowest level at which the ABR waveform obtained by changing the sound pressure level at 5 dB intervals could be clearly detected by visual inspection. The results are shown in FIG. It was confirmed that Lac-HP- ⁇ -CyD did not affect hearing.
  • lactose-modified hydroxypropyl cyclodextrin of the present invention is useful as a pharmaceutical composition for the treatment of lipid accumulation diseases.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本発明は、脂質蓄積病を治療するための医薬組成物を提供することを目的とする。より具体的には、少なくとも脳内での脂質蓄積を改善することにより治療効果を示す脂質蓄積病を治療するための医薬組成物を提供することを目的とする。本発明により、ラクトースで修飾されたヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、又はラクトースで修飾されたヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンを有効成分として含む脳内における脂質の蓄積を治療するための医薬組成物であって、前記化合物は、生体内に投与された場合、少なくとも脳内に移行することを特徴とする医薬組成物が提供される。

Description

脂質蓄積病を治療するための医薬組成物
　本発明は、脂質蓄積病を治療するための医薬組成物に関する。
　脂質蓄積病の一つであるニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）は、膜タンパク質であるＮＰＣ１あるいは可溶性タンパク質であるＮＰＣ２の異常により遊離型コレステロールなどの脂質が後期エンドソーム／ライソゾーム系（エンドライソゾーム）に蓄積することを特徴とする。ＮＰＣの発生率は約１５０，０００人に１人であり、患者の約９５％がＮＰＣ１遺伝子に原因がある。世界中で約５００家系にＮＰＣ１遺伝子の突然変異が認められている。日本では推定約１５０名の患者が存在する。ＮＰＣの主症状は発現時期により異なるが、いずれの年代においても神経症状及び肝脾腫がみられる。すなわち、その標的組織は脳と肝臓である。
　ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣｙＤ）は、薬物の可溶化剤として汎用されているが、その空洞内にコレステロールを取り込むことができるため、近年、ＨＰ－β－ＣｙＤをＮＰＣ治療薬として応用する基礎・臨床研究が精力的に行われている（非特許文献１：Liu B.ら、Proc Natl Acad Sci U S A. 2009; 106(7):2377-82、非特許文献２：Ory DSら、Lancet. 2017; 390(10104):1758-1768）。２００９年より米国にて双子のＮＰＣ患者に対するＨＰ－β－ＣｙＤの人道的臨床応用が静脈内投与で開始され、２０１１年からは、神経症状の更なる改善を企図して、髄腔内投与も実施されている。現在、米国 CTD Holdings 社は、ＨＰ－β－ＣｙＤの静脈内投与による、ＰｈａｓｅＩ／ＩＩの臨床試験を実施しており、米国 Mallinckrodt 社は、ＨＰ－β－ＣｙＤの髄腔内投与による、ＰｈａｓｅＩＩｂ／ＩＩＩの臨床試験を実施している。特に髄腔内投与は、ＮＰＣ患者１４名の神経症状の進行を遅延させ、難聴などの副作用も軽度であったことから、大きな期待が寄せられている。ただし、髄腔内投与の患者負担は非常に大きく、また、ＮＰＣの患者の多くは小児であることを勘案すると、患者負担の少ない皮下注射あるいは静脈内注射による治療が切望されている。
　一方、ＨＰ－β－ＣｙＤの皮下注射あるいは静脈内注射は、大量投与による肺障害（非特許文献３：Yin-Hsiu Chienら、Mol Genet Metab. 2013; 109(2):231-2）や聴覚障害（非特許文献２）などの副作用を引き起こしやすい。実際、日本の佐賀大学における医師指導の人道的臨床応用では、小児に対して４０ｇという高用量の点滴静注が行われ、肺に異常陰影が観察されたため、脳室内投与に切り替えられた（非特許文献４：Matsuo M.ら、Mol. Genet. Metab. Rep. 2014; 1:391-400）。また、５ｇ／ｋｇのＨＰ－β－ＣｙＤの週３回静脈内投与によっても一過性の肺障害が惹起され、さらに、髄腔内投与においても、２００ｍｇ／ｋｇのＨＰ－β－ＣｙＤの２週間に１回投与で難聴の悪化が確認されている。そのため、皮下注射あるいは静脈内注射可能で、なおかつ副作用を軽減可能な治療法の確立が強く望まれている。とりわけ、患者の多くは小児であり、症状の進行も早いため、新薬の開発は喫緊の課題である。
　ＨＰ－β－ＣｙＤの皮下注射及び静脈内注射による治療効率を向上させる方法は明確であり、神経症状を改善するためには脳へ、肝脾腫を改善するためには肝臓へＨＰ－β－ＣｙＤを送り届けることである。本発明者らはこれまで、ラクトース修飾したβ－シクロデキストリンが、肝臓に移行することを偶然発見し、既に報告している（非特許文献５：Motoyamaら、Beilstein J. Org. Chem. 13, 10-18, 2017）。そこには、ニーマン・ピック病Ｃ型における肝脾腫治療を企画したラクトース修飾β－シクロデキストリンが記載されている。そこで、本発明者らはさらに、ラクトース修飾ＨＰ－β－ＣｙＤ（Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ）を新規に合成し、インビトロにおける血液脳関門（ＢＢＢ）透過性ならびにインビボにおける脳移行性を評価した結果、ＢＢＢ透過性及び脳移行量が認められることを見いだし、特許出願を行っている（特願２０１８－２４５５３８）。
　また、脂質蓄積病としてアルツハイマー病が知られており、脳細胞内でコレステロールの上昇が起こり、オートファゴソーム－ライソゾーム融合を阻害し、アミロイドβのクリアランスを低下させることが報告されている（非特許文献６：Nixon RA ら、J. Neuropathol. Exp. Neurol., 2005, 64, 113-122、非特許文献７：Barbero-Camps E.ら、Autopagy, 2018, 14, 1129-1154）。
Liu B.ら、Proc Natl Acad Sci U S A. 2009; 106(7):2377-82 Ory DSら、Lancet. 2017; 390(10104):1758-1768 Yin-Hsiu Chienら、Mol Genet Metab. 2013; 109(2):231-2 Matsuo M.ら、Mol. Genet. Metab. Rep. 2014; 1:391-400 Motoyamaら、Beilstein J. Org. Chem. 13, 10-18, 2017 Nixon RA ら、J. Neuropathol. Exp. Neurol., 2005, 64, 113-122 Barbero-Camps E.ら、Autopagy, 2018, 14, 1129-1154
　本発明は、脂質蓄積病を治療するための医薬組成物を提供することを目的とする。より具体的には、少なくとも脳内での脂質蓄積を改善することにより治療効果を示す脂質蓄積病を治療するための医薬組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン、あるいはそれらの誘導体が、血液脳関門を透過し脳内の神経細胞内に移行することにより、神経細胞内の脂質蓄積を改善することを見いだし、本発明を完成した。
　本発明は以下を含むものである。
［１］ラクトースで修飾されたヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、及びラクトースで修飾されたヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンからなる群より選ばれる化合物を有効成分として含む脳内における脂質の蓄積を治療するための医薬組成物であって、前記化合物は、生体内に投与された場合、少なくとも脳内に移行することを特徴とする医薬組成物。
［２］前記化合物の脳内への移行が、前記化合物の血液脳関門の透過に加え、脳内神経細胞内への移行を含むことを特徴とする、上記［１］に記載の医薬組成物。
［３］静脈内又は皮下に投与されることを特徴とする上記［１］又は［２］に記載の医薬組成物。
［４］前記化合物におけるシクロデキストリンに対するラクトースの置換度が４以上である、上記［１］～［３］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
［５］前記化合物におけるシクロデキストリンに対するラクトースの置換度が８以上である、上記［１］～［３］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
［６］前記脂質の蓄積が、脳内における脂質の蓄積を引き起こす脂質蓄積病に起因する、上記［１］～［５］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
［７］前記脂質蓄積病がライソゾーム病である、上記［６］に記載の医薬組成物。
［８］前記脂質蓄積病がニーマン・ピック病である、上記［６］に記載の医薬組成物。
［９］前記脂質蓄積病がアルツハイマー病である、上記［６］に記載の医薬組成物。
［１０］さらに、脳内において薬効を示す他の薬物を含む、上記［１］～［９］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
［１１］週１回～2回、数週間以上に渡り連続投与されることを特徴とする、上記［１］～［１０］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
［１２］ラクトースで修飾されたヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、及びラクトースで修飾されたヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンからなる群より選ばれる化合物を有効成分として含む脳内における脂質の蓄積を治療するための医薬組成物であって、前記化合物は少なくとも脳内神経細胞内の脂質（好ましくはコレステロール）の量の軽減を目的として投与されることを特徴とする医薬組成物。
［１３］静脈内又は皮下に投与されることを特徴とする上記［１２］に記載の医薬組成物。
［１４］前記化合物におけるシクロデキストリンに対するラクトースの置換度が４以上である、上記［１２］又は［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］前記化合物におけるシクロデキストリンに対するラクトースの置換度が８以上である、上記［１２］又は［１３］に記載の医薬組成物。
［１６］前記脂質の蓄積が、脳内における脂質の蓄積を引き起こす脂質蓄積病に起因する、上記［１２］～［１５］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
［１７］前記脂質蓄積病がライソゾーム病である、上記［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］前記脂質蓄積病がニーマン・ピック病である、上記［１６］に記載の医薬組成物。
［１９］前記脂質蓄積病がアルツハイマー病である、上記［１６］に記載の医薬組成物。
［２０］さらに、脳内において薬効を示す他の薬物を含む上記［１２］～［１９］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
［２１］週１回～２回、数週間以上に渡り連続投与されることを特徴とする、上記［１２～［２０］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
［２１］脂質蓄積病の治療方法であって、脂質蓄積病の患者に、ラクトースで修飾されたヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、又はラクトースで修飾されたヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンの治療有効量を、少なくとも脳内に投与することを特徴とする治療方法。
［２２］前記化合物の脳内への投与が、前記化合物の血液脳関門の通過を経て行われる上記［２１］に記載の治療方法。
［２３］前記化合物を静脈内又は皮下に投与する上記［２１］又は［２２］に記載の治療方法。
［２４］前記化合物におけるシクロデキストリンに対するラクトースの置換度が４以上である、上記［２１］～［２３］のいずれか一つに記載の治療方法。
［２５］前記化合物におけるシクロデキストリンに対するラクトースの置換度が８以上である、上記［２１］～［２３］のいずれか一つに記載の治療方法。
［２６］前記脂質蓄積病がライソゾーム病である、上記［２１］～［２５］のいずれか一つに記載の治療方法。
［２７］前記脂質蓄積病がニーマン・ピック病である、上記［２１］～［２５］のいずれか一つに記載の治療方法。
［２８］前記脂質蓄積病がアルツハイマー病である、上記［２１］～［２５］のいずれか一つに記載の治療方法。
［２９］さらに、脳内において薬効を示す他の薬物を含む上記［２１］～［２８］のいずれか一つに記載の治療方法。
　本発明により、脂質蓄積病に対する医薬組成物が提供される。
ラクトースで修飾されたヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンの一部の例を模式的に示した図である。図では、４つのヒドロキシプロピル基が置換されたβ－シクロデキストリンが、それぞれ、２個、４個、又は８個のラクトースで修飾されている。それぞれ、ＤＳＬ＝２，４，又は８と示している。 ＨＰ－β－ＣｙＤからＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを合成する工程の一例の概略を示した図である。 左図は、実施例１で合成したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳスペクトルを測定した結果であり、右図は、1Ｈ－ＮＭＲスペクトルを測定した結果である。 インビトロＢＢＢモデルを用いて、ＨｉＬｙｔｅで蛍光標識したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤのｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞単層の透過量を測定した結果である。左図は経時的な透過量を示しており、右図（表）は透過係数を示した結果である。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊はＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０５を、＋はＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ２）と比較した場合のｐ＜０．０５を、＋＋はＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ４）と比較した場合のｐ＜０．０５を示している。 インビトロＢＢＢモデルにおけるＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの透過に対するラクトースの競合阻害を確認した結果である。ラクトース、グルコース又はフロレチンによる阻害効果を確認した結果である。左図は経時的な透過量を示しており、右図（表）は透過係数を示した結果である。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊はＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０５を示す。 インビトロＢＢＢモデルを用いて、ＢＢＢ透過後の、蛍光標識したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤのＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞への取り込みを確認し、フローサイトメーターで測定した結果である。 Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの細胞毒性及び血液脳関門の密着結合に与える影響の確認した結果である。Ａは、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞に対する細胞障害性を確認した結果である。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊はＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０５を示す。Ｂは、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞単層の密着結合への影響を確認した結果である。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。 マウスに静注したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの各臓器への移行性を確認した結果である。摘出した各臓器の蛍光をIn vivo imaging system（ＩＶＩＳ）にて観察した（Ｅｘ：５３５ｎｍ，Ｅｍ：ＤｓＲｅｄ）結果である。３回の実験の代表的なイメージを示している。 ＡＤモデルマウス（ＡｐｐNL-G-Fマウス）に皮下投与したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの各臓器への移行性を確認した結果である。摘出した各臓器の蛍光をＩＶＩＳにて観察した結果である。左図は３回の実験の代表的なイメージを示している。右図は、各臓器の蛍光強度の結果を表したグラフである。＊はＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０５を示す。 マウスに静注したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの脳への移行を確認した結果である。左図が、ＩＶＩＳにて観察した結果であり、右図が、蛍光強度をマイクロリーダーで測定した結果である。４回の実験の代表的なイメージを示している。＊はＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０５を示す。 脳の各組織（脳血管内皮細胞、大脳皮質、海馬）におけるＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの局在を観察した結果である。３回の実験の代表的なイメージを示している。 ＡＤモデルマウスの脳の各組織（脳血管内皮細胞、大脳皮質、海馬）におけるＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの局在を観察した結果である。３回の実験の代表的なイメージを示している。左図は大脳皮質の結果であり、右図は海馬の結果である。 ＴＰＰＳとともにマウスに静注したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの脳への移行を確認した結果である。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊はＴＰＰＳと比較した場合のｐ＜０．０５を示し、＋は、ＨＰ－β－ＣｙＤ／ＴＰＰＳと比較した場合のｐ＜０．０５を示す。 Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを静脈内投与した後の血液生化学的検査の結果である。ＬＤＨは、Lactate dehydrogenase、ＡＳＴは、Aspartate aminotransferase、ＡＬＴは、Alanine aminotransferase、ＢＵＮは、Blood urea nitrogen、ＣＲＥは、Creatinineである。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。 Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤをＮＰＣモデルマウスに皮下投与した後の血液生化学的検査の結果である。各数値は、３－５回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊は生理食塩水を投与したＮｐｃ１-/-マウスと比較した場合のｐ＜０．０５を、＋は、ＨＰ－β－ＣｙＤを投与したＮｐｃ１-/-マウスと比較した場合のｐ＜０．０５を示す。 Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤをＡＤモデルマウスに皮下投与した後の血液生化学的検査の結果である。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。 Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用い、標識したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの細胞内への取り込みを確認した結果である。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊はＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０５を、＋は、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ２）と比較した場合のｐ＜０．０５を、＋＋はＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ４）と比較した場合のｐ＜０．０５を示す。 Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用い、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの透過に対するラクトースの競合阻害を確認した結果である。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊はＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０５を、＋は、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ＋ラクトースと比較した場合のｐ＜０．０５を、＋＋はＬａｃ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０５を示す。 Ｕ１８６６６Ａで処理したＨｅｐＧ２細胞を用い、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの透過に対するアシアロフェツイン（ＡＦ）の競合阻害を確認した結果である。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊はコントロールと比較した場合のｐ＜０．０５を、＋は、ＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０５を、＋＋はＬａｃ－β－ＣｙＤ＋ＡＦと比較した場合のｐ＜０．０５を示す。 Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用い、エンドライソゾーム内に蓄積した遊離型コレステロールに対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果を確認した結果である。Filipin III 及び LysoTracker（登録商標）Green DND-26を用いてコレステロールとエンドライソゾームをそれぞれ染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した結果を示している。 Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用い、エンドライソゾーム内に蓄積した遊離型コレステロールに対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果を確認した結果である。図は、細胞における、BZ-II アナライザーを用いて測定した蛍光強度より算出したエンドライソゾーム中のコレステロール量を示している。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊はコントロール（ＣｙＤの添加なし）と比較した場合のｐ＜０．０５を、＋は、ＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０５を示す。 Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用い、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤによるエンドライソゾーム内の蓄積遊離型コレステロール量の減少効果に対するラクトースの競合阻害を確認した結果である。Filipin III 及び LysoTracker（登録商標）Green DND-26を用いてコレステロールとエンドライソゾームをそれぞれ染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した結果を示している。 Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用い、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤによるエンドライソゾーム内の蓄積遊離型コレステロール量の減少効果に対するラクトースの競合阻害を確認した結果である。図は、細胞における、BZ-II アナライザーを用いて測定した蛍光強度より算出したエンドライソゾーム中のコレステロール量を示している。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊はコントロール（ＣｙＤの添加なし）と比較した場合のｐ＜０．０５を、＋は、ＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０５を、§は、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ＋Ｌａｃｔｏｓｅと比較した場合のｐ＜０．０５を示す。 ＮＰＣ様神経細胞に対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの細胞毒性を確認した結果である。Ａは、Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に対する細胞障害性を確認した結果である。各数値は、６－８回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊はＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０５を示す。Ｂは、Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の細胞形質膜からのコレステロール漏出に対する影響を確認した結果である。各数値は、４－６回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊はコントロールと比較した場合のｐ＜０．０５を示す。＋はＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０５を示す。 Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ又はＨＰ－β－ＣｙＤを皮下投与したＮＰＣモデルマウス（Ｎｐｃ１-/-）の体重を経時的に測定の結果である。各数値は、５匹のマウスの平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊はＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０５を示す。 Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ又はＨＰ－β－ＣｙＤを皮下投与したＮＰＣモデルマウス（Ｎｐｃ１-/-）のビームウオーキングテスト（Beam Walking Test）の結果である。Ａは、足下を滑らせた回数であり、Ｂは、移動速度である。体重を経時的に測定の結果である。各数値は、５－７匹のマウスの平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊は生理食塩水と比較した場合のｐ＜０．０５を示し、＋はＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０１を示す。 Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ又はＨＰ－β－ＣｙＤを皮下投与したＮＰＣモデルマウス（Ｎｐｃ１-/-）の生存率の結果である。各数値は、５－７匹のマウスの平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊は生理食塩水と比較した場合のｐ＜０．０５を示し、＋はＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０１を示す。 ＨｉＬｙｔｅ－ＡβとＵ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用い、細胞内に蓄積したＡβに対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果を確認した結果である。Filipin III 及び LysoTracker（登録商標）Redを用いてコレステロールとエンドライソゾームをそれぞれ染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した結果を示している。 Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用い、オートファゴソームの細胞内蓄積に対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果を確認した結果である。Hoechst 33342及び LysoTracker（登録商標）Redを用いて細胞核とエンドライソゾームをそれぞれ染色し、CYTO-ID（登録商標）Greenを用いてオートファジー小胞を染色した。その後、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した結果を示している。 Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用い、オートファジーフラックスに対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果を確認した結果である。Hoechst 33342及び抗ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１抗体を用いて細胞を染色し、その後、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した結果を示している。 ＡＤモデルマウスを用いたＹ字迷路試験の結果である。各数値は、グループあたり１５－１７匹のマウスの平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊は生理食塩水と比較した場合のｐ＜０．０５を示し、＋はＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０１を示す。 ＡＤモデルマウスを用いたバーンズ迷路試験の結果である。Ａは、４日目までのターゲットに留まった時間であり、Ｂは、５日目のそれぞれの領域（ＴＱ、ＬＱ、ＯＱ，ＲＱ）に留まった時間、Ｃは、５日目のターゲットに留まった時間、Ｄは、９日目のそれぞれの領域（ＴＱ、ＬＱ、ＯＱ，ＲＱ）に留まった時間、Ｅは、９日目のターゲットに留まった時間を示している。各数値は、グループあたり１５匹のマウスの平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊は生理食塩水と比較した場合のｐ＜０．０５を示し、＋はＨＰ－β－ＣｙＤと比較した場合のｐ＜０．０１を示す。 ＡＤモデルマウスを用い、脳内コレステロールに対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果を確認した結果である。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊は生理食塩水と比較した場合のｐ＜０．０５を示している。 ＡＤモデルマウスを用い、脳内の遊離型コレステロールに対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果を確認した結果である。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊は生理食塩水と比較した場合のｐ＜０．０５を示している。 Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを皮下投与したＡＤモデルマウスの脳内のＡβの蓄積を確認した結果である。各条件での半脳のイメージである。３回の実験の代表的なイメージを示している。 Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを皮下投与したＡＤモデルマウスの脳内のＡβの蓄積を確認した結果である。各条件での半脳中のＡβプラークの数を示している。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊は生理食塩水と比較した場合のｐ＜０．０５を示している。 Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを皮下投与したＡＤモデルマウスの脳内のＡβの蓄積を確認した結果である。３回の実験の代表的なイメージを示している。 Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを皮下投与したＡＤモデルマウスの脳内のＡβの蓄積をＥＬＩＳＡにより確認した結果である。各数値は、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。＊は生理食塩水と比較した場合のｐ＜０．０５を示している。 脳内グリア細胞に対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果を確認した結果である。３回の実験の代表的なイメージを示している。 Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの聴覚に対する影響を確認した結果である。各数値は、４～５匹の実験の平均±Ｓ．Ｅ.を示している。Ｓａｌｉｎｅ：－■－、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ：--▲--、ＨＰ－β－ＣｙＤ：－●－である。
　以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法及び材料とともに説明する。なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等又は同様の任意の材料及び方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物及び特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
　本明細書中で、「Ｘ～Ｙ」という表現を用いた場合は、下限としてＸを上限としてＹを含む意味で、或いは上限としてＸを下限としてＹを含む意味で用いる。本明細書において「約」とは、±１０％を許容する意味で用いる。
（１）ラクトース修飾ヒドロキシプロプルシクロデキストリン
　β－シクロデキストリン（β－ＣｙＤ）、γ－シクロデキストリン（γ－ＣｙＤ）は、ブドウ糖が環状に７個、又は８個連なったオリゴ糖である。ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣｙＤ）、ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン（ＨＰ－γ－ＣｙＤ）（以下、本明細書では、文脈によりいずれかを明確に示す場合を除いて、まとめて「ヒドロキシプロピル－シクロデキストリン（ＨＰ－ＣｙＤ）」という）は、β－シクロデキストリン又はγ－シクロデキストリン（以下、本明細書では、文脈によりいずれかを明確に示す場合を除いて、まとめて「シクロデキストリン（ＣｙＤ）」という）のグルコース骨格の２，３，６位の水酸基、好ましくは２位又は６位の水酸基がランダムにヒドロキシプロピル基、好ましくは２－ヒドロキシプロピル基で置換されている。ヒドロキシプロピル基の修飾数は、ＨＰ－ＣｙＤの１分子個あたりの平均置換度として表される。平均置換度は、特に制限がないが、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個をあげることができ、一般には、平均置換度は４～８個程度である。本明細書中では、平均４個の水酸基がヒドロキシプロピル基で置換されているＣｙＤを、ＨＰ－ＣｙＤ（ＤＳ ４）と表記する。ＣｙＤのヒドロキシプロピル基での修飾は公知の方法を適宜参照して用いて行うことができる。また、ＨＰ－ＣｙＤは市販されているので、購入してそれを用いることもできる、
　本発明で用いることができるラクトースで修飾されたＨＰ－β－ＣｙＤ（Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ）又はラクトースで修飾されたＨＰ－γ－ＣｙＤ（Ｌａｃ－ＨＰ－γ－ＣｙＤ）（以下、本明細書では、文脈によりいずれかを明確に示す場合を除いて、まとめて「ラクトース修飾ヒドロキシプロピルシクロデキストリン（Ｌａｃ－ＨＰ－ＣｙＤ）」という）は、ＨＰ－β－ＣｙＤ又はＨＰ－γ－ＣｙＤのグルコースの２，３，６位の水酸基又はヒドロキシプロピル基の水酸基、好ましくはグルコースの２位又は６位の水酸基、より好ましくはグルコースの６位の水酸基がランダムに１個、２個又は複数個のラクトースで置換されている。ラクトースの修飾数は、Ｌａｃ－ＨＰ－ＣｙＤの１分子個あたりの平均置換度として表される。ラクトースの平均置換度は、特に限定されないが、少なくとも２以上、好ましくは４以上、さらに好ましくは８以上である。Ｌａｃ－ＨＰ－ＣｙＤは、好ましくはＬａｃ－ＨＰ－β－シクロデキストリンである。本明細書中では、平均８個のラクトースで置換されているＨＰ－ＣｙＤを、Ｌａｃ－ＨＰ－ＣｙＤ（ＤＳＬ ８）と表記する。図１に、ラクトースで修飾されたＨＰ－ＣｙＤの例を模式的に示している。そこでは、例として、ヒドロキシプロピル基の置換度が４で、ラクトースの置換度が２，４及び８のＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤが例示されている。
　ＨＰ－ＣｙＤのラクトースによる修飾は、公知の報告を参考に行うことができる。これに限定されないが、例えば、ＤＭＳＯに溶解したＨＰ－β－ＣｙＤにエチレンジアミンを加え、ＣＤＩを用いて反応させて、グルコース又はヒドロキシプロピル基の水酸基とエチレンジアミンの間にウレタン結合を形成して、ＮＨ2－ＨＰ－β－ＣｙＤ（エチレンジアミン）を得る。それを再びＤＭＳＯに溶解し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム及びラクトースを添加して反応させ、エチレンジアミンのアミノ基とラクトースの１位の水酸基との間で還元的アミノ化反応を行うことによりラクトースで修飾されたＨＰ－β－ＣｙＤを得ることができる。さらには、別の任意のリンカーを用いて、ＨＰ－ＣｙＤにラクトースを結合することもできる。
　その他、例えば、シクロデキストリンに存在する、アミノ基、カルボキシル基など、反応性の高い官能基に対してラクトース修飾を容易に行うことができ、それらの基を用いる場合でもさらに任意のリンカーを用いて、ＨＰ－ＣｙＤにラクトースを結合することもできる。
　本明細書において、ラクトースで修飾されたヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、又はラクトースで修飾されたヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンという場合は、ＨＰ－β－ＣｙＤ又はＨＰ－γ－ＣｙＤがもつ基（例えば、水酸基）にラクトース分子が直接結合している場合、結合のための原子団を介して結合している場合、リンカーを介して結合している場合のいずれも含む意味である。結合のための原子団を介してとは、例えば、ラクトースをＨＰ－ＣｙＤに結合させるために、ＨＰ－ＣｙＤを任意の基で修飾し、その基を介してラクトースが結合している場合をあげることができる。
　ラクトースで修飾されたＨＰ－ＣｙＤはまた、ＰＥＧ等で修飾することができ、これもまた、本発明のラクトースで修飾されたＨＰ－ＣｙＤに含まれる。ＰＥＧによる修飾は、公知の方法を用い、ＨＰ－ＣｙＤにＰＥＧを結合することにより行うことができる。ＰＥＧを修飾することにより、血中滞留性の向上が期待できる。
（２）対象疾患
　本発明の医薬組成物又は治療方法で用いるＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤは、血液脳関門を通過して脳内の神経細胞内に移送され、細胞内の脂質を軽減するという特徴を有する。かかる特徴を有するので、Ｌａｃ－ＨＰ－ＣｙＤを有効成分として含む本発明の医薬組成物は、脂質蓄積病、好ましくは、スフィンゴリピドーシスやアルツハイマー病の治療のための医薬品として用いることができる。スフィンゴリピドーシスとしては、これに限定されないが、ニーマン・ピック病、ＧＭ１及びＧＭ２ガングリオシドーシス、ファブリー病、ゴーシェ病、ファーバー病、クラッベ病、異染性ロイコジストロフィーをあげることができる、本発明の医薬組成物は特に好ましくは、ニーマン・ピック病Ｃ型の疾患又はアルツハイマー病の治療に用いることができる。
（３）薬物
　本発明の医薬組成物において、Ｌａｃ－ＨＰ－ＣｙＤとともに用いることができる脳内において薬効を示す他の薬剤とは、脂質蓄積病の治療のための医薬組成物において有効成分としてＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤを用いる際に、その補助となる薬効を示す薬剤を意味する。例えば、その薬剤そのものが脳内において生理活性を有する物質（以下、単に生理活性物質という場合がある）をあげることができる。生理活性物質としては、これに限定されないが、例えば、低分子化合物、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質や核酸、をあげることができる。例えば、スフィンゴリピドーシスやアルツハイマーの治療に用いることができる薬剤をあげることができる。あるいはまた、脂質の蓄積の低減に加えて脳内の状態を改善させることができる薬剤、例えば、脳内の炎症を抑えるための抗炎症作用を有する薬剤、脳内感染症治療のための抗菌薬や抗ウィルス薬の有効成分である薬剤などをあげることができる。
　上記低分子化合物としては、例えば、スフィンゴリピドーシスやアルツハイマー病の治療に用いることができる低分子の薬剤などをあげることができる。例えば、本発明の医薬組成物をニーマン・ピック病Ｃ型の治療に用いる場合は、ミグルスタット、クルクミン、ボリノスタット、アリモクロモルをあげることができる。公知の方法を用いて、これらの低分子化合物とＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤとの複合体を形成させることができ、一つの医薬組成物として投与することができる。また、本発明の医薬組成物をアルツハイマー病の治療に用いる場合は、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチンをあげることができる。公知の方法を用いて、これらの低分子化合物とＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤとの複合体を形成させることができ、一つの医薬組成物として投与することができる。本発明の医薬組成物の有効成分であるＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤは、血液脳関門を通過し、脳内の神経細胞内へと移送されるので、一緒に用いる他の薬剤である低分子化合物も効率良く脳内の神経細胞へと輸送され、増強された薬効を示すことが期待できる。
　上記ペプチド（ポリペプチドやオリゴペプチド）は、例えば、スフィンゴリピドーシスやアルツハイマー病の治療に用いることができる生理活性ペプチドをあげることができる。公知の方法を用いて、これらのペプチドとＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤとの複合体を形成させることができ、一つの医薬組成物として投与することができる。本発明の医薬組成物の有効成分であるＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤは、血液脳関門を通過し、脳内の神経細胞内へと移送されるので、一緒に用いる他の薬剤であるペプチドも効率良く脳内の神経細胞へと輸送され、増強された薬効を示すことが期待できる。
　上記核酸は、例えば、スフィンゴリピドーシスやアルツハイマー病の治療のために用いられる核酸をあげることができる。これに限定されないが、例えば、遺伝子ノックダウン法による又はＲＮＡ干渉を用いた疾患の治療のための核酸、例えば、アンチセンス核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）、ヘテロ２本鎖核酸、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡをあげることができる。具体的には、これに限定されないが、異染性ロイコジストロフィーの治療目的で用いられている核酸をあげることができる。公知の方法を用いて、これらの核酸とＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤとの複合体を形成させることができ、一つの医薬組成物として投与することができる。本発明の医薬組成物の有効成分であるＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤは、血液脳関門を通過し、脳内の神経細胞内へと移送されるので、一緒に用いる他の薬剤である核酸も効率良く脳内の神経細胞へと輸送され、増強された薬効を示すことが期待できる。
　上記タンパク質は、例えば、スフィンゴリピドーシスやアルツハイマー病の治療のために用いられるタンパク質をあげることができる。これに限定されないが、標的に結合して脳内で生理活性を発揮する酵素、抗体、転写因子、あるいはそれらを構成する特定の部分をあげることができる。例えば、本発明の医薬組成物をゴーシェ病、ファブリー病に用いる場合は、それらの疾患に対する酵素補充療法で用いられる酵素をあげることができる。アルツハイマー病の治療に用いる場合は、アミロイドβに対する抗体をあげることができる。公知の方法を用いて、これらのタンパク質とＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤとの複合体を形成させることができ、一つの医薬組成物として投与することができる。例えば、これに限定されないが、タンパク質及び／又はＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤを化学的に修飾し、場合によりスペーサーを介して、両者を結合させればよい。或いは、非共有結合的に、例えば、静電的にタンパク質とＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤを結合させてもよい。本発明の医薬組成物の有効成分であるＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤは、血液脳関門を通過し、脳内の神経細胞内へと移送されるので、一緒に用いる他の薬剤であるタンパク質も効率良く脳内の神経細胞へと輸送され、増強された薬効を示すことが期待できる。
（医薬組成物）
　本発明のＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤを有効成分として含む医薬組成物は、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。例えば、液剤として又は適当な剤型の医薬組成物として、ヒトに対して非経口的又は経口的に投与することができる。非経口的投与方法としては、例えば、注射剤が例示できる。本発明の複合体を含む医薬組成物は、好ましくは非経口的に投与される。非経口的な投与方法としては、これに限定されないが、静脈内投与、皮下投与を挙げることができる。
　本発明の医薬組成物は、薬効を損なわない範囲で任意の成分を適宜配合できる。任意成分としては、これに限定されないが、例えば、架橋剤、溶解剤、乳化剤、保湿剤、清涼化剤、無機粉体、酸化防止剤、防腐剤、着色剤、香味剤、ｐＨ調整剤、安定化剤をあげることができる。
　本発明の有効成分であるＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤのヒトに対する投与量は、投与対象の年齢、体重、状態、性別、投与方法、その他の条件に応じて適宜決定される。例えば、投与量は、１日あたり、約０．１ｇ／ｋｇ～約２０ｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｇ／ｋｇ～約１０ｇ／ｋｇ、があげられる。
　本発明の有効成分であるＬａｃ－ＨＰ－ＣｙＤの投与方法は、投与対象の状態、投与目的、投与方法に応じて適宜決定される。投与間隔は、これに限定されないが、例えば、毎日、一日おき、二日おき、週１回、週２回の投与を挙げることができ、好ましくは、週１～２回の投与である。投与期間は、これに限定されないが、例えば、数週間～１、２ヶ月、あるいは数ヶ月～半年、あるいは数年間投与することを挙げることができる。長期に投与する場合は、週１～２回を数週間～１、２ヶ月投与した後、休薬期間を設け、その後、また投与するのが好ましい。
　以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）Ｌａｃ－ＨＰ－β―ＣｙＤの製造
　合成の概略を図２に示す。ＤＭＳＯに溶解したＨＰ－β－ＣｙＤ（１０ｇ）にエチレンジアミン４９．８ ｍＬを添加し、ＣＤＩ（９．８ｇ）を用いて、室温にて２４時間反応させた。得られたＮＨ2－ＨＰ－β－ＣｙＤ（エチレンジアミン）１０ｇをＤＭＳＯに溶解し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１００ｇ）を添加し、さらにラクトース一水和物（４７２ｇ）を添加して、７５℃で４８時間撹拌した。ＮＨ2－ＨＰ－β－ＣｙＤに対するラクトースモル比は１：１００である。凍結乾燥後、本品を得た。得られたサンプルのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳスペクトル及び1Ｈ－ＮＭＲスペクトルを測定した。結果を図３に示す。1Ｈ－ＮＭＲの結果から、それらの積分値を用いて算出したところ、平均ラクトース置換度が約８のＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤが得られた。同様にして、ただし、ＮＨ2－ＨＰ－β－ＣｙＤに対するラクトースモル比を、１：５０～１：２００の間で任意に調整し、種々のラクトース置換度のＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを製造した。製造したサンプルは、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳスペクトル及び1Ｈ－ＮＭＲスペクトルにより分析し、ラクトース置換度を決定した。その結果、ラクトース置換度が、２，４，及び８のＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを得ることができた。以下の実験は、ラクトース置換度が、２，４，及び８のＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを用いて行った。
（実施例２）インビトロ血液脳関門モデルでのＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの透過性の確認
　インビトロの血液脳関門モデルを用い、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの時間依存的な透過量を以下のようにして確認した。
　ラクトース置換度が２，４，及び８のＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ及びコントロールであるＨＰ－β－ＣｙＤを、製造者のマニュアルに従ってＨｉＬｙｔｅ蛍光色素で標識した。これらを用いて以下の実験を行った。
　トランスウエルの上層にヒト脳血管内皮細胞であるｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を１．０×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、一方、下層にヒト神経芽細胞であるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を１．０×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃にてＣＯ2インキュベーター内で７日間培養して、インビトロＢＢＢモデルを作製した。ＢＢＢのバリアー機能は、経皮内電気抵抗（ＴＥＥＲ値）を測定することにより確認した。
　蛍光標識したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（０．１ｍＭ）を上層に添加後、経時的（５，１５，３０，６０分）に、下層側の培地をサンプリングし、蛍光を測定することで、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの膜透過性を評価した。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞単層の透過性の結果を図４に示す。左図に示すように、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）は、透過量が経時的に有意に増大した。また、透過係数Ｐａｐｐ（ｃｍ／ｓｅｃ）を以下のようにして算出した：Ｐａｐｐ＝（ｄＱ／ｄｔ）／（Ａ＊Ｃｏ）。結果を右図に示す。Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）の膜透過係数は、ＨＰ－β－ＣｙＤと比較し、約３０倍のＢＢＢ透過能を有することが示された。
（実施例３）ラクトースによる競合阻害の確認
　インビトロＢＢＢモデルにおける、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤのｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞単層の透過が、ラクトースにより特異的に競合阻害されるか否かを以下のようにして確認した。
　実施例２に記載のインビトロＢＢＢモデルを用い、３７℃の温度にて、蛍光標識したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）を、グルコース（４ｍＭ）、ＧＬＵＴ阻害剤であるフロレチン（１ｍＭ）、又はラクトース（４ｍＭ）とともに上層に添加し、経時的（５，１５，３０，６０分）に、下層側の培地をサンプリングし、蛍光を測定することで、膜透過性を評価した。また、エンドサイトーシス阻害を示す４℃にて同様の実験を行った。結果を図５に示す。経時的な透過量を左図に、透過係数を右図に示す。ラクトースの添加により、透過係数は約１／５に低下していた。この結果は、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤが、ラクトースを認識するトランスポーター又はレセプターを介して、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞の単層を透過していることを示唆している。また、４℃において、膜透過量は顕著に減少した。
（実施例４）ＢＢＢ透過後のＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの神経細胞内取り込みの確認
　実施例２に記載のインビトロＢＢＢモデルを用い、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞単層を透過した後に、下層のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞内に取り込まれるＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを共焦点レーザー走査顕微鏡で観察し、フローサイトメトリーを行い確認した。顕微鏡での観察の結果、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）は、ＨＰ－β－ＣｙＤ、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ２及びＤＳＬ４）に比べ顕著な取込が確認できた。取込量は、ＤＳＬ２＜ＤＳＬ４＜ＤＳＬ８であった。フローサイトメトリーの結果を図６に示す。
　以下の実施例において、特に明記がない場合は、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、ラクトース置換度が８のＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）を用いた。
（実施例５）細胞毒性及び血液脳関門の密着結合に与える影響の確認
　Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）の細胞毒性及び血液脳関門の密着結合に与える影響を以下のようにして検討した。
　ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞をＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）存在下で培養することにより、細胞障害性を確認した。結果を図７Ａに示す。Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、ＨＰ－β－ＣｙＤに比べて顕著に細胞障害性が低く、安全性に優れることが判った。
　実施例２で記載のインビトロＢＢＢモデルを用い、トランスウエルにｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を播種し、３７℃にてＣＯ2インキュベーター内で４～６日間培養した。実験の開始前に、ＥＢＭ－２培地でｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞単層の平衡化を行った（３７℃、ａｐｉｃａｌ側に２．０ｍＬ、ｂａｓａｌ側に２．０ｍＬ）。標識したＨＰ－β－ＣｙＤ又はＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤをそれぞれ、培地に１０μＭの濃度となるように溶解し、あらかじめ３７℃に温めた後、上層の培地と交換した。５，１５，３０，６０分後に、単層の経皮内電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することで密着結合への影響を評価した。図７Ｂに示すように、いずれも細胞の密着結合を低下させなかった。
　以上より、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤは血液脳関門において細胞障害を起こさず、ＨＰ－β－ＣｙＤより安全性に優れることが確認された。
（実施例６）Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの臓器移行性の確認（１）
　実施例１で製造したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）及びＨＰ－β－ＣｙＤを製造者のマニュアルに従ってＨｉＬｙｔｅ蛍光色素で標識し以下の実験に用いた。
　標識したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ又はＨＰ－β－ＣｙＤをそれぞれ、７．２μｍｏｌ／ｋｇとなるように、８週齢の雄のＢＡＬＢ／ｃマウスの尾に静脈内注射した。６０分後にマウスを安楽死させ、ＰＢＳで灌流し、各臓器（脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓）を回収した。摘出した各臓器を、In vitro image spectrum（ＩＶＩＳ）にて観察した。結果を図８に示す。Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤが、脳と肝臓に蓄積していることが確認できた。ラクトース修飾したβ－ＣｙＤが肝臓に蓄積することは本発明者らにより既に報告されており、ラクトース修飾したＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）も同様に肝臓に蓄積することが確認できた。加えて、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）は、有意に脳に蓄積することが確認できた。
（実施例７）Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの臓器移行性の確認（２）
　次いで、アルツハイマー病モデルマウスであるＡｐｐNL-G-F 雄性マウス（７ヵ月齢、３０ｇ）（名古屋市立大学大学院医学研究科 脳神経科学研究所・斉藤貴志教授より供与）を用い、ＨＦ６４７（HiLyteTMFluor647）で標識したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ又はＨＰ－β－ＣｙＤをそれぞれ、７．２μｍｏｌ／ｋｇとなるように、皮下投与し、各臓器への移行性を確認した。結果を図９に示す。アルツハイマー病モデルマウスでも同様に、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤが、脳と肝臓に蓄積していること、そして、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、有意に脳に蓄積することが確認できた。
（実施例８）脳移行性の確認（１）
　実施例６と同様にして、投与１０分後の脳へのＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの蓄積を確認した。結果を図１０に示す。ＡがＩＶＩＳで観察した画像であり、Ｂが、蛍光強度をマイクロリーダーで測定した結果である。Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの脳移行率はＨＰ－β－ＣｙＤに比べて２０倍であり、また投与量の約５．２％であった。
（実施例９）脳移行性の確認（２）
　実施例７と同様にして、脳へのＨＦ６４７標識Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの蓄積を確認した。脳への早い移行が確認でき、脳への移行は投与１分後に最大であった。
（実施例１０）脳内局在の確認（１）
　実施例６と同様にして、投与６０分後にマウスを安楽死させ、ＰＢＳで灌流し、脳を回収した。脳を、ＤＡＰＩ（青：核を染色）、ＮｅｕＮ（緑：Ｎｅｕｒｏｎを染色）、及びＤｙＬｉｇｈｔ４８８（緑：脳血管内皮細胞を染色）で染色し、ＨｉＬｙｔｅ（赤）とともに、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて観察した。脳血管内皮細胞、大脳皮質、海馬を含む組織における蛍光を観察した結果を図１１に示す。その結果、ＨｙＬｙｔｅ－ＨＰ－β－ＣｙＤの蛍光はいずれの組織でも観察されなかったが、ＨｙＬｙｔｅ－Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤは全ての組織において確認された。さらに、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの投与では、緑と赤の蛍光が共局在しておらず、血管内皮細胞以外に赤の蛍光が観察されることより、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、有意に脳血管を透過し、脳実質に移行することが確認された。
（実施例１１）脳内局在の確認（２）
　ＨＦ６４７－ＨＰ－β－ＣｙＤ又はＨＦ６４７－Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（それぞれ、７．２ ｍｍｏｌ／ｋｇ）を含む生理食塩水２０ ｍＬ／ｋｇをＡｐｐNL-G-F 雄性マウス（７ヵ月齢、３０ｇ）に皮下投与した。６０分後、ＰＢＳ及び４％ ＰＦＡで経心灌流し、脳の摘出を行った。４％ ＰＦＡに浸して、４℃で一晩固定した。翌日ＰＢＳで洗浄し、１５％スクロース溶液に浸して、３日間脱水を行った。脱水後、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドに脳を浸してドライアイスにて急速凍結した。その後、－８０℃にて凍結した。凍結後、ＣＭ３０５０ Ｓ ｃｒｙｏｓｔａｔを用いて、２０ｍｍの厚さで脳をスライスし、ＰＢＳに浸漬した。ＰＢＳで洗浄し、３％ Ｄｏｎｋｅｙ Ｓｅｒｕｍ含有０．３％ ＰＢＳＴ溶液にて１時間ブロッキングした。以下の実施例において、ここまでの工程を「脳スライス調製工程」という場合がある。ＰＢＳで洗浄し、ＭＡＰ２含有０．３％ ＰＢＳＴ溶液（１：１，０００）を添加し、３７℃遮光下で、１２時間染色した。ＰＢＳで洗浄し、二次抗体処理（１：１，０００）を添加後、３７℃遮光下で、３時間染色した。ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ（３００ｎＭ）溶液を添加後、３７℃遮光下で、１０分間染色した。ＰＢＳで洗浄し、各切片をスライドガラスに貼り付け、マリノール溶液で包埋後、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。結果を図１２に示す。左図は大脳皮質の結果、右図は海馬の結果である。その結果、ＨＦ６４７－ＨＰ－β－ＣｙＤの蛍光はいずれの組織でも観察されなかったが、ＨＦ６４７－Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤは大脳皮質及び海馬において確認された。
（実施例１２）Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤと他の化合物の複合体の脳移行性の確認
　本発明の医薬組成物の有効成分であるＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、他の薬剤とともに脳内へ効率良く移行するかを以下のようにして確認した。
　実施例１で製造したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）又はＨＰ－β－ＣｙＤを、蛍光物質であるＴＰＰＳとともに、それぞれ、５．８μｍｏｌ／ｋｇとなるように８週齢の雄のＢＡＬＢ／ｃマウスの尾に静脈内注射した。６０分後にマウスを安楽死させ、ＰＢＳで灌流し、脳を回収した。摘出した脳を、ＩＶＩＳにて観察し、蛍光強度をマイクロリーダーで測定した。結果を図１３に示す。ＨＰ－β－ＣｙＤと比較し、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、他の物質とともに脳に移行することが確認された。Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの脳移行率はＨＰ－β－ＣｙＤに比べて約９倍であり、また投与量の約４．０％であった。
（実施例１３）Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ静脈内投与後の血液生化学的検査値の確認
（実施例１３－１）野生型マウスに対する影響
　実施例１で製造したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）及びＨＰ－β－ＣｙＤをそれぞれ、０．７ｍｍｏｌ／ｋｇとなるように、８週齢の雄のＢＡＬＢ／ｃマウスの尾に静脈内注射した。２４時間後に、血液を採取し、各種生化学的検査項目について測定を行った。コントロールとして生理食塩水を投与した。結果を図１４に示す。Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを投与した群は、生理食塩水を投与した群と比べて血液生化学的検査値に影響は見られず、安全であることが確認された。
（実施例１３－２）ＮＰＣモデルマウスに対する影響
　ＨＰ－β－ＣｙＤ又はＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを含む生理食塩水２０μＬ／ｋｇを、４週齢の野生型マウス（ＷＴ）及びＢＡＬＢ／ｃ Ｎｃｔｒ－Ｎｐｃ１m1N（Ｎｐｃ１-/-）マウスに、投与量が１．４ｍｍｏｌ／ｋｇとなるように、１週間おきに、８週齢まで皮下投与した。５回目の投与の７２時間後に、腹部下大動脈より採血した。血液は遠心分離により血漿を分取した。各血液生化学的パラメータは、富士ドライケム７０００「Ｚ」により定量した。結果を図１５に示す。ＮＰＣモデルマウスへのＬａｃ－ＨＰ－β－Ｃｙ　
（実施例１３－３）ＡＤモデルマウスに対する影響
１４）Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ皮下投与後の血液生化学的検査値の確認
　ＨＰ－β－ＣｙＤ又はＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを含む生理食塩水２０μＬ／ｋｇを、投与量が７．２ ｍｍｏｌ／ｋｇとなるように、ＡｐｐNL-G-F雌雄性マウス（２ヵ月齢）に７ヵ月齢まで週２回、皮下投与した。上記β－ＣｙＤｓを含む生理食塩水２０μＬ／ｋｇを、投与量が０．７ ｍｍｏｌ／ｋｇとなるように、ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスに同様にして投与した。最終投与の１週間後に、腹部下大動脈より採血した。血液は遠心分離により血漿を分取した。各血液生化学的パラメータは、富士ドライケム７０００「Ｚ」により定量した。結果を図１６に示す。
（実施例１４）ＮＰＣ細胞様神経細胞へのＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの取り込みの確認
　ステロイド誘導体であるＵ１８６６６Ａ（プロゲステロン）は、細胞内コレステロール輸送を阻害し、ＮＰＣ細胞によく似た遊離型コレステロール蓄積を引き起こす。Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用い、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの細胞内への取り込みを以下のようにして測定した。
　実施例１で合成したラクトース置換度が２，４，及び８のＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ及びコントロールであるＨＰ－β－ＣｙＤを、製造者のマニュアルに従ってＨＦ６４７蛍光色素で標識した。これらを用いて以下の実験を行った。
　ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（５ｘ１０5細胞）をＵ１８６６６Ａ（１．２５μＭ）含有培地で３７℃にて４８時間培養した。その後、Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（１ｘ１０4細胞）をＨＦ６４７－Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ２，４，及び８）又はＨＦ６４７－ＨＰ－β－ＣｙＤをそれぞれ０．１ｍＭの濃度で添加した培養培地中で、３７℃にて２４時間培養した。細胞中の蛍光強度を、BZ-II アナライザーを用いて測定した。結果を図１７に示す。右図は、蛍光強度の平均を示したものである。ラクトース置換度が大きくなるに従い取り込み量が増大し、ＤＳＬ８では、顕著な取り込みが確認できた。
（実施例１５）ラクトースによる競合阻害の確認
　Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用い、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの細胞内への取り込みが、ラクトースにより競合阻害されるか否かを確認した。
　実施例１４と同様にしてＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＵ１８６６６Ａで処理した後、ラクトース（４ｍＭ）の有無の条件で、ＨＦ６４７－Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）又はＨＦ６４７－ＨＰ－β－ＣｙＤをそれぞれ培地に０．１ｍＭの濃度となるように加え、３７℃で２４時間培養し、細胞内への取り込みを確認した。細胞中の蛍光強度を、BZ-IIアナライザーを用いて測定した。結果を図１８に示す。ラクトースの添加により、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの細胞内への取り込みが顕著に阻害された。
（実施例１６）アシアロフェツイン（ＡＦ）による競合阻害の確認
　Ｕ１８６６６Ａで処理したＨｅｐＧ細胞を用い、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの細胞内への取り込みが、アシアロフェツイン（ＡＦ）により競合阻害されるか否かを確認した。
　ＨｅＰＧ２細胞（２ｘ１０5細胞）をＵ１８６６６Ａ（１．２５μＭ）含有培地で３７℃にて４８時間培養した。その後、Ｕ１８６６６Ａで処理したＨｅｐＧ２細胞（１ｘ１０4細胞）をＨＦ６４７で標識したＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ又はＨＰ－β－ＣｙＤをそれぞれ添加した培養培地中（ＡＦの存在及び非存在の条件にて）で、３７℃にて２４時間培養し、細胞内の取り込みを確認した。細胞中の蛍光強度を、BZ-II アナライザーを用いて測定した。結果を図１９に示す。ＡＦの添加により、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの細胞内　
（実施例１７）エンドライソゾーム内遊離型コレステロール量への影響の確認
　Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用い、細胞内で蓄積した遊離型コレステロールに対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの影響を確認した。
　実施例１１と同様にしてＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＵ１８６６６Ａで処理した後、Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（１ｘ１０4細胞）をＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ２，４，及び８）又はＨＰ－β－ＣｙＤをそれぞれ０．１ｍＭの濃度で添加した培養培地中で、３７℃にて２４時間培養した後、４％のＰＦＡで１０分間固定した。ＰＢＳで洗浄後、細胞をFilipin III 及び LysoTracker（登録商標）Green DND-26を用い、コレステロールとエンドライソゾームをそれぞれ染色した。ランダムに選択した１０個の細胞のFilipin III の蛍光強度を共焦点レーザー走査顕微鏡及び BZ-II アナライザーを用いて測定した。共焦点顕微鏡での観察結果を図２０に、BZ-II アナライザーを用いて測定した蛍光強度より算出したエンドライソゾーム中のコレステロール量を図２１に示す。共焦点顕微鏡での観察より、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）は、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ２及びＤＳＬ４）に比べ顕著な蓄積したコレステロール量の減少を示すことが確認できた。また、蓄積したコレステロールの減少効果は、ＤＳＬ２＜ＤＳＬ４＜ＤＳＬ８であった。
（実施例１８）Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤによるエンドライソゾーム内遊離型コレステロール量の減少に対するラクトースによる競合阻害の確認
　Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用い、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤによるエンドライソゾーム内遊離型コレステロール量の減少効果が、ラクトースにより競合阻害されるか否かを確認した。
　実施例１４と同様にしてＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＵ１８６６６Ａで処理した後、Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（１ｘ１０4細胞）をＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）又はＨＰ－β－ＣｙＤをそれぞれ０．１ｍＭの濃度で添加した培養培地中で、ラクトース（４ｍＭ）の有無の条件で３７℃にて２４時間培養した。その後、実施例１３と同様にして、コレステロールとエンドライソゾームをそれぞれ染色し、蛍光を共焦点レーザー走査顕微鏡及び BZ-II アナライザーを用いて測定を行った。共焦点顕微鏡での観察結果を図２２に、BZ-II アナライザーを用いて測定した蛍光強度より算出したエンドライソゾーム中のコレステロール量を図２３に示す。ラクトースの添加により、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）の蓄積コレステロール量の減少効果が阻害された。
（実施例１９）神経細胞に対する細胞毒性の確認
　Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を種々の濃度のＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）存在下で培養することにより、細胞障害性を確認した。対照として、ＨＰ－β－ＣｙＤを用いた。結果を図２４Ａに示す。Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、ＨＰ－β－ＣｙＤに比べて有意にＮＰＣ様神経細胞に対する細胞障害性が低く、安全性に優れることが判った。
　また、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用い、細胞形質膜からのコレステロール漏出に及ぼす影響を確認した。Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を、３０ｍMのＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）存在下で１時間培養した後、コレステロール Ｅ－テストワコー（富士フィルム和光純薬（株））を用い、製造元のマニュアルに従ってコレステロールの漏出を測定した。対照として、生理食塩水（コントロール）及びＨＰ－β－ＣｙＤ（３０ｍＭ）を用いた。を結果を図２４Ｂに示す。Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、ＨＰ－β－ＣｙＤに比べて有意にＮＰＣ様神経細胞において、細胞形質膜からのコレステロール漏出作用が低いことが示された。
（実施例２０）ＮＰＣマウスモデルを用いたＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果の確認
　ＮＰＣマウスモデルを用いて、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの治療効果を以下のようにして確認した。
　ＮＰＣモデルマウス（Ｎｐｃ１-/-）（ＢＡＬＢ／ｃ、４週齢、鳥取大学の大野耕作博士及び檜垣克美博士より供与を受け、熊本大学にて繁殖）を用い、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（1.4 nmol/kg、6,079 mg/kg）又はＨＰ－β－ＣｙＤ（1.4 nmol/kg、2,000 mg/kg）を、４週齢目～９週齢目まで、週１回、皮下投与した（計６回投与）。コントロールとして、ＮＰＣモデルマウス及び野生型マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、４週齢）に生理食塩水を投与した。マウスは、各条件につき、５－７匹（雄２－４匹、雌３匹）を用いた。体重測定、ビームウオーキングテスト（Beam Walking Test）、生存率を評価した。
　ＮＰＣモデルマウスでの４週齢目～１０週齢目までの体重測定の結果を図２５に示す。Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、ＨＰ－β－ＣｙＤと比較して、ＮＰＣモデルマウスの体重減少を有意に抑制することが示された。
　ＮＰＣモデルマウスでの４週齢目～７週齢目までのビームウオーキングテストの結果を図２６に示す。Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、ＨＰ－β－ＣｙＤと比較して、ＮＰＣモデルマウスの運動機能障害を有意に改善することが示された。
　ＮＰＣモデルマウスでの生存率の結果を図２７に示す。Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、ＨＰ－β－ＣｙＤと比較して、ＮＰＣモデルマウスの生存率を有意に延長することが示された。
（実施例２１）アミロイドβの細胞内蓄積に及ぼすＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの影響
　細胞内にコレステロール蓄積を誘導するＵ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用いて、細胞内に蓄積するアミロイドβを測定した。ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（５ｘ１０5細胞）を、ＨｉＬｙｔｅで標識したアミロイドβ（１５０ｎＭ）及びＵ１８６６６Ａ（７．５μＭ）を添加した培地で３７℃にて２４時間培養した後、細胞を培地で洗浄した。次いで、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（１ｘ１０4細胞）をＨＦ６４７－Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ ８）又はＨＦ６４７－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳ ４．４）をそれぞれ０．１ｍＭの濃度で添加した培養培地中で、３７℃にて２４時間培養した。コントロールとして、ＰＢＳを用いた。その後、４％のＰＦＡで１０分間固定した。ＰＢＳで洗浄後、細胞をFilipin III 及び LysoTracker（登録商標）Red L7528を用い、コレステロールとエンドライソゾームをそれぞれ染色した。ランダムに選択した１０個の細胞の蛍光を共焦点レーザー走査顕微鏡により観察した。結果を図２６に示す。図２８に示されるように、ＨＰ－β－ＣｙＤを添加した場合は、Filipin III、HiLyte-Aβ、LysoTracker（登録商標）での蛍光は、コントロールと差がなかった。一方、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを添加した場合は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞内のアミロイドβの蓄積量を有意に減少させることが確認できた。
（実施例２２）オートファジー異常に対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果
　オートファジー異常により誘導される、オートファゴソームの細胞内蓄積に対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果を、Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用いて検討した。Cyto-ID（登録商標）オートファジー検出キットを用い、製造元のプロトコールに従い、オートファジー機能の検出を行った。具体的には、以下のようにして確認した。
　ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を１ｘ１０4個／ｄｉｓｈになるように播種し、３７℃で２４時間培養、Ｕ１８６６６Ａ（７．５μＭ）含有培地でさらに２４時間培養した。細胞を０．１ｍＭのＨＰ－β－ＣｙＤ又はＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ ８）含有培地で２４時間処理した後、ＰＢＳで洗浄し、Cyto-ID（登録商標）及びLysoTracker（登録商標）Red DND-99（最終濃度１００ｎＭ）含有無血清培地で３０分間培養した。ＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡで１０分間固定した。その後、Hoechst33342含有ＰＢＳ溶液にて３０分間インキュベーションすることで、核を染色した。最後に、ＰＢＳで洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡により、Cyto-ID（登録商標）、LysoTracker（登録商標）、及びHoechst33342の蛍光を観察した。結果を図２９に示す。図２９に示されるように、ＨＰ－β－ＣｙＤを添加した場合は、オートファゴソームの蓄積はコントロールと差がなかった。一方、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを添加した場合は、オートファゴソーム蓄積が改善された。
（実施例２３）オートファジーフラックスに対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果
　ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１は細胞が正常な時はオートファジーにより分解を受けるが、異常な場合は細胞内に蓄積する。Ｕ１８６６６Ａで処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用い、オートファジーフラックスに対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果を以下のようにして確認した。
　ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を１ｘ１０4個／ｄｉｓｈになるように播種し、３７℃で２４時間培養後、Ｕ１８６６６Ａ（７．５μＭ）含有培地でさらに２４時間培養した。細胞を０．１ｍＭのＨＰ－β－ＣｙＤ又はＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ ８）含有培地で２４時間処理した後、ＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡで１０分間固定した。ＰＢＳで洗浄後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（０．１％）で１０分間処理して、膜透過処理した。その後、抗体を用いて免疫染色を行った（一次抗体：抗ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１ウサギ抗体、二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体）。その後、Hoechst33342で核を染色した。染色後、共焦点レーザー顕微鏡にて、二次抗体及びHoechst33342の蛍光を観察した。結果を図３０に示す。図３０に示されるように、ＨＰ－β－ＣｙＤを添加した場合は、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１の細胞内蓄積はコントロールと差がなかった。一方、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤを添加した場合は、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１が分解され、オートファジーフラックスの上昇が確認された。
　アルツハイマー病においては、細胞内コレステロールの上昇が原因となってオートファゴソーム－ライソゾーム融合を阻害し、アミロイドβのクリアランスを低下させることが報告されている。よって、上記の結果より、アルツハイマー病におけるアミロイドβの神経細胞内蓄積に対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果が確認された。
（実施例２４）ＡＤマウスモデルを用いたＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果の確認
　ＡＤモデルマウス（ＡｐｐNL-G-Fマウス）を用い、マウスの行動試験を行った。行動試験は、Ｙ字迷路試験－短期記憶試験、及びバーンズ迷路試験により測定した。
　各マウス（７ヵ月齢）を約１時間、試験室に馴化させた。概日リズムの影響を減らすために、すべての行動試験は、試験台（床から１００ｃｍ）上で毎日同じ時間間隔（０９：００－１８：００）に２つのライトを点灯して行われた。各試験は、ＳＭＡＲＴ Ｖ３．０によって撮影された。各試験終了後、マウスをホームケージに戻し、７０％エタノールで迷路を拭き、その後、乾拭きした。行動試験には、合計６０～６８匹のマウスを使用した。
　２ヵ月齢のＡｐｐNL-G-FマウスにＨＰ－β－ＣｙＤ又はＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）（それぞれ、１．４ ｍｍｏｌ／ｋｇ）を含む生理食塩水２０μＬ／ｋｇを７ヵ月齢まで（５ヶ月間）週２回、皮下投与を行った。次に、ＡｐｐNL-G-Fマウスの認知機能障害の改善を目的に、７ヵ月齢の雌雄性マウスにＨＰ－β－ＣｙＤ又はＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳＬ８）を長期間投与し、２種類の行動試験（Ｙ字迷路、バーンズ行動試験）を行った。
（実施例２４－1）Ｙ字迷路試験（短期記憶試験）
　Ｙ字迷路試験（短期記憶試験）は、３つのアームがついたＹ字型の迷路（長さ２２ｃｍ、幅５ｃｍ、高さ１５ｃｍ）の中央にマウスを配置し、８分間に連続して異なるアームに進入できた割合を交替行動率（Alternation, Eq. (2)）とした。以上の操作を、マウスの匹数分、繰り返した。マウスは記憶していれば直前に入っていないアームに入ろうとするので、３連続で異なるアームに侵入した回数をカウント（Alternation Triplet）し、以下の式より交替行動率を（％）を算出した。
　交替行動率（Alternation behavior：％）
　＝Alternation Triplet (count)ｘ１００／（Total Arm Entries －２）
結果を図３１に示す。
（実施例２４－２）バーンズ迷路試験（空間学習記憶試験）
　円盤の円周上に２０個の穴が開いており、そのうち１つだけターゲット（マウスが中に入れる直径５ｃｍの深い穴）を設置した。また、円盤を４等分にし、それぞれの領域をTarget quadrant（ＴＱ）、Opposite quadrant（ＯＰ）、Left quadrant（ＬＰ）、Right quadrant（ＲＰ）とした。トレーニングを４日間行うことで、ターゲットの位置を記憶し、円盤中心からターゲットに向かうようにさせる。なお、３分間のトレーニングにおいて、ターゲットを見つけられなかったマウスは、開始位置に一旦戻して、迷路中央からターゲットまで誘導し、ターゲットボックスに入れて１分間そのまま入れた。入らない場合は無理やり入れず、ターゲット周辺で留まらせた。以上を１匹あたり１日に３回、連続で４日間行った。５日目に、ターゲットの深い穴を外して、３分間のプローブテスト（ターゲット付近に滞在する時間を測定）を行った。ターゲット領域は、ターゲット（直径５ｃｍの穴）を中心に直径１２ｃｍの円とした。最後に、５日目のプローブテストから、４日間ゲージに戻し、９日目に再度プローブテストを行った。結果を、図３１２に示す。
（実施例２５）脳内総コレステロールに対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果
　実施例２４の行動試験を行った後にマウスから脳を回収し、脳内コレステロール蓄積量を評価した。具体的には以下のようにして行った。
　７ヵ月齢のマウス脳の摘出し、脳の重量を測定した。チューブに脳を入れ、Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｍ（１ｍＬ）を添加後、ホモジナイズしたものをサンプル溶液とした。サンプル溶液を二本の試験管に等量添加し、一方にはコレステロールエステラーゼを（ＴＣ測定）、もう一方には純水を入れ（ＵＣ測定）、３７℃ ３０分間インキュベーションした。その後、２－プロパノール／ヘキサン（２：３）混合液を各サンプルに２ｍＬ添加し、１０分間振盪した。さらに、ヘキサン１ｍＬ追加し、３０秒間ボルテックスし、純水を１ｍＬ加え３０秒間ボルテックスし、遠心した。遠心後、上清１ｍＬを４０°Ｃで蒸発乾固し、混合液２００ｍＬ（２－プロパノール／ポリオキシレンアルキルエーテル／ポリオキシレンラウリルエーテル＝８７／１０／３）で溶解させた後、デタミナーＬ ＦＣによる吸光度の測定から溶液中のコレステロール量を測定した。結果を図３３に示す。
（実施例２６）脳内遊離型コレステロールに対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果
　実施例２４の行動試験を行った後にマウスから脳を回収し、脳内コレステロール蓄積量を評価した。具体的には以下のようにして行った。
　７ヵ月齢のマウスを用い、前記の脳スライス調製工程を行い、脳スライスを調製した。次いで、ＰＢＳで洗浄し、Ｆｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩ溶液（５０μｇ／ｍＬ）を添加後、３７℃遮光下で、１時間染色した。ＰＢＳで洗浄し、各切片をスライドガラスに貼り付け、マリノール溶液で包埋後、共焦点レーザー顕微鏡にて観察し、遊離型コレステロールを確認した。結果を図３４に示す。左図は顕微鏡の画像であり、右図は蛍光強度をグラフに示したものである。Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤにより、遊離型コレステロールの量が有意に減少していた。
（実施例２７）脳内Ａβに対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果（１）
　実施例２４の行動試験を行った後にマウスから脳を回収し、脳内Ａβの蓄積量を評価した。具体的には以下のようにして行った。
　７ヵ月齢のマウスを用い、前記の脳スライス調製工程を行い、脳スライス調製した。次いで、ＰＢＳで洗浄し、Ａβ含有０．３％ＰＢＳＴ溶液（１：１，０００）を添加し、３７℃遮光下で、１２時間染色した。ＰＢＳで洗浄し、二次抗体処理（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８，１：１，０００）を添加後、３７℃遮光下で、３時間染色した。ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ（３００ｎＭ）溶液を添加後、３７℃遮光下で、５分間染色した。ＰＢＳで洗浄し、各切片をスライドガラスに貼り付け、マリノール溶液で包埋後、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。脳におけるＡβ発現のイメージの結果を図３５に示す。また、Ａβプラーク数の定量化は、取得した組織画像を用いて、目視でカウントした。結果を図３６に示す。また、大脳皮質及び海馬におけるＡβの蓄積を確認したイメージを図３７に示す。大脳皮質及び海馬において、Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤにより、Aβの蓄積が有意に減少していることが確認された。
（実施例２８）脳内Ａβに対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果（２）
　実施例２４の行動実験を行った後にマウスから脳を回収し、脳内Ａβの蓄積量をＥＬＩＳＡにより評価した。具体的には以下のようにして行った。
　７ヵ月齢のマウス脳の摘出し、脳の重量を測定した。チューブに脳を入れ、Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｍ（１ｍＬ）を添加後、ホモジナイズしたものをサンプル溶液とした。サンプル溶液（１０ｍＬ）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにコーティングＢｕｆｆｅｒともに添加した。サンプル溶液を４℃で一晩インキュベーション後、ＰＢＳＴで洗浄し、ブロッキングＢｕｆｆｅｒを添加した。ＰＢＳＴで洗浄し、Ａβ含有０．０５％ ＰＢＳＴ溶液（１：１，０００，５０ｍＬ／ｗｅｌｌ）を添加し、３７℃遮光下で、１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴで洗浄し、二次抗体処理（１：５，０００，５０ｍＬ／ｗｅｌｌ）を添加後、３７℃遮光下で、１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴで洗浄し、3,3',5,5'-tetramethylbenzidine（ＴＭＢ）溶液で、１時間インキュベーション後、ＨＣｌ溶液を添加した。マイクロプレートリーダーにて、サンプル４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図３８に示す。Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤにより、Aβの蓄積が有意に減少していることが確認された。
（実施例２９）脳内グリア細胞に対するＬａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの効果
　実施例２４の行動試験を行った後にマウスから脳を回収し、脳内グリア細胞の蓄積量を評価した。具体的には以下のようにして行った。
　７ヵ月齢のマウスを用い、前記の脳スライス調製工程を行い、脳スライス調製した。次いで、ＰＢＳで洗浄し、Ｉｂａ１，ＧＦＡＰ含有０．３％ ＰＢＳＴ溶液（１：１，０００）を添加し、３７℃遮光下で、１２時間染色した。ＰＢＳで洗浄し、二次抗体処理（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８，１：１，０００）を添加後、３７℃遮光下で、３時間染色した。ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ溶液を添加後、３７℃遮光下で、５分間染色した。ＰＢＳで洗浄し、各切片をスライドガラスに貼り付け、マリノール溶液で包埋後、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。結果を図３９に示す。Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤにより、ミクログリアの蓄積が有意に減少していることが確認された。
（実施例３０）Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの聴覚に対する影響
　Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤの治療用量（２．９ｍｍｏｌ／ｋｇ）をマウスに皮下投与し、マウスの聴性脳幹反応（auditory brainstem response：ＡＢＲ）検査を行った。聴覚閾値は、ABR System 3 (Tucker-Davis Technologies, FL, USA) を使用して測定した。ＡＢＲはマウスを麻酔下にて測定した。頭部付近の皮膚直下に測定電極を設置し、接地電極を背部皮膚直下に配置した。周波数は、マウスの可聴領域に含まれる４、８、１２、２０及び３２ ｋＨｚで計測した。各周波数における聴覚閾値は、音圧レベルを５ ｄＢ間隔で変化させて得られるＡＢＲ波形が目視検査によって明確に検出できる最低レベルとして定義したＡＢＲ検査を行った。結果を図４０に示す。Ｌａｃ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、聴覚に影響を及ぼさないことが確認された。
　上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
　本発明のラクトース修飾したヒドロキシプロピルシクロデキストリンは、脂質蓄積病の治療のための医薬組成物として有用である。

Claims (21)

  1. 　ラクトースで修飾されたヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、及びラクトースで修飾されたヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンからなる群より選ばれる化合物を有効成分として含む脳内における脂質の蓄積を治療するための医薬組成物であって、前記化合物は、生体内に投与された場合、少なくとも脳内に移行することを特徴とする医薬組成物。
  2. 　前記化合物の脳内への移行が、前記化合物の血液脳関門の透過に加え、脳内神経細胞内への移行を含む請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　静脈内又は皮下に投与されることを特徴とする請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 　前記化合物におけるシクロデキストリンに対するラクトースの置換度が４以上である、請求項１～３のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  5. 　前記化合物におけるシクロデキストリンに対するラクトースの置換度が８以上である、請求項１～３のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  6. 　前記脂質の蓄積が、脳内における脂質の蓄積を引き起こす脂質蓄積病に起因する、請求項１～５のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  7. 　前記脂質蓄積病がライソゾーム病である、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 　前記脂質蓄積病がニーマン・ピック病である、請求項６に記載の医薬組成物。
  9. 　前記脂質蓄積病がアルツハイマー病である、請求項６に記載の医薬組成物。
  10. 　さらに、脳内において薬効を示す他の薬物を含む請求項１～９のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  11. 　週１～２回、数週間以上に渡り連続投与されることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  12. 　ラクトースで修飾されたヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、及びラクトースで修飾されたヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリンからなる群より選ばれる化合物を有効成分として含む脳内における脂質の蓄積を治療するための医薬組成物であって、前記化合物は、少なくとも脳内神経細胞内のコレステロール量の軽減を目的として投与されることを特徴とする医薬組成物。
  13. 　静脈内又は皮下に投与されることを特徴とする請求項１１に記載の医薬組成物。
  14. 　前記化合物におけるシクロデキストリンに対するラクトースの置換度が４以上である、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
  15. 　前記化合物におけるシクロデキストリンに対するラクトースの置換度が８以上である、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
  16. 　前記脂質の蓄積が、脳内における脂質の蓄積を引き起こす脂質蓄積病に起因する、請求項１１～１４のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  17. 　前記脂質蓄積病がライソゾーム病である、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 　前記脂質蓄積病がニーマン・ピック病である、請求項１６に記載の医薬組成物。
  19. 　前記脂質蓄積病がアルツハイマー病である、請求項１６に記載の医薬組成物。
  20. さらに、脳内において薬効を示す他の薬物を含む請求項１１～１８のいずれか一つに記載の医薬組成物。
  21. 　週１～２回、数週間以上に渡り連続投与されることを特徴とする、請求項１２～２０のいずれか一つに記載の医薬組成物。
PCT/JP2020/049046 2019-12-27 2020-12-26 脂質蓄積病を治療するための医薬組成物 WO2021132703A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021567755A JPWO2021132703A1 (ja) 2019-12-27 2020-12-26

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPPCT/JP2019/051421 2019-12-27
PCT/JP2019/051421 WO2020138421A1 (ja) 2018-12-27 2019-12-27 脳移行性リガンド及び薬物担体
JP2020-082028 2020-05-07
JP2020082028 2020-05-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021132703A1 true WO2021132703A1 (ja) 2021-07-01

Family

ID=76574534

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/049046 WO2021132703A1 (ja) 2019-12-27 2020-12-26 脂質蓄積病を治療するための医薬組成物

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2021132703A1 (ja)
WO (1) WO2021132703A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07126162A (ja) * 1993-10-28 1995-05-16 Showa Denko Kk アスコルビン酸類の脳内投与剤
JP2010090054A (ja) * 2008-10-07 2010-04-22 Kumamoto Univ アミロイド線維形成抑制剤
WO2015083736A1 (ja) * 2013-12-05 2015-06-11 国立大学法人熊本大学 コレステロール蓄積疾患治療薬、およびそのスクリーニング方法
KR101906578B1 (ko) * 2017-07-28 2018-10-10 경북대학교 산학협력단 사이클로덱스트린 및 vegf 과발현 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07126162A (ja) * 1993-10-28 1995-05-16 Showa Denko Kk アスコルビン酸類の脳内投与剤
JP2010090054A (ja) * 2008-10-07 2010-04-22 Kumamoto Univ アミロイド線維形成抑制剤
WO2015083736A1 (ja) * 2013-12-05 2015-06-11 国立大学法人熊本大学 コレステロール蓄積疾患治療薬、およびそのスクリーニング方法
KR101906578B1 (ko) * 2017-07-28 2018-10-10 경북대학교 산학협력단 사이클로덱스트린 및 vegf 과발현 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FUKAURA, MADOKA : "2-hydroxypropyl-p- cyclodextrin in niemann-pick C-type disease", CLINICAL PHARMACY SYMPOSIUM, vol. 26, 24 July 2018 (2018-07-24) - 24 June 2018 (2018-06-24), pages 195, XP009529291, ISSN: 1348-0863 *
MAEDA, YUKI ET AL.: "27W-am12 In vivo evaluation of lactose-modified cyclodextrin with Niemann-Pick disease C-type treatment", 138TH ANNUAL MEETING OF THE PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN; MARCH 25-28, 2018, vol. 138, 25 March 2018 (2018-03-25), XP009529278 *
YOKOYAMA, RYOMA ET AL.: "P-06 Evaluation of the usefulness of cyclodextrin derivatives of blood- brain barrier penetration intended for the treatment of Alzheimer disease", PROGRAMS AND PREPRINTS OF THE 36TH ANNUAL MEETING OF THE JAPAN SOCIETY OF DRUG DELIVERY SYSTEM, vol. 36, 10 August 2020 (2020-08-10), pages 175, XP009529655 *
YOKOYAMA, RYUUMA ET AL.: "2-3-11 Possibility evaluation of lactose-modified cyclodextrin for construction of brain-localized drug carrier", PROCEEDINGS OF THE 35TH ANNUAL MEETING OF THE JAPAN SOCIETY OF DRUG DELIVERY SYSTEM, vol. 35, 15 June 2019 (2019-06-15), pages 149, XP009529144 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2021132703A1 (ja) 2021-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240148913A1 (en) Liposomal nanocarrier delivery system for targeting active cd44 molecule,preparation method therefor, and uses thereof
TWI499434B (zh) Treatment of pulmonary fibrosis
US8574623B2 (en) Therapeutic agent for pulmonary fibrosis
JP2021152032A (ja) トレハロースの非経口投与によるタンパク質凝集ミオパシーおよび神経変性疾患の治療
EP3037097B1 (en) Polyrotaxane and medicinal composition
US11737977B2 (en) Cerasome delivery system for targeting activated CD44 molecule, preparation method and use thereof
CN108495619A (zh) 棘霉素制剂及其制备方法和使用方法
Yu et al. Enhanced transdermal efficiency of curcumin-loaded peptide-modified liposomes for highly effective antipsoriatic therapy
KR20170012555A (ko) 신경 질환 및 대뇌 상해의 치료를 위한 조성물 및 방법
WO2019102606A1 (ja) 疾患部位特異的リポソーム製剤
EP4382094A1 (en) Atherosclerosis-targeted liposome nanocarrier delivery system and preparation method therefor
US20150157610A1 (en) Pharmaceutical composition for treating inflammatory disease
TW201121992A (en) Suppression of cancer metastasis
WO2021132703A1 (ja) 脂質蓄積病を治療するための医薬組成物
US20030211142A1 (en) Liposome
KR100535266B1 (ko) 항노화 활성이 우수한 현삼 추출물 및 이를 포함하는 조성물
JP4827277B2 (ja) リポソーム
US20190192544A1 (en) Methods for treatment using small molecule potassium-sparing diuretics and natriuretics
EP3308790A1 (en) Novel amyloid fibril formation inhibitor
Jin et al. A precise dual-drug codelivery nanosystem for treating kidney failure by eliminating senescent cells
JP2021529153A (ja) 細胞透過性物質が融合したアプチド（ａｐｔｉｄｅ）が捕集された脂質ナノ粒子複合体及びその用途
JP2014028761A (ja) マクロファージ機能抑制及び／又は癌細胞増殖抑制
CN107898774A (zh) 异甘草素脂质体在制备治疗阿霉素诱导的急（慢）性心肌毒性药物中的应用
RU2744453C2 (ru) Таргетная неинвазивная трансплантация в мозг функционально активных митохондрий для лечения нейродегенеративных заболеваний
JP7506378B2 (ja) 脳移行性リガンド及び薬物担体

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20905344

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021567755

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20905344

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1